CN114656424A - 一种上转换长余辉化学发光成像纳米探针及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种上转换长余辉化学发光成像纳米探针及其制备方法和应用，所述荧光探针无需使用稀土元素，可以接收660nm激光、发射出570nm的化学发光，在激光停止照射后仍可持续发光，持续十天后依旧能发出可以被观测到的化学发光，在生物成像领域有重要意义。
Description
技术领域
本发明涉及生物成像技术领域，特别涉及一种上转换长余辉化学发光成像纳米探针及其制备方法和应用。
背景技术
生物光学成像(Optical Imaging)是指利用光学的探测手段结合光学探测分子对细胞或者组织甚至生物体进行成像，来获得其中的生物学信息的方法。生物光学成像由于其检测仪器发展成熟、灵敏度高、对比度高、分辨率高、成像直观、成像速度快和无损探测等优点被广泛应用。其在探寻疾病的发病机理、临床表现、基因病变，了解相应的生理学和病理学信息，疾病诊断和新的医疗手段的开发等方面具有重要的实践意义和应用前景。
上转换发光即反-斯托克斯发光(Anti-Stokes)，指的是材料受到低能量的光激发，发射出高能量的光，即经波长长、频率低的光激发，材料发射出波长短、频率高的光。
长余辉纳米材料具有独特的发光性质，能在激发光关闭后持续发光。通过收集激发光关闭后的长余辉发光信号可以有效消除背景信号的干扰。此外，长余辉材料在成像时无需原位激发，可以减少生物体系的组织自发荧光和光散射干扰，提高生物成像和检测的灵敏度。由于这种独特的光学特性，长余辉纳米材料在生物传感/生物成像以及疾病治疗等领域被广泛应用。
目前上转换纳米探针几乎都需要掺杂稀土元素，目前的长余辉纳米探针很多也都需要掺杂镧等稀土元素，稀土是非常稀有的资源，因此成本高。且现有的长余辉材料发光时间短，一般只有几个小时。因此目前亟需一种成本低、发光时间长的上转换长余辉化学发光成像纳米探针。
发明内容
针对现有技术中的缺陷，本发明提出了一种上转换长余辉化学发光成像纳米探针及其制备方法和应用。
本发明提供一种上转换长余辉化学发光成像纳米探针的制备方法，包括如下步骤：
(1)称取第一化合物和SA，用有机溶剂溶解，随后加入第二化合物，再加入纯水，轻微摇晃数次，振荡；所述有机溶剂为三氯甲烷、二氯甲烷、四氢呋喃、丙酮、乙腈等。
所述第一化合物的结构式如式(I)所示：
其中，R为饱和全氟链及其同分异构体；
所述第二化合物为DSPE-PEG2000、聚乙二醇二丙烯酸酯，DSPE-PEG6000，PLA-PEG2000中的任意一种；
所述SA的结构式如式(II)所示：
其中，R为烷烃链；
(2)通惰性气体到步骤(1)的溶液中直至有机溶剂全部挥发，将剩余液体过滤可得到在水中均匀分散的所述上转换长余辉化学发光成像纳米探针。所述惰性气体为氮气、氩气、二氧化碳等。
进一步的，所述第一化合物的饱和全氟链及其同分异构体选自C4F8、C5F11、C8F17、C9F19、C10F21、C11F23、C12F25、C15F31中的任意一种。
进一步的，所述SA的烷烃链为-OH，-SO3，-NO2，-COOH中的任意一种。
进一步的，所述第一化合物与SA的质量比为(7：3)～(3：7)之间。
进一步的，所述有机溶剂与所述第一化合物的质量比为(1000～30000)：1。
进一步的，所述第二化合物与所述第一化合物的质量比为(10～100)：1。
进一步的，所述过滤采用220nm滤膜。
进一步的，所述步骤(1)中还可加入细胞穿膜肽。制备得到的纳米探针中细胞穿膜肽位于纳米探针表面。
本发明还提供所述的制备方法制备得到的上转换长余辉化学发光成像纳米探针。第一化合物和SA被包裹在第二化合物的内部。
