CN113249431A - 一种乳中青霉素g残留测试片、制备方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

一种青霉素G残留测试片、制备方法及其在检测乳中青霉素G残留方面的应用，属于食品检测技术领域。测试片为三层结构，上层材料为聚酯薄膜、中层材料为带有镂空区域的聚氯乙烯透明板，底层材料为聚丙烯粘性薄膜。在镂空区域内填充有显色检测培养基，上层材料的内侧涂覆有复配冷水可溶性凝胶。本发明基于青霉素G对其敏感指示菌嗜热链球菌的生长抑制作用测定青霉素G残留量，将青霉素G敏感指示菌嗜热链球菌制备为冻干粉，检测程序方便快捷。显色培养基中加入促生长因子L‑谷氨酸，可以显著缩短检测时间。加入表面活性剂亚甲基双萘磺酸钠(NNO)，可以使菌落呈现清晰且菌落直径增大，测试片呈现的颜色和抑菌圈边缘最清晰。

Description

一种乳中青霉素G残留测试片、制备方法及其应用
技术领域
本发明属于食品检测技术领域，具体涉及一种青霉素G残留测试片、制备方法及其在检测乳中青霉素G残留方面的应用。
背景技术
动物源性食品中的抗生素残留对消费者构成潜在的健康风险。抗生素被广泛应用于细菌性疾病的治疗，不适当和不规范的使用导致了动物源性食品中抗生素残留，这不仅仅是食品安全监管机构关注的问题，也是食品加工者和消费者关注的问题。目前《GB/T4789.27-2008食品安全国家标准食品微生物学检验鲜乳中青霉素G残留检验》采用微生物抑制法，该方法需要配制培养基，检测程序繁琐，孵育时间长。微生物测试片类检测产品则省去了配制培养基、消毒灭菌和培养器皿清洗处理等大量辅助性工作，观察检测结果方便。使用起来只需要3个简单的步骤：样品制备、增殖培养和测定结果。现有商业化乳中青霉素G残留检测产品中，没有用于乳中青霉素G残留检测的测试片产品，因此研制乳中青霉素G残留测试片亟待解决。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种操作简单、价格低廉、能够定量检测的乳中青霉素G残留测试片。测试片的结构分为三层：上层材料为聚酯(PET)薄膜(透明度高、无毒无刺激性气味、防水透气，厚度为0.05mm～0.10mm)，中层材料为带有直径5cm圆形镂空区域的聚氯乙烯(PVC)透明板，镂空区域面积与中层材料面积的比例范围为1：1.6～2.7；底层材料为聚丙烯(BOPP)粘性薄膜(具有良好粘性，韧性，透气性)，以上材料所耐温度为130℃～150℃。
在镂空区域内填充有显色检测培养基，上层材料的内侧涂覆有复配冷水可溶性凝胶。显色检测培养基除基础培养基胰蛋白胨、酵母浸粉、牛肉浸粉、乳糖、抗坏血酸钠、硫酸镁、磷酸氢二铵外，另加入促生长因子L-谷氨酸、表面活性剂亚甲基双萘磺酸钠(NNO)和显色剂2,3,5-三苯基氯化四氮唑(TTC)。
本发明基于青霉素G对其敏感指示菌嗜热链球菌的生长抑制作用测定青霉素G残留量，将青霉素G敏感指示菌嗜热链球菌制备为冻干粉，检测程序方便快捷。
本发明又一个目的是提供上述乳中青霉素G残留测试片的制备方法，其步骤如下：
(1)复配冷水凝胶制备
将瓜尔胶、魔芋胶分别研磨成粉末，过100～120目筛，然后按4：5～7重量比例充分混匀，得到复配冷水可溶凝胶粉末；
(2)显色培养基干粉制备
