CN113257355A - 与鸡蛋相关的交叉过敏原作用表位的确定方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及与鸡蛋相关的交叉过敏原作用表位的确定方法，包括：S1、通过NCBI检索鸡蛋主要过敏原的氨基酸序列；S2、手动输入某食物主要过敏原的氨基酸序列，通过Uniprot网页工具中的Align工具比对输入的过敏原与鸡蛋过敏原的序列相似性，预测是否存在交叉过敏；S3、判断存在交叉过敏的情况下，通过DNAstar软件中Protean工具预测存在交叉过敏的鸡蛋过敏原的二级结构及抗原表位；S4、基于S3的预测，采用Blastp网页工具分析确定存在交叉过敏的该鸡蛋过敏原和过敏原蛋白的相似序列；S5、根据S2交叉过敏反应的蛋白制备相应的单抗或多抗，应用免疫印迹法和ELISA法识别交叉过敏原，进一步合成步骤S4所确定的相似序列，用血清学鉴定该相似序列是否为作用表位。

Description

与鸡蛋相关的交叉过敏原作用表位的确定方法
技术领域
本发明涉及食品安全技术领域，尤其涉及一种与鸡蛋相关的交叉过敏原作用表位的确定方法。
背景技术
对过敏食物的研究已成为食品安全问题的关注点之一。食物过敏反应，是在某些外源蛋白质进入机体后由IgE或IgG介导的一种免疫反应。食物过敏问题是重要的公共健康问题，并呈上升趋势。对某种食物过敏的人食用其他食物也可能产生过敏反应，这称为食物的交叉过敏。一些研究表明，对完全不同的过敏原的交叉反应可能发生在同一生物体内。这可能是由于2种过敏原具有相似的线性表位，从而发生交叉过敏反应，例如，对孢子过敏的病人可能发生替代性食物的交叉反应。已经证明，苹果和芹菜的食物过敏原中存在交叉过敏反应。将对腰果过敏的小鼠接触核桃过敏原，小鼠会产生对核桃的过敏反应。研究人员在瓜类、香蕉和豚草间记录了交叉致敏性。对食物过敏原和其他过敏原之间存在的交叉过敏反应也有陆续的报道。目前IgE抗原性和IgE交叉反应性不能可靠地用作发生食物过敏的存在或可能性的指标。同样，抗原的结构特征并不总是与变应原性、过敏反应的严重程度相关，使得蛋白质结构预测在基于人群的食物过敏预测中也存在一定的问题。
食物交叉过敏的流行和复杂性将增加过敏的发生，因此在食品过敏学领域，交叉过敏反应研究越来越被重视。目前，对于鸡蛋交叉过敏原的研究正在进行。Mozhgan等使用鸽，鸭，鹅，火鸡，鹌鹑等禽蛋新鲜提取物对52例鸡蛋过敏儿童进行皮肤点刺实验，结果50例(96.1％)的鸡蛋过敏儿童对至少一种禽蛋表现出过敏性。Langeland基于定量免疫电泳技术证明了在鸡，鹅，火鸡，鸭，鹌鹑和海鸥的禽蛋之间存在交叉反应性。Wolfgang Hemmer等描述了在对羽毛和家禽羽毛过敏的人(禽蛋综合症)中，发现他们对鸡蛋产生了交叉过敏反应的现象。组成鸡蛋的不同变应原成分之间也有交叉反应性，这是由于分子结构中存在常见的变应原决定因素而引起的。除此之外，国内外关于鸡蛋交叉过敏原的其他研究报道较为少见，因此，开展鸡蛋交叉过敏原的研究具有重要意义。
发明内容
(一)要解决的技术问题
鉴于现有技术的上述缺点、不足，本发明提供一种与鸡蛋相关的交叉过敏原作用表位的确定方法，能够高效、快速、准确地预测或确定鸡蛋与其他食物交叉过敏原作用表位，为避免交叉过敏反应的发生具有重要意义，为开发低过敏性食品提供理论依据。
(二)技术方案
为了达到上述目的，本发明采用的主要技术方案包括：
本发明提供一种与鸡蛋相关的交叉过敏原作用表位的确定方法，所述方法包括：
S1、通过NCBI检索鸡蛋主要过敏原的氨基酸序列；
S2、手动输入某食物主要过敏原的氨基酸序列，通过Uniprot网页工具中的Align工具比对输入的过敏原与鸡蛋过敏原的序列相似性，预测是否存在交叉过敏原；若鸡蛋的某过敏原蛋白与该食物的过敏原蛋白之间存在任一80个以上氨基酸序列相似性≥30％，则预判该对过敏原蛋白存在交叉过敏；反之，则预判不存在交叉过敏；
S3、在预判存在交叉过敏的情况下，通过DNAstar软件中的Protean工具预测存在交叉过敏的该鸡蛋过敏原的二级结构及抗原表位；
S4、基于S3的预测结果，采用Blastp网页工具分析确定所述存在交叉过敏的该鸡蛋过敏原和过敏原蛋白的相似序列；
S5、根据S2预判的存在交叉过敏反应的蛋白，制备相应的单抗或多抗，应用免疫印迹法和ELISA方法识别交叉过敏原，进一步合成和纯化步骤S4所确定的所述相似序列，用血清学鉴定该相似序列是否为作用表位。
根据本发明较佳实施例，S1中，所述鸡蛋主要过敏原为6种蛋白，分别为：卵类黏蛋白(NCBI检索登录号为P01005)、卵清蛋白(NCBI检索登录号为P01012)、卵转铁蛋白(NCBI检索登录号为P02789)，溶菌酶(NCBI检索登录号为P00698)，α-卵黄蛋白(NCBI检索登录号为P19121)，卵黄糖蛋白42(NCBI检索登录号为P87498)。
根据本发明较佳实施例，S2中，通过Uniprot工具手动输入牛乳的主要过敏原蛋白，包括:α-乳白蛋白、β-乳球蛋白、血清白蛋白、免疫球蛋白、αs1-酪蛋白、αs2-酪蛋白、β-酪蛋白、κ-酪蛋白。
根据本发明较佳实施例，S2中，通过比对确定鸡蛋中的溶菌酶与牛乳中的α-乳白蛋白序列相似性为34.459％，鸡蛋中的α-卵黄蛋白与牛乳中的血清白蛋白序列相似性为44.065％；因此预判溶菌酶与α-乳白蛋，α-卵黄蛋白与牛乳血清白蛋白存在交叉过敏。
根据本发明较佳实施例，S3中，利用Protean工具预测鸡蛋溶酶菌可能的抗原表位为：4-6，48-51，98-100，112-114，123-126，140-142，157-164，180-182，192-196，208-211；α-卵黄蛋白可能的抗原表位为：18-21，36-39，122-125，141-144，156-159，248-251，362-365，391-393，469-472，488-490，509-513。
根据本发明较佳实施例，步骤S3中，还包括：采用BEPIPRED-1.0网络工具预测鸡蛋溶酶菌和α-卵黄蛋白的线性表位；将Protean工具预测的抗原表位的预测结果结合采用BEPIPRED-1.0网络工具预测的线性表位的预测结果，作为步骤S4分析确定交叉过敏原相似序列的基础。