本发明还提供所述的上转换长余辉化学发光成像纳米探针在生物成像领域的应用。
综上，与现有技术相比，本发明达到了以下技术效果：
(1)目前上转换纳米探针几乎都需要掺杂稀土元素，而稀土是非常稀有的资源。本发明的纳米探针利用两种不同的小分子物质便实现了上转换，无需稀缺的稀土资源。
(2)目前长余辉纳米探针很多也都需要掺杂镧等稀土元素，如上所说，稀土是非常稀有的资源。本发明的纳米探针利用特殊的化学结构实现光能的储存和释放，无需稀土元素。
(3)现有的长余辉材料发光时间短，一般只有几个小时。本发明的长余辉颗粒在体外可以持续发光10天以上，在体内经过两天依旧能检测到化学发光。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明的光敏剂NMBF(左)与SA(右)的结构式；
图2为NMBF、SA和纳米探针的紫外吸收图谱；
图3为本发明的纳米探针粒径图；
图4为本发明的纳米探针ROS释放测试；
图5为本发明的纳米探针体外化学发光时间测试；
图6为本发明的纳米探针的细胞吞噬细胞成像；
图7为本发明的纳米探针的动物体内化学发光结果；
图8为本发明的纳米探针的体内化学发光寿命。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
将第一化合物(如下述实施例中的光敏剂NMBF)与ROS响应分子SA分子按一定比例用第二化合物(如DSPE-PEG2000)包裹在一起，便可得到本发明的上转换长余辉化学发光成像纳米探针，它可以接受660nm激光，释放出ROS，ROS传播距离有限，所以利用第二化合物将SA与第一化合物包裹在一起，SA便可与ROS反应持续发出化学发光。
具体制备方法如下：
(1)称取第一化合物和SA，用有机溶剂溶解，随后加入第二化合物，再加入纯水，轻微摇晃数次，振荡；第一化合物与SA的质量比为(7：3)～(3：7)之间；所述有机溶剂与所述第一化合物的质量比为(1000～30000)：1。所述第二化合物与所述第一化合物的质量比为(10～100)：1。此步还可加入细胞穿膜肽。
所述第一化合物的结构式如式(I)所示：
其中，R为饱和全氟链及其同分异构体；所述饱和全氟链及其同分异构体选自C4F8、C5F11、C8F17、C9F19、C10F21、C11F23、C12F25、C15F31中的任意一种。
所述第二化合物为DSPE-PEG2000、聚乙二醇二丙烯酸酯，DSPE-PEG6000，PLA-PEG2000中的任意一种；以下实施例以DSPE-PEG2000为例，聚乙二醇二丙烯酸酯、DSPE-PEG6000、PLA-PEG2000均具有相似的理化性质，因此本领域技术人员可以知晓采用聚乙二醇二丙烯酸酯、DSPE-PEG6000、PLA-PEG2000均能实现本发明的技术方案。
所述SA的结构式如式(II)所示：
其中，R为各种烷烃链，选自-OH，-SO3，-NO2，-COOH中的任意一种。以下实施例中以-OH为例，但是具有其他烷烃链的SA分子均可以利用本发明的制备方法合成所述化学发光成像纳米探针。
(2)通惰性气体到步骤(1)的溶液中直至有机溶剂全部挥发，将剩余液体采用220nm滤膜过滤可得到在水中均匀分散的所述上转换长余辉化学发光成像纳米探针。所述惰性气体为氮气、氩气、二氧化碳等。以下实施例中以氮气为例，惰性气体在反应中起保护作用，所以任何具有保护作用的惰性气体都能实现本发明的技术效果。
实施例1光敏剂NMBF的制备
具体制备方法如下：
(1)将40-70mg新亚甲蓝与80mg全氟烷碘装入50mL圆底烧瓶，随后加入8-10mLDMF，1-2滴三乙胺。在圆底烧瓶口接三通阀，三通阀一端接充满氮气的气球。