将胰蛋白胨10～20g、酵母浸粉1～5g、牛肉浸粉5～10g、乳糖1～5g、抗坏血酸钠0.5～1.5g、硫酸镁0.2～0.5g、磷酸氢二铵10～15g、NNO 0.5～1g、L-谷氨酸0.1～0.4g和TTC 0.2～0.5g混合均匀后过100～120目筛，得到显色培养基干粉；
(3)乳中青霉素G残留测试片的制备
将上层材料、中层材料及底层材料剪裁成同样大小，用聚丙烯酸树脂压敏胶(透明、无毒、无味、无菌)将一侧封闭粘合；
将上述复配冷水可溶凝胶粉末均匀地涂在上层材料的内侧有粘性的一面，厚度为0.10mm～0.20mm；
首先在中层材料镂空区域对应的底层材料上均匀涂覆聚丙烯酸树脂压敏胶，厚度为0.05mm～0.10mm，再将显色培养基干粉填充在中层材料的镂空区域内，厚度为0.10mm～0.20mm；
(4)将步骤(3)得到的测试片真空无菌包装，最后采用环氧乙烷灭菌法对测试片进行灭菌；灭菌温度50～60℃，环氧乙烷质量浓度500～700mg/L，相对湿度30～50％，灭菌时间2.5～3.5h，解析时间10～15h，从而得到本发明所述的乳中青霉素G残留测试片。
本发明又一个目的是提供应用上述乳中青霉素G残留测试片检测乳中青霉素G残留量的方法，其步骤如下：
(1)青霉素G敏感指示菌嗜热链球菌冻干粉的制备：将嗜热链球菌于脱脂乳中37℃恒温12～15h培养两次，将得到的活化的嗜热链球菌取两环接种于M17液体培养基中，37℃恒温培养15～25h；再将得到的种子液转接于另一M17液体培养基中，37℃恒温培养10～15h后进行离心，离心条件为5000～8000r/min，10～20min；将离心得到的菌泥与冻干保护剂水溶液(脱脂乳5～15g/L、海藻糖5～15g/L、抗坏血酸0.5～1.5g/L)以质量比1：0.8的比例均匀混合，将得到的菌悬液置于-70～-90℃下预先冷冻10～15h，然后再真空冷冻(冷冻温度-40～-60℃)干燥20～30h后得到菌嗜热链球菌冻干粉；取1g该嗜热链球菌冻干粉等体积复水，菌液浓度为105CFU/mL；
(2)乳中青霉素G残留测试片标准曲线的建立
①用无抗乳制备青霉素G浓度不同的牛乳，其浓度为10μg/L～1μg/L；
②将灭菌后(121℃、15min)直径6mm的多个滤纸片分别浸泡于10mL步骤①制备的青霉素G浓度不同的牛乳中20～30s，取出后平铺于灭菌的平皿中于37℃下烘干2～3min；
③掀开本发明制备的乳中青霉素G残留测试片的上层材料，取1mL步骤(1)嗜热链球菌冻干粉等体积复水后得到的菌悬液加至中层材料含有显色培养基干粉的镂空区域内，再将步骤②得到的滤纸片置于菌悬液的中心处；将上层材料缓缓落下，避免挤压，静置30s待复配冷水可溶性凝胶固化后，放入培养箱37℃培养4～5h，测量抑菌圈直径；步骤②的每一个滤纸片分别使用不同的乳中青霉素G残留测试片进行抑菌圈直径的测量；
④以青霉素G浓度为横坐标，以抑菌圈直径为纵坐标，建立乳中青霉素G残留测试片标准曲线，得出线性回归方程y＝0.8915x+14.7867，y表示抑菌圈直径，x表示青霉素G浓度；
(3)检测样品前处理：
检测样品可为鲜牛乳、乳粉和灭菌乳，将鲜牛乳在70～90℃条件下加热3～6min进行杀菌，将乳粉以蒸馏水10倍稀释，灭菌乳可以直接检测；
(4)乳中青霉素G残留测试片法测定的操作步骤：