采用Protean工具来预测鸡蛋溶酶菌和α-卵黄蛋白的二级结构和抗原表位，而采用BEPIPRED-1.0预测鸡蛋溶酶菌和α-卵黄蛋白的线性表位。使用两种工具预测的结果作为Blastp工具分析的参考，根据预测的抗原表位和预测的线性表位，指导后续采用Blastp工具分析时确定用溶酶菌或α-卵黄蛋白的哪段序列与交叉过敏原比对。
根据本发明较佳实施例，S4中，基于S3的预测结果，通过Blastp工具分析溶菌酶与α-乳白蛋白具有2条相似序列：溶菌酶氨基酸序列中的第56-71位与α-乳白蛋白氨基酸序列的第55-69位(Y55DTQAIVQNNDSTEY69)；溶菌酶氨基酸序列中的第81-95位与α-乳白蛋白氨基酸序列的第79-93位(W79CKDDQNPHSSNICN93)；
通过Blastp分析α-卵黄蛋白与牛乳血清白蛋白有6条相似序列：依次为：α-卵黄蛋白氨基酸序列中的第26-35位与血清白蛋白氨基酸序列的第24-32位(R24DTHKSEIA32)；α-卵黄蛋白氨基酸序列中的第80-94位与血清白蛋白氨基酸序列的第312-326位(C312IAEVEKDAIPENLP326)；α-卵黄蛋白氨基酸序列中的第115-125位与血清白蛋白氨基酸序列的第112-122位(A112DCCEKQEPER122)；α-卵黄蛋白氨基酸序列中的第323-335位与血清白蛋白氨基酸序列的第525-554位(F525DEKLFTFHADICTLPDTEKQIKKQTALVE554)；α-卵黄蛋白氨基酸序列中的第525-535位与血清白蛋白氨基酸序列的第520-530位(Y520VPKAFDEKLF530)；α-卵黄蛋白氨基酸序列中的第560-570位与血清白蛋白氨基酸序列的第555-565位(L555LKHKPKATEE565)。
根据本发明较佳实施例，步骤S5中的过程包括：
(1)采用Fmoc固相肽合成法，将C-末端氨基酸连接到一种合适的固相载体上，采用Fmoc法进行逐步缩合，合成结束后，用强酸将序列从固相载体上切割下来，经HPLC纯化，冷冻干燥后备用；合成乳白蛋白的序列为Y55DTQAIVQNNDSTEY69和W79CKDDQNPHSSNICN93；合成血清白蛋白的序列为R24DTHKSEIA32，C312IAEVEKDAIPENLP326，A112DCCEKQEPER122，F525DEKLFTFHADICTLPDTEKQIKKQTALVE554，Y520VPKAFDEKLF530和L555LKHKPKATEE565；
(2)依次通过间接ELISA鉴定上述8条相似序列是否与血清抗体发生免疫反应，最终确定溶菌酶交叉过敏原α-乳白蛋白线性序列为Y55DTQAIVQNNDSTEY69和W79CKDDQNPHSSNICN93；α-卵黄蛋白交叉过敏原牛血清白蛋白线性序列为C312IAEVEKDAIPENLP326、F525DEKLFTFHADICTLPDTEKQIKKQTALVE554、Y520VPKAFDEKLF530和L555LKHKPKATEE565。
S5中，制备抗体时，通过免疫Balb/c小鼠制备α-乳白蛋白单克隆抗体，通过免疫新西兰白兔分别制备溶菌酶、牛血清白蛋白的多克隆抗体；采用间接酶联免疫(ELISA)方法测定单抗的效价，结果显示抗体效价均较高，质量较好，可适用于后期的血清学实验。α-乳白蛋白单克隆抗体的制备及效价鉴定，溶菌酶多克隆抗体及效价鉴定、牛血清白蛋白的多克隆抗体及效价鉴定仔细的下文中。
本发明通过特定比对方法，确定溶菌酶与牛乳α-乳白蛋白的序列相似性为34.459％，α-卵黄蛋白与牛乳血清白蛋白序列相似性为44.065％，说明溶菌酶与牛乳α-乳白蛋白，α-卵黄蛋白与牛乳血清白蛋白存在潜在的交叉过敏原，再采用多种预测方法相结合，分析确定鸡蛋与交叉过敏原的相似序列，再用血清学鉴定相似序列是否为鸡蛋交叉过敏原的作用表位。
目前，过Uniprot网络数据库对鸡蛋过敏原与其他七种食物主要过敏原进行序列比对，得到溶菌酶与牛乳α-乳白蛋白的序列相似性为34.459％，α-卵黄蛋白与牛乳血清白蛋白序列相似性为44.065％，这是之前未见报道的。通过预测手段，预测出溶菌酶与α-乳白蛋白有2条相似序列，溶菌酶氨基酸序列中的第56-71位和第81-95位分别与α-乳白蛋白氨基酸序列的第55-69位和第79-93位是相似序列，α-卵黄蛋白氨基酸序列中的第26-35位、第80-94位、第115-125位、第323-335位、第525-535位、第560-570位分别与血清白蛋白氨基酸序列的第24-32位、第312-326位、第112-122位、第525-554位、第520-530位、第555-565位是相似序列，都是之前未见报道的。最后，通过血清学方法最终识别的牛乳α-乳白蛋白作用表位W79CKDDQNPHSSNICN93与目前已经确认的α-乳白蛋白IgE表位均不相同；α-卵黄蛋白交叉过敏原牛血清白蛋白作用表位C312IAEVEKDAIPENLP326、F525DEKLFTFHADICTLPDTEKQIKKQTALVE554、Y520VPKAFDEKLF530和L555LKHKPKATEE565也未见相关报道。
(三)有益效果
本发明提供了一种鉴定与鸡蛋是否存在交叉过敏反应的食源性蛋白的方法，首先通过生物学信息工具来预测是否有交叉过敏的可能性以及预测存在交叉过敏反应的蛋白原，并一步在基于Protean工具预测的鸡蛋过敏原蛋白二级结构及抗原表位和/或BEPIPRED-1.0工具预测的线性表位，采用Blastp网页工具分析确定交叉过敏反应的鸡蛋过敏原和过敏原蛋白的相似序列，最后按照预判存在交叉过敏反应的蛋白分别制备相应的单抗或多抗，应用免疫印迹法和ELISA方法识别交叉过敏原以验证和确认存在交叉过敏原。同时，进一步合成分析鸡蛋交叉过敏原的相似序列，用血清学鉴定该相似序列是否为交叉过敏原的作用表位。
本发明首先进行鸡蛋主要过敏原氨基酸序列与其他食物主要过敏原氨基酸序列进行相似性判断，以判断是否可能存在潜在的交叉过敏原并确定可能存在交叉过敏的蛋白，合成其相应的单抗或多抗，应用免疫印迹法和ELISA方法识别交叉过敏原；采用Protean工具和BEPIPRED-1.0工具预测抗原表位和线性表位，为后续采用Blastp工具分析时可锁定用哪段序列(用预测的抗原表位/线性表位、或其所在的一段序列、或其所在附近位置的一段序列、或两个预测位置的连接序列)与交叉过敏原进行比对，以便找出交叉过敏原的相似序列，进一步用血清学鉴定作用表位。本发明利用多种生物学信息工具进行预测，基于预测结果进行血清学鉴定，有效缩小了筛选范围，提高了鉴定和识别效率。
