CN113262213A - 甲萘醌在制备治疗食管鳞状细胞癌和/或抑制其增殖和转移药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物医药领域，特别是涉及甲萘醌在制备治疗食管鳞状细胞癌及抑制其转移药物中的应用。本发明提供了甲萘醌在制备治疗食管鳞状细胞癌药物中的应用。甲萘醌的副作用较化疗药更清楚，该药物安全性已被证明，可用作治疗食管鳞状细胞癌，而且还能显著抑制食管鳞状细胞癌细胞和裸鼠移植瘤的增殖以及抑制食管鳞状细胞癌细胞的转移水平。

Description

甲萘醌在制备治疗食管鳞状细胞癌和/或抑制其增殖和转移 药物中的应用

技术领域

本发明涉及生物医药领域，特别是涉及甲萘醌在制备治疗食管鳞状细胞癌和/或抑制其增殖和转移药物中的应用。

背景技术

食管鳞状细胞癌是全球最常见的恶性肿瘤之一，且食管鳞状细胞癌预后极差。烟酒史、营养缺失、热食以及摄入致癌物等因素都与食管鳞状细胞癌相关。放化疗是食管鳞状细胞癌的重要治疗手段，但是其5年生存率只有13％左右，副作用比较大。寻找一种副作用小且能够有效治疗食管鳞状细胞癌的方法是极为重要的。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了甲萘醌在制备治疗食管鳞状细胞癌和/或抑制其增殖和转移药物中的应用。甲萘醌的副作用较采用的化疗药物更清楚，而且该药物药物安全性已被证明，可用作治疗食管鳞状细胞癌药物，还能显著抑制食管鳞状细胞癌细胞和裸鼠移植瘤的增殖以及抑制食管鳞状细胞癌细胞的转移水平。

为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

本发明提供了甲萘醌在制备治疗食管鳞状细胞癌药物中的应用。

本发明提供了一种治疗食管鳞状细胞癌的药物，所述药物的有效成分包括甲萘醌。

优选的，所述药物还包括药学上可接受的辅料。

优选的，所述药物的剂型包括注射剂。

本发明提供了甲萘醌在制备抑制食管鳞状细胞癌增殖和转移药物中的应用。

本发明提供了一种抑制食管鳞状细胞癌增殖和转移药物，所述药物的有效成分包括甲萘醌。

优选的，所述药物还包括药学上可接受的辅料。

优选的，所述药物的剂型包括注射剂。

有益效果：甲萘醌在制备治疗食管鳞状细胞癌药物中的应用。本发明所述甲萘醌的药物安全性已被证明，其副作用较化疗药物更清楚，可用作治疗食管鳞状细胞癌细胞。本发明具体实施例采用食管鳞状细胞癌的细胞和荷瘤裸鼠动物模型试验证明：甲萘醌的浓度在15μM，用量为10mg/kg时，能显著抑制食管鳞状细胞癌细胞和裸鼠移植瘤的增殖和转移水平。

附图说明

图1为不同药物浓度下的细胞活力典型图；

图2为细胞克隆数量示意图，其中A为培养KYSE30细胞用0μM和15μM的甲萘醌处理后的克隆数量统计柱状图，B为培养KYSE150细胞用0μM和15μM的甲萘醌处理后的克隆数量统计柱状图，C为A图数据来源情况的细胞真实克隆情况典型图片，D为B图数据来源情况的细胞真实克隆情况典型图片；

图3为划痕愈合面积示意图，其中A为0μM和15μM的甲萘醌在分别处理KYSE30细胞0小时和24小时的愈合变化统计柱状图，B为0μM和15μM的甲萘醌在分别处理KYSE30细胞0小时和24小时的愈合变化统计柱状图，C为A数据来源的实际剥落细胞的愈合面积变化情况图片，D为B数据来源的实际剥落细胞的愈合面积变化情况图片；

图4为裸鼠接种能形成移植瘤食管鳞状细胞癌细胞并按每3天腹腔注射药物溶解剂二甲亚砜和甲萘醌(10mg/kg)，30天后的肿瘤重量示意图。

具体实施方式

本发明提供了甲萘醌(Menadione)在制备治疗食管鳞状细胞癌药物中的应用。甲萘醌的药物安全性已被证明，其副作用较化疗药更清楚，可以用于治疗食管鳞状细胞癌；本发明对甲萘醌的来源没有特殊限定，本领域技术人员常规购买即可；在本发明具体实施例中，所述甲萘醌优选购买于MedChemExpress，货号为HY-B0332；所述甲萘醌的化学式优选如式I所示：

