CN113260618A - 二甲氧基苯化合物类似物、分析所述化合物的方法和所述化合物的标准品 - Google Patents

二甲氧基苯化合物类似物、分析所述化合物的方法和所述化合物的标准品 Download PDF

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Abstract

由式(1)至(5)中任一项表示的化合物或其盐、或其组合。式(1)：1,3‑双((S)‑3‑(4‑氨基‑3‑((3,5‑二甲氧基苯基)乙炔基)‑1H‑吡唑并[3,4‑d]嘧啶‑1‑基)吡咯烷‑1‑基)丙‑1‑酮。式(2)：1‑((S)‑3‑(4‑((3‑((S)‑3‑(4‑氨基‑3‑((3,5‑二甲氧基苯基)乙炔基)‑1H‑吡唑并[3,4‑d]嘧啶‑1‑基)吡咯烷‑1‑基)‑3‑氧代丙基)氨基)‑3‑((3,5‑二甲氧基苯基)乙炔基)‑1H‑吡唑并[3,4‑d]嘧啶‑1‑基)吡咯烷‑1‑基)丙‑2‑烯‑1‑酮。式(3)：(S)‑3‑((1‑(1‑丙烯酰基吡咯烷‑3‑基)‑6‑((3,5‑二甲氧基苯基)乙炔基)‑1H‑吡唑并[3,4‑d]嘧啶‑4‑基)氨基)丙酸。式(4)：(S)‑3‑(4‑氨基‑3‑((3,5‑二甲氧基苯基)乙炔基)‑1H‑吡唑并[3,4‑d]嘧啶‑1‑基)吡咯烷‑1‑甲醛。式(5)：(S)‑1‑(3‑(4‑氨基‑3‑((3,5‑二甲氧基苯基)乙炔基)‑1H‑吡唑并[3,4‑d]嘧啶‑1‑基)吡咯烷‑1‑基)‑3‑羟丙‑1‑酮。

Description

二甲氧基苯化合物类似物、分析所述化合物的方法和所述化 合物的标准品
技术领域
相关申请的交叉引用
本申请要求2018年11月9日提交的国际申请号为PCT/JP2018/041744和2019年3月11日提交的日本专利申请第2019-044236号的说明书的优先权，其全部公开内容通过引用并入本文。本发明涉及二甲氧基苯化合物的相关物质、用于分析该化合物的方法及该化合物的标准品。
背景技术
为确保具有适当质量保证的药品的持续供应，有必要确认有效成分是否适当地包含在药品中，以及所含杂质是否控制在一定水平之下。特别地，药品中杂质的控制对于确保药品质量和患者安全性均非常重要。因此，能够适当地评估药品中含有的相关物质(杂质)的量的分析方法是质量控制中比其他分析方法优先的方法之一。
据报道化合物(S)-1-(3-(4-氨基-3-((3,5-二甲氧基苯基)乙炔基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)吡咯烷-1-基)-2-丙烯-1-酮(本说明书下文中的“化合物A”)具有对成纤维细胞生长因子受体(FGFR)优异的抑制活性并表现出抗肿瘤活性(PTL 1至5)。已经公开了通过使用(S)-3-((3,5-二甲氧基苯基)乙炔基)-1-(吡咯烷-3-基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-胺(本说明书中的“化合物B”)和丙烯酰氯合成化合物A的方法。已经公开了通过使用ACQUITY SQD(由Waters Corporation制造)分析化合物A等化合物的方法(PTL 4)。还已报道，通过使用各种溶剂可以以晶体形式得到化合物A，并且将这些晶体溶解并通过使用1200系列二元LC系统(Agilent Technologies)和ACQUITY SQD(Waters Corporation)进行分析(PTL 4)。
引用列表
专利文献
PTL 1：WO2013/108809A
PTL 2：WO2015/008844A
PTL 3：WO2015/008839A
PTL 4：WO2016/159327A
PTL 5：WO2017/150725A
发明内容
技术问题
本发明的目的是提供一种用于制造化合物A或其药学上可接受的盐的方法，该方法能够大量合成化合物A或其药学上可接受的盐，且操作简单且易于使用，并且满足药品所要求的质量。
然而，即使是这种制造方法，也存在不可避免的相关物质，需要进行质量控制以保持药品所要求的质量。因此，本发明的另一个目的是提供这些相关物质的标准品，用于质量控制以确定药品是否满足所要求的质量。
本发明的另一个目的是提供用于适当检测用于质量控制的原料药或制剂中这些相关物质的含量的分析方法。
技术问题的解决方案
本发明人进行了深入研究，发现了一种制造化合物A或其药学上可接受的盐的方法，该方法能够大量制造具有作为药品的合适质量的化合物A或其药学上可接受的盐。本发明人还发现了可用作确认化合物A的质量的标准品的化合物A的相关物质。本发明还发现一种能够使用高效液相色谱控制化合物A的质量的分析方法。
具体而言，本发明包括以下[1]至[12]。
[1]一种由下式(1)至(5)中的任何一者表示的化合物或其盐、或其组合：
Figure BDA0003144991910000031
Figure BDA0003144991910000041
[2]根据[1]的化合物或其盐、或其组合，其中该化合物由式(1)或(2)表示。
[3]一种由下式(1)至(5)中的任何一者表示的化合物或其盐、或其组合，该化合物用作用于控制(S)-1-(3-(4-氨基-3-((3,5-二甲氧基苯基)乙炔基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)吡咯烷-1-基)-2-丙烯-1-酮的质量的标准品：
Figure BDA0003144991910000042
Figure BDA0003144991910000051
[4]一种由下式(1)或(2)表示的化合物或其盐、或其组合，该化合物用作用于控制(S)-1-(3-(4-氨基-3-((3,5-二甲氧基苯基)乙炔基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)吡咯烷-1-基)-2-丙烯-1-酮的质量的标准品：
Figure BDA0003144991910000052
Figure BDA0003144991910000061
[5]一种通过高效液相色谱分析(S)-1-(3-(4-氨基-3-((3,5-二甲氧基苯基)乙炔基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)吡咯烷-1-基)-2-丙烯-1-酮的方法，其中通过高效液相色谱所测量的由下式(1)表示的化合物、下式(2)表示的化合物和(S)-1-(3-(4-氨基-3-((3,5-二甲氧基苯基)乙炔基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)吡咯烷-1-基)-2-丙烯-1-酮所组成之群的化合物之间的分离度为1.5以上：
Figure BDA0003144991910000062
[6]一种通过高效液相色谱分析(S)-1-(3-(4-氨基-3-((3,5-二甲氧基苯基)乙炔基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)吡咯烷-1-基)-2-丙烯-1-酮的方法，其中通过高效液相色谱所测量的由下式(1)表示的化合物、下式(2)表示的化合物、下式(3)表示的化合物、下式(4)表示的化合物、下式(5)表示的化合物和(S)-1-(3-(4-氨基-3-((3,5-二甲氧基苯基)乙炔基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)吡咯烷-1-基)-2-丙烯-1-酮所组成之群的化合物之间的分离度为1.5以上：
Figure BDA0003144991910000071
Figure BDA0003144991910000081
[7]根据[5]或[6]的分析方法，其中流动相包括使用磷酸盐将pH调节至6.4以上且6.8以下的缓冲溶液。
[8]根据[5]至[7]中任一项的分析方法，其中所述流动相是有机相和水相的混合物，且包括第一梯度、第二梯度和第三梯度，在每一个梯度中，所述流动相中的有机相的百分比随着时间的推移以恒定的增加速率增加。
[9]根据[5]至[8]中任一项的分析方法，其中所述第一梯度中的有机相的增加速率为0.7～2.0体积％/分钟，所述第一梯度的起始时间点为所述测量的起始时间点后0～5分钟，所述第一梯度的终止时间点为所述第一梯度的起始时间点后5～15分钟，所述有机相在所述第一梯度的起始时间点处的百分比是整个流动相的0～15质量％，并且所述有机相在所述第一梯度的终止时间点处的百分比为整个流动相的5～15质量％；
所述第二梯度中的有机相的增加速率为0.3～2.0体积％/分钟，所述第二梯度的起始时间点为所述第一梯度的终止时间点后0～10分钟，所述第二梯度的终止时间点为所述第二梯度的起始时间点后10～20分钟，所述有机相在所述第二梯度的起始时间点处的百分比与所述有机相在所述第一梯度的终止时间点处的百分比相同，并且所述有机相在所述第二梯度的终止时间点处的百分比为整个流动相的15～45质量％；并且
所述第三梯度中的有机相的增加速率为1.0～6.0体积％/分钟，所述第三梯度的起始时间点为所述第二梯度的终止时间点后0～10分钟，所述第三梯度的终止时间点为所述第三梯度的起始时间点后10～20分钟，所述有机相在所述第三梯度的起始时间点处的百分比与所述有机相在所述第二梯度的终止时间点处的百分比相同，并且所述有机相在所述第三梯度的终止时间点处的百分比为整个流动相的45～75质量％。
[10]根据[5]至[9]中任一项的分析方法，其中使用十八烷基硅烷化硅胶柱。
[11]根据[5]至[10]中任一项的分析方法，其中使用基于水相总量以15～40体积％的量包括乙腈的水相。
[12]根据[5]至[11]中任一项的分析方法，其中使用流动相清洁剂。
本发明的有益效果
本发明通过使用化合物A的相关物质作为标准品，能够可靠地控制化合物A的质量。本发明还能够高效控制作为药品所要求的化合物A或其药学上可接受的盐的质量。
附图说明
图1示出了实施例1中的色谱图。
具体实施方式
本发明中，化合物A为(S)-1-(3-(4-氨基-3-((3,5-二甲氧基苯基)乙炔基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)吡咯烷-1-基)-2-丙烯-1-酮。化合物A的结构如下所示。
Figure BDA0003144991910000091
化合物A或其药学上可接受的盐可以是溶剂化物(例如，水合物)或非溶剂化物。在本发明中，任何这样的形式都包括在“化合物A或其药学上可接受的盐”的范围内。化合物A的药学上可接受的盐没有特别限定，其实例包括与无机酸如盐酸和硫酸的加成盐；与有机酸如乙酸、柠檬酸、酒石酸和马来酸的加成盐；与碱金属如钾和钠的盐；与碱土金属如钙和镁的盐；与有机碱的盐，如铵盐、乙胺盐和精氨酸盐；等等。在本说明书中，术语“化合物A”可旨在包括化合物A的药学上可接受的“盐”和“溶剂化物”。
在本发明中，化合物B为(S)-3-((3,5-二甲氧基苯基)乙炔基)-1-(吡咯烷-3-基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-胺。化合物B的结构如下所示。
Figure BDA0003144991910000101
化合物B或其盐可以是溶剂化物(例如，水合物)或非溶剂化物。在本发明中，任何这样的形式都包括在“化合物B或其盐”的范围内。化合物B的盐没有特别限定，其实例包括与无机酸如盐酸、氢溴酸、氢碘酸、氢氟酸和硫酸的加成盐；与烷基硫酸如甲磺酸、对甲苯磺酸和苯磺酸的加成盐；与有机酸如乙酸、柠檬酸、酒石酸和马来酸的加成盐；与碱金属如钾和钠的盐；与碱土金属如钙和镁的盐；与有机碱的盐，如铵盐、乙胺盐和精氨酸盐；等等。在本说明书中，术语“化合物B”可旨在包括化合物B的“盐”和“溶剂化物”。
在本发明中，用于制造化合物A的化合物B可以是游离形式或盐形式，优选为与无机酸、烷基硫酸或有机酸的加成盐，更优选为与烷基硫酸的加成盐，甚至更优选为与甲磺酸的加成盐。
Figure BDA0003144991910000102
在本发明中，化合物B或其盐通过将式(C)表示的化合物的P1(P1表示氨基的保护基)脱保护而获得。式(C)表示的化合物可以通过WO2013/108809中公开的方法获得。
游离形式的化合物B易溶于水、高水溶性有机溶剂和高脂溶性有机溶剂，而化合物B的酸加成盐或碱加成盐在有机溶剂中的溶解度低，容易被分离和净化。
由P1表示的氨基的保护基的实例包括可在酸性条件下脱保护的保护基，例如叔丁氧基羰基(Boc基团)。作为保护基的P1脱保护的方法可以由本领域技术人员合适地选择。当P1为可在酸性条件下脱保护的保护基例如叔丁氧基羰基时，脱保护优选在酸性条件下进行。可以选择例如盐酸、甲磺酸、碘化氢或三氟乙酸的酸。从反应条件、易用性、制造设备的负担等方面考虑，优选甲磺酸。酸的用量例如优选相对于每摩尔由式(C)表示的化合物为1～100摩尔。
例如，当P1为可在酸性条件下脱保护的保护基如叔丁氧基羰基时，化合物B可作为酸加成盐得到，并可转化为化合物A或其药学上可接受的盐。
在本发明中，化合物A或其盐由化合物B或其盐通过丙烯酰化试剂制造。作为本发明的丙烯酰化试剂的一个实施方式，可以使用由下式(I-1-A)或式(I-2-A)表示的化合物。
Figure BDA0003144991910000111
其中L1和L2相同或不同，各自表示离去基团。
在由式(I-1-A)表示的化合物中，离去基团L2连接到羰基的β-位。在由式(I-2-A)表示的化合物中，离去基团L2连接到羰基的α-位。在这两种情况下，丙烯酰基都可以在碱性条件下衍生出来，且可以构建化合物A中的丙烯酰胺结构。
作为离去基团的L1的实例包括卤素原子等。L1优选为氯原子。
作为离去基团的L2的实例包括卤素原子、-OSO2CnFn+2(n表示1至4的整数)、甲磺酸酯(-OMs；Ms表示甲磺酰基)、甲苯磺酸酯(-OTs；Ts表示对甲苯磺酰基)、硝基苯磺酸酯(nosylate)(-ONs；Ns表示对硝基苯磺酰基(p-nosyl))、-OSO2Ph(Ph表示苯基)、苯氧基(-OPh)等。L2优选为卤素原子，更优选为氯原子。
卤素原子的实例包括氟原子、氯原子、溴原子和碘原子。
由式(I-1-A)表示的化合物的实例包括3-氯丙酰氯和3-溴丙酰氯。
由式(I-2-A)表示的化合物的实例包括2-氯丙酰氯和2-溴丙酰氯。
作为本发明的丙烯酰化试剂的另一个实施方式，可以使用由下式(I-1-B)、式(I-1-C)、式(I-2-B)或式(I-2-C)表示的化合物。由下式(I-1-B)、式(I-1-C)、式(I-2-B)或式(I-2-C)表示的化合物是酸酐。
Figure BDA0003144991910000121
其中各个L2相同或不同，并且各自表示离去基团。
L2的实例包括上述离去基团。L2优选为卤素原子，更优选为氯原子。
由式(I-1-B)表示的化合物的实例包括3-氯丙酸酐、3-溴丙酸酐、3-氯丙酸3-溴丙酸酐等。由式(I-1-B)表示的化合物优选为3-氯丙酸酐。
由式(I-1-C)表示的化合物的实例包括丙烯酸3-氯丙酸酐、丙烯酸3-溴丙酸酐等。由式(I-1-C)表示的化合物优选为丙烯酸3-氯丙酸酐。