附图说明
图1为DNAstar软件Protean预测鸡蛋溶菌酶的二级结构参数。
图2为DNAstar软件Protean预测鸡蛋α-卵黄蛋白的二级结构参数。
图3为间接ELISA测定溶菌酶与α-乳白蛋白抗体反应的OD值均值。
图4为间接ELISA测定牛乳蛋白与溶菌酶抗体反应的OD值均值。
图5为间接ELISA测定蛋黄蛋白与牛血清白蛋白抗体反应的OD值均值。
图6为脱脂牛乳及其α-乳白蛋白SDS-PAGE电泳图谱。
图7为脱脂牛乳及α-乳白蛋白免疫印迹结果。
图8为卵清、卵黄蛋白和牛乳蛋白SDS-PAGE电泳图谱；图中，1表示蛋白Marker，2表示卵清蛋白，3为卵黄蛋白，4为牛乳蛋白。
图9为牛乳蛋白、卵清蛋白与α-乳白蛋白单克隆抗体反应的免疫印迹图。
图10为牛乳蛋白、卵清蛋白与小鼠阴性血清反应的免疫印迹图。
图11为牛乳蛋白、卵清蛋白与溶菌酶多克隆抗体反应的免疫印迹图。
图12为牛乳蛋白、卵清蛋白与兔阴性血清反应的免疫印迹图。
图13为牛乳蛋白、卵黄蛋白与牛血清白蛋白多克隆抗体反应的免疫印迹图。
图14为牛乳蛋白、卵黄蛋白与兔阴性血清反应的免疫印迹图。
图15为合成的相似序列Y55DTQAIVQNNDSTEY69的液相质谱鉴定图。
图16为合成的相似序列W79CKDDQNPHSSNICN93的液相质谱鉴定图。
图17为血清学鉴定交叉过敏原作用表位。
具体实施方式
为了更好的解释本发明，以便于理解，下面结合附图，通过具体实施方式，对本发明作详细描述。本发明的叙述包括如下内容：
(一)鸡蛋过敏原的氨基酸序列
鸡蛋的主要过敏原包括6种，分别是卵类黏蛋白(NCBI检索登录号为P01005)、卵清蛋白(NCBI检索登录号为P01012)、卵转铁蛋白(NCBI检索登录号为P02789)，溶菌酶(NCBI检索登录号为P00698)，α-卵黄蛋白(NCBI检索登录号为P19121)，卵黄糖蛋白42(NCBI检索登录号为P87498)。根据NCBI中各鸡蛋过敏原的登录号检索出的鸡蛋过敏原氨基酸序列如下：
卵类黏蛋白：
M1AMAGVFVLFSFVLCGFLPDAAFGAEVDCSRFPNATDKEGKDVLVCNKDLRPICGTDGVTYTNDCLLCAYSIEFGTNISKEHDGECKETVPMNCSSYANTTSEDGKVMVLCNRAFNPVCGTDGVTYDNECLLCAHKVEQGASVDKRHDGGCRKELAAVSVDCSEYPKPDCTAEDRPLCGSDNKTYGNKCNFCNAVVESNGTLTLSHFGKC210
卵清蛋白：
M1GSIGAASMEFCFDVFKELKVHHANENIFYCPIAIMSALAMVYLGAKDSTRTQINKVVRFDKLPGFGDSIEAQCGTSVNVHSSLRDILNQITKPNDVYSFSLASRLYAEERYPILPEYLQCVKELYRGGLEPINFQTAADQARELINSWVESQTNGIIRNVLQPSSVDSQTAMVLVNAIVFKGLWEKAFKDEDTQAMPFRVTEQESKPVQMMYQIGLFRVASMASEKMKILELPFASGTMSMLVLLPDEVSGLEQLESIINFEKLTEWTSSNVMEERKIKVYLPRMKMEEKYNLTSVLMAMGITDVFSSSANLSGISSAESLKISQAVHAAHAEINEAGREVVGSAEAGVDAASVSEEFRADHPFLFCIKHIATNAVLFFGRCVSP386
卵转铁蛋白：
M1KLILCTVLSLGIAAVCFAAPPKSVIRWCTISSPEEKKCNNLRDLTQQERISLTCVQKATYLDCIKAIANNEADAISLDGGQAFEAGLAPYKLKPIAAEVYEHTEGSTTSYYAVAVVKKGTEFTVNDLQGKTSCHTGLGRSAGWNIPIGTLLHRGAIEWEGIESGSVEQAVAKFFSASCVPGATIEQKLCRQCKGDPKTKCARNAPYSGYSGAFHCLKDGKGDVAFVKHTTVNENAPDQKDEYELLCLDGSRQPVDNYKTCNWARVAAHAVVARDDNKVEDIWSFLSKAQSDFGVDTKSDFHLFGPPGKKDPVLKDLLFKDSAIMLKRVPSLMDSQLYLGFEYYSAIQSMRKDQLTPSPRENRIQWCAVGKDEKSKCDRWSVVSNGDVECTVVDETKDCIIKIMKGEADAVALDGGLVYTAGVCGLVPVMAERYDDESQCSKTDERPASYFAVAVARKDSNVNWNNLKGKKSCHTAVGRTAGWVIPMGLIHNRTGTCNFDEYFSEGCAPGSPPNSRLCQLCQGSGGIPPEKCVASSHEKYFGYTGALRCLVEKGDVAFIQHSTVEENTGGKNKADWAKNLQMDDFELLCTDGRRANVMDYRECNLAEVPTHAVVVRPEKANKIRDLLERQEKRFGVNGSEKSKFMMFESQNKDLLFKDLTKCLFKVREGTTYKEFLGDKFYTVISSLKTCNPSDILQMCSFLEGK705
溶菌酶：
M1RSLLILVLCFLPLAALGKVFGRCELAAAMKRHGLDNYRGYSLGNWVCAAKFESNFNTQATNRNTDGSTDYGILQINSRWWCNDGRTPGSRNLCNIPCSALLSSDITASVNCAKKIVSDGNGMNAWVAWRNRCKGTDVQAWIRGCRL147
α-卵黄蛋白：