①将灭菌后(121℃、15min)直径6mm的滤纸片浸泡于10mL步骤(3)加热杀菌后的鲜牛乳、稀释的乳粉或灭菌乳中20～30s，取出后平铺于灭菌的平皿中于37℃下烘干2～3min；
②掀开本发明制备的乳中青霉素G残留测试片的上层材料，取1mL步骤(1)嗜热链球菌冻干粉等体积复水后得到的菌悬液加至中层材料含有显色培养基干粉的镂空区域内，再将步骤①得到的滤纸片置于菌悬液的中心处；将上层材料缓缓落下，避免挤压，静置20～30s待复配冷水可溶性凝胶固化后，放入培养箱37℃培养4～5h，测量抑菌圈直径；
③将步骤②的抑菌圈直径代入乳中青霉素G残留测试片标准曲线以计算青霉素G残留量，从而实现对乳中青霉素G残留量的检测。
本发明研制的乳中青霉素G残留测试片的突出特征在于该测试片可以在5h内得到检测结果，对于乳中青霉素G残留可以进行定量检测，操作简便。主要包括三个重要特征：
1、本发明通过在显色培养基中加入促生长因子L-谷氨酸，显著缩短检测时间。试验结果表明，在相同检测时间内，添加L-谷氨酸后测试片颜色呈现更加清晰，抑菌圈呈现更加明显(图2)。
2、本发明通过在显色培养基中加入表面活性剂亚甲基双萘磺酸钠(NNO)，青霉素G敏感指示菌嗜热链球菌菌落呈现清晰且菌落直径增大，测试片呈现的颜色和抑菌圈边缘最清晰(如图3所示，a图为使用不含有NNO显色培养基得到的生长影响照片；b图为使用含有NNO显色培养基得到的生长影响照片，结果表明NNO具有良好的分散作用，使冷水可溶性凝胶可以形成很好的网络结构，使菌落分散均匀)。为此，加入表面活性剂亚甲基双萘磺酸钠(NNO)可以显著促进抑菌圈直径增大，降低检测限。
3、本发明首次研制一种基于微生物抑制法检测乳中青霉素G残留测试片，本测试片能够准确快速定量检测乳中青霉素G残留量，操作简单，成本低廉。
本发明的关键点
(1)乳中青霉素G残留测试片培养基的研制；
(2)青霉素G敏感指示菌嗜热链球菌冻干粉的研制；
(3)乳中青霉素G残留测试片的研制。
本发明的效果
本发明突出优点在于该测试片显色培养基由基础培养基、促生长因子、表面活性剂、显色剂组成，本发明基于上述组分制备乳中青霉素G残留测试片，加入待检样品稀释液(待检食品可以是灭菌乳、鲜牛乳、乳粉等多类乳品)于中层材料培养区域后，中层材料培养基与上层的复配冷水可溶性凝胶混合，在凝胶吸水过程中形成稳定的、孔隙适中又具有致密网状空间的凝胶胶体，尤其适合测试片环境下的青霉素G敏感指示菌嗜热链球菌生长与抑菌圈形成；加入具有促进细菌生长、提高细菌活力作用的促生长因子L-谷氨酸，加快青霉素G敏感指示菌嗜热链球菌在培养过程的增殖速率；加入表面活性剂亚甲基双萘磺酸钠(NNO)有利于乳中青霉素G均匀分布、渗透、抑菌圈的形成与可视测量，达到降低检测限的目的，与显色剂混合后可使显色效果更好，使不同浓度青霉素G形成的抑菌圈更易于辨认；本发明还选用了常用显色剂TTC，根据可视效果，对其含量进行了优化，达到良好显色效果，进行乳中青霉素G残留测定后在测试片上形成红色的抑菌圈，选择抑菌圈均匀的测试片进行测量。本测试片将在牧场和乳品生产企业出厂检验、卫生防疫、市场监督、商检及进出口检疫领域有着较为广阔的应用前景。
附图说明
图1：乳中青霉素G残留测试片结构示意图。
如图1所示，各部分名称为：标签1(在测试片一侧贴上带有本产品名称、被测样品名称、检测时间的标签1)、上层材料2、带有镂空区域4的塑料中层材料3、底层材料5、滤纸片6。