由式(I-2-B)表示的化合物的实例包括2-氯丙酸酐、2-溴丙酸酐、2-氯丙酸2-溴丙酸酐等。由式(I-2-B)表示的化合物优选为2-氯丙酸酐。
由式(I-2-C)表示的化合物的实例包括丙烯酸2-氯丙酸酐、丙烯酸2-溴丙酸酐等。由式(I-2-C)表示的化合物优选为丙烯酸2-氯丙酸酐。
在本发明中，丙烯酰化试剂优选为式(I-1-A)或式(I-2-A)表示的化合物，更优选为式(I-1-A)表示的化合物，甚至更优选为3-氯丙酰氯。
在本发明中，相对于每摩尔当量化合物B或其盐，作为由式(I-1-A)、式(I-1-B)、式(I-1-C)、式(I-2-A)、式(I-2-B)或式(I-2-C)表示的化合物的丙烯酰化试剂的量为1.0～1.3摩尔当量，更优选为1.05～1.3摩尔当量，甚至更优选为1.1～1.2摩尔当量，特别优选为1.1摩尔当量。当使用含有氢氧根离子的碱时，相对于每摩尔当量化合物B或其盐，丙烯酰化试剂的用量可以不少于1.0摩尔当量；丙烯酰化试剂的用量优选为1.0～3.0摩尔当量，更优选为1.1～2.0摩尔当量，特别优选为1.1摩尔当量或1.8摩尔当量。在本发明的方法中，意在对每分子化合物B或其盐添加一个-C(＝O)-CH2-CH2-L2基团。因此，在本说明书中，例如，相对于每摩尔当量的化合物B或其盐使用1.0摩尔当量的式(I-1-A)表示的化合物、式(I-1-C)表示的化合物或式(I-2-C)表示的化合物是指相对于每摩尔化合物B或其盐使用1.0摩尔丙烯酰化试剂(每分子具有一个-C(＝O)-CH2-CH2-L2基团的丙烯酰化试剂)。此外，例如，相对于每摩尔当量的化合物B或其盐使用1.0摩尔当量的由式(I-1-B)表示的化合物或由式(I-2-B)表示的化合物是指相对于每摩尔化合物B或其盐使用0.5摩尔的丙烯酰化试剂(每分子具有两个-C(＝O)-CH2-CH2-L2基团的丙烯酰化试剂)。当这些丙烯酰化试剂组合使用时，将上述计算结合起来。
在本说明书中，“当量”是指摩尔当量，除非明确另有含义。
本发明中，由式(I-1-A)、式(I-1-B)、式(I-1-C)、式(I-2-A)、式(I-2-B)或式(I-2-C)表示的化合物可用作丙烯酰化试剂。因此，当使用由式(I-1-A)或式(I-2-A)表示的化合物时，反应在以下两个步骤中进行，并且可以制造化合物A或其药学上可接受的盐。
Figure BDA0003144991910000141
其中L1和L2同上。
当由化合物B或其盐制造化合物A或其药学上可接受的盐时，得到由式(A-1)或式(A-2)表示的化合物或其盐作为中间体。在本发明中，可以从这些中间体中除去L2以制造化合物A而无需分离中间体。
例如，当使用3-氯丙酰氯作为由式(I-1-A)表示的化合物时，式(A-1)表示的化合物为(S)-1-(3-(4-氨基-3-((3,5-二甲氧基苯基)乙炔基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)吡咯烷-1-基)-3-氯丙-1-酮(以下可称为“A-1-3CP化合物”)。
Figure BDA0003144991910000151
当使用2-氯丙酰氯作为由式(I-2-A)表示的化合物时，作为中间体的式(A-2)表示的化合物为1-((S)-3-(4-氨基-3-((3,5-二甲氧基苯基)乙炔基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)吡咯烷-1-基)-2-氯丙-1-酮(以下可称为“A-1-2CP化合物”)。
Figure BDA0003144991910000152
化合物B或其盐和由式(A-1)或式(A-2)表示的化合物或其盐可用于确认当自化合物B衍生化合物A时反应是否已进行。此外由于这些化合物或其盐可能作为杂质包含在化合物A的原料药和/或药物制剂中，因此它们也可用于确定杂质的存在。
在将化合物A用作药品的情况下，关于可作为杂质包含在药品的原料药和/或药物制剂中的化合物的量的指南在人用药品技术要求国际协调委员会(InternationalCouncil for Harmonisation of Technical Requirements for Pharmaceuticals forHuman Use)的ICH-Q3指南中指出。
当丙烯酰氯用于由化合物B或其盐制造化合物A或其药学上可接受的盐时，(S)-N-(1-(1-丙烯酰基吡咯烷-3-基)-3-((3,5-二甲氧基苯基)乙炔基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-基)丙烯酰胺(下文中可称为“二酰胺化合物”)可包含在制造的化合物A(化合物A的原料药)中。
Figure BDA0003144991910000161
本发明人为了除去二酰胺化合物或抑制二酰胺化合物的形成，尝试了少量使用丙烯酰氯的方法，发现用该方法，化合物B残留，导致产率下降。本发明人还尝试了通过调节pH来分解二酰胺的方法，发现用该方法，由于步骤数增加而不能高效地大量制造化合物A，并且进一步地，化合物A也被分解，导致产率下降。此外，虽然检查了结晶条件，但难以高效地移除二酰胺化合物。鉴于此，认为在通过使用丙烯酰氯制造化合物A的方法中，难以在保持作为药品的质量的同时大量制造化合物A。
另外，当使用式(I-1-A)、式(I-1-B)、式(I-1-C)、式(I-2-A)、式(I-2-B)或式(I-2-C)表示的化合物作为丙烯酰化试剂由化合物B或其盐衍生式(A-1)或式(A-2)表示的化合物或其盐时，可以经由式(A-1-二酰胺)或式(A-2-二酰胺)表示的化合物获得二酰胺化合物作为副产物，如下所示。
Figure BDA0003144991910000171
其中L1和L2同上。
二酰胺或式(A-1-二酰胺)或式(A-2-二酰胺)表示的化合物可用于测定化合物A或其药学上可接受的盐、式(A-1)的化合物或其盐、或式(A-1)的化合物或其盐中所含杂质的存在。
例如，当由式(I-1-A)、式(I-1-B)、式(I-1-C)、式(I-2-A)、式(I-2-B)或式(I-2-C)表示的化合物中的L1和L2为氯时，式(A-1-二酰胺)为(S)-3-氯-N-(1-(1-(3-氯丙酰基)吡咯烷-3-基)-3-((3,5-二甲氧基苯基)乙炔基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-基)丙酰胺(下文中可称为“3CP二酰胺”)。
Figure BDA0003144991910000181
当由式(I-1-A)、式(I-1-B)、式(I-1-C)、式(I-2-A)、式(I-2-B)或式(I-2-C)表示的化合物中的L1和L2为氯时，式(A-2-二酰胺)为2-氯-N-(1-((3S)-1-(2-氯丙酰基)吡咯烷-3-基)-3-((3,5-二甲氧基苯基)乙炔基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-基)丙酰胺(下文中可称为“2CP二酰胺”)。
Figure BDA0003144991910000182
在本发明中，当自化合物B衍生式(A-1)或式(A-2)表示的化合物或其盐作为中间体时，它可以在碱(例如，碱的量至少与化合物B的量相当)的存在下衍生。此外，当自这些中间体衍生化合物A时，它可以在碱(例如，碱的量至少与中间体的量相当)的存在下衍生。当两个步骤都在碱存在下进行时，这两个步骤中的碱可以彼此相同或不同。
当自化合物B或其盐衍生由式(A-1)或式(A-2)表示的化合物或其盐时可以使用的碱的实例包括有机胺碱如三甲胺、三乙胺、二异丙基乙胺、N-甲基吗啉、二氮杂双环十一烯(DBU)、二氮杂双环壬烯(DBN)、吡啶和4-二甲氨基吡啶(DMAP)；无机碱如氢氧化锂、氢氧化钠、氢氧化镁、氢氧化钾、氢氧化钙、氢氧化铯、醋酸锂、醋酸钠、醋酸镁、醋酸钾、醋酸钙、醋酸铯、碳酸锂、碳酸钠、碳酸镁、碳酸钾、碳酸钙、碳酸铯、碳酸氢锂、碳酸氢钠、碳酸氢钾、碳酸氢铯、磷酸锂、磷酸钠、磷酸镁、磷酸钾、磷酸钙、磷酸铯；等等。优选有机胺碱或无机碱，更优选含有氢氧根离子的碱，甚至更优选含有碱金属离子(例如钠离子或钾离子)和氢氧根离子的碱，并且甚至更优选氢氧化钠或氢氧化钾。这些碱可以单独使用或以两种或更多种的组合使用。
当从由式(A-1)或式(A-2)表示的化合物中除去L2以获得化合物A时可以使用的碱的实例包括上述碱。优选无机碱，更优选含有氢氧根离子的碱，甚至更优选含有碱金属离子(例如钠离子或钾离子)和氢氧根离子的碱，甚至更优选氢氧化钠或氢氧化钾。
上述碱大致分为一价碱、二价碱或三价碱。一价碱是每分子可以接受一个质子的碱，实例包括三乙胺、二异丙基乙胺、氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸氢钠等。二价碱是每分子可以接受两个质子的碱，实例包括碳酸钠等。三价碱是每分子可以接受三个质子的碱，实例包括磷酸钾等。
在本发明中，当使用一价碱由化合物B或其盐衍生由式(A-1)或式(A-2)表示的化合物或其盐时，碱的量在减去用化合物B的酸加成盐中和的当量后，相对于每当量的化合物B或其盐，即相对于游离形式的化合物B，优选为0.5～10当量，更优选为1～10当量，甚至更优选为1～5当量，还甚至更优选为1～3当量，进一步更优选为1～2当量，特别优选为1.1当量或1.9当量。当使用一价碱时，从由式(A-1)或式(A-2)表示的化合物或其盐中除去L2以得到化合物A或其药学上可接受的盐中所使用的碱的量，相对于每当量化合物B或其盐，即相对于游离形式的化合物B，优选为1～10当量，更优选为1～5当量，甚至更优选为3～4当量，并且特别优选为3.4当量或3.6当量。类似地，对于二价碱和三价碱，可在考虑化合价的情况下根据上述计算最佳当量。
在本发明中，当使用一价碱从由式(A-1)或式(A-2)表示的化合物或其盐中除去L2以获得化合物A或其药学上可接受的盐时，所用的碱的量在减去用式(A-1)或式(A-2)表示的化合物的酸加成盐中和的当量后，相对于每当量的由式(A-1)或式(A-2)表示的化合物或其盐，即相对于游离形式的由式(A-1)或式(A-2)表示的化合物，可以为1～5当量。当不分离由式(A-1)或式(A-2)表示的化合物而进行上述操作时，碱的量相对于游离形式的由式(A-1)或式(A-2)表示的化合物的理论产量(即游离形式的化合物B的量)可以为1～10当量。类似地，对于二价碱和三价碱，可在考虑化合价的情况下根据上述计算最佳当量。
在本发明中，当自化合物B或其盐衍生由式(A-1)或式(A-2)表示的化合物或其盐时使用的溶剂没有特别限定，只要它不干扰化合物B与丙烯酰化试剂的结合即可。溶剂的实例包括乙腈、水、N-甲基-2-吡咯烷酮、四氢呋喃、丙酮、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、N,N-二甲基乙酰胺、二甲亚砜(DMSO)、1,4-二噁烷及其混合物。优选乙腈、水或其混合物。溶剂的体积没有特别限定，溶剂的量相对于每1重量份的化合物B或其盐，优选为1～50倍体积(v/w)，更优选为2～30倍体积(v/w)，甚至更优选为10～20倍体积(v/w)，特别优选为12倍体积(v/w)或14倍体积(v/w)。当使用溶剂的混合物时，每种溶剂的比例没有特别限定。例如，当使用乙腈和水的混合物时，各溶剂的比例没有特别限定，水的量相对于每1体积的乙腈，优选为0.1～2倍体积(v/v)，更优选为0.1～1倍体积(v/v)，甚至更优选为0.5～1倍体积(v/v)，特别优选为0.5倍体积(v/v)或1倍体积(v/v)。
当从由式(A-1)或式(A-2)表示的化合物或其盐中除去L2以获得化合物A或其药学上可接受的盐时可以使用的溶剂的实例包括与上述相同的溶剂。此外，在不分离由式(A-1)或式(A-2)表示的化合物或其盐的情况下进行该操作时可以使用的溶剂的实例也包括与上述相同的溶剂。
在本发明中，当自化合物B或其盐衍生由式(A-1)或式(A-2)表示的化合物或其盐时所使用的溶剂的温度没有特别限定，只要它介于溶剂的熔点和沸点之间并且在化合物B可以稳定存在的范围内即可，优选为0～50℃，更优选为25～35℃。
从由式(A-1)或式(A-2)表示的化合物或其盐中除去L2以获得化合物A或其药学上可接受的盐时使用的温度例如在与上述相同的范围内。
在本发明中，可以使用由下式(I-1-D)或式(I-2-D)表示的羧酸作为从化合物B或其盐衍生由式(A-1)或式(A-2)表示的化合物或其盐的方式。
Figure BDA0003144991910000211
其中L1和L2同上。
在这种情况下，可由化合物B或其盐衍生由式(A-1)或式(A-2)表示的化合物或其盐的步骤如下所示。
Figure BDA0003144991910000221
其中L1和L2同上。
由于该步骤是化合物B与式(I-1-D)或式(I-2-D)的羧酸的缩合，因此可以使用缩合剂。缩合剂的实例包括二环己基碳二亚胺(DCC)、二异丙基碳二亚胺(DIC)、1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC、WSCI)、苯并三唑-1-基氧基-三-(二甲氨基)鏻六氟磷酸盐(BOP)、苯并三唑-1-基氧基-三-吡咯烷子基-鏻六氟磷酸盐(PyBOP)、(2-(7-氮杂-1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3,-四甲基脲六氟磷酸盐(HATU)、O-(1H-苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲鎓六氟磷酸盐(HBTU)、羰基二咪唑(CDI)、4-(4,6-二甲氧基-(1,3,5)三嗪-2-基)-4-甲基吗啉鎓氯化物(DMT-MM)等。
在该步骤中可加入对硝基苯酚、五氟苯酚、2,4,5-三氯苯酚、1-羟基苯并三唑(HOBt)、1-羟基-7-氮杂苯并三唑(HOAt)、N-羟基琥珀酰亚胺(HOSu)等，以便将羧酸转化为活化的酯。
此外，在该步骤中，可以适当地使用上面列出的碱。
在本发明中，从化合物B或其盐衍生由式(A-1)或式(A-2)表示的化合物或其盐和从由式(A-1)或式(A-2)表示的化合物或其盐中除去L2以得到化合物A或其药学上可接受的盐的反应可通过使用例如色谱如高效液相色谱(下文中可称为“HPLC”)和薄层色谱(TLC)确认。在使用HPLC的情况下，当化合物B的峰面积为总峰面积的1％以下时，可以确定从化合物B或其盐衍生由式(A-1)或式(A-2)表示的化合物或其盐的步骤完成。此外，当由式(A-1)或式(A-2)表示的化合物的峰面积为总峰面积的1％以下时，可以确定从由式(A-1)或式(A-2)表示的化合物或其盐中除去L2以得到化合物A的步骤完成。HPLC的测定条件没有特别限定，只要能够检测化合物A、化合物B、由式(A-1)或式(A-2)表示的化合物即可。
此外，在使用HPLC来确认从化合物B或其盐衍生由式(A-1)或式(A-2)表示的化合物或其盐的反应的情况下，当由式(A-1-二酰胺)表示的杂质和3CP二酰胺或由式(A-2-二酰胺)表示的杂质和2CP二酰胺的峰面积为总峰面积的2％以下时，二酰胺化合物不太可能包含在化合物A或其药学上可接受的盐中。