M1KWVTLISFIFLFSSATSRNLQRFARDAEHKSEIAHRYNDLKEETFKAVAMITFAQYLQRCSYEGLSKLVKDVVDLAQKCVANEDAPECSKPLPSIILDEICQVEKLRDSYGAMADCCSKADPERNECFLSFKVSQPDFVQPYQRPASDVICQEYQDNRVSFLGHFIYSVARRHPFLYAPAILSFAVDFEHALQSCCKESDVGACLDTKEIVMREKAKGVSVKQQYFCGILKQFGDRVFQARQLIYLSQKYPKAPFSEVSKFVHDSIGVHKECCEGDMVECMDDMARMMSNLCSQQDVFSGKIKDCCEKPIVERSQCIMEAEFDEKPADLPSLVEKYIEDKEVCKSFEAGHDAFMAEFVYEYSRRHPEFSIQLIMRIAKGYESLLEKCCKTDNPAECYANAQEQLNQHIKETQDVVKTNCDLLHDHGEADFLKSILIRYTKKMPQVPTDLLLETGKKMTTIGTKCCQLGEDRRMACSEGYLSIVIHDTCRKQETTPINDNVSQCCSQLYANRRPCFTAMGVDTKYVPPPFNPDMFSFDEKLCSAPAEEREVGQMKLLINLIKRKPQMTEEQIKTIADGFTAMVDKCCKQSDINTCFGEEGANLIVQSRATLGIGA615
卵黄糖蛋白42：
P1628EIASQIAQEDQSTCEVSKGDFKTFDRMSFTCSFNKSCNVVVAQDCTEHPKFIITTRKVDHQSLSREVHINTSSANITICPAADSSLLVTCNKESVLSDSGVSEYEKDNIKIYKNGKTVIVEAPIHGLKNVNFDGEILKVTVASWMRGKTCGVCGNNDREKHNELLMPNHKLAHSCSAFVHSWVLLEETCSGGCKLQRRYVKLNRNPTIDGEESTCYSVDPVLKCMKDCTPIEKTSVKVGFHCFPKATAVSLLEWQRSSDKKSASEDVVESVDADIDCTCTGDCS1912
(二)通过Uniprot手动输入7类食物主要过敏原的氨基酸序列，将其分别与鸡蛋过敏原氨基酸序列进行比对，分析其序列相似性，预测可能的交叉过敏原。这7种食物分别为牛乳、花生、大豆、小麦、虾、鱼、腰果。
牛乳α-乳白蛋白包括8种主要过敏原：α-乳白蛋白、β-乳球蛋白、血清白蛋白、免疫球蛋白、αs1-酪蛋白、αs2-酪蛋白、β-酪蛋白和κ-酪蛋白。花生的主要过敏原为4种：Ara h1、Ara h2、Ara h3、Ara h6。大豆的主要过敏原为3种：Gly m Bd 28K、Gly m Bd 30K、Gly m Bd60K。小麦主要过敏原为7种：Tria 14、Tria 33、Tria 37、Tria 21、Tria 20、Tria 19和Tria36。虾的主要过敏原有4种：Litv 1、Litv 2、Litv 3和Litv 4。鱼的主要过敏原为小清蛋白。腰果的主要过敏原为11s球蛋白。
分别将上述7种食物的主要过敏原一一与鸡蛋的6种过敏原的氨基酸序列进行比对相似性，结果如下：
(1)鸡蛋过敏原与牛乳主要过敏原序列比对结果
Figure BDA0003069974220000101
Figure BDA0003069974220000111
根据上表可知，鸡蛋过敏原与牛乳中主要过敏原的序列相似性在1％-45％之间，其中，溶菌酶与α-乳白蛋白序列相似性为34.459％，α-卵黄蛋白与牛乳血清白蛋白序列相似性为44.065％。
预测鸡蛋的溶菌酶与牛乳α-乳白蛋白、鸡蛋的α-卵黄蛋白与牛乳血清白蛋白可能是潜在的交叉致敏性，而鸡蛋过敏原与牛乳中其他过敏原发生交叉过敏反应的概率相对较小。
(2)鸡蛋过敏原与花生主要过敏原序列比对结果
Figure BDA0003069974220000121
根据上表可知，鸡蛋过敏原与花生中主要过敏原的序列相似性在1％-15％之间，相似性非常低，判断鸡蛋过敏原与花生中主要过敏原之间发生交叉过敏反应的概率相对较小。
(3)鸡蛋过敏原与大豆主要过敏原序列比对结果
Figure BDA0003069974220000122
Figure BDA0003069974220000131
根据上表可知，鸡蛋过敏原与大豆中主要过敏原的序列相似性在4-13％之间，相似度很低，判断鸡蛋过敏原与大豆中主要过敏原之间发生交叉过敏反应的概率很小。
(4)鸡蛋过敏原与小麦主要过敏原序列比对结果
Figure BDA0003069974220000132
Figure BDA0003069974220000141
根据上表可知，鸡蛋过敏原与小麦中主要过敏原的序列相似性在0.5％-24％之间，相似度很低，判断鸡蛋过敏原与小麦中主要过敏原之间发生交叉过敏反应的概率很小。
(5)鸡蛋过敏原与虾主要过敏原序列比对结果
Figure BDA0003069974220000142
根据上表可知，鸡蛋过敏原与虾主要过敏原的序列相似性在1％-17％之间，相似度很低，判断鸡蛋过敏原与虾主要过敏原之间发生交叉过敏反应的概率很小。
(6)鸡蛋过敏原与鱼主要过敏原序列比对结果
Figure BDA0003069974220000143
Figure BDA0003069974220000151
根据上表可知，鸡蛋过敏原与鱼中主要过敏原的序列相似性在1％-8％之间，相似度极低，判断鸡蛋过敏原与鱼中主要过敏原之间发生交叉过敏反应的概率很小。
(7)鸡蛋过敏原与腰果主要过敏原序列比对结果
Figure BDA0003069974220000152
根据上表可知，蛋过敏原与腰果主要过敏原的序列相似性在4％-12％之间，相似程度极低，我们推断鸡蛋过敏原与腰果主要过敏原之间发生交叉过敏反应的概率很小。
经过上述分析判断，鸡蛋中溶菌酶与α-乳白蛋白序列相似性为34.459％，α-卵黄蛋白与牛乳血清白蛋白序列相似性为44.065％，α-卵黄蛋白与牛乳血清白蛋白，溶菌酶与牛乳α-乳白蛋白可能存在交叉过敏反应。后续进行的应用免疫印迹法和间接ELISA方法识别交叉过敏原时，则需要预先制备溶菌酶、α-乳白蛋、α-卵黄蛋白及牛乳血清白蛋的单抗或多抗。
(三)使用DNAstar软件Protean工具对鸡蛋溶菌酶和α-卵黄蛋白的二级结构和及抗原表位进行预测
蛋白质的二级结构信息与抗原表位的形成具有一定关系。通过分析这些结构来预测得到蛋白质抗原表位。β折叠和无规则卷曲区域是表位形成的常见位置，若两者在氨基酸序列中占比较高，则该区域出现表位的可能性较高。预测的序列中亲水区域较多，则这个蛋白质的亲水性能较高。序列中表面可及性区域越多，则表示该段序列易发生折叠，有利于形成抗原表位。因此认为，位于β折叠和无规则卷曲区域且当抗原指数>0，亲水性>0，表面可及性>1时，形成表位的可能性大。