图2：添加L-谷氨酸对乳中青霉素G残留测试片呈现效果照片。
图3：添加NNO对青霉素G敏感指示菌嗜热链球菌生长影响照片。
图4：添加NNO对乳中青霉素G残留测试片呈现效果照片。
图5：本发明测试片的标准曲线及线性回归方程。
图6：本发明测试片检测乳中不同浓度青霉素G照片。
具体实施方式
实施例1：乳中青霉素G残留显色培养基的制备
乳中青霉素G残留显色培养基的制备：
将胰蛋白胨10g、酵母浸粉2.5g、牛肉浸粉5g、乳糖3g、抗坏血酸钠0.5g、硫酸镁0.25g、磷酸氢二铵10g、L-谷氨酸0.2g、NNO 0.6g、TTC 0.4g混合后置于研钵中研磨成粉末，过120目筛，得到乳中青霉素G残留显色培养基。
复配冷水可溶性凝胶的制备：
将复配冷水可溶性凝胶瓜尔胶、魔芋胶分别研磨成粉末，过120目筛，按4g：6g重量比例充分混匀，得到复配冷水可溶性凝胶。
实施例2乳中青霉素G残留测试片的制备
(1)测试片由三层组成，上层材料为PET薄膜、中层材料为带有镂空区域的聚丙烯塑料板、底层材料为BOPP粘性薄膜载体材料。三部分均裁剪成7cm×9cm，中层材料镂空区域(直径为5cm圆形)与底层材料粘合成培养区，将上、中、下三部分材料用聚丙烯酸树脂压敏胶将标签一侧边缘互相粘合，粘合宽度为5mm。镂空区域面积与中层材料面积的比例为1：2。
(2)将复配冷水可溶凝胶粉末均匀地涂在上层材料内侧，厚度为0.15mm，每片测试片复配冷水凝胶的质量用量为0.2g。
(3)首先在中层材料镂空区域对应的底层材料上均匀涂覆聚丙烯酸树脂压敏胶，厚度为0.08mm，再将显色培养基干粉填充在中层材料的镂空区域内，厚度为0.15mm；每片测试片显色培养基干粉的质量用量为0.6g。
(4)将测试片进行真空无菌包装。
(5)采用环氧乙烷灭菌法对测试片进行灭菌。灭菌条件：温度55℃、环氧乙烷质量浓度600mg/L，相对湿度40％，灭菌时间为3h，解析时间12h，得到本发明所述的乳中青霉素G残留测试片。
实施例3青霉素G敏感指示菌嗜热链球菌冻干粉的制备
将嗜热链球菌于脱脂乳中37℃恒温12h培养两次，将活化后的嗜热链球菌取两环接种于M17液体培养基，37℃恒温培养24h，将种子液转接于另一瓶M17液体培养基中，37℃恒温培养12h后进行离心(5000r/min，15min)，将离心后收集到的嗜热链球菌菌泥与冻干保护剂水溶液(脱脂乳10g/L、海藻糖10g/L、抗坏血酸1.0g/L)以质量比为1:0.8均匀混合，得到菌悬液。将制备好的菌悬液倒入无菌的真空冷冻干燥瓶中封膜，将干燥瓶置于-80℃冰箱中预冻12h，然后置于真空冷冻干燥机中进行冻干(真空度15Pa，冷冻温度-50℃)24h。取1g该嗜热链球菌冻干粉等体积复水，菌液浓度为105CFU/mL。
实施例4添加促生长因子对乳中青霉素G残留测试片检测的影响
将实施例1制备的乳中青霉素G残留显色培养基(含有促生长因子L-谷氨酸)添加到中层材料的镂空区域内，再取1mL实施例3嗜热链球菌冻干粉等体积复水后得到的菌悬液加至中层材料含有显色培养基干粉的镂空区域内，然后在镂空区域中心位置放入一片浸泡于10μg/L青霉素G水溶液中20s的药敏滤纸片，置于37℃恒温培养箱中培养5h后观察结果(图2，a图为使用不含有促生长因子L-谷氨酸显色培养基得到的抑菌圈照片；b图为使用促生长因子L-谷氨酸显色培养基得到的抑菌圈照片)。试验结果表明，相同检测时间内，加入促生长因子L-谷氨酸的乳中青霉素G残留测试片呈现清晰的红色(b图)，未加入促生长因子L-谷氨酸乳中青霉素G残留测试片无法呈现清晰的红色(a图)。