在本发明中，当分离由式(A-1)或式(A-2)表示的化合物或其盐时，这些化合物可以通过例如重结晶的方法纯化或可以用于下一步而不经纯化。此外，在完成从由式(A-1)或式(A-2)表示的化合物或其盐中除去L2以得到化合物A或其药学上可接受的盐的操作后，可以对化合物A或其药学上可接受的盐进行纯化。作为纯化方法，从本发明用于大量制造的观点来看，优选使用结晶，而不通过柱色谱进行纯化。
在本发明中，当溶解在反应溶剂中的化合物A或其药学上可接受的盐结晶时，例如，可以加入化合物A或其药学上可接受的盐在其中具有低溶解度的溶剂。添加的溶剂的实例包括水等。溶剂的加入量没有特别限定，只要化合物A或其药学上可接受的盐析出即可，且相对于反应溶剂的体积优选为0.5～5倍体积(v/v)，更优选为1～3倍体积(v/v)，甚至更优选为1～2倍体积(v/v)，并且特别优选为1.1倍体积(v/v)或1.8倍体积(v/v)。当不分离由式(A-1)或式(A-2)表示的化合物或其盐而由化合物B或其盐制造化合物A或其药学上可接受的盐时，溶剂的加入量相对于化合物B或其盐的重量，为5～50倍体积(v/w)，优选为10～40倍体积(v/w)，更优选为15～30倍体积(v/w)，特别优选为15倍体积(v/w)或22倍体积(v/w)。
在本发明中，进行结晶的温度没有特别限定，只要在加入上述溶剂后化合物A或其药学上可接受的盐析出即可，优选为0～40℃，更优选为20～30℃。
另外，在本发明中，结晶所需的时间例如为1小时以上，优选为2～72小时。
在本发明中，化合物A或其药学上可接受的盐可以通过结晶和过滤分离为固体。由于化合物A或其药学上可接受的盐用作药品，因此过滤所需的时间优选较短以高效地大量制造。由于过滤性的好坏不能根据过滤时间、过滤速度等的绝对值来判断，所以通过比较工艺条件来相对判断。因此，使过滤面积、过滤所用的滤纸和抽吸过程中的压力统一以进行比较。没有颗粒因大尺寸析出而造成的滤纸堵塞、过滤的溶剂量小等是可以确定过滤性优异的因素。
在本发明中，在将式(I-1-A)或式(I-2-A)的化合物用于从化合物B或其盐制造化合物A或其药学上可接受的盐而不分离由式(A-1)或式(A-2)表示的化合物或其盐时，相比于在使用丙烯酰氯时，化合物A或其药学上可接受的盐的过滤性更好。这在制造化合物A或其盐时是无法预料的。在本发明中，在过滤性方面可以使用的由式(I-1-A)或式(I-2-A)表示的化合物没有特别限定，只要与使用丙烯酰氯的情况相比提高过滤性即可，优选为由式(I-1-A)表示的化合物，更优选为3-氯丙酰氯。
由此获得的由式(A-1)或式(A-2)表示的化合物或其盐以及化合物A或其药学上可接受的盐可以通过各种定量分析和定性分析进行分析。
在本发明中，作为一个实施方式，可以使用用于制造由式(A-1)表示的化合物或其盐的方法，该方法包括使1当量的化合物B或其盐与1.0～1.3当量的由式(I-1-A)表示的化合物进行反应。
优选地，该方法用于制造式(A-1)表示的化合物或其盐，其包括使1当量的化合物B或其盐与1.0～1.3当量的由式(I-1-A)表示的化合物进行反应，其中L1和L2相同或不同，且各自选自卤素原子。
更优选地，该方法用于制造由式(A-1)表示的化合物或其盐，其包括使1当量的化合物B或其盐与1.0～1.3当量的3-氯丙酰氯进行反应。
更优选地，该方法用于制造由式(A-1)表示的化合物或其盐，其包括使1当量的化合物B或其盐与1.0～1.3当量的3-氯丙酰氯在至少一种选自有机胺碱和无机碱的碱存在下进行反应。
更优选地，该方法用于制造由式(A-1)表示的化合物或其盐，其包括使1当量的化合物B或其盐与1.0～1.3当量的3-氯丙酰氯在至少一种选自有机胺碱和含有氢氧根离子的碱的碱存在下进行反应。
更优选地，该方法用于制造由式(A-1)表示的化合物或其盐，其包括使1当量的化合物B或其盐与1.0～1.3当量的3-氯丙酰氯在至少一种选自有机胺碱和含有氢氧根离子的碱的碱存在下进行反应，碱的量在减去用化合物B或其盐的酸加成盐中和的当量后为1.0～10当量。
更优选地，该方法用于制造由式(A-1)表示的化合物或其盐，其包括使1当量的化合物B或其盐与1.0～1.3当量的3-氯丙酰氯在至少一种选自有机胺碱和含有碱金属离子和氢氧根离子的碱的碱存在下进行反应，碱的量在减去用化合物B或其盐的酸加成盐中和的当量后为0.5～10当量。
更优选地，该方法用于制造由式(A-1)表示的化合物或其盐，其包括使1当量的化合物B或其盐与1.0～1.3当量的3-氯丙酰氯在至少一种选自二异丙基乙胺、氢氧化钠和氢氧化钾的碱存在下进行反应，碱的量在减去用化合物B或其盐的酸加成盐中和的当量后为0.5～10当量。
更优选地，该方法用于制造由式(A-1)表示的化合物或其盐，其包括使1当量的化合物B或其盐与1.05～1.2当量的3-氯丙酰氯在至少一种选自二异丙基乙胺、氢氧化钠和氢氧化钾的碱存在下进行反应，碱的量在减去用化合物B或其盐的酸加成盐中和的当量后为0.5～10当量。
特别优选地，该方法用于制造由式(A-1)表示的化合物或其盐，其包括使1当量的化合物B或其盐与1.1当量的3-氯丙酰氯在氢氧化钠存在下进行反应，氢氧化钠的量在减去用化合物B或其盐的酸加成盐中和的当量后为1.1当量。
在本发明中，作为另一个实施方式，可以使用用于制造由式(A-1)表示的化合物或其盐的方法，该方法包括使化合物B或其盐与由式(I-1-A)表示的化合物在含有氢氧根离子的碱存在下进行反应。
优选地，该方法用于制造由式(A-1)表示的化合物或其盐，其包括使化合物B或其盐与由其中L1和L2相同或不同并且各自是卤素原子的式(I-1-A)表示的化合物在含有氢氧根离子的碱存在下进行反应。
更优选地，该方法用于制造由式(A-1)表示的化合物或其盐，其包括使化合物B或其盐与3-氯丙酰氯在含有氢氧根离子的碱的存在下进行反应。
更优选地，该方法用于制造由式(A-1)表示的化合物或其盐，其包括使1当量的化合物B或其盐与3-氯丙酰氯在含有氢氧根离子的碱存在下进行反应，碱的量在减去用化合物B或其盐的酸加成盐中和的当量后为0.5～10当量。
更优选地，该方法用于制造由式(A-1)表示的化合物或其盐，其包括使1当量的化合物B或其盐与3-氯丙酰氯在含有碱金属离子和氢氧根离子的碱的存在下进行反应，碱的量在减去用化合物B或其盐的酸加成盐中和的当量后为0.5～10当量。
更优选地，该方法用于制造由式(A-1)表示的化合物或其盐，其包括使1当量的化合物B或其盐与3-氯丙酰氯在至少一种选自氢氧化钠和氢氧化钾的碱的存在下进行反应，碱的量在减去用化合物B或其盐的酸加成盐中和的当量后为0.5～10当量。
更优选地，该方法用于制造由式(A-1)表示的化合物或其盐，其包括使1当量的化合物B或其盐与3-氯丙酰氯在至少一种选自氢氧化钠和氢氧化钾的碱的存在下进行反应，碱的量在减去用化合物B或其盐的酸加成盐中和的当量后为1.0～5当量。
特别优选地，该方法用于制造由式(A-1)表示的化合物或其盐，其包括使1当量的化合物B或其盐与1.8当量的3-氯丙酰氯在至少一种选自氢氧化钠和氢氧化钾的碱的存在下进行反应，碱的量在减去用化合物B或其盐的酸加成盐中和的当量后为3.5当量。
根据上述方法制造的化合物A可能含有各种杂质。特别地，当使用3-氯丙酰氯由化合物B制造化合物A时，化合物A可能包含以下相关物质。
表1
Figure BDA0003144991910000271
表2
Figure BDA0003144991910000281
表3
Figure BDA0003144991910000291
相关物质1为上述二酰胺化合物。
相关物质2为上述A-1-3CP化合物。
相关物质3为上述化合物B。
相关物质4为(S)-3-((1-(1-丙烯酰基吡咯烷-3-基)-6-((3,5-二甲氧基苯基)乙炔基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-基)氨基)丙酸(下文中可称为“CE化合物”)。
相关物质5为(S)-1-(3-(4-氨基-3-((3,5-二甲氧基苯基)乙炔基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)吡咯烷-1-基)-3-羟基丙-1-酮(以下可称为“OH化合物”)。这是A-1-3CP化合物的氯被羟基替代的化合物。
相关物质6为(S)-8-(1-丙烯酰基吡咯烷-3-基)-10-((3,5-二甲氧基苯基)乙炔基)-3,4-二氢吡唑并[4,3-e]嘧啶并[1,2-c]嘧啶-2(8H)-酮(以下可称为“CDA1化合物”)。这是相关物质1中吡唑并[3,4-d]嘧啶的4位丙烯酰胺和5位氮形成环的化合物。
相关物质7为(S)-3-(4-氨基-3-((3,5-二甲氧基苯基)乙炔基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)吡咯烷-1-甲醛(以下可称为“CHO化合物”)。这是化合物A的丙烯酰基被甲酰基替代的化合物。
相关物质8为1,3-双((S)-3-(4-氨基-3-((3,5-二甲氧基苯基)乙炔基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)吡咯烷-1-基)丙-1-酮(以下可称为“MA化合物”)。这是化合物B的吡咯烷部分与化合物A的丙烯酰基结合的化合物。
相关物质9为1-((S)-3-(4-((3-((S)-3-(4-氨基-3-((3,5-二甲氧基苯基)乙炔基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)吡咯烷-1-基)-3-氧代丙基)氨基)-3-(((3,5-二甲氧基苯基)乙炔基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)吡咯烷-1-基)丙-2-烯-1-酮(下文中可称为“二聚体化合物”)。这是化合物B的氨基的氮与化合物A的丙烯酰基结合的化合物。
相关物质10为(S)-1-(1-丙烯酰基吡咯烷-3-基)-5-氨基-3-((3,5-二甲氧基苯基)乙炔基)-1H-吡唑-4-甲腈(以下可称为“UK化合物”)。这是化合物A的嘧啶部分是开环的化合物。
本发明还包括相关物质的盐等。相关物质或其盐可以是溶剂化物(例如，水合物)或非溶剂化物。在本发明中，任何这样的形式都包括在“化合物或其盐”的范围内。化合物的盐没有特别限定，其实例包括与无机酸如盐酸、氢溴酸、氢碘酸、氢氟酸和硫酸的加成盐；与烷基硫酸如甲磺酸、对甲苯磺酸和苯磺酸的加成盐；与有机酸如乙酸、柠檬酸、酒石酸和马来酸的加成盐；与碱金属如钾和钠的盐；与碱土金属如钙和镁的盐；与有机碱的盐，如铵盐、乙胺盐和精氨酸盐；等等。在本说明书中，术语“相关物质1”、“相关物质2”、……“相关物质10”可以旨在包括相关物质的“盐”和“溶剂化物”。
本发明还包括一种或更多种上述相关物质和/或一种或更多种相关物质的盐的组合。该组合包括相关物质及其盐中的两种或更多种。该组合包括以下所有情况：该组合由两种或更多种相关物质组成的情况，该组合由一种或更多种相关物质和一种或更多种相关物质的盐组成的情况，以及该组合由两种或多种相关物质的盐组成的情况。该组合可包括任何一种相关物质和相关物质的盐。
在本发明中，标准品是指用于药品的药物制剂和/或原料药的定量或定性评价的标准品。本发明中的相关物质或其盐可以通过在HPLC测定中检查每种相关物质的保留时间等，在含有化合物A的药物制剂和/或原料药的稳定性测试、对其制造工艺进行工艺检查等中用作用于控制质量的标准品。
可用于质量控制的相关物质的实例包括作为起始材料和/或中间体的化合物、作为原料药制造中的副产品的化合物、从原料药制造药物制剂时形成的化合物，等等。然而，可用于质量控制的相关物质不受特别限定，只要它们是可包含在实际制造的原料药和/或药物制剂中的化合物即可。在原料药的制造中，这种相关物质不仅包括原料药中实际含有的化合物，还包括原料药纯化过程中移除的化合物。
因此，在本发明中，上述相关物质可用于化合物A的原料药和含有化合物A或其盐的药物组合物(例如，药物制剂)的质量控制(例如，用于管理(调整)相关物质的量)。此外，根据本发明，相关物质还可以用作检测含有化合物A的样品中杂质的标准品。此外，本发明可以提供一种制造相关物质的方法，该方法包括从含有化合物A的样品中分离相关物质。本发明还可以提供一种分析化合物A的方法。在本发明中，分析化合物A不仅指分析含有化合物A的样品中是否含有化合物A，还指分析样品是否含有化合物A的相关物质，并且若检测到相关物质，则测定其含量。
本发明中使用的HPLC系统通常可以是市售的HPLC系统。HPLC系统至少包括分离柱和检测器。
在本发明中，通过HPLC测量的峰分离度Rs表示色谱图中峰的保留时间与峰的宽度之间的关系，并使用下式计算。
Rs＝1.18×(tR2-tR1)/(W0.5h1+W0.5h2)
tR1和tR2：用于分离度测量的两种物质的保留时间，条件是tR1<tR2
W0.5h1和W0.5h2：峰半高处的峰宽
需要注意的是，tR1、tR2、W0.5h1和W0.5h2使用相同的单位。
日本药典规定，当分离度为1.5以上时，峰完全分离。同样在本发明中，1.5以上的分离度可以用作指标。
在本发明中，用于HPLC的测量条件没有特别限定，只要相关物质1至10之一与化合物A之间的分离度为1.5以上。优选地，相关物质8(MA化合物)、相关物质9(二聚体化合物)与化合物A之间的分离度为1.5以上。更优选地，相关物质8(MA化合物)、相关物质9(二聚体化合物)、相关物质4(CE化合物)、相关物质5(OH化合物)、相关物质7(CHO化合物)与化合物A之间的分离度为1.5以上。甚至更优选地，相关物质3(化合物B)、相关物质4(CE化合物)、相关物质5(OH化合物)、相关物质6(CDA1化合物)、相关物质7(CHO化合物)、相关物质2(A-1-3CP化合物)、相关物质8(MA化合物)、相关物质9(二聚体化合物)与化合物A之间的分离度为1.5以上。
在本发明中，可以适当地设置用于HPLC的测量条件，例如流动相梯度、硅胶柱、测量样品的进样量、流动相清洁剂的存在与否、测量波长、柱温、流动相流速和HPLC系统的混合器体积。
已知的用于HPLC的柱包括：正相柱，其中将有机相用作流动相以根据化合物极性分离化合物，以及反相柱，其中将水相用作流动相以分离化合物。在本发明中，就化合物A的性质而言，使用反相柱的反相色谱是优选的。
通常，在HPLC测量中，将测量样品注入(引入)流动相并且检测器中的检测开始的时间定义为测量的起始时间点。下面，在本发明中，可以参考测量的起始时间点来定义HPLC测量期间的时间点。
可用于本发明的HPLC分离柱选自硅胶柱、含有表面用十八烷基甲硅烷基改性的硅胶的柱(ODS柱或C18柱)、含有表面用辛基改性的硅胶的柱(C8柱)、含有表面用氰丙基改性的硅胶的柱(CN柱)、含有表面用苯乙基改性的硅胶的柱(Ph柱)、含有表面用氨基丙基改性的硅胶的柱(NH柱)、含有表面用二羟丙基改性的硅胶的柱(Diol柱)、填充有各种聚合物的柱(聚合物柱)、填充有离子交换树脂的柱(离子交换柱)等。在本发明中，ODS柱是优选的。