如图1所示，为DNAstar软件Protean预测鸡蛋溶菌酶的二级结构。如图2所示，为DNAstar软件Protean工具预测鸡蛋α-卵黄蛋白的二级结构。溶菌酶共有147个氨基酸残基，根据图中信息推测出溶菌酶可能的抗原表位为：4-6，48-51，98-100，112-114，123-126，140-142，157-164，180-182，192-196，208-211。α-卵黄蛋白共有615个氨基酸残基，根据图中信息推测出α-卵黄蛋白可能的抗原表位为：18-21，36-39，122-125，141-144，156-159，248-251，362-365，391-393，469-472，488-490，509-513。
(四)使用Bepipred 1.0工具预测溶菌酶和α-卵黄蛋白的线性表位
通过Bepipred 1.0预测的溶菌酶线性表位为AA55-71、82-91、117-123、133-137。预测的α-卵黄蛋白线性表位为AA40-43、81-92、118-125、137-148、155-157、198-201、217-221、250-257、323-331、364-366、390-400、402-404、413-416、442-446、457-459、490-500、522-535、542-551、565-570、572-574、595-598。由于AA40-43、155-157、198-201、217-221、323-331、364-366、402-404、413-416、442-446、457-459、572-574、595-598区域所含的氨基酸数目太少，无法构成线性表位，故应剔除。最终得到的溶菌酶和α-卵黄蛋白线性表位如下表：
Figure BDA0003069974220000161
上述(三)采用Protean工具预测的抗原表位的序列都很短，只有2-4个氨基酸，不能构成表位(一般要求大于8个才能构成表位)。因而需要采用Bepipred 1.0工具预测线性表位作为补充，与Protean工具预测的抗原表位结合起来，共同作为Blastp工具分析溶菌酶与α-乳白蛋白、α-卵黄蛋白与牛乳血清白蛋白的相似序列的基础。
在进行鸡蛋与其他食源性蛋白交叉过敏分析时，同样可采用Protean工具预测抗原表位、同时采用Bepipred 1.0工具预测线性表位，以预测的抗原表位和线性表位的集合为依据，选取鸡蛋过敏原的某些肽段与交叉过敏原进行比对分析，找出相似序列。
(五)使用Blastp工具分析溶菌酶与α-乳白蛋白、α-卵黄蛋白与牛乳血清白蛋白的相似序列
在参考(三)中溶菌酶序列和α-卵黄蛋白的二级结构及抗原表位预测结果和(四)中线性表位预测结果的基础上，通过Blastp分析鸡蛋“溶菌酶”与牛乳“α-乳白蛋白”、鸡蛋“α-卵黄蛋白”和“牛乳血清白蛋白”的相似序列，结果若下表：
(1)溶菌酶与α-乳白蛋白的相似序列
Figure BDA0003069974220000171
(2)α-卵黄蛋白与牛乳血清白蛋白的相似序列
Figure BDA0003069974220000172
由此可知，溶菌酶与α-乳白蛋白有2条相似序列，即：溶菌酶氨基酸序列中的第56-71位与α-乳白蛋白氨基酸序列的第55-69位是相似序列，得分21、E值为3e-4、相似性50％、高相似区68％、空位6％；溶菌酶氨基酸序列中的第81-95位与α-乳白蛋白氨基酸序列的第79-93位是相似序列，得分24.4、E值为2e-5、相似性53％、高相似区53％、空位0％。
同理，基于二级结构及抗原表位结果确定α-卵黄蛋白序列，通过Blastp分析α-卵黄蛋白与牛乳血清白蛋白的相似序列有6条序列，结果显示：α-卵黄蛋白氨基酸序列中的第26-35位与血清白蛋白氨基酸序列的第24-32位是相似序列，得分24、E值为4e-5、相似性80％、高相似区80％、空位10％；α-卵黄蛋白氨基酸序列中的第80-94位与血清白蛋白氨基酸序列的第312-326位是相似序列，得分12.1、E值为1.6、相似性50％、高相似区55％、空位33％；α-卵黄蛋白氨基酸序列中的第115-125位与血清白蛋白氨基酸序列的第112-122位是相似序列，得分28.2、E值为1e-6、相似性73％、高相似区81％、空位0％；α-卵黄蛋白氨基酸序列中的第323-335位与血清白蛋白氨基酸序列的第525-554位是相似序列，得分18、E值为0.013、相似性37％、高相似区36％、空位56％；α-卵黄蛋白氨基酸序列中的第525-535位与血清白蛋白氨基酸序列的第520-530位是相似序列，得分15.5、E值为0.1、相似性45％、高相似区63％、空位0％；α-卵黄蛋白氨基酸序列中的第560-570位与血清白蛋白氨基酸序列的第555-565位是相似序列，得分20.6、E值为7e-4、相似性64％、高相似区63％、空位0％。
(六)通过免疫印迹实验验证鸡蛋溶菌酶与α-乳白蛋白以及α-卵黄蛋白与牛血清白蛋白之间的交叉过敏反应；通过合成第(五)部分确认的8条相似序列(溶菌酶与α-乳白蛋白有2条、α-卵黄蛋白与牛乳血清白蛋白的相似序列有6条)，通过间接ELISA方法进一步识别交叉过敏原的线性表位。具体包括如下步骤：
(1)准备实验材料
①溶菌酶，牛血清白蛋白Sigma公司；溶菌酶多克隆抗体、牛血清白蛋白多克隆抗体、α-乳白蛋白单克隆抗体来自中国科学院遗传与发育生物学研究所动物实验中心。
②实验试剂
Figure BDA0003069974220000191
③实验仪器
KHB ST-360酶标仪上海科华实验系统有限公司；DYY-7C型电泳仪北京市六一仪器厂；BSA124S-CW电子天平赛多利斯科学仪器有限公司。
(2)制备α-乳白蛋白单克隆抗体及测定效价
用牛乳α-乳白蛋白免疫Balb/c小鼠，四次免疫后取小鼠脾细胞与NS-1骨髓瘤细胞相融合，筛选出阳性杂交瘤细胞并进行多次亚克隆，待细胞活性达到最佳状态时，将杂交瘤细胞注射到Balb/c小鼠的腹腔内，待可明显观察到小鼠腹部隆起时，收集腹水。
采用小鼠Ig G1、IgG2、IgG2a、IgE ELISA试剂盒鉴定，按照使用说明书操作，鉴定其亚型为IgG1。