新亚甲蓝的结构式为：
本实施例使用的全氟烷碘是全氟癸烷碘，其化学结构式如下：
当2＜n＜5时，反应温度可以为50-80℃。当n＞5时，反应温度应大于75℃，且随着n的增加反应温度应该逐渐提高。
(2)在油浴锅加热至80-90℃，500rpm，避光反应24h。
(3)抽滤，除去多余固体。将抽滤得到的溶液旋蒸，旋干后的固体放真空干燥箱干燥24h。
(4)干燥后的固体用水完全溶解，随后用二氯甲烷萃取，并旋蒸旋干。
(5)旋干后的固体用水清洗去除水溶性杂志，收集剩下固体，真空干燥后得到产物。
制备得到的产物光敏剂(NMBF)的结构式如下：
实施例2光敏剂NMBF与SA制备NMBF@SA纳米探针
称取1-1.5mg实施例1制备的NMBF与1-1.5mg SA，用1-1.5mL三氯甲烷溶解，随后加入5-6mg DSPE-PEG2000，再加入5-6mL纯水，轻微摇晃4-5次，使用超声机振荡1min。随后将针管插入溶液，通氮气10-15min直至三氯甲烷全部挥发，将剩余液体滤过220nm滤膜便可得到在水中均匀分散的NMBF@SA纳米探针。
实施例3 NMBF、SA和纳米探针的紫外吸收图谱
具体步骤如下：
(1)将NMBF、SA和纳米探针溶于DMSO，浓度为100-200mM/L，加入1mL比色皿。
(2)用紫外光谱仪测试其在200-700nm范围内的紫外吸收曲线。
(3)取NMBF、SA和纳米探针的DMSO溶液，浓度100-1000μg/mL共1mL于1.5mL试管中。
(4)用580nm激光器照射下，用荧光成像相机拍摄的此时NMBF溶液的发光状态。
图2为NMBF、SA和纳米探针的紫外吸收图谱，表明其具有发光性质。
实施例4本发明的纳米探针的粒径检测
具体步骤如下：
(1)将NMBF@SA水溶液用纯水稀释至30-50ng/mL，取1mL加入比色皿。
(2)用激光粒度仪利用动态光衍射的方法测试溶液中纳米探针从0-10000nm的粒径分布情况。
(3)将粒径分布数据制成柱状图，横坐标为粒径，纵坐标为该粒径探针占总数的百分比，总体平均粒径为139nm。
图3的结果表明本发明的NMBF@SA纳米探针平均粒径为139nm。
实施例5利用DPBF(1,3-二苯基异苯并呋喃)检测ROS释放
具体步骤如下：
(1)将紫外分光光度计用超纯水校准基线。
(2)将1-2mg DPBF溶于DMSO，随后吸取8-10μL加入1mL超纯水，混匀后加入1mL比色皿，并测试其紫外曲线。
(3)将比色皿取出，用功率5W的660nm激光器照射4-5min，再次测试其紫外曲线。
(4)再重复第(3)步3次，共计5条紫外曲线。
(5)取每条紫外曲线在415nm处的数值，按时间顺序做折线图。
(6)按步骤(2)重新配置溶液，并加入DMSO溶解的NMBF使其终浓度100-200mM/L，并保持DPBF终浓度一致，装入1mL比色皿测紫外曲线。
(7)重复(3)(4)(5)步，比较加入NMBF前后曲线变化。
图4的结果说明NMBF@SA在激光照射下能够释放ROS，是一种优秀的光敏剂。
实施例6体外化学发光时间测试
具体步骤如下：
(1)将NMBF@SA纳米探针制成5-6mg/mL的水溶液，分装到ep管，每管1-1.2mL，共三管。
(2)用功率为5W的660nm激光器照射ep管2-3min。
(3)用小动物成像仪ivis对ep管的化学发光进行检测，并记录数值。
(4)按10min，30min，1h，2h，4h，6h，8h，10h，12h，1d，2d，4d，6d，8d，10d的时间间隔对ep管检测化学发光，除检测时间外ep管放在黑暗条件下。
(5)将发光强度数值按照时间顺序做图。
结果如图5所示，用660nm激光激发，接收570nm的光信号，结果表明本发明的纳米探针体外发光可持续10天以上。