可以使用具有不同硅胶粒径、不同孔径、不同十八烷基甲硅烷基结合类型、不同十八烷基甲硅烷基取代程度等的各种类型的ODS柱。在本发明中，使用高纯度硅胶，优选使用将十八烷基化后获得的残留硅烷醇用低分子甲硅烷基化试剂处理的ODS柱(封端ODS柱)。
可以使用具有不同硅胶粒径、不同孔径、不同十八烷基甲硅烷基结合类型、不同十八烷基甲硅烷基取代程度等的各种类型的ODS柱。硅胶优选具有例如3μm的平均粒径。硅胶的平均粒径可以通过例如激光衍射法测量。
硅胶优选具有例如10～12nm的平均孔径。硅胶的平均孔径可通过例如气体吸附法测量。
硅胶中十八烷基甲硅烷基的结合类型优选为例如单体或聚合的。
十八烷基甲硅烷基的取代程度可以通过各种方法测量。硅胶中的碳含量优选为例如14％以上。
硅胶中的碳含量优选为例如20％以下。硅胶中的碳含量可以通过各种方法测量。
在本发明中，将有机相和水相的混合物用作HPLC的流动相。
HPLC的流动相中使用的有机相是主要含有有机溶剂的液体介质。有机溶剂的实例包括非极性溶剂，例如己烷、环己烷、庚烷、乙醚、四氢呋喃、氯仿和二氯甲烷；质子惰性极性溶剂，如丙酮、二甲亚砜和乙腈；醋酸；甲醇；乙醇；异丙醇；乙腈；等等。这些有机溶剂可以单独使用或以两种或更多种的组合(例如，溶剂的混合物)使用。本发明有机相中所含的有机溶剂优选为甲醇或乙腈，更优选为乙腈。
有机相可以含有20体积％以下的水。水的量优选为整个有机相的10体积％以下，更优选为5体积％以下，并且特别优选为1体积％以下。
HPLC的流动相中使用的水相是主要含有水的液体介质。包含在水相中的所有液体可以是水。水相可以含有50体积％以下的有机溶剂。在这种情况下使用的有机溶剂没有特别限定，只要它可以与水均匀混合即可。有机溶剂的实例包括丙酮、二甲亚砜、乙腈、甲酸、乙酸、甲醇、乙醇、异丙醇等。有机溶剂优选为乙腈或甲醇，更优选为乙腈。水相中包含的有机溶剂的量为整个水相的50体积％以下。有机溶剂的量优选为整个水相的30体积％以下，更优选为5～30体积％。
HPLC的流动相中的pH没有特别限定，只要可以检测上述相关物质并可以计算其含量即可。HPLC的流动相中的pH优选为6.9～7.1之外的pH。HPLC的流动相中的pH更优选为6.1～6.8和7.2～7.5，甚至更优选为6.4～6.8，特别优选为6.6。HPLC的流动相中的pH可以通过添加如下所述的缓冲液来调节。
可以向HPLC的流动相中加入缓冲液，以减少pH对测量的影响并提高重现性。例如，可以添加作为缓冲液的乙酸或其盐、柠檬酸或其盐、酒石酸或其盐、以及磷酸或其盐。乙酸或其盐的实例包括乙酸和乙酸钠。柠檬酸或其盐的实例包括柠檬酸、柠檬酸一钠、柠檬酸二钠和柠檬酸三钠。酒石酸或其盐的实例包括酒石酸和酒石酸钠。磷酸或其盐的实例包括磷酸、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾和磷酸氢二钾。作为本发明中的缓冲液，从待测量物质的性质和由测量得到的峰的形状以及测量的重现性来看，优选磷酸和磷酸盐，更优选磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾和磷酸氢二钾，特别优选磷酸二氢钾。这些缓冲液可以单独使用，或两种以上组合使用。
可以将缓冲液加入到水相和有机相。优选地，将缓冲液加入水相。
本发明中可以使用的缓冲液的浓度可以在HPLC测量过程中缓冲液不发生沉淀的浓度范围内适当调整。缓冲液的浓度优选为5～10mM。
通常，在HPLC测量中，可以通过改变流动相中有机相和水相的混合物的组成来适当地分离目标相关物质。这样做时，可以通过将流动相中混合物各组分的比例保持恒定(等度)或连续改变组成(梯度)来测量上述相关物质。
在反相色谱中，流动相中有机相和水相的混合物组成的变化通常绘制在二维图上，其中纵轴表示有机相在整个流动相中的百分比(％)，横轴表示测量时间(分钟)。也就是，当流动相的组成在等度条件下时，图形由斜率为0的线性函数表示；当流动相的组成处于有机相百分比以恒定增加速率随时间增加的梯度条件下时，图形由具有正斜率的线性函数表示；且当流动相的组成处于有机相百分比以恒定下降速率随时间下降的梯度条件下时，图形由具有负斜率的线性函数表示。通过组合这些，低极性的相关物质也可以被高效地洗脱并以较短的保留时间进行测量，同时保持峰的分离度。流动相中有机相的增加速率，即上述线性函数的斜率，例如可以表示为单位时间有机相的增加速率，可以如下计算。
单位时间有机相的增加速率＝((梯度的终止时间点处流动相中有机相的百分比)-(梯度的起始时间点处流动相中有机相的百分比))÷(梯度的起始时间点与终止时间点之间的时间长度)
例如，当测量起始时间点处(0分钟)有机相的百分比为流动相的10体积％，且有机相的百分比连续增加并在测量开始后10分钟达到流动相的30体积％时，每单位时间有机相的增加速率表示为2体积％/分钟。
在本发明中，流动相的组成和流动相的变化的有无没有特别限定，只要能够测量上述相关物质即可。本发明的一优选实施方式包括三个梯度，其中流动相中有机相的百分比随时间增加。这三个梯度在下面可以被称为“第一梯度”、“第二梯度”和“第三梯度”，以便从最接近测量起始时间点的一个开始。
下面描述本发明的一个优选实施方式中的第一梯度、第二梯度和第三梯度。
第一梯度中有机相的增加速率为0.7～2.0体积％/分钟，优选为0.7～1.5体积％/分钟，更优选为0.7～1.3体积％/分钟，甚至更优选为1.0体积％/分钟。
第一梯度的起始时间点是测量起始时间点之后的0～5分钟，优选0～2分钟，并且更优选0～1分钟。第一梯度的起始时间点甚至更优选地是测量的起始时间点(测量的起始时间点之后0分钟)。
第一梯度的终止时间点是在第一梯度的起始时间点之后5～15分钟，优选7～12分钟，更优选10分钟。
有机相在第一梯度的起始时间点处的百分比为整个流动相的0～15质量％，优选0～10质量％，更优选0～5质量％，特别优选0质量％。
有机相在第一梯度的终止时间点处的百分比为整个流动相的5～15质量％，优选7～12质量％，特别优选10质量％。
第二梯度中有机相的增加速率为0.3～2.0体积％/分钟，优选为0.3～1.8体积％/分钟，更优选为0.7～1.8体积％/分钟，甚至更优选为1.3～1.4体积％/分钟。在另一个实施方式中，第二梯度中有机相的增加速率优选为0.5体积％/分钟。
第二梯度的起始时间点为第一梯度的终止时间点后0～10分钟，优选0～5分钟。第二梯度的起始时间点更优选是第一梯度的终止时间点(第一梯度的终止时间点之后的0分钟)。
第二梯度的终止时间点是在第二梯度的起始时间点之后10～20分钟，优选12～18分钟，更优选15分钟。在另一个实施方式中，第二梯度的终止时间点优选为第二梯度的起始时间点之后20分钟。
有机相在第二梯度的起始时间点处的百分比与有机相在第一梯度的终止时间点处的百分比相同。
有机相在第二梯度的终止时间点处的百分比为整个流动相的15～45质量％，优选为20～40质量％，更优选为28～38质量％，并且特别优选为30质量％。在另一个实施方式中，有机相在第二梯度的终止时间点处的百分比优选为20质量％。
第三梯度中有机相的增加速率为1.0～6.0体积％/分钟，优选为1.0～2.0体积％/分钟，更优选为1.0～1.5体积％/分钟，甚至更优选为1.3～1.4体积％/分钟。在另一个实施方式中，第三梯度中有机相的增加速率优选为5.0体积％/分钟。
第三梯度的起始时间点为第二梯度的终止时间点之后0～10分钟，优选0～5分钟。第三梯度的起始时间点更优选为第二梯度的终止时间点(第二梯度的终止时间点之后0分钟)。
第三梯度的终止时间点为第三梯度的起始时间点之后10～20分钟，优选13～18分钟，更优选15分钟。在另一个实施方式中，第三梯度的终止时间点优选为第三梯度的起始时间点之后10分钟。
有机相在第三梯度的起始时间点处的百分比与有机相在第二梯度的终止时间点处的百分比相同。
有机相在第三梯度的终止时间点处的百分比为整个流动相的45～75质量％，优选为45～70质量％，更优选为45～55质量％，并且特别优选为50质量％。在另一个实施方式中，有机相在第三梯度的终止时间点处的百分比优选为70质量％。
测量的起始时间点可以与第一梯度的起始时间点一致，也可以不一致。当测量的起始时间点与第一梯度的起始时间点不一致时，流动相在测量的起始时间点和第一梯度的起始时间点之间的时间期间可以是等度的。
当在第一梯度的终止时间点和第二梯度的起始时间点之间设置流动相为等度的时间段时，该时间段的长度大于0分钟且5分钟以下，优选大于0分钟且2分钟以下，更优选大于0分钟且1分钟以下。
第一梯度的终止时间点可以与第二梯度的起始时间点一致，也可以不一致。当第一梯度的终止时间点与第二梯度的起始时间点不一致时，流动相在第一梯度的终止时间点和第二梯度的起始时间点之间的时间期间可以是等度的。
当在第一梯度的终止时间点和第二梯度的起始时间点之间设置流动相为等度的时间段时，该时间段的长度大于0分钟且10分钟以下，并且优选大于0分钟且5分钟以下。
第二梯度的终止时间点可以与第三梯度的起始时间点一致，也可以不一致。当第二梯度的终止时间点与第三梯度的起始时间点不一致时，流动相在第二梯度的终止时间点和第三梯度的起始时间点之间的时间期间可以是等度的。
当在第二梯度的终止时间点和第三梯度的起始时间点之间设置流动相为等度的时间段时，该时间段的长度大于0分钟且10分钟以下，并且优选大于0分钟且5分钟以下。
测量的起始时间点和第一梯度的起始时间点可以一致，第一梯度的终止时间点和第二梯度的起始时间点可以一致，且第二梯度的终止时间点和第三个梯度的起始时间点可以一致。
在这样的实施方式中，第一梯度、第二梯度和第三梯度可以如下。
第一梯度的终止时间点是在测量的起始时间点之后5～15分钟，优选地7～12分钟，并且更优选地10分钟。
第二梯度的终止时间点是在测量的起始时间点之后20～35分钟，优选地22～28分钟，并且更优选地25分钟。在另一个实施方式中，第二梯度的终止时间点优选为测量的起始时间点之后30分钟。
第三梯度的终止时间点是测量的起始时间点之后35～50分钟，优选38～48分钟，并且更优选40分钟。
即使在这种情况下，也不排除在选自测量的起始时间点和第一梯度的起始时间点之间的时间、第一梯度的终止时间点和第二梯度的起始时间点之间的时间、和第二梯度的终止时间点和第三梯度的起始时间点之间的时间的至少一个时间期间设置流动相是等度的时间段。
在本发明中，第一梯度、第二梯度和第三梯度中有机相的增加速率可以全部相同、部分相同或彼此不同。在本发明的一个优选实施方式中，第二梯度中有机相的增加速率与第三梯度中有机相的增加速率相同。具有相同有机相增加速率的两个或三个梯度意味着如果在它们之间没有设置流动相等度的时间段，则这些梯度一起形成一个梯度。
本发明中用于HPLC测量的梯度的优选实施方式包括如上所述的第一至第三梯度。优选地，第一梯度中有机相的增加速率为0.7～2.0体积％/分钟，第一梯度的起始时间点为测量的起始时间点后0～5分钟，第一梯度的终止时间点为第一梯度的起始时间点后5～15分钟，第一梯度的起始时间点的有机相的百分比为整个流动相的0～15质量％，第一梯度的终止时间点的有机相的百分比为整个流动相的5～15质量％，第二梯度中有机相的增加速率为0.3～2.0体积％/分钟，第二梯度的起始时间点为第一梯度的终止时间点后0～10分钟，第二梯度的终止时间点为第二梯度的起始时间点后10～20分钟，第二梯度的起始时间点的有机相的百分比与第一梯度的终止时间点的有机相的百分比相同，第二梯度的终止时间点的有机相的百分比为整个流动相的15～45质量％，第三梯度中有机相的增加速率为1.0～6.0体积％/分钟，第三梯度的起始时间点为第二梯度的终止时间点后0～10分钟，第三梯度的终止时间点为第三梯度的起始时间点后10～20分钟，第三梯度的起始时间点的有机相的百分比与第二梯度的终止时间点的有机相的百分比相同，并且第三梯度的终止时间点的有机相的百分比为整个流动相的45～75质量％。
更优选地，第一梯度中有机相的增加速率为0.7～1.5体积％/分钟，第一梯度的起始时间点为测量的起始时间点后0～2分钟，第一梯度的终止时间点为第一梯度的起始时间点后7～12分钟，第一梯度的起始时间点的有机相的百分比为整个流动相的0～10质量％，第一梯度的终止时间点的有机相的百分比为整个流动相的7～12质量％，第二梯度中有机相的增加速率为0.3～2.0体积％/分钟，第二梯度的起始时间点为第一梯度的终止时间点后0～10分钟，第二梯度的终止时间点为第二梯度的起始时间点后10～20分钟，第二梯度的起始时间点的有机相的百分比与第一梯度的终止时间点的有机相的百分比相同，第二梯度的终止时间点的有机相的百分比为整个流动相的15～45质量％，第三梯度中有机相的增加速率为1.0～6.0体积％/分钟，第三梯度的起始时间点为第二梯度的终止时间点后0～10分钟，第三梯度的终止时间点为第三梯度的起始时间点后10～20分钟，第三梯度的起始时间点的有机相的百分比与第二梯度的终止时间点的有机相百分比相同，并且第三梯度的终止时间点的有机相的百分比为整个流动相的45～75质量％。
更优选地，第一梯度中有机相的增加速率为0.7～1.3体积％/分钟，第一梯度的起始时间点为测量的起始时间点后0～1分钟，第一梯度的终止时间点为第一梯度的起始时间点后10分钟，第一梯度的起始时间点的有机相的百分比为整个流动相的0～5质量％，第一梯度的终止时间点的有机相的百分比为整个流动相的10质量％，第二梯度中有机相的增加速率为0.3～2.0体积％/分钟，第二梯度的起始时间点为第一梯度的终止时间点后0～10分钟，第二梯度的终止时间点为第二梯度的起始时间点后10～20分钟，第二梯度的起始时间点的有机相的百分比与第一梯度的终止时间点的有机相的百分比相同，第二梯度的终止时间点的有机相的百分比为整个流动相的15～45质量％，第三梯度中有机相的增加速率为1.0～6.0体积％/分钟，第三梯度的起始时间点为第二梯度的终止时间点后0～10分钟，第三梯度的终止时间点为第三梯度的起始时间点后10～20分钟，第三梯度的起始时间点的有机相的百分比与第二梯度的终止时间点的有机相的百分比相同，并且第三梯度的终止时间点的有机相的百分比为整个流动相的45～75质量％。
更优选地，第一梯度中有机相的增加速率为1.0体积％/分钟，第一梯度的起始时间点为测量的起始时间点(测量的起始时间点后0分钟)，第一梯度的终止时间点为测量的起始时间点后10分钟，第一梯度的起始时间点的有机相的百分比为0质量％，第一梯度的终止时间点的有机相的百分比为10质量％，第二梯度中有机相的增加速率为0.3～1.8体积％/分钟，第二梯度的起始时间点为第一梯度的终止时间点后0～5分钟，第二梯度的终止时间点为第二梯度的起始时间点后12～18分钟，第二梯度的起始时间点的有机相的百分比与第一梯度的终止时间点的有机相的百分比相同，第二梯度的终止时间点的有机相的百分比为整个流动相的20～40质量％，第三梯度中有机相的增加速率为1.0～2.0体积％/分钟，第三梯度的起始时间点为第二梯度的终止时间点后0～5分钟，第三梯度的终止时间点为第三梯度的起始时间点后13～18分钟，第三梯度的起始时间点的有机相的百分比与第二梯度的终止时间点的有机相百分比相同，并且第三梯度的终止时间点的有机相的百分比为整个流动相的45～70质量％。