采用间接酶联免疫(ELISA)方法测定单抗的效价。通过方阵法测定，抗原包被浓度均为5μg/mL，单抗依次按1:5000，1:10000，1:20000，1:40000，1:80000，1:160000，1:320000，1:640000倍数稀释。以未被免疫的小鼠血清作为阴性对照，用酶标仪测450nm处的吸光度值(OD)。结果如下表所示：
α-乳白蛋白单克隆抗体效价的OD值
Figure BDA0003069974220000201
上表中，P表示抗体的OD值，N表示未被免疫的小鼠血清的OD值。检测时以P/N值>2.1判定检测结果为阳性，P/N值<2.1判定检测结果为阴性。在抗体稀释倍数大于等于320000时，P/N值大于2.1，但当稀释度为640000时，P/N值小于2.1，因此由α-乳白蛋白制备的单抗效价可达到320000。
(3)制备溶菌酶、牛血清白蛋白多克隆抗体及测定效价
用鸡蛋溶菌酶、牛血清白蛋白分别免疫新西兰白兔，得到溶菌酶、牛血清白蛋白多克隆抗体，具体步骤如下：
①取体重为2000-2500克新西兰白兔1只，本实验室观察7-14天，身体状态良好备用。
②第一次免疫(第1天)取体积小于等于1mL抗原(约1mg蛋白)和等体积弗氏完全佐剂(Sigma)乳化至混合物在水中不扩散。家兔背部皮下6-8点，双后脚皮下免疫。
③第二次免疫(第22天)取0.5mL抗原和等体积弗氏不完全佐剂(Sigma)乳化至混合物在水中不扩散，家兔背部皮下4-6点免疫。
④第三次免疫(第36天)取0.5mL抗原，免疫位置同第二次免疫。
⑤家兔耳缘静脉取1mL血(第50天)，离心分离血清检测效价用。
⑥第四次免疫(第50天)取1mL抗原，免疫位置同第二次免疫。
⑦取全血(第60天)，家兔颈动脉插管放血至死亡，放在37℃温箱中30分钟后室温放置3小时，10000转/分钟离心10分钟后分离血清40-60mL。
采用间接酶联免疫(ELISA)方法测定多抗的效价。通过方阵法测定，以5μg/mL的溶菌酶作为包被抗原，横向抗体按1:3200，1:6400，1:12800，1:25600，1:51200，1:102400，1:204800倍数稀释。同样以5μg/mL的牛血清白蛋白作为包被抗原，横向抗体按1:800，1:1600，1:3200，1:6400，1:12800，1:25600，1:51200倍数稀释。以未被免疫的兔子血清作为阴性对照，用酶标仪测450nm处的吸光度值(OD)。结果如下表所示：
测定溶菌酶多克隆抗体效价的OD值
Figure BDA0003069974220000211
上表中，P表示抗体的OD值，N表示未被免疫的兔子阴性血清的OD值。检测时以P/N值>2.1判定检测结果为阳性，P/N值<2.1判定检测结果为阴性。在抗体稀释倍数大于等于51200时，P/N值大于2.1，但当稀释度为102400时，P/N值小于2.1，因此由溶菌酶制备的多抗效价可达到51200。
采用上述相同方法测定牛血清白蛋白多克隆抗体效价的OD值如下表：
Figure BDA0003069974220000221
上表中，P表示抗体的OD值，N表示未被免疫的兔子阴性血清的OD值。检测时以P/N值>2.1判定检测结果为阳性，P/N值<2.1判定检测结果为阴性。在抗体稀释倍数大于等于12800时，P/N值大于2.1，但当稀释度为25600时，P/N值小于2.1，因此由牛血清白蛋白制备的多抗效价可达到12800。
至此，制备的α-乳白蛋白单克隆抗体、溶菌酶多克隆抗体、牛血清白蛋白多克隆抗体均具有很高的效价，可以用于接下来的间接ELISA鉴别交叉过敏反应实验。
(4)间接ELISA鉴别交叉过敏反应
间接ELISA方法的基本流程为：
①酶标板中加入稀释后的抗原包被液，每孔100μL，4℃过夜。
②PBST洗板3次，每孔200μL，甩干。
③加入封闭液进行封闭，每孔100μL，37℃下静置1h。
④将不同稀释度的一抗加入酶标板内，每孔100μL，孵育2h(37℃)。
⑤将羊抗鼠IgG二抗加入到酶标板中，每孔100μL，37℃静置1h后洗板。
⑥将新鲜配置的底物应用液加入到酶标板中，每孔100μL，常温暗处反应20min。
⑦加2mol/L硫酸终止反应，每孔50μL。
⑧测定各孔的吸光度值(单波长450nm)。
间接ELISA所需试剂的配制：
Figure BDA0003069974220000231
按照上述的间接ELISA方法的基本流程进行以下交叉过敏反应：
A、以5μg/mL的溶菌酶为包被抗原，牛乳α-乳白蛋白抗体按1:8000倍数稀释，HRP-羊抗小鼠IgG抗体为二抗，用稀释液按1:10000比例稀释，同时做四组平行实验，重复三次，通过间接ELISA方法测定溶菌酶与α-乳白蛋白抗体血清之间的反应情况。以未被免疫小鼠血清为阴性对照。
结果如图3所示:阴性对照组和阳性对照组的OD值有显著性差异(P<0.05)，说明溶菌酶与α-乳白蛋白抗体发生了免疫交叉反应。
B、以5μg/mL的牛乳蛋白为包被抗原，溶菌酶抗体按1:800倍数稀释，HRP-羊抗兔IgG抗体为二抗，以相同比例稀释，同时做四组平行实验，重复三次，通过间接ELISA方法测定牛乳蛋白与抗体血清之间的反应情况。以未被免疫兔子血清为阴性对照。结果如图4所示:阴性对照组和阳性对照组的OD值有显著性差异(P<0.05)，说明牛乳蛋白与溶菌酶抗体发生了免疫交叉反应。
C、以5μg/mL的α-卵黄蛋白为包被抗原，牛血清白蛋白抗体按1:1600倍数稀释，HRP-羊抗兔IgG抗体为二抗，以相同比例稀释，同时做四组平行实验，重复三次，通过间接ELISA方法测定α-卵黄蛋白与抗体血清之间的反应情况。以未被免疫兔子血清为阴性对照。结果如图5所示:阴性对照组和阳性对照组的OD值有显著性差异(P<0.05)，说明卵黄蛋白与牛血清白蛋白抗体发生了免疫交叉反应。
(5)免疫印迹方法，免疫印迹方法的基本流程为：
①SDS-PAGE：配制分离胶和浓缩胶，浓度分别为12.5％、4.5％。按1:1的比例将样品蛋白与样品处理液混合，加入溴酚蓝指示剂，混匀，在水浴锅煮沸5min左右，晾至室温后上样，每个泳道上样量为20μL。第一泳道加入预染蛋白Marker。
以恒流20mA的条件电泳。指示剂迁至凝胶下端约1cm处停止电泳。取出凝胶后用考马斯亮蓝G-250染色液染色30min，然后用脱色液脱色至凝胶中蛋白条带清晰。
②电转移：
a、将聚偏二氟乙烯膜(PVDF膜)剪裁至SDS-PAGE凝胶中分离胶的大小，在PVDF膜的粗糙面上标记出各泳道位置，将PVDF膜在甲醇中浸泡3～5s，裁六张大小约为6×8cm的滤纸，将PVDF膜、滤纸、海绵、分离胶一同浸泡于电转缓冲液中10min。