实施例7细胞吞噬实现细胞成像
(1)25mL培养瓶培养巨噬细胞RAW246.3，并传代至8孔共聚焦培养板。
(2)将NMBF@SA溶于纯水，浓度1-2mg/mL。
(3)待共聚焦培养板中细胞数量长到300w时，将(2)中溶液用功率为5W的660nm激光器照射2-3min。再按体积比1:100加入共聚焦培养板，使其在培养基中浓度为10-20μg/mL，共同孵育20-30min。
(4)将巨噬细胞消化并收集至ep管。
(5)用小动物成像仪ivis对ep管的化学发光进行检测，并观察发光情况。
结果如图6所示，蓝色为细胞核染料荧光，红色为纳米探针的荧光，图中以灰度表示，证明纳米探针可以进入细胞。
为了验证本发明的纳米探针是否可以在体内发光，将RAW246.3细胞用纳米探针孵育后，注射进小鼠肌肉组织后，进行化学发光观察，结果如图7所示，图7为细胞孵育后纳米探针在小鼠体内的化学发光成像，图8为发光寿命的结果，证明了本发明的纳米探针的长余辉效应，激光照射后可以持续发光，上述结果说明本发明的荧光探针可以实现生物体内的发光检测。
综合以上实施例，本发明的纳米探针制作过程经实验证明可行，形成了约150nm大小的纳米探针，利用DPBF检测纳米探针确实可以释放ROS，纳米探针体外检测可持续发光10天以上，体内检测可以持续发光2天以上，也可以被细胞吞噬实现细胞成像。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种上转换长余辉化学发光成像纳米探针的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)称取第一化合物和SA，用有机溶剂溶解，随后加入第二化合物，再加入纯水，轻微摇晃数次，振荡；
所述第一化合物的结构式如式(I)所示：
其中，R为饱和全氟链及其同分异构体；
所述第二化合物为DSPE-PEG2000、聚乙二醇二丙烯酸酯，DSPE-PEG6000，PLA-PEG2000中的任意一种；
所述SA的结构式如式(II)所示：
其中，R为烷烃链；
(2)通惰性气体到步骤(1)的溶液中直至有机溶剂全部挥发，将剩余液体过滤可得到在水中均匀分散的所述上转换长余辉化学发光成像纳米探针。
2.根据权利要求1所述的纳米探针的制备方法，其特征在于，所述第一化合物的饱和全氟链及其同分异构体选自C4F8、C5F11、C8F17、C9F19、C10F21、C11F23、C12F25、C15F31中的任意一种。
3.根据权利要求1所述的纳米探针的制备方法，其特征在于，所述SA的烷烃链为-OH，-SO3，-NO2，-COOH中的任意一种。
4.根据权利要求1所述的纳米探针的制备方法，其特征在于，所述第一化合物与SA的质量比为(7：3)～(3：7)之间。
5.根据权利要求1所述的纳米探针的制备方法，其特征在于，所述有机溶剂与所述第一化合物的质量比为(1000～30000)：1。
6.根据权利要求1所述的纳米探针的制备方法，其特征在于，所述第二化合物与所述第一化合物的质量比为(10～100)：1。
7.根据权利要求1所述的纳米探针的制备方法，其特征在于，所述过滤采用220nm滤膜。
8.根据权利要求1所述的纳米探针的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中还可加入细胞穿膜肽。
9.权利要求1～8任一项所述的制备方法制备得到的上转换长余辉化学发光成像纳米探针。
10.权利要求9所述的上转换长余辉化学发光成像纳米探针在生物成像领域的应用。
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