在另一个实施方式中，更优选地，第一梯度中有机相的增加速率为0.7～1.5体积％/分钟，第一梯度的起始时间点为测量的起始时间点后0～2分钟，第一梯度的终止时间点为第一梯度的起始时间点后7～12分钟，第一梯度的起始时间点的有机相的百分比为整个流动相的0～10质量％，第一梯度的终止时间点的有机相的百分比为整个流动相的7～12质量％，第二梯度中有机相的增加速率为0.3～1.8体积％/分钟，第二梯度的起始时间点为第一梯度的终止时间点后0～5分钟，第二梯度的终止时间点为第二梯度的起始时间点后12～18分钟，第二梯度的起始时间点的有机相的百分比与第一梯度的终止时间点的有机相的百分比相同，第二梯度的终止时间点的有机相的百分比为整个流动相的20～40质量％，第三梯度中有机相的增加速率为1.0～2.0体积％/分钟，第三梯度的起始时间点为第二梯度的终止时间点后0～5分钟，第三梯度的终止时间点为第三梯度的起始时间点后13～18分钟，第三梯度的起始时间点的有机相的百分比与第二梯度的终止时间点的有机相的百分比相同，并且第三梯度的终止时间点的有机相的百分比为整个流动相的45～70质量％。
在另一个实施方式中，更优选地，第一梯度中有机相的增加速率为0.7～1.3体积％/分钟，第一梯度的起始时间点为从测量的起始时间点起的0～1分钟，第一梯度的终止时间点为第一梯度的起始时间点后10分钟，第一梯度的起始时间点的有机相的百分比为整个流动相的0～5质量％，第一梯度的终止时间点的有机相的百分比为整个流动相的10质量％，第二梯度中有机相的增加速率为0.7～1.8体积％/分钟，第二梯度的起始时间点为第一梯度的终止时间点后0分钟，第二梯度的终止时间点为第二梯度的起始时间点后15分钟，第二梯度的起始时间点的有机相的百分比与第一梯度的终止时间点的有机相的百分比相同，第二梯度的终止时间点的有机相的百分比为整个流动相的28～38质量％，第三梯度中有机相的增加速率为1.0～1.5体积％/分钟，第三梯度的起始时间点为第二梯度的终止时间点后0分钟，第三梯度的终止时间点为第三梯度的起始时间点后15分钟，第三梯度的起始时间点的有机相的百分比与第二梯度的终止时间点的有机相的百分比相同，并且第三梯度的终止时间点的有机相的百分比为整个流动相的45～55质量％。
特别优选地，第一梯度中有机相的增加速率为1.0体积％/分钟，第一梯度的起始时间点为测量的起始时间点(测量的起始时间点后0分钟)，第一梯度的终止时间点为测量的起始时间点后10分钟，第一梯度的起始时间点的有机相的百分比为0质量％，第一梯度的终止时间点的有机相的百分比为10质量％，第二梯度中有机相的增加速率为1.3～1.4体积％/分钟，第二梯度的起始时间点为第一梯度的终止时间点后0分钟，第二梯度的终止时间点为第二梯度的起始时间点后15分钟，第二梯度的起始时间点的有机相的百分比与第一梯度的终止时间点的有机相的百分比相同，第二梯度的终止时间点的有机相的百分比为30质量％，第三梯度中有机相的增加速率为1.3～1.4体积％/分钟，第三梯度的起始时间点为第二梯度的终止时间点后0分钟，第三梯度的终止时间点为第三梯度的起始时间点后15分钟，第三梯度的起始时间点的有机相的百分比与第二梯度的终止时间点的有机相的百分比相同，并且第三梯度的终止时间点的有机相的百分比为50质量％。
本发明中用于HPLC测量的梯度的另一个优选实施方式包括如上所述的第一至第三梯度。优选地，第一梯度中有机相的增加速率为1.0体积％/分钟，第一梯度的起始时间点为测量的起始时间点后0分钟，第一梯度的终止时间点为第一梯度的起始时间点后10分钟，第一梯度的起始时间点的有机相的百分比为整个流动相的0质量％，第一梯度的终止时间点的有机相的百分比为整个流动相的10质量％，第二梯度中有机相的增加速率为0.5体积％/分钟，第二梯度的起始时间点为第一梯度的终止时间点后0分钟，第二梯度的终止时间点为第二梯度的起始时间点后20分钟，第二梯度的起始时间点的有机相的百分比与第一梯度的终止时间点的有机相的百分比相同，第二梯度的终止时间点的有机相的百分比为整个流动相的20质量％，第三梯度中有机相的增加速率为5.0体积％/分钟，第三梯度的起始时间点为第二梯度的终止时间点后0分钟，第三梯度的终止时间点为第三梯度的起始时间点后10分钟，第三梯度的起始时间点的有机相的百分比与第二梯度的终止时间点的有机相的百分比相同，并且第三梯度的终止时间点的有机相的百分比为整个流动相的70质量％。
在第三梯度终止后，如果需要，可以设置流动相等度的时间段，然后可以设置流动相中有机相的百分比随时间降低的梯度。
流动相中有机相的百分比随时间降低的梯度的时间期间可以是1分钟以下，优选0.5分钟以下，并且更优选0.1分钟以下。
通过流动相中有机相的百分比随时间降低的梯度，有机相的百分比可降低至整个流动相的0～15质量％，优选0～10质量％，更优选0～5质量％，甚至更优选0质量％。
还可以适当地将流动相清洁剂用于本发明中的HPLC。清洁剂在卡套柱(cartridge)中使用活性炭，可以移除流动相中的杂质和灰尘。结果，色谱图基线噪声降低；因此，即使由化合物A衍生的少量相关物质也可以被适当地检测和定量。
在本发明中，在HPLC测量的起始时间点注入流动相的溶液量没有特别限定，只要是可测量的量即可，优选为2μL以上，更优选为4～22μL，特别优选为8～22μL。
实施例
下面参考实施例更详细地描述本发明。然而，本发明不限于这些实施例。尽管通过实施例充分描述了本发明，但是本领域技术人员将理解可以进行各种变化和修改。因此，这些变化和修改包括在本发明中，除非它们背离本发明的精神和主要构思。
除非另有说明，实施例中使用的试剂均为市售产品。
制造例中的产率如下计算：
产率(％)＝((所得目标产物量)/(所得目标产物的理论量))×100。
制造例中的LCMS光谱是使用ACQUITY SQD(quadrupole，Waters Corporation制造)在以下条件下测定的。
柱：ACQUITY
Figure BDA0003144991910000421
BEH C18，Waters Corporation制造，2.1×50mm，1.7μm
MS检测：ESI阳性
紫外检测：254和280nm
柱流速：0.5mL/分钟
流动相：水/乙腈(0.1％甲酸)
进样量：1μL
制造例的各步骤中进行HPLC的条件如下所述。
条件1
柱：InertSustain C18(4.6mm I.D.×150mm，3μm)
检测器：紫外吸收光度计(测量波长：287nm)
柱温：40℃左右恒温
流速：1.0mL/分钟
进样量：10μL
分析时间：25分钟(面积测量范围：15分钟)
流动相：
溶液A：10mmol/L磷酸水溶液
溶液B：乙腈
梯度程序
表4
Figure BDA0003144991910000431
流动相B的比例(vol％)
Figure BDA0003144991910000432
条件2
柱：InertSustain C18(4.6mm I.D.×150mm，3μm)
检测器：紫外吸收光度计(测量波长：287nm)
柱温：40℃左右恒温
流速：1.0mL/分钟
进样量：10μL
分析时间：30分钟(面积测量范围：15分钟)
流动相：
溶液A：10mmol/L磷酸水溶液
溶液B：乙腈
梯度程序
表5
Figure BDA0003144991910000441
流动相B的比例(vol％)
Figure BDA0003144991910000442
条件3
柱：InertSustain C18(4.6mm I.D.×150mm，3μm)
检测器：紫外吸收光度计(测量波长：220nm)
柱温：40℃左右恒温
流速：1.0mL/分钟
进样量：10μL
分析时间：78分钟(面积测量范围：58分钟)
流动相：
溶液A：10mmol/L磷酸水溶液
溶液B：乙腈
梯度程序
表6
Figure BDA0003144991910000451
流动相B的比例(vol％)
Figure BDA0003144991910000452
制造例1：(S)-3-((3,5-二甲氧基苯基)乙炔基)-1-(吡咯烷-3-基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-胺·2甲磺酸盐的合成
将甲苯(2165g)、(S)-3-(4-氨基-3-碘-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(500g)、1-乙炔基-3,5-二甲氧基苯(207.5g，PTL1)和三乙胺(176.35g)溶解，并用氮吹扫反应体系内部。向溶解的混合物中加入碘化铜(885mg)、双(三苯基膦二氯化钯)(3.264g)和三苯基膦(1.2195g)，并将混合物在氮氛中在75℃的内部温度下搅拌18小时。之后，将反应液部分取出，并通过HPLC(条件1)测定。(S)-3-(4-氨基-3-碘-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯的峰面积被证实为总峰面积的1.0％以下。
将内部温度冷却至50℃，并向混合物中加入乙酸乙酯(2255g)、Scavenger SHSilica(250g)和精制白鹭活性炭(50g)，随后搅拌21小时。Scavenger SH Silica和精制白鹭活性炭通过用Nutsche过滤器抽滤而从混合物中移除。将残余物用4L乙酸乙酯洗涤，然后与滤液混合。在减压下从所得滤液中蒸馏出溶剂。蒸馏6L时，加入2.5L乙腈。在减压下进一步蒸馏溶剂。蒸馏2.4L后，加入2.5L乙腈。在减压下进一步蒸馏溶剂。蒸馏2.6L后，加入乙腈，以使总量是相对于(S)-3-(4-氨基-3-碘-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯的5倍体积(v/w)。
将纯化水(500g)和甲磺酸(234.5g)加入到所得混合物中，并在60℃以上的内部温度搅拌混合物2小时。在5分钟内将8L乙腈加入混合物中以使(S)-3-((3,5-二甲氧基苯基)乙炔基)-1-(吡咯烷-3-基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-胺·2甲磺酸盐结晶。将混合物在3小时内从52℃的内部温度冷却至25℃，然后搅拌11小时。使用Nutsche过滤器通过抽滤从混合物中得到(S)-3-((3,5-二甲氧基苯基)乙炔基)-1-(吡咯烷-3-基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-胺·2甲磺酸盐的湿晶体。将湿晶体用2L乙腈洗涤，在60℃下减压干燥，从而得到题述化合物(571.56g，产率88.4％)，其为淡黄白色晶体。
1H-NMR(400MHz,D2O)δ8.358(s,1H),6.741(d,2.4Hz,2H),6.539(t,2.2Hz,1H),5.715-5.662(m,1H),3.955-3.860(m,2H),3.828(s,6H),3.799-3.645(m,2H),2.838(s,6H),2.766-2.666(m,1H),2.536-2.471(m,1H)。
制造例2：(S)-N-(1-(1-丙烯酰基吡咯烷-3-基)-3-((3,5-二甲氧基苯基)乙炔基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-基)丙烯酰胺的合成
将化合物A(348mg，PTL 1)和DMF(6mL)放入反应容器中，并向其中加入含60％矿物油的氢化钠(49mg)。之后，滴加3-氯丙酰氯(120μL)，并将混合物在室温下搅拌30分钟。将反应液加入到饱和碳酸氢钠水溶液中，并用乙酸乙酯进行萃取，随后蒸馏出有机层的溶剂。将残余物通过柱色谱(Biotage SNAP Ultra HP-Sphere，氯仿/甲醇)纯化，从而获得题述化合物(49mg)。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ8.84(1H,s),8.71(1H,d,J＝1.2Hz,NH),7.37(1H,ddd,J＝17.0,10.2,5.1Hz),6.86(2H,dd,J＝2.2,0.7Hz),6.74-6.48(1H,m),6.60-6.42(1H,m),6.56(1H,dd,J＝4.4,2.2Hz),6.46-6.39(1H,m),5.96(1H,ddd,J＝10.4,4.2,1.2Hz),5.77-5.69(1H,m),5.68-5.56(1H,m),4.20-4.01(2H,m),4.15-3.70(2H,m),3.84(6H,s),2.75-2.43(2H,m)；m/z 473[M+H]+。
制造例3：(S)-1-(3-(4-氨基-3-((3,5-二甲氧基苯基)乙炔基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)吡咯烷-1-基)-3-氯丙-1-酮的合成
将(S)-3-((3,5-二甲氧基苯基)乙炔基)-1-(吡咯烷-3-基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-胺·2甲磺酸盐(1.0g)和二甲亚砜(25mL)放入反应容器中，然后向其中加入1M氢氧化钠水溶液(3.6mL)。向其中加入3-氯丙烷甲酸(297mg)和DMT-MM水合物(694mg)，随后在室温下搅拌2小时。进一步加入3-氯丙烷甲酸(67mg)和DMT-MM水合物(272mg)，并将混合物在室温下搅拌1小时。将反应液加入碳酸氢钠水溶液中，并用乙酸乙酯萃取，随后蒸馏出有机层的溶剂。将残余物通过柱色谱(Biotage SNAP Ultra HP-Sphere，氯仿/甲醇)纯化，从而获得题述化合物(713mg)。
1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.26(1H,s),7.98(1H,brs),6.90(2H,m),6.78(1H,brs),6.60(1H,m),5.55-5.38(1H,m),4.05-3.76(2H,m),3.85-3.74(2H,m),3.80-3.49(2H,m),3.77(6H,s),2.79(2H,dt,J＝25.8,6.8Hz),2.49-2.28(2H,m)；m/z 455,457[M+H]+。
制造例4：(S)-1-(3-(4-氨基-3-((3,5-二甲氧基苯基)乙炔基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)吡咯烷-1-基)-2-丙烯-1-酮的合成
将(S)-3-((3,5-二甲氧基苯基)乙炔基)-1-(吡咯烷-3-基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-胺·2甲磺酸盐(10g)、水(56mL)和乙腈(50mL)放入反应容器中，并向其中加入5N氢氧化钠水溶液(14mL)。加入通过用乙腈(20mL)稀释3-氯丙酰氯(2.51g)所制备的溶液，并将混合物在20至30℃的温度下搅拌2小时。将反应液部分取出，并通过HPLC测量(条件2)。确认化合物B的峰面积小于总峰面积的0.1％。在此阶段，在HPLC中未检测到二酰胺化合物和3CP二酰胺化合物。此后，进一步加入5N氢氧化钠水溶液(4mL)，并将混合物在20至30℃的温度下搅拌2小时。此后，进一步加入5N氢氧化钠水溶液(2mL)，并将混合物在20至30℃的温度下搅拌2小时。将反应液部分取出，并通过HPLC测量(条件2)。确认A-1-3CP化合物的峰面积小于总峰面积的0.1％。反应完成后，加入水(150mL)，通过过滤收集不溶物，然后用水(50mL)和乙腈(50mL)洗涤。将收集的物质在60℃下减压干燥，从而获得题述化合物(5.60g，产率74.5％)。