实施例5添加表面活性剂对乳中青霉素G残留测试片检测的影响
将实施例1制备的乳中青霉素G残留显色培养基(含有表面活性剂亚甲基双萘磺酸钠)添加到中层材料的镂空区域内，再取1mL实施例3嗜热链球菌冻干粉等体积复水后得到的菌悬液加至中层材料含有显色培养基干粉的镂空区域内，然后在镂空区域中心位置放入一片浸泡于10μg/L青霉素G水溶液中20s的药敏滤纸片，置于37℃恒温培养箱中培养5h后测量抑菌圈直径。试验结果表明(图4，a图为使用不含有表面活性剂亚甲基双萘磺酸钠的显色培养基得到的抑菌圈直径照片；b图为使用含有表面活性剂亚甲基双萘磺酸钠的显色培养基得到的抑菌圈直径照片)，加入表面活性剂亚甲基双萘磺酸钠(NNO)后菌落分布均匀，抑菌圈直径为23.3mm，与空白对照组(使用不含有表面活性剂亚甲基双萘磺酸钠的显色培养基)19.1mm相比差异显著(p<0.05)，达到降低青霉素G检测限的目的。
实施例6乳中青霉素G残留测试片标准曲线的建立及青霉素G浓度的检测
(1)乳中青霉素G残留测试片标准曲线的建立
①用无抗乳制备含有青霉素G的牛乳，其浓度分别10μg/L、9μg/L、8μg/L、7μg/L、6μg/L、5μg/L、4μg/L、3μg/L、2μg/L、1μg/L；
②将灭菌后(121℃、15min)直径6mm的10个滤纸片分别浸泡于10mL步骤①制备的含有不同浓度青霉素G的牛乳中20s，取出后平铺于灭菌的平皿中于37℃下烘干2min；
③掀开实施例2制备的乳中青霉素G残留测试片的上层材料，取1mL实施例3嗜热链球菌冻干粉等体积复水后得到的菌悬液加至中层材料含有显色培养基干粉的镂空区域内，再将步骤②得到的滤纸片置于菌悬液的中心处；将上层材料缓缓落下，避免挤压，静置30s待复配冷水可溶性凝胶固化后，放入培养箱37℃培养4～5h，测量抑菌圈的直径；
④以青霉素G浓度为横坐标，以抑菌圈直径为纵坐标，建立乳中青霉素G残留测试片标准曲线(图5)，得出线性回归方程y＝0.8915x+14.7867，y表示抑菌圈直径，x表示青霉素G浓度；应用此线性回归方程，可以实现对鲜牛乳、乳粉和灭菌乳中青霉素G浓度的定量检测。
(2)检测样品前处理：
检测样品可为鲜牛乳、乳粉和灭菌乳，将鲜牛乳在80℃条件下加热5min进行杀菌，将乳粉以蒸馏水10倍稀释，灭菌乳可以直接检测；
(3)乳中青霉素G残留测试片法测定的操作步骤：
①将灭菌后(121℃、15min)直径6mm的滤纸片浸泡于10mL步骤(2)加热杀菌后的鲜牛乳、稀释的乳粉或灭菌乳中20s，取出后平铺于灭菌的平皿中于37℃下烘干2min；
②掀开实施例2制备的乳中青霉素G残留测试片的上层材料，取1mL实施例3嗜热链球菌冻干粉等体积复水后得到的菌悬液加至中层材料含有显色培养基干粉的镂空区域内，再将步骤①得到的滤纸片置于菌悬液的中心处；将上层材料缓缓落下，避免挤压，静置30s待复配冷水可溶性凝胶固化后，放入培养箱37℃培养4～5h，测量抑菌圈直径；