b、将电转移用的夹子打开平铺于干净平整的实验台上，使黑色栅在下面且保持水平，在黑色栅面上铺上处理过的海绵，用光滑的玻璃棒从一侧向另一侧擀动，赶出气泡。将三层滤纸铺在海绵垫，将凝胶放在滤纸上，将PVDF膜放在凝胶上。再在膜上铺三层滤纸，最后放上另一块海绵，放下白色栅，装入电泳槽后，灌满电转移缓冲液。操作时每一层的放置都要小心，并不断赶气泡，防止产生气泡影响结果。
c、将电泳槽置于水中，用冰袋降温，在恒流200mA条件下电泳转膜2h(注意降温)。
d、转印后卸下“凝胶三明治”，取出PVDF膜从中间剪开一式两份，一份用氨基黑10B染色液染色5min，脱色至可以看清膜上的条带，观察转印效果及蛋白条带位置，另一份用于免疫印迹。
③免疫印迹：
a、将转印后的PVDF膜于大小合适的平皿中用dH2O洗5min，再用TBST于37℃下，漂洗4次，每次15min，弃去液体。
b、加入封闭液(10～20mL)，于37℃下，进行1h淬灭，封闭PVDF膜，然后水洗5min。
c、加入合适浓度的单抗，4℃过夜，然后水洗5min，TBST洗3次，每次10min。
d、加入合适浓度的HRP标记的羊抗鼠/兔二抗，37℃孵育2h，然后水洗5min，TBST洗3次，每次10min。
e、将PVDF膜浸在新鲜配制的底物溶液中显色(37℃，避光，35～40min)
转移电泳及免疫印迹过程中所需试剂等其他未明确事项均参照常规处理。
(6)按照上述基本流程，进行α-乳白蛋白单克隆抗体特异性鉴定及交叉过敏原识别、溶菌酶兔多克隆抗体识别鉴定牛乳过敏原、牛血清白蛋白兔多克隆抗体识别鉴定卵黄过敏原。实验结果如下：
①α-乳白蛋白单克隆抗体特异性鉴定及交叉过敏原识别
对α-乳白蛋白、脱脂牛奶进行SDS-PAGE电泳分析，结果见图6(M:低分子量标准蛋白；1为α-乳白蛋白标品；2为脱脂牛乳)。用制备的单抗识别α-乳白蛋白标品和脱脂牛乳中α-乳白蛋白的结果如图7所示，表明单抗对α-乳白蛋白具有很强的特异性反应能力。
对卵清蛋白进行SDS-PAGE电泳分析，结果见图8第2泳道，卵清蛋白条带由上到下分别为卵转铁蛋白、卵清蛋白、卵类黏蛋白、溶菌酶。对卵黄蛋白进行SDS-PAGE电泳分析，结果见图8第3泳道，蛋白条带由上到下分别为α-卵黄蛋白、卵黄糖蛋白42。第4泳道为牛乳蛋白条带，由上到下分别为牛血清白蛋白、β-酪蛋白、αs1-酪蛋白、β-乳球蛋白、α-乳白蛋白。
对α-乳白蛋白单克隆抗体与卵清蛋白之间的交叉过敏反应情况进行鉴定，卵清蛋白、卵黄蛋白、脱脂牛乳的SDS-PAGE电泳图谱见图8。
牛乳蛋白、卵清蛋白均与α-乳白蛋白抗体发生了反应，结果显示出两个条带，见图9，分子量分别为14.2kDa、14kDa，为α-乳白蛋白和溶菌酶。为了排除假阳性反应，用小鼠阴性血清进行了免疫印迹试验，牛乳蛋白、卵清蛋白与小鼠阴性血清均没有发生反应，结果见图10。因此可以得出：卵清蛋白中的溶菌酶与α-乳白蛋白单抗发生了特异性免疫反应。
②溶菌酶多克隆抗体识别鉴定牛乳交叉过敏原免疫印迹结果
结果如图11所示(1表示卵清蛋白，2表示牛乳蛋白)。溶菌酶多克隆抗体与牛乳蛋白、卵清蛋白均发生反应，显示出两个条带，分子量分别是14.2kDa、14kDa，为α-乳白蛋白和溶菌酶。为了排除假阳性反应，用兔阴性血清进行了免疫印迹试验，牛乳蛋白、卵清蛋白与兔阴性血清均没有发生反应，结果见图12。因此再一次证明：卵清蛋白中的溶菌酶与α-乳白蛋白抗体发生了特异性免疫反应，溶菌酶与α-乳白蛋白为交叉过敏原。
③牛血清白蛋白多克隆抗体识别卵黄交叉过敏原免疫印迹结果
结果如图13所示(1表示牛乳蛋白，2表示卵黄蛋白)。牛血清白蛋白多克隆抗体与牛乳蛋白、卵黄蛋白均发生反应，显示出两个条带，分子量分别是67kDa、69kDa，为牛血清蛋白和α-卵黄蛋白。为了排除假阳性反应，用兔阴性血清进行了免疫印迹试验，牛乳蛋白、卵黄蛋白与兔阴性血清均没有发生反应，结果见图14。因此可以得出：卵黄蛋白中的α-卵黄蛋白与牛血清白蛋白抗体发生特异性免疫反应，α-卵黄蛋白与牛血清白蛋白为交叉过敏原。
(7)合成和鉴定鸡蛋溶菌酶、α-卵黄蛋白交叉过敏原相似序列
采用Fmoc固相肽合成法，将C-末端氨基酸连接到一种合适的固相载体上，采用常规Fmoc法进行逐步缩合。合成结束后，用强酸将序列从固相载体上切割下来，经HPLC纯化，冷冻干燥后备用。合成乳白蛋白的序列为Y55DTQAIVQNNDSTEY69和W79CKDDQNPHSSNICN93。合成的肽经过液相纯化，质谱鉴定。
对合成的乳白蛋白序列Y55DTQAIVQNNDSTEY69和W79CKDDQNPHSSNICN93通过液相法进行纯化，纯度都在90％以上。如图15所示为Y55DTQAIVQNNDSTEY69的液相图，如图16所示为W79CKDDQNPHSSNICN93的液相图。质谱鉴定分子量合成准确。
按照上述方法合成其余6条相似序列：血清白蛋白的序列R24DTHKSEIA32，C312IAEVEKDAIPENLP326，A112DCCEKQEPER122，F525DEKLFTFHADICTLPDTEKQIKKQTALVE554，Y520VPKAFDEKLF530和L555LKHKPKATEE565。按照相同方法对合成的肽经过液相纯化，质谱鉴定。
(8)血清学鉴定交叉过敏原作用表位
在96孔微板上检测合成的上述8条相似序列，每孔均先用链霉亲和素包被，分别依次加入待进行表位作图的序列，再用抗体检测。鉴定乳白蛋白序列时用溶菌酶兔血清做一抗，鉴定牛血清白蛋白的序列时用牛血清白蛋白兔血清做一抗。
操作步骤如下：
①冻干的肽溶于100％二甲基亚砜(DMSO)中，使其贮存液的浓度为10mg/mL，工作液的终浓度为1mg/mL，贮存于-70℃。
②用5ug/mL链霉亲和素(去离子水稀释)包被96孔板每孔50uL。
③用0.1％PBS-Tween洗板4次，用2％BSA/PBS封闭非特异性结合位点，室温2h。
④将肽用0.1％(重量/体积)BSA/PBS稀释至终浓度为20ug/mL，每孔加入50uL肽溶液，4℃孵育过夜，未加肽溶液的孔作为对照组。
⑤加入用0.1％BSA/PBS稀释的一抗，孵育2h。
⑥吸去抗体溶液，用洗涤液洗板4次，然后加入辣根过氧化物酶标记的二抗(用BSA/PBS作1/800稀释)，孵育2h。