通过HPLC分析获得的题述化合物未检测到二酰胺化合物。
制造例5：(S)-1-(3-(4-氨基-3-((3,5-二甲氧基苯基)乙炔基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)吡咯烷-1-基)-2-丙烯-1-酮的合成
将(S)-3-((3,5-二甲氧基苯基)乙炔基)-1-(吡咯烷-3-基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-胺·2甲磺酸盐(25.0g)、水(69mL)和乙腈(158mL)放入反应容器中，并向其中加入5N氢氧化钠水溶液(35mL)。在10分钟内加入通过用乙腈(50mL)稀释3-氯丙酰氯(6.27g)所制备的溶液。滴加完成后，将混合物在30℃下搅拌30分钟。将反应液部分取出，并通过HPLC测量(条件3)。确认化合物B的峰面积小于总峰面积的0.1％。在此阶段，在HPLC中未检测到二酰胺化合物和3CP二酰胺化合物。此后，进一步加入5N氢氧化钠水溶液(25mL)，并将混合物在30℃下搅拌4小时。将反应液部分取出，并通过HPLC测量(条件3)。确认A-1-3CP化合物的峰面积小于总峰面积的0.1％。反应完成后，在2小时内加入水(550mL)。滴加结束后，将内部温度调整为25℃，并将混合物搅拌1.5小时。通过过滤收集不溶物，并用水(125mL)洗涤后，随后在60℃下减压干燥经洗涤的物质，从而得到题述化合物(16.02g，产率85.3％)。
通过HPLC分析获得的题述化合物未检测到二酰胺化合物。
制造例6：通过使用3.1当量氢氧化钠合成(S)-1-(3-(4-氨基-3-((3,5-二甲氧基苯基)乙炔基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)吡咯烷-1-基)-2-丙烯-1-酮
将(S)-3-((3,5-二甲氧基苯基)乙炔基)-1-(吡咯烷-3-基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-胺·2甲磺酸盐(3.0g)、水(9.15mL)和乙腈(18.96mL)放入反应容器中，并向其中加入5N氢氧化钠水溶液(3.34mL)，随后将内部温度调整为30℃。在10分钟内加入通过用乙腈(6mL)稀释3-氯丙酰氯(0.753g)所制备的溶液。滴加完成后，将混合物在30℃下搅拌30分钟。将反应液部分取出，并通过HPLC测量(条件3)。确认化合物B的峰面积小于总峰面积的0.1％。在此阶段，在HPLC中未检测到二酰胺化合物和3CP二酰胺化合物。此后，进一步加入5N氢氧化钠水溶液(3.56mL)，并将混合物在30℃下搅拌4小时。将反应液部分取出，并通过HPLC测量(条件3)。确认A-1-3CP化合物的峰面积小于总峰面积的0.1％。反应结束后，在30分钟内加入水(66mL)，并将内部温度调整为25℃，随后搅拌1小时。通过过滤收集不溶物，并用水(15mL)洗涤，随后在60℃下减压干燥收集的物质，从而得到题述化合物(1.874g，产率83.1％)。
通过HPLC分析获得的题述化合物未检测到二酰胺化合物。
制造例7：通过使用N,N-二异丙基乙胺合成(S)-1-(3-(4-氨基-3-((3,5-二甲氧基苯基)乙炔基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)吡咯烷-1-基)-2-丙烯-1-酮
将(S)-3-((3,5-二甲氧基苯基)乙炔基)-1-(吡咯烷-3-基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-胺·2甲磺酸盐(3.0g)、水(12.48mL)和乙腈(18.96mL)放入反应容器中，并向其中加入N,N-二异丙基乙胺(2.26g)，随后将内部温度调整为30℃。在10分钟内加入通过用乙腈(6mL)稀释3-氯丙酰氯(0.753g)所制备的溶液。滴加完成后，将混合物在30℃下搅拌30分钟。将反应液部分取出，并通过HPLC测量(条件3)。确认化合物B的峰面积小于总峰面积的1.0％。在此阶段，在HPLC中未检测到二酰胺化合物和3CP二酰胺化合物。然后，进一步加入5N氢氧化钠水溶液(6.47mL)，并将混合物在30℃下搅拌4小时30分钟。反应完成后，在30分钟内加入水(66mL)，并将内部温度调整为25℃，随后搅拌1小时30分钟。通过过滤收集不溶物，并用水(15mL)洗涤，随后在60℃下减压干燥经洗涤的物质，从而得到题述化合物(1.897g，产率84.2％)。
通过HPLC分析获得的题述化合物未检测到二酰胺化合物。
制造例8：通过使用氢氧化钾合成(S)-1-(3-(4-氨基-3-((3,5-二甲氧基苯基)乙炔基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)吡咯烷-1-基)-2-丙烯-1-酮
将(S)-3-((3,5-二甲氧基苯基)乙炔基)-1-(吡咯烷-3-基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-胺·2甲磺酸盐(500mg)、水(3.5mL)和乙腈(3.5mL)放入反应容器中，然后向其中加入5N氢氧化钾(相当于280.7mg)。加入通过用乙腈(1mL)稀释3-氯丙酰氯(205.2mg)所制备的溶液，并将混合物在20至30℃的温度下搅拌30分钟。将反应液部分取出，并通过HPLC测量(条件2)。确认化合物B的峰面积小于总峰面积的1.0％。在此阶段，在HPLC中未检测到二酰胺化合物和3CP二酰胺化合物。
这表明，由于其能够抑制相关物质如二酰胺化合物的形成，制造例8的方法在保持化合物A的高质量方面是优异的并且适用于药品的大量制造。
制造例9：通过使用氢氧化钠合成(S)-1-(3-(4-氨基-3-((3,5-二甲氧基苯基)乙炔基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)吡咯烷-1-基)-2-丙烯-1-酮
将(S)-3-((3,5-二甲氧基苯基)乙炔基)-1-(吡咯烷-3-基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-胺·2甲磺酸盐(500mg)、水(3.5mL)和乙腈(3.5mL)放入反应容器中，并向其中加入5N氢氧化钠(1.0mL)。加入通过用乙腈(1mL)稀释3-氯丙酰氯(205.2mg)所制备的溶液，并将混合物在20至30℃的温度下搅拌30分钟。将反应液部分取出，并通过HPLC测量(条件2)。确认化合物B的峰面积小于总峰面积的1.0％。在此阶段，3CP二酰胺化合物的峰面积为总峰面积的0.31％。
这表明，由于其能够抑制由3CP二酰胺化合物诱导的二酰胺化合物的形成，制造例9的方法在保持化合物A的质量方面优异并且适用于药品的大量制造。
制造例10：通过使用丙烯酰氯合成(S)-1-(3-(4-氨基-3-((3,5-二甲氧基苯基)乙炔基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)吡咯烷-1-基)-2-丙烯-1-酮
将(S)-3-((3,5-二甲氧基苯基)乙炔基)-1-(吡咯烷-3-基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-胺·2甲磺酸盐(5.0g)、N-甲基-2-吡咯烷酮(50mL)和磷酸钾(3.43g)放入反应容器中，并将内部温度调整为10℃以下。向其中加入丙烯酰氯(1.219g)，并将混合物搅拌3小时。将反应液部分取出，并通过HPLC测量(条件2)。确认化合物B的峰面积小于总峰面积的1.0％，确认二酰胺化合物的峰面积为2％以上。
此后，加入水(25g)和磷酸(880mg)，并将混合物在20至30℃的温度下搅拌3小时。将反应液部分取出，并通过HPLC测量(条件2)。确认二酰胺化合物的峰面积小于总峰面积的2％。
此后，将反应液的pH用20％氢氧化钾水溶液调节至7至8。然后向其中加入乙醇(40mL)，并将混合物加热至50至60℃的内部温度以将其溶解。在50℃的内部温度，加入化合物A的结晶II(25.2mg，PTL 8)，并将混合物搅拌3小时。此后，在3小时内滴加水(176.3mL)。将内部温度在15小时内从50℃冷却到25℃。在此阶段，包含溶液和不溶物的整个溶液为375mL。通过过滤从该溶液中收集不溶物，并用水(30mL)洗涤，随后在60℃下减压干燥经洗涤的物质，从而得到题述化合物(2.936g，产率78.2％)。
通过HPLC分析获得的题述化合物未检测到二酰胺化合物。
然而，当通过使用过滤面积为12.56cm2的Nutsche过滤器从包含溶液和不溶物的整个溶液(375mL)中滤出不溶物时，过滤耗时1716秒，过滤速率为0.2mL/秒。当在与实施例相同规模的过滤所花费的时间段方面进行比较时，该过滤速率是实施例中过滤速率的约1/20。
这表明制造例10的方法需要时间来过滤化合物A，并且表明作为用于大量制造的方法的条件可能不充分。
制造例11
将(S)-3-((3,5-二甲氧基苯基)乙炔基)-1-(吡咯烷-3-基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-胺·2甲磺酸盐(500mg)、水(2.5mL)和乙腈(2.5mL)放入反应容器中，并向其中加入5N氢氧化钠水溶液(1mL)。然后向其中加入通过用乙腈(1mL)稀释丙烯酰氯(162.9mg)所制备的溶液，随后在冰冷温度下搅拌混合物30分钟。将反应液部分取出，并通过HPLC测量(条件2)。化合物B的峰面积为总峰面积的1.94％，二酰胺化合物的峰面积为总峰面积的3.02％。
这表明，从产品质量的角度来看，制造例11的方法作为用于制造药品的方法可能不充分。
制造例12
将(S)-3-((3,5-二甲氧基苯基)乙炔基)-1-(吡咯烷-3-基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-胺·2甲磺酸盐(500mg)、水(3.5mL)和乙腈(2.5mL)放入反应容器中，然后向其中加入磷酸钾(343.8mg)。然后向其中加入通过用乙腈(1mL)稀释丙烯酰氯(97.8mg)所制备的溶液，随后在冰冷温度下搅拌混合物60分钟。将反应液部分取出，并通过HPLC测量(条件2)。化合物B的峰面积为总峰面积的17.79％，二酰胺化合物的峰面积为总峰面积的20.85％。
这表明制造例12的方法作为用于大量制造化合物A的方法可能不充分。
制造例13
将(S)-3-((3,5-二甲氧基苯基)乙炔基)-1-(吡咯烷-3-基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-胺·2甲磺酸盐(500mg)、水(3.5mL)和乙腈(2.5mL)放入反应容器中，并向其中加入磷酸钾(343.8mg)。然后向其中加入通过用乙腈(1mL)稀释丙烯酰氯(146.6mg)所制备的溶液，随后在冰冷温度下搅拌混合物60分钟。将反应液部分取出，并通过HPLC测量(条件2)。尽管确认化合物B的峰面积小于总峰面积的1.0％，但二酰胺化合物的峰面积为总峰面积的44.23％。
这表明制造例13的方法作为用于大量制造化合物A的方法可能不充分。
制造例14
将(S)-3-((3,5-二甲氧基苯基)乙炔基)-1-(吡咯烷-3-基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-胺·2甲磺酸盐(500mg)、水(3.5mL)和乙腈(2.5mL)放入反应容器中，并向其中加入二异丙基乙胺(406.2mg)。然后向其中加入通过用乙腈(1mL)稀释丙烯酰氯(171mg)所制备的溶液，随后在冰冷温度下搅拌混合物60分钟。将反应液部分取出，并通过HPLC测量。尽管化合物B的峰面积小于总峰面积的0.1％，但二酰胺化合物的峰面积为2.04％。在此阶段，尽管以各种方式进行了重结晶，但化合物A中二酰胺化合物的含量并不能降低到小于0.1％。
这表明，从产品质量的角度来看，制造例14的方法作为用于制造药品的方法可能不充分。
制造例15
将(S)-3-((3,5-二甲氧基苯基)乙炔基)-1-(吡咯烷-3-基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-胺·2甲磺酸盐(500mg)、水(3.5mL)和乙腈(3.5mL)放入反应容器中，并向其中加入碳酸钾(620.6mg)。然后加入通过用乙腈(1mL)稀释3-氯丙酰氯(205.2mg)所制备的溶液，随后在20至30℃的温度下搅拌混合物30分钟。将反应液部分取出，并通过HPLC测量(条件2)。尽管化合物B的峰面积小于总峰面积的1.0％，但3CP二酰胺化合物的峰面积为总峰面积的3.41％。
这表明，从产品质量的角度来看，制造例15的方法作为用于制造药品的方法可能不充分。
制造例16
将(S)-3-((3,5-二甲氧基苯基)乙炔基)-1-(吡咯烷-3-基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-胺·2甲磺酸盐(500mg)、水(3.5mL)和乙腈(3.5mL)放入反应容器中，并向其中加入磷酸钾(343.1mg)。然后加入通过用乙腈(1mL)稀释3-氯丙酰氯(205.2mg)所制备的溶液，随后在20至30℃的温度下搅拌混合物30分钟。将反应液部分取出，并通过HPLC测量(条件2)。尽管化合物B的峰面积小于总峰面积的1.0％，但3CP二酰胺化合物的峰面积为总峰面积的6.58％。
这表明，从产品质量的角度来看，制造例16的方法作为用于制造药品的方法可能不充分。
制造例17
将(S)-3-((3,5-二甲氧基苯基)乙炔基)-1-(吡咯烷-3-基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-胺·2甲磺酸盐(500mg)、水(3.5mL)和乙腈(3.5mL)放入反应容器中，并向其中加入三乙胺(318.0mg)。然后加入通过用乙腈(1mL)稀释3-氯丙酰氯(171.0mg)所制备的溶液，随后在20至30℃的温度下搅拌混合物30分钟。将反应液部分取出，并通过HPLC测量(条件2)。尽管化合物B的峰面积小于总峰面积的1.0％，但3CP二酰胺化合物的峰面积为总峰面积的1.68％，且检测到了许多其他种类的相关物质。
这表明从产品质量的角度来看，制造例17的方法作为用于制造药品的方法可能不充分。
制造例18