本发明具体实施例采用食管鳞状细胞癌的细胞和荷瘤裸鼠动物模型试验证明：甲萘醌能显著抑制食管鳞状细胞癌细胞和裸鼠移植瘤的增殖和转移水平，可见甲萘醌能够用于制备治疗食管鳞状细胞癌药物。

本发明提供了一种治疗食管鳞状细胞癌的药物，所述药物的有效成分包括甲萘醌。在本发明中，所述药物优选还包括药学上可接受的辅料；所述药物的剂型优选包括注射剂。本发明所述甲萘醌在进行细胞活力试验时，浓度为15μM，进行裸鼠异种移植实验时的用量是10mg/kg，就能够达到抑制癌细胞生长的效果。

本发明提供了甲萘醌在制备抑制食管鳞状细胞癌转移药物中的应用。

本发明提供了一种抑制食管鳞状细胞癌转移药物，所述药物的有效成分包括甲萘醌。在本发明中，所述药物优选还包括药学上可接受的辅料；所述药物的剂型优选包括注射剂。本发明所述甲萘醌进行裸鼠异种移植实验时的用量是10mg/kg，就能够达到抑制食管鳞状细胞癌转移的效果。

本发明在进行细胞活力试验时，采用的细胞系优选包括KYSE30、KYSE150、KYSE450、TE1、TE3和TE5；本发明对所述细胞系的来源没有特殊要求，采用本领域技术人员常规购买所得，KYSE30、KYSE150、KYSE450来自于日本细胞库Japanese Collection ofResearch Bioresources Cell Bank；TE1、TE3和TE5来自于Japanese Cell ResourceCenter for Biomedical Research。

为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的甲萘醌在制备治疗食管鳞状细胞癌和/或抑制其增殖和转移药物中的应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

细胞活力试验(MTS试验)

为了测量不同细胞系(KYSE30、KYSE150、KYSE450来自于日本细胞库JapaneseCollection of Research Bioresources Cell Bank；TE1、TE3和TE5来自于Japanese CellResource Center for Biomedical Research。)对药物甲萘醌的敏感性，细胞被消化并在含有10％血清的RPMI Medium 1640培养基(购买厂家：英潍捷基(上海)贸易有限公司，货号：11875119，品牌：GIBCO)中培养，形成单个细胞悬液，计数细胞，接种于96孔板，每孔10000个细胞。每孔介质体积为100μl。将细胞培养12小时贴壁，然后换成分别含有0μM、5μM、10μM、20μM、30μM、40μM和60μM的甲萘醌的RPMI Medium 1640培养基(购买厂家：英潍捷基(上海)贸易有限公司，货号：11875119，品牌：GIBCO)。连续培养24小时后，每孔加入MTS(货号：G3581，公司：Promega)20μl，孵育2小时。采用Thermo Scientific公司的MK3酶标仪在波长为492nm处测量各孔的吸光度值。具体步骤参考《SLC52A3 expression is activated byNF-kappaB p65/Rel-B and serves as a prognostic biomarker in esophagealcancer》(Long,L.et al.Cell Mol Life Sci 75,2643-2661,doi:10.1007/s00018-018-2757-4(2018))，计算不同药物浓度下的细胞活力，结果见表1，然后使用GraphPadprism 7软件进行绘图，结果见图1。

表1不同药物浓度下的细胞活力比值

由表1和图1记载的可知，随着药物浓度的增加甲萘醌逐渐显著地抑制了食管鳞状细胞系KYSE30，KYSE150，KYSE450，TE1，TE3和TE5这些癌细胞的存活。

实施例2

集落形成实验

在12孔板中，每孔接种500～1,000个KYSE30或KYSE150细胞。待细胞贴壁后，在RPMI Medium 1640细胞培养液(购买厂家：英潍捷基(上海)贸易有限公司，货号：11875119，品牌：GIBCO)中加入浓度为15μM的甲萘醌药物，培养12小时。用RPMI Medium 1640培养基替换有药物的RPMI Medium 1640细胞培养液再继续培养细胞2周。4℃预冷PBS洗涤后，用4℃预冷甲醇和冰醋酸3:1固定20分钟，并用紫结晶染色15分钟，以二甲亚砜(英文缩写为DMSO，全称为Dimethyl sulfoxide，购买厂家：sigma，货号：D4540-1L，品牌：sigma)为阴性对照，具体步骤参考《Riboflavin Depletion Promotes Tumorigenesis in HEK293T andNIH3T3 Cells by Sustaining Cell Proliferation and Regulating Cell Cycle-Related Gene Transcription》(Long,L.,et al.J Nutr,2018.148(6):p.834-843)。用ChemiDoc Touch(Bio-Rad)对菌落拍照，用Image J软件(美国国立卫生研究院，Bethesda,MD，USA)计算菌落数量，每个实验重复3次，结果见表2、表3和图2。