⑦洗板4次，加入TMB底物，每孔50uL，出现蓝色时，加入100mmol/L硫酸50uL终止反应。在450nm波长下测其OD值。
通过间接ELISA鉴定8条相似序列是否与血清抗体发生免疫反应，Y55DTQAIVQNNDSTEY69、W79CKDDQNPHSSNICN93、R24DTHKSEIA32、C312IAEVEKDAIPENLP326、A112DCCEKQEPER122、F525DEKLFTFHADICTLPDTEKQIKKQTALVE554、Y520VPKAFDEKLF530和L555LKHKPKATEE565分别对应编号为1-8，结果如图17所示(横坐标)：
溶菌酶交叉过敏原α-乳白蛋白线性表位为Y55DTQAIVQNNDSTEY69和W79CKDDQNPHSSNICN93；
α-卵黄蛋白交叉过敏原牛血清白蛋白线性表位为C312IAEVEKDAIPENLP326、F525DEKLFTFHADICTLPDTEKQIKKQTALVE554、Y520VPKAFDEKLF530和L555LKHKPKATEE565。上述鉴定结果与预测的相似序列略有区别。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (9)

1.一种与鸡蛋相关的交叉过敏原作用表位的确定方法，其特征在于，包括：
S1、通过NCBI检索鸡蛋主要过敏原的氨基酸序列；
S2、手动输入某食物主要过敏原的氨基酸序列，通过Uniprot网页工具中的Align工具比对输入的过敏原与鸡蛋过敏原的序列相似性，预测是否存在交叉过敏原；若鸡蛋的某过敏原蛋白与该食物的过敏原蛋白之间存在任一80个以上氨基酸序列相似性≥30％，则预判该对过敏原蛋白存在交叉过敏；反之，则预判不存在交叉过敏；
S3、在预判存在交叉过敏的情况下，通过DNAstar软件中的Protean工具预测存在交叉过敏的该鸡蛋过敏原的二级结构及抗原表位；
S4、基于S3的预测结果，采用Blastp网页工具分析确定所述存在交叉过敏的该鸡蛋过敏原和过敏原蛋白的相似序列；
S5、根据S2预判的存在交叉过敏反应的蛋白，制备相应的单抗或多抗，应用免疫印迹法和ELISA方法识别交叉过敏原，进一步合成和纯化步骤S4所确定的所述相似序列，用血清学实验鉴定该相似序列是否为作用表位。
2.根据权利要求1所述的确定方法，其特征在于，S1中，所述鸡蛋主要过敏原为6种蛋白，分别为：卵类黏蛋白、卵清蛋白、卵转铁蛋白、溶菌酶、α-卵黄蛋白、卵黄糖蛋白42。
3.根据权利要求2所述的确定方法，其特征在于，S2中，通过Uniprot工具手动输入牛乳的主要过敏原蛋白，包括:α-乳白蛋白、β-乳球蛋白、血清白蛋白、免疫球蛋白、αs1-酪蛋白、αs2-酪蛋白、β-酪蛋白、κ-酪蛋白。
4.根据权利要求3所述的确定方法，其特征在于，S2中，通过比对确定鸡蛋中的溶菌酶与牛乳中的α-乳白蛋白序列相似性为34.459％，鸡蛋中的α-卵黄蛋白与牛乳中的血清白蛋白序列相似性为44.065％；预判溶菌酶与α-乳白蛋，α-卵黄蛋白与牛乳血清白蛋白存在交叉过敏。
5.根据权利要求1所述的确定方法，其特征在于，步骤S3中，还包括：采用BEPIPRED-1.0网络工具预测鸡蛋溶酶菌和α-卵黄蛋白的线性表位；将Protean工具预测的抗原表位的预测结果结合采用BEPIPRED-1.0网络工具预测的线性表位的预测结果，作为步骤S4分析确定交叉过敏原相似序列的基础。
6.根据权利要求1或4所述的确定方法，其特征在于，S4中，基于步骤S3的预测结果，通过Blastp工具分析溶菌酶与α-乳白蛋白具有2条相似序列：溶菌酶氨基酸序列中的第56-71位与α-乳白蛋白氨基酸序列的第55-69位；溶菌酶氨基酸序列中的第81-95位与α-乳白蛋白氨基酸序列的第79-93位；
通过Blastp分析α-卵黄蛋白与牛乳血清白蛋白有6条相似序列：依次为：α-卵黄蛋白氨基酸序列中的第26-35位与血清白蛋白氨基酸序列的第24-32位；α-卵黄蛋白氨基酸序列中的第80-94位与血清白蛋白氨基酸序列的第312-326位；α-卵黄蛋白氨基酸序列中的第115-125位与血清白蛋白氨基酸序列的第112-122位；α-卵黄蛋白氨基酸序列中的第323-335位与血清白蛋白氨基酸序列的第525-554位；α-卵黄蛋白氨基酸序列中的第525-535位与血清白蛋白氨基酸序列的第520-530位；α-卵黄蛋白氨基酸序列中的第560-570位与血清白蛋白氨基酸序列的第555-565位。
7.根据权利要求6所述的确定方法，其特征在于，步骤S5中的过程包括：
(1)采用Fmoc固相肽合成法，将C-末端氨基酸连接到一种合适的固相载体上，采用Fmoc法进行逐步缩合，合成结束后，用强酸将序列从固相载体上切割下来，经HPLC纯化，冷冻干燥后备用；合成乳白蛋白的序列为Y55DTQAIVQNNDSTEY69和W79CKDDQNPHSSNICN93；合成血清白蛋白的序列为R24DTHKSEIA32，C312IAEVEKDAIPENLP326，A112DCCEKQEPER122，F525DEKLFTFHADICTLPDTEKQIKKQTALVE554，Y520VPKAFDEKLF530和L555LKHKPKATEE565；
(2)依次通过间接ELISA鉴定上述8条相似序列是否与血清抗体发生免疫反应，最终确定溶菌酶交叉过敏原α-乳白蛋白线性序列为Y55DTQAIVQNNDSTEY69和W79CKDDQNPHSSNICN93；α-卵黄蛋白交叉过敏原牛血清白蛋白线性序列为C312IAEVEKDAIPENLP326、F525DEKLFTFHADICTLPDTEKQIKKQTALVE554、Y520VPKAFDEKLF530和L555LKHKPKATEE565。
8.α-乳白蛋白的IgE结合表位为W79CKDDQNPHSSNICN93。
9.α-卵黄蛋白交叉过敏原牛血清白蛋白作用表位，包括：
C312IAEVEKDAIPENLP326、
F525DEKLFTFHADICTLPDTEKQIKKQTALVE554、
Y520VPKAFDEKLF530和L555LKHKPKATEE565。
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