③将步骤②的抑菌圈直径代入乳中青霉素G残留测试片标准曲线以计算青霉素G残留量，从而实现对乳中青霉素G残留量的检测。每组设置3个平行样品，同时取1mL生理盐水(替代1mL实施例2待检鲜牛乳样品)浸泡滤纸片作为空白对照。
实施例7：乳中青霉素G残留测试片测定效果评价
(1)乳中青霉素G残留测试片检测限的测定
用无抗乳制备含有青霉素G的牛乳，其浓度分别1μg/L、2μg/L、3μg/L、4μg/L、5μg/L、6μg/L、7μg/L、8μg/L、9μg/L、10μg/L，然后将滤纸片置于其中浸泡得到青霉素G浓度不同的滤纸片，各浓度滤纸片取1片按照实施例6步骤(3)的方法进行试验(图6，从左至右，青霉素G的浓度分别为0μg/L、1μg/L、2μg/L、3μg/L、4μg/L、5μg/L、6μg/L、7μg/L、8μg/L、9μg/L、10μg/L)，当青霉素G低于2μg/L时，滤纸片变为红色，说明青霉素G已经无法抑制嗜热链球菌的生长，最终确定青霉素G残留测试片检测限为2μg/L。
(2)乳中青霉素G残留测试片加标回收试验
用无抗乳制备含有青霉素G的牛乳，其浓度分别10μg/L、8μg/L、6μg/L、4μg/L、2μg/L，然后将滤纸片置于其中浸泡得到青霉素G浓度不同的滤纸片，各浓度滤纸片取1片按照实施例6步骤(3)的方法进行检测，将检测结果按照乳中青霉素G残留测试片标准曲线进行计算，检测结果见表1。
表1：乳中青霉素G残留测试片加标回收试验结果
Figure BDA0003063818480000081
表1表明，本测试片的加标回收率均在95％以上，说明本测试片检测结果准确度高。

Claims (6)

1.一种乳中青霉素G残留测试片的制备方法，其步骤如下：
(1)复配冷水凝胶制备
将瓜尔胶、魔芋胶分别研磨成粉末，过100～120目筛，然后按4：5～7的重量比例充分混匀，得到复配冷水可溶凝胶粉末；
(2)显色培养基干粉制备
将胰蛋白胨10～20g、酵母浸粉1～5g、牛肉浸粉5～10g、乳糖1～5g、抗坏血酸钠0.5～1.5g、硫酸镁0.2～0.5g、磷酸氢二铵10～15g、NNO 0.5～1g、L-谷氨酸0.1～0.4g和TTC 0.2～0.5g混合均匀后过100～120目筛，得到显色培养基干粉；
(3)乳中青霉素G残留测试片的制备
将上层材料、中层材料及底层材料剪裁成同样大小，用聚丙烯酸树脂压敏胶将一侧封闭粘合；
将步骤(1)的复配冷水可溶凝胶粉末均匀地涂在上层材料的内侧有粘性的一面，厚度为0.10mm～0.20mm；
在中层材料镂空区域对应的底层材料上均匀涂覆聚丙烯酸树脂压敏胶，厚度为0.05mm～0.10mm，再将步骤(2)的显色培养基干粉填充在中层材料的镂空区域内，厚度为0.10mm～0.20mm；
(4)将步骤(3)得到的测试片真空无菌包装，最后采用环氧乙烷灭菌法对测试片进行灭菌，从而得到乳中青霉素G残留测试片。
2.如权利要求1所述的一种乳中青霉素G残留测试片的制备方法，其特征在于：步骤(4)中的灭菌温度50～60℃，环氧乙烷质量浓度500～700mg/L，相对湿度30～50％，灭菌时间2.5～3.5h，解析时间10～15h。
3.如权利要求1所述的一种乳中青霉素G残留测试片的制备方法，其特征在于：上层材料为聚酯薄膜，厚度为0.05mm～0.10mm；中层材料为带有直径5cm圆形镂空区域的聚氯乙烯透明板，镂空区域面积与中层材料面积的比例为1：1.6～2.7；底层材料为聚丙烯粘性薄膜。