将(S)-3-((3,5-二甲氧基苯基)乙炔基)-1-(吡咯烷-3-基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-胺·2甲磺酸盐(500mg)、水(3.5mL)和乙腈(3.5mL)放入反应容器中，并向其中加入吡啶(3551.6mg)。然后加入通过用乙腈(1mL)稀释3-氯丙酰氯(205.2mg)所制备的溶液，随后在20至30℃的温度下搅拌混合物30分钟。将反应液部分取出，并通过HPLC测量(条件2)。化合物B的峰面积为43.72％，表明反应没有充分进行。
这表明制造例18的方法作为用于大量制造化合物A的方法可能不充分。
制造例19
将(S)-3-((3,5-二甲氧基苯基)乙炔基)-1-(吡咯烷-3-基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-胺·2甲磺酸盐(500mg)、水(3.5mL)和乙腈(3.5mL)放入反应容器中，并向其中加入叔丁醇钾(503.8mg)。然后加入通过用乙腈(1mL)稀释3-氯丙酰氯(205.2mg)所制备的溶液，随后在20至30℃的温度下搅拌混合物30分钟。将反应液部分取出，并通过HPLC测量(条件2)。尽管化合物B的峰面积小于总峰面积的1.0％，但3CP二酰胺化合物的峰面积为总峰面积的4.66％。
这表明，从产品质量的角度来看，制造例19的方法作为用于制造药品的方法可能不充分。
下表示出了由化合物B的2甲磺酸盐制造由L2为氯原子的式(A-1)表示的化合物的结果。
表7
Figure BDA0003144991910000551
对碱当量标注的短语“减去酸加成盐后”是指通过减去中和化合物B的2甲磺酸盐的甲磺酸(酸加成部分)所需的碱当量数而确定的值。表述“N.D.”意指“低于检测限”，表述“N.A.”意指未进行测量。
结果表明，当相对于每当量化合物B使用1.1当量3-氯丙酰氯时，化合物A中含有二酰胺的概率较低。结果还表明，当氢氧化钠或氢氧化钾用作碱时，并且当相对于每当量化合物B使用1.8当量3-氯丙酰氯时，化合物A中含有二酰胺的概率较低。
测试例1：分离度的确认
根据PTL 4的实施例1中的方法，使制造例4、5和6中获得的化合物A结晶。通过质谱和HPLC分析在此阶段获得的滤液检测到CE化合物(保留时间：18.3分钟)、OH化合物(保留时间：23.1分钟)、CDA1化合物(保留时间：24.7分钟)、CHO化合物(保留时间：27.3分钟)、二酰胺化合物(保留时间：47.9分钟)、UK化合物(保留时间：48.5分钟)、MA化合物(保留时间：55.9分钟)和二聚体化合物(保留时间：58.6分钟)。在HPLC分析中，CDA1化合物和二酰胺化合物的保留时间与单独合成的CDA1化合物和二酰胺化合物一致。HPLC分析条件如下所述。
检测器：紫外吸收光度计(波长：220nm)
柱：不锈钢管(内径：4.6mm，长度：15cm)填充3μm十八烷基硅烷化硅胶用于液相色谱(InertSustain C18，GL Sciences Inc.制造)
柱温：40℃
进样量：10μL
流速：1.0mL/分钟
流动相A：通过向1000mL水加入0.685mL磷酸，然后向其中加入45％氢氧化钾溶液以将pH调节至6.8而制备950mL磷酸盐缓冲液。然后向其中加入50mL乙腈。
流动相B：乙腈
流动相A和流动相B的比例如下所示改变以控制浓度梯度。
表8
Figure BDA0003144991910000571
流动相B的比例(vol％)
Figure BDA0003144991910000572
这表明不仅化合物B和A-1-3CP化合物(制造化合物A的中间体)，还有CE化合物、OH化合物、CDA1化合物、CHO化合物、二酰胺化合物、UK化合物、MA化合物和二聚体化合物均是可能包含在化合物A的原料药和/或制剂中的相关物质。此外，这也表明这些化合物可用作保持化合物A质量的标准品。
制造实施例1：(S)-1-(3-(4-氨基-3-((3,5-二甲氧基苯基)乙炔基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)吡咯烷-1-基)-3-羟基丙-1-酮(OH化合物)的合成
将制造例1中得到的化合物B·2甲磺酸盐(1.004g)溶解在DMSO(25mL)中，并在室温下向其中加入1M氢氧化钠水溶液(3.610mL)。在室温下向所得溶液中加入3-羟基丙酸(30％水溶液，1.50mL)和DMT-MM·一水合物(1.067g)，随后搅拌1小时。将碳酸氢钠水溶液加入到反应液中，然后用乙酸乙酯萃取。将萃取液经无水硫酸钠干燥并减压浓缩。将由此获得的残余物通过硅胶色谱(Biotage SNAP Ultra HP-Sphere，50g，然后是SNAP IsoluteFlash-NH，110g，洗脱液：氯仿/甲醇)纯化，从而获得题述化合物。
1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.26(1H,d,J＝3.4Hz),7.97(1H,brs),6.91(2H,d,J＝2.4Hz),6.76(1H,brs),6.60(1H,t,J＝2.4Hz),5.45(1H,m),4.52(1H,dt,J＝5.4,17.6Hz),4.05-3.80(1H,m),3.80-3.62(4H,m),3.78(6H,s),3.62-3.47(1H,m),2.52-2.27(5H,m)；m/z 473.3[M+H]+。
制造实施例2：(S)-3-(4-氨基-3-((3,5-二甲氧基苯基)乙炔基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)吡咯烷-1-甲醛(CHO化合物)的合成
将制造例1中得到的化合物B·2甲磺酸盐(520.4mg)溶解在DMSO(10mL)中，并在室温下向其中加入1M氢氧化钠水溶液(1.870mL)。在室温下向所得溶液中加入甲酸(42.35μL)和DMT-MM·一水合物(412.8mg)，然后搅拌20分钟。将碳酸氢钠水溶液加入到反应液中，然后用乙酸乙酯萃取。将萃取液经无水硫酸钠干燥并减压浓缩。将乙酸乙酯加入由此得到的残余物中以从溶液中沉淀出题述化合物。通过过滤收集生成的固体，并用乙酸乙酯洗涤，随后在65℃减压干燥，从而得到CHO化合物(239.0mg)。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ8.37(1H,s),8.30(1H,d,J＝9.5Hz),6.76-6.72(2H,m),6.56-6.52(1H,m),5.92(2H,brs),5.62-5.45(1H,m),4.09-3.97(2H,m),3.94-3.63(2H,m),3.82(6H,s),2.71-2.41(2H,m)；m/z393.3[M+H]+。
制造实施例3：1,3-双((S)-3-(4-氨基-3-((3,5-二甲氧基苯基)乙炔基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)吡咯烷-1-基)丙-1-酮(MA化合物)的合成)
向制造例1中得到的化合物B·2甲磺酸盐(100.4mg)中加入50％乙腈水溶液(4mL)，以使化合物B·2甲磺酸盐溶解。在室温下向其中加入1M氢氧化钠水溶液(360.7mg)。将PTL 1中公开的化合物A(75.4mg)和DBU(26.9μL)加入到获得的混悬液中。将混合物在80℃下搅拌11小时后，结束加热，随后继续搅拌直至恢复至室温。通过过滤收集析出的固体，并用50％乙腈水溶液洗涤，随后在65℃减压干燥，从而得到题述化合物的粗品。将所得粗品通过硅胶柱色谱(Biotage SNAP Isolute Flash-NH，25g，洗脱液：乙酸乙酯/甲醇)纯化，从而获得MA化合物(109.1mg)。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ8.42-8.29(2H,m),6.81-6.64(2H,m),6.52(2H,s),6.18-5.90(4H,m),5.61-5.41(1H,m),4.08-3.59(4H,m),3.81(12H,s),3.17(1H,dt,J＝9.0,23.6Hz),3.08-2.78(5H,m),2.71-2.30(6H,m)；m/z 783.5[M+H]+。
制造实施例4：(S)-3-((1-(1-丙烯酰基吡咯烷-3-基)-6-((3,5-二甲氧基苯基)乙炔基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-基)氨基)丙酸(CE化合物)的合成
将PTL 1中公开的化合物A(502.0mg)溶解在DMF(10mL)中，并在冰冷温度下向其中加入60％氢化钠(液体石蜡中分散的粉末，60.3mg)，随后搅拌10分钟。在冰冷温度下加入3-溴丙酸叔丁酯(220.2μL)，并将混合物搅拌15分钟，随后加热至室温，并搅拌20小时。将饱和氯化铵水溶液加入到反应液中，然后用乙酸乙酯萃取。将萃取液经无水硫酸钠干燥并减压浓缩。通过硅胶柱色谱(Biotage SNAP Ultra HP-Sphere，50g，洗脱液：乙酸乙酯/甲醇)纯化由此获得的残余物，从而获得(S)-3-((1-丙烯酰基吡咯烷-3-基)-3-((3,5-二甲氧基苯基)乙炔基-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-基)氨基)丙酸叔丁酯(题述化合物的羧酸受叔丁基保护，510.0mg)。
将得到的受叔丁基保护的羧酸(510.0mg)溶解在甲酸(8mL)中，随后在室温下搅拌20小时，并在50℃下搅拌3小时。减压浓缩反应液得到残余物，并向残余物中加入甲醇以从溶液中析出题述化合物。通过过滤收集析出的固体，并用少量甲醇洗涤，随后在65℃减压干燥，从而得到CE化合物(342.3mg)。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ8.35(1H,d,J＝7.3Hz),6.84(2H,t,J＝2.4Hz),6.84-6.75(1H,m),6.53-6.36(3H,m),5.74-5.66(1H,m),5.55-5.40(1H,m),4.10-3.85(5H,m),3.82-3.68(1H,m),3.79(6H,s),2.79-2.72(2H,m),2.64-2.32(2H,m)；m/z 491.3[M+H]+。
制造实施例5：1-((S)-3-(4-((3-((S)-3-(4-氨基-3-((3,5-二甲氧基苯基)乙炔基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)吡咯烷-1-基)-3-氧代丙基)氨基)-3-((3,5-二甲氧基苯基)乙炔基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)吡咯烷-1-基)丙-2-烯-1-酮(二聚体化合物)的合成
将制造例1中得到的化合物B的2甲磺酸盐(2.751g)溶解在50％乙腈水溶液中，并将得到的溶液滴加到0.5M氢氧化钠溶液中。所得混悬液用氯仿萃取，将萃取液经无水硫酸钠干燥并减压浓缩，从而得到制造例4所得化合物B的脱盐产物(1.753g)。
将由此获得的脱盐产物(268.2mg)和制造实施例104中获得的CE化合物(301.0mg)溶解在DMSO(15mL)和水(1.5mL)的溶剂混合物中，然后向其中加入DMT-MM·一水合物(274.4mg)，随后在室温下搅拌2小时，然后在50℃下搅拌1小时。进一步加入DMT-MM·一水合物(38.5mg)，并将混合物在50℃下再搅拌1小时，随后冷却至室温。向反应液中加入水，随后用氯仿萃取。将萃取液经无水硫酸钠干燥后，将通过减压浓缩得到的残余物通过硅胶色谱(Biotage，SNAP Ultra HP-Sphere，110g，洗脱液：氯仿/甲醇)纯化，从而得到二聚体化合物(360.7mg)。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ8.38-8.27(2H,m),7.30-7.13(1H,m),7.08(1H,dd,J＝2.2,7.8Hz),7.03(1H,d,J＝2.2Hz),6.71(1H,d,J＝2.4Hz),6.70(1H,dd,J＝2.2,5.1Hz),6.56-6.47(2H,m),6.45-6.36(2H,m),6.00-5.87(2H,m),5.74-5.65(1H,m),5.58-5.43(2H,m),4.17-3.56(10H,m),3.86-3.75(12H,m),2.75-2.31(6H,m)；m/z 837.6[M+H]+。
制造实施例6：(S)-8-(1-丙烯酰基吡咯烷-3-基)-10-((3,5-二甲氧基苯基)乙炔基)-3,4-二氢吡唑并[4,3-e]嘧啶并[1,2-c]嘧啶-2(8H)-酮(CDA1化合物)的合成
将PTL 1中公开的化合物A(500.1mg)溶解在氯仿(10mL)中，并向其中加入4-二甲氨基吡啶(358.9mg)和丙烯酰氯(234.0μL)，随后在室温下搅拌2小时。将饱和碳酸氢钠水溶液加入到反应液中，然后用氯仿萃取。将萃取液经无水硫酸钠干燥并减压浓缩。将得到的残余物通过硅胶色谱(Biotage，SNAP Ultra HP-Sphere，50g，洗脱液：氯仿/甲醇)纯化，从而得到CDA1化合物(232.8mg)。
1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.41(1H,d,J＝2.0Hz),6.82(2H,d,J＝2.4Hz),6.61(1H,ddd,J＝10.2,17.0,37.1Hz),6.58(1H,t,J＝2.4Hz),6.16(1H,ddd,J＝2.4,6.3,17.0Hz),5.69(1H,ddd,J＝2.4,10.2,16.1Hz),5.56-5.42(1H,m),4.36(2H,t,J＝7.3Hz),4.14-3.92(1H,m),3.96-3.73(1H,m),3.86-3.57(1H,m),3.78(6H,s),2.64(2H,t,J＝7.3Hz),2.56-2.23(2H,m)；m/z 473.3[M+H]+。
制造实施例7：(S)-N-(1-(1-丙烯酰基吡咯烷-3-基)-3-((3,5-二甲氧基苯基)乙炔基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-基)丙烯酰胺(二酰胺化合物)的合成
将PTL 1中公开的化合物A(3.000g)溶解在DMF(50mL)中。在室温下搅拌混合物的同时，向其中加入60％氢化钠(液体石蜡中分散的粉末，440.0mg)，然后搅拌5分钟。加入3-氯丙酰氯(1.40mL)，然后在室温下搅拌20分钟。将饱和氯化铵水溶液加入到所得凝胶状反应液中直至凝胶状态消失，然后加入饱和碳酸氢钠水溶液并用乙酸乙酯萃取。将萃取液用饱和氯化钠溶液洗涤，经无水硫酸钠干燥，并减压浓缩。通过硅胶色谱(Biotage，SNAPUltra HP-Sphere，100g，洗脱液：乙酸乙酯/甲醇)纯化由此获得的残余物，从而获得二酰胺化合物(374.3mg)。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ8.84(1H,s),8.72(1H,s),7.43-7.31(1H,m),6.85(2H,d,J＝2.4Hz),6.75-6.34(3H,m),6.56(1H,q,J＝2.4Hz),5.96(1H,ddd,J＝1.2,4.1,10.5Hz),5.77-5.69(1H,m),5.67-5.56(1H,m),4.48-3.74(4H,m),3.84(6H,s),2.75-2.42(2H,m)；m/z 473.3[M+H]+。