表2 KYSE30菌落数量示意表

表3 KYSE150菌落数量示意表

由表2、表3和图2记载的可知，15μM的Menadione显著抑制了KYSE30和KYSE150两种细胞形成的细胞克隆数目。

实施例3

伤口愈合实验

将KYSE30或KYSE150细胞(购自于日本细胞库Japanese Collection of ResearchBioresources Cell Bank)接种到6孔板中，在无血清的RPMI Medium 1640培养基中培养12小时。用无菌移液管尖端画一条直线。用PBS清洗细胞，然后在2％胎牛血清的RPMI Medium1640培养基中培养。用含有0μM和15μM的甲萘醌药物的RPMI Medium 1640培养基分别于培养KYSE30或KYSE150细胞的细胞皿中加入该含药的RPMI Medium 1640培养基的0小时和24小时后用显微镜对指定区域进行显微观察，以二甲亚砜为阴性对照，具体步骤参考《RAC1inhibition reverses cisplatin resistance in esophageal squamous cellcarcinoma and induces downregulation of glycolytic enzymes》(Zeng,R.J.,etal.Mol Oncol,2019.13(9):p.2010-2030.)。采用ImageJ软件(美国国立卫生研究院，Bethesda,MD,USA)计算伤口愈合面积，结果见表4、表5和图3。

表4 KYSE30的划痕愈合面积

表5 KYSE150的划痕愈合面积

由表4、表5和图3记载的可知，15μM的甲萘醌显著抑制了KYSE30和KYSE150两种细胞在细胞培养板中的移动速度。

实施例4

裸鼠异种移植实验

动物实验按照汕头大学医学院医学实验动物伦理委员会批准的方案进行，具体步骤参考《RAC1 inhibition reverses cisplatin resistance in esophageal squamouscell carcinoma and induces downregulation of glycolytic enzymes》(Zeng,R.J.,etal.Mol Oncol,2019.13(9):p.2010-2030)。3～5周龄裸鼠(中国北京Vital River实验动物技术有限公司)随机分为4组(1组为KYSE30二甲亚砜组、2组为KYSE30甲萘醌组、3组为KYSE150二甲亚砜组和4组为KYSE150甲萘醌组)，每组5只，分别将KYSE30(2×10⁶个)和KYSE150(1×10⁶个)细胞注入小鼠腋窝。当肿瘤平均体积达到50mm³时开始注射甲萘醌药物，其中2组和4组每3天腹腔注射甲萘醌(10mg/kg)，1组和3组每3天注射二甲亚砜(150μL)。每3天测量肿瘤体积，按下式(宽²×长)/2计算。接种后30天，用二氧化碳对小鼠实施安乐死，切除肿瘤并称重，结果见表6～表9与图4。

表6 KYSE30细胞裸鼠移植瘤体积统计表(mm³)

表7 KYSE150细胞裸鼠移植瘤体积统计表(mm³)

表8 KYSE30细胞裸鼠移植瘤重量统计表(g)

表9 KYSE150细胞裸鼠移植瘤重量统计表(g)

由表6～表9和图4记载的可知，在裸鼠异种移植实验中，甲萘醌(10mg/kg)分别显著抑制了KYSE30和KYSE150细胞在裸鼠皮下形成移植瘤的体积和重量。

虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可以做各种改动和修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (8)

1.甲萘醌在制备治疗食管鳞状细胞癌药物中的应用。

2.一种治疗食管鳞状细胞癌的药物，其特征在于，所述药物的有效成分包括甲萘醌。

3.根据权利要求3所述药物，其特征在于，所述药物还包括药学上可接受的辅料。

4.根据权利要求2或3所述药物，其特征在于，所述药物的剂型包括注射剂。

5.甲萘醌在制备抑制食管鳞状细胞癌增殖或转移药物中的应用。

6.一种抑制食管鳞状细胞癌增殖或转移药物，其特征在于，所述药物的有效成分包括甲萘醌。

7.根据权利要求6所述药物，其特征在于，所述药物还包括药学上可接受的辅料。

8.根据权利要求6或7所述药物，其特征在于，所述药物的剂型包括注射剂。

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