4.一种乳中青霉素G残留测试片，其特征在于：是由权利要求1～3任何一项所述的方法制备得到。
5.权利要求4所述的乳中青霉素G残留测试片在检测乳中青霉素G残留方面的应用。
6.如权利要求5所述的乳中青霉素G残留测试片在检测乳中青霉素G残留方面的应用，其特征在于：该应用的步骤如下，
(1)青霉素G敏感指示菌嗜热链球菌冻干粉的制备：将嗜热链球菌于脱脂乳中37℃恒温12～15h培养两次，将得到的活化的嗜热链球菌取两环接种于M17液体培养基中，37℃恒温培养15～25h；再将得到的种子液转接于另一M17液体培养基中，37℃恒温培养10～15h后进行离心；将离心得到的菌泥与以质量比1：0.8的比例均匀混合，将得到的菌悬液置于-70～-90℃下预冷冻10～15h，然后再真空、-40～-60℃下冷冻干燥20～30h后得到菌嗜热链球菌冻干粉；取1g该嗜热链球菌冻干粉等体积复水，菌液浓度为105CFU/mL；冻干保护剂水溶液为脱脂乳、海藻糖和抗坏血酸的水溶液，其中脱脂乳的浓度为5～15g/L、海藻糖的浓度为5～15g/L、抗坏血酸的浓度为0.5～1.5g/L；
(2)乳中青霉素G残留测试片标准曲线的建立
①用无抗乳制备青霉素G浓度不同的牛乳，其浓度为10μg/L～1μg/L；
②将灭菌后直径6mm的多个滤纸片分别浸泡于10mL步骤①制备的青霉素G浓度不同的牛乳中20～30s，取出后平铺于灭菌的平皿中于37℃下烘干2～3min；
③掀开权利要求4所述的乳中青霉素G残留测试片的上层材料，取1mL步骤(1)嗜热链球菌冻干粉等体积复水后得到的菌悬液加至中层材料含有显色培养基干粉的镂空区域内，再将步骤②得到的滤纸片置于菌悬液的中心处；将上层材料缓缓落下，避免挤压，静置30s待复配冷水可溶性凝胶固化后，放入培养箱37℃培养4～5h，测量抑菌圈直径；步骤②的每一个滤纸片分别使用不同的乳中青霉素G残留测试片进行抑菌圈直径的测量；
④以青霉素G浓度为横坐标，以抑菌圈直径为纵坐标，建立乳中青霉素G残留测试片标准曲线，得出线性回归方程y＝0.8915x+14.7867，y表示抑菌圈直径，x表示青霉素G浓度；
(3)检测样品前处理：
检测样品可为鲜牛乳、乳粉和灭菌乳，将鲜牛乳在70～90℃条件下加热3～6min进行杀菌，将乳粉以蒸馏水10倍稀释，灭菌乳可以直接检测；
(4)乳中青霉素G残留测试片法测定的操作步骤：
①将灭菌后直径6mm的滤纸片浸泡于10mL步骤(3)加热杀菌后的鲜牛乳、稀释的乳粉或灭菌乳中20～30s，取出后平铺于灭菌的平皿中于37℃下烘干2～3min；
②掀开权利要求4所述的乳中青霉素G残留测试片的上层材料，取1mL步骤(1)嗜热链球菌冻干粉等体积复水后得到的菌悬液加至中层材料含有显色培养基干粉的镂空区域内，再将步骤①得到的滤纸片置于菌悬液的中心处；将上层材料缓缓落下，避免挤压，静置20～30s待复配冷水可溶性凝胶固化后，放入培养箱37℃培养4～5h，测量抑菌圈直径；
③将步骤②的抑菌圈直径代入乳中青霉素G残留测试片标准曲线以计算青霉素G残留量，从而实现对乳中青霉素G残留量的检测。
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