制造实施例8：(S)-1-(1-丙烯酰基吡咯烷-3-基)-5-氨基-3-((3,5-二甲氧基苯基)乙炔基)-1H-吡唑-4-甲腈(UK化合物)的分离
根据PTL 4的实施例1中公开的方法，将制造例4、5和6中获得的化合物A结晶并过滤。将氯仿(40mL)加入滤液(40mL)中，然后萃取两次。合并萃取液，并减压浓缩，随后将所得残余物通过硅胶柱色谱(Biotage，SNAP Isolute Flash-NH，11g，洗脱液：乙酸乙酯/甲醇)和硅胶制备薄层色谱(Merck，Cat.No.1.05744，展开剂：氯仿/甲醇)纯化，从而得到UK化合物(2.5mg)。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ6.75-6.71(2H,m),6.53-6.43(2H,m),6.42-6.35(1H,m),5.78-5.70(1H,m),4.80-4.60(1H,m),4.73(2H,s),4.07-3.86(2H,m),3.86-3.60(2H,m),3.80(6H,s),2.78-2.27(2H,m)；m/z392.3[M+H]+。
实施例1：通过液相色谱分析化合物A
在下述测试条件下进行HPLC测量。HPLC测量中使用的化合物A的溶液以下述方式制备。将50mL水和乙腈(1:1)的混合物加入到制造例4、5或6中获得的化合物A(20mg：其制剂也可用)中以溶解化合物A。称重1mg CE化合物、OH化合物、MA化合物、二聚体化合物和CHO化合物，并向其中加入2mL化合物A在水和乙腈(1:1)的混合物中的溶液。进一步加入水和乙腈(1:1)的混合物以精确形成100mL的溶液。
条件：实施例1
检测器：紫外吸收光度计(波长：220nm)
柱：不锈钢管(内径：4.6mm，长度：15cm)填充3μm十八烷基硅烷化硅胶用于液相色谱(InertSustain C18HP，GL Sciences Inc.制造)
柱温：40℃
进样量：10μL
流速：1.0mL/分钟
流动相A：将2.04g磷酸二氢钾溶解于1500mL水中，并向其中加入8mol/L氢氧化钾试剂以调节pH至6.6，随后加入500mL乙腈。
流动相B：乙腈
如下所示改变混合物中流动相A和流动相B的比例以控制浓度梯度。
表9
Figure BDA0003144991910000621
流动相B的比例(vol％)
Figure BDA0003144991910000631
图1示出了测量结果。该测量方法证实化合物A的保留时间为约18.9分钟。测量方法还证实，CE化合物的保留时间为约8.7分钟，OH化合物的保留时间为约12.6分钟，MA化合物的保留时间为约24.1分钟，二聚体化合物的保留时间为约27.3分钟，且CHO化合物的保留时间为约15.2分钟。
此外，表10示出了这些相关物质与化合物A的峰之间的分离度的评估结果。
表10
Figure BDA0003144991910000632
在表中的分离度行中，化合物的保留时间比与该化合物进行分离度比较的另一化合物更长的化合物分离度栏表示这两化合物峰之间的分离度。例如，OH化合物的分离度栏表示保留时间较长的OH化合物和保留时间较短的CE化合物之间的分离度。CHO化合物的分离度栏表示保留时间较长的CHO化合物和保留时间较短的OH化合物之间的分离度。
结果表明，任何峰之间的分离度为1.5以上，并且峰完全分离。因此，证实实施例1中的HPLC条件能够控制化合物A的质量。
实施例2：通过液相色谱分析化合物A
在下述测试条件下进行HPLC测量。HPLC测量中使用的化合物A的溶液与实施例1相同。
条件：实施例2
检测器：紫外吸收光度计(波长：220nm)
柱：不锈钢管(内径：4.6mm，长度：15cm)填充3μm十八烷基硅烷化硅胶用于液相色谱(InertSustain C18HP，GL Sciences Inc.制造)
柱温：40℃
进样量：5μL
流速：1.0mL/分钟
流动相A：将2.04g磷酸二氢钾溶解于1500mL水中，并向其中加入8mol/L氢氧化钾试剂以调节pH至6.6，随后加入500mL乙腈。
流动相B：乙腈
如下所示改变混合物中流动相A和流动相B的比例以控制浓度梯度。
表11
Figure BDA0003144991910000641
流动相B的比例(vol％)
Figure BDA0003144991910000651
该测量方法证实化合物A的保留时间为约18.7分钟。其他相关物质的保留时间与实施例1相同。结果表明该测量条件可以分离每种相关物质，包括化合物A。
实施例3：通过液相色谱分析化合物A
在下述测试条件下进行HPLC测量。HPLC测量中使用的化合物A的溶液与实施例1相同。
条件：实施例3
检测器：紫外吸收光度计(波长：220nm)
柱：不锈钢管(内径4.6mm，长度15cm)填充3μm十八烷基硅烷化硅胶用于液相色谱(InertSustain C18HP，GL Sciences Inc.制造)
柱温：40℃
进样量：5μL
流速：1.0mL/分钟
流动相A：将2.04g磷酸二氢钾溶解于1500mL水中，并向其中加入8mol/L氢氧化钾试剂以调节pH至6.6，随后加入500mL乙腈。
流动相B：乙腈
如下所示改变混合物中流动相A和流动相B的比例以控制浓度梯度。
表12
Figure BDA0003144991910000661
流动相B的比例(vol％)
Figure BDA0003144991910000662
该测量方法证实化合物A的保留时间为约18.1分钟。测量方法还证实，CE化合物的保留时间为约8.5分钟，OH化合物的保留时间为约12.3分钟，MA化合物的保留时间为约22.6分钟，二聚体化合物的保留时间为约25.4分钟，且CHO化合物的保留时间为约14.7分钟。结果表明，测量条件可以分离每种相关物质，包括化合物A。
实施例4：通过液相色谱分析化合物A
在下述测试条件下进行HPLC测量。HPLC测量中使用的化合物A的溶液与实施例1相同。
条件：实施例4
检测器：紫外吸收光度计(波长：220nm)
柱：不锈钢管(内径：4.6mm，长度：15cm)填充3μm十八烷基硅烷化硅胶用于液相色谱(InertSustain C18HP，GL Sciences Inc.制造)
柱温：40℃
进样量：5μL
流速：1.0mL/分钟
流动相A：将2.04g磷酸二氢钾溶解于1500mL水中，并向其中加入8mol/L氢氧化钾试剂以调节pH至6.6，随后加入500mL乙腈。
流动相B：乙腈
如下所示改变混合物中流动相A和流动相B的比例以控制浓度梯度。
表13
Figure BDA0003144991910000671
流动相B的比例(vol％)
Figure BDA0003144991910000672
该测量方法证实化合物A的保留时间为约18.1分钟。测量方法还证实，CE化合物的保留时间为约8.5分钟，OH化合物的保留时间为约12.3分钟，MA化合物的保留时间为约22.6分钟，二聚体化合物的保留时间为约25.4分钟，且CHO化合物的保留时间为约14.7分钟。结果表明，测量条件可以分离每种相关物质，包括化合物A。
实施例5：通过液相色谱分析化合物A
在下述测试条件下进行HPLC测量。以与实施例4相同的方式进行分析，不同之处在于下述的HPLC条件。
条件：实施例5
流动相A：将2.72g磷酸二氢钾溶解于1800mL水中，并向其中加入0.2mol/L氢氧化钠试剂以调节pH至6.6，然后向1500mL该溶液中加入500mL乙腈。
如下所示改变混合物中流动相A和流动相B的比例以控制浓度梯度。
表14
Figure BDA0003144991910000681
流动相B的比例(vol％)
Figure BDA0003144991910000682
该测量方法证实化合物A的保留时间为约19.9分钟。测量方法还证实，CE化合物的保留时间为约8.3分钟，OH化合物的保留时间为约12.2分钟，MA化合物的保留时间为约30.2分钟，二聚体化合物的保留时间为约35.1分钟，且CHO化合物的保留时间为约14.9分钟。结果表明，该测量条件可以分离每种相关物质，包括化合物A。
实施例6：通过液相色谱分析化合物A
在下述测试条件下进行HPLC测量。HPLC测量中使用的化合物A的溶液与实施例1相同。
条件：实施例6
检测器：紫外吸收光度计(波长：220nm)
柱：不锈钢管(内径：4.6mm，长度：15cm)填充3μm十八烷基硅烷化硅胶用于液相色谱(InertSustain C18HP，GL Sciences Inc.制造)
柱温：40℃
进样量：5μL
流速：1.0mL/分钟
流动相A：将2.04g磷酸二氢钾溶解于1500mL水中，并向其中加入8mol/L氢氧化钾试剂以调节pH至6.6，随后加入500mL乙腈。
流动相B：乙腈
如下所示改变混合物中流动相A和流动相B的比例以控制浓度梯度。
表15
Figure BDA0003144991910000691
流动相B的比例(vol％)
Figure BDA0003144991910000701
该测量方法证实化合物A的保留时间为约19.8分钟。相关物质也得到了很好的分离。这表明该测量条件可以分离每种相关物质，包括化合物A。
测试例2：分离度的确认
在实施例1中的条件下pH 6.8处，在不改变其他条件的情况下将pH改变为6.3、6.6、7.0和7.3的同时确认了化合物B的行为。表16示出了结果。
表16
Figure BDA0003144991910000711
化合物的保留时间比与该化合物进行分离度比较的另一化合物更长的化合物分离度栏表示这两个化合物峰之间的分离度。符号“-”表示CE化合物和化合物B的峰重叠，未计算其分离度。这表明如果化合物B包含在化合物A的原料药或制剂中，除了pH为7.0的条件外，其它条件对于HPLC测量化合物A是可接受的。

Claims (12)

1.一种由下式(1)至(5)中的任何一者表示的化合物或其盐、或其组合：
Figure FDA0003144991900000011
Figure FDA0003144991900000021
2.根据权利要求1所述的化合物或其盐、或其组合，其中所述化合物由式(1)或(2)表示。
3.一种由下式(1)至(5)中的任何一者表示的化合物或其盐、或其组合，所述化合物用作用于控制(S)-1-(3-(4-氨基-3-((3,5-二甲氧基苯基)乙炔基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)吡咯烷-1-基)-2-丙烯-1-酮的质量的标准品：
Figure FDA0003144991900000022
Figure FDA0003144991900000031
4.根据权利要求3所述的化合物或其盐、或其组合，其中所述化合物由式(1)或(2)表示。
5.一种通过高效液相色谱分析(S)-1-(3-(4-氨基-3-((3,5-二甲氧基苯基)乙炔基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)吡咯烷-1-基)-2-丙烯-1-酮的方法，其中通过高效液相色谱所测量的由下式(1)表示的化合物、下式(2)表示的化合物和(S)-1-(3-(4-氨基-3-((3,5-二甲氧基苯基)乙炔基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)吡咯烷-1-基)-2-丙烯-1-酮所组成之群的化合物之间的分离度为1.5以上：
Figure FDA0003144991900000041
6.一种通过高效液相色谱分析(S)-1-(3-(4-氨基-3-((3,5-二甲氧基苯基)乙炔基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)吡咯烷-1-基)-2-丙烯-1-酮的方法，其中通过高效液相色谱所测量的由下式(1)表示的化合物、下式(2)表示的化合物、下式(3)表示的化合物、下式(4)表示的化合物、下式(5)表示的化合物和(S)-1-(3-(4-氨基-3-((3,5-二甲氧基苯基)乙炔基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)吡咯烷-1-基)-2-丙烯-1-酮所组成之群的化合物之间的分离度为1.5以上：
Figure FDA0003144991900000042
Figure FDA0003144991900000051
7.根据权利要求5或6所述的分析方法，其中流动相包括使用磷酸盐将pH调节至6.4以上且6.8以下的缓冲溶液。
8.根据权利要求5-7中任一项所述的分析方法，其中所述流动相是有机相和水相的混合物，且包括第一梯度、第二梯度和第三梯度，在每一个梯度中，所述流动相中的有机相的百分比随着时间的推移以恒定的增加速率增加。
9.根据权利要求5-8中任一项所述的分析方法，其中所述第一梯度中的有机相的增加速率为0.7～2.0体积％/分钟，所述第一梯度的起始时间点为所述测量的起始时间点后0～5分钟，所述第一梯度的终止时间点为所述第一梯度的起始时间点后5～15分钟，所述有机相在所述第一梯度的起始时间点处的百分比是整个流动相的0～15质量％，并且所述有机相在所述第一梯度的终止时间点处的百分比为整个流动相的5～15质量％；
所述第二梯度中的有机相的增加速率为0.3～2.0体积％/分钟，所述第二梯度的起始时间点为所述第一梯度的终止时间点后0～10分钟，所述第二梯度的终止时间点为所述第二梯度的起始时间点后10～20分钟，所述有机相在所述第二梯度的起始时间点处的百分比与所述有机相在所述第一梯度的终止时间点处的百分比相同，并且所述有机相在所述第二梯度的终止时间点处的百分比为整个流动相的15～45质量％；并且
所述第三梯度中的有机相的增加速率为1.0～6.0体积％/分钟，所述第三梯度的起始时间点为所述第二梯度的终止时间点后0～10分钟，所述第三梯度的终止时间点为所述第三梯度的起始时间点后10～20分钟，所述有机相在所述第三梯度的起始时间点处的百分比与所述有机相在所述第二梯度的终止时间点处的百分比相同，并且所述有机相在所述第三梯度的终止时间点处的百分比为整个流动相的45～75质量％。
10.根据权利要求5-9中任一项所述的分析方法，其中使用十八烷基硅烷化硅胶柱。
11.根据权利要求5-10中任一项所述的分析方法，其中使用基于水相总量以15～40体积％的量包括乙腈的水相。
12.根据权利要求5-11中任一项所述的分析方法，其中使用流动相清洁剂。
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