CN113234613A - 鼠李糖乳杆菌在预防牙周病产品中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)LRH09在制备具有预防牙周病产品中的应用，所述鼠李糖乳杆菌LRH09(Lactobacillus rhamnosus)已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.19423。本发明为鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)LRH09提供了一种新的用途，采用该鼠李糖乳杆菌制备的乳酸菌发酵液以及以该乳酸菌发酵液为有效成分的食品或日化用品能够通过改善口腔内菌群失调使机体长期维持免疫稳态，从而对预防牙周病具有良好的预防和改善作用，可以作为牙周病的辅助治疗手段。

Description

鼠李糖乳杆菌在预防牙周病产品中的应用
技术领域
本发明涉及鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)LRH09在制备具有预防牙周病产品中的应用，属于生物医药加工技术领域。
背景技术
牙周病是一种由于牙菌斑感染所导致的疾病，我国80％以上的成年人都罹患不同程度的牙周病，牙周病患者会出现牙结石增多的情况，更甚者出现牙龈萎缩，病程不同牙槽骨也会发生病变。牙周病病因复杂，牙周微生态失衡细菌感染是引起牙周病最主要的途径，研究发现牙周病患者口腔内至少存在两种以上厌氧菌，如具核梭杆菌、放线杆菌、直型弯曲菌等都是引起牙周病的主要细菌。
目前牙周病的治疗以基础治疗为主，一般是通过手工刮治以及超声洁治将牙菌斑和牙结石去除，但在治疗过程中常有机器无法到达的部位从而影响治疗效果。虽然药物治疗对牙周病有较好的防治效果，但其具有药物副作用及药物毒性。
发明内容
本发明要解决的技术问题就是现有的牙周病的基础治疗手段常有机器无法到达的部位从而影响治疗效果、而虽然药物治疗又具有药物副作用及药物毒性的问题。
申请人经过研究发现，鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)LRH09不仅可以通过竞争性抑制牙周病病原体来对抗菌群失调、调节牙菌斑代谢，从而控制牙周病的进展，还可以改善全身免疫状况。
基于上述研究，本发明提供一种鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)LRH09及其在制备具有预防牙周病产品中的应用。
上述鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)LRH09已于2020年2月17日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC NO.19423。
该鼠李糖乳杆菌的16S rDNA序列如下：
GCTCAGGATGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTCGAACGAGTTCTGATTATTGAAAGGTGCTTGCATCTTGATTTAATTTTGAACGAGTGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCCTTAAGTGGGGGATAACATTTGGAAACAGATGCTAATACCGCATAAATCCAAGAACCGCATGGTTCTTGGCTGAAAGATGGCGTAAGCTATCGCTTTTGGATGGACCCGCGGCGTATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAATGATACGTAGCCGAACTGAGAGGTTGATCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGACGCAAGTCTGATGGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGCTTTCGGGTCGTAAAACTCTGTTGTTGGAGAAGAATGGTCGGCAGAGTAACTGTTGTCGGCGTGACGGTATCCAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTATCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGTTTTTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCTCGGCTTAACCGAGGAAGTGCATCGGAAACTGGGAAACTTGAGTGCAGAAGAGGACAGTGGAACTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATATGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTGTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCTCGAAAGCATGGGTAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATGCCGTAAACGATGAATGCTAGGTGTTGGAGGGTTTCCGCCCTTCAGTGCCGCAGCTAACGCATTAAGCATTCCGCCTGGGGAGTACGACCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCTTTTGATCACCTGAGAGATCAGGTTTCCCCTTCGGGGGCAAAATGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATGACTAGTTGCCAGCATTTAGTTGGGCACTCTAGTAAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGATGGTACAACGAGTTGCGAGACCGCGAGGTCAAGCTAATCTCTTAAAGCCATTCTCAGTTCGGACTGTAGGCTGCAACTCGCCTACACGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCACGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGAGAGTTTGTAACACCCGAAGCCGGTGGCGTAACCCTTTTAGGGAGCGAGCCGTCTAAGGTGGGACAAATGATTAGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAGCCGTAGGAGAACCTG。
本发明同时还提供由鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)LRH09制备的乳酸菌发酵液，该发酵液通过如下方法制备：
1)调配：全脂奶粉10～16g，乳清蛋白粉1～2g，酵母抽提物0.5～2g，低聚异麦芽糖浆4～6g，低聚果糖1～2g，低聚半乳糖2～4g，食品添加剂1～2g，水补至100g；
2)灭菌；
3)冷却：冷却至42～45℃；
4)接种：在发酵底物接入鼠李糖乳杆菌LRH09，使得原始菌数为1.0×104cfu/ml～1.0×105cfu/ml；
5)发酵：34～45℃发酵14～18小时；
6)灌装。
上述步骤2)是在88～92℃下灭菌15～30分钟。
本发明还提供一种由上述乳酸菌发酵液制备的具有预防牙周病的产品，该产品中乳酸菌发酵的重量含量为5～10％。
上述具有预防牙周病的产品可以是食品，如酸奶、果冻、口香糖或含片；也可以是日化产品，如牙膏或漱口水。
本发明的有益效果：
本发明为鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)LRH09提供了一种新的用途，采用该鼠李糖乳杆菌制备的乳酸菌发酵液以及以该乳酸菌发酵液为有效成分的食品或日化用品能够通过改善口腔内菌群失调使机体长期维持免疫稳态，从而对预防牙周病具有良好的预防和改善作用，可以作为牙周病的辅助治疗手段。
附图说明
图1为乳酸菌发酵液抑菌结果示意图。
图2为菌株自凝集能力及共凝集能力示意图。
图2中，
Figure BDA0002935937270000031
为LRH09的自凝集率曲线；
Figure BDA0002935937270000032
为变形链球菌的自凝集率曲线；
Figure BDA0002935937270000033
为变形链球菌+LRH09的共凝集率曲线；
Figure BDA0002935937270000034
为具核梭杆菌的自凝集率曲线；
Figure BDA0002935937270000041
为具核梭杆菌+LRH09的共凝集率曲线；
Figure BDA0002935937270000042
为伴放线放线杆菌的自凝集率曲线；
Figure BDA0002935937270000043
为伴放线放线杆菌+LRH09的共凝集率曲线。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行进一步的阐述，应该说明的是，下述说明仅仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。
制备MRS培养基
MRS培养基的具体成分如下：
Figure BDA0002935937270000044
将上述成分加入到1000mL蒸馏水中加热溶解，调节pH为6.2，分装后121℃高压灭菌18分钟，得到MRS培养基。
从酸奶中分离得到鼠李糖乳杆菌LRH09
分离方法如下：将酸奶样品于灭菌的生理盐水中十倍梯度稀释，分别取10-5，10-6，和10-7三种梯度的稀释液100μL，均匀涂布于具有2％碳酸钙的MRS培养基上，于37℃厌氧培养48h。挑取明显兼有溶钙环的有差别形态的菌落。接种于相对应的MRS中増菌培养24h，选择pH为4.5左右的菌株，再一次划线接种于MRS培养基上，分离纯化3次后得到鼠李糖乳杆菌菌株。
上述方法得到的鼠李糖乳杆菌LRH09的特性如下：
革兰氏阳性、不运动、无芽孢的耐氧厌酸细菌，形态呈双杆状，短小的杆菌。鼠李糖乳杆菌的DNA的鸟嘌呤(G)+胞嘧啶(C)的含量为45～47％；大多数菌株能产生少量的可溶性氮；不产吲哚和H2S，菌株经试验证实对牙周病具有预防和辅助治疗作用。
鼠李糖乳杆菌LRH09乳酸菌发酵液抑菌实验
(1)乳酸菌发酵液上清液的制备
取制备好的鼠李糖乳杆菌LRH09乳酸菌发酵液5g置于离心管，3000r/min离心处理10min，收集上清液用0.22μm滤膜过滤除菌后备用。
(2)BHI固体培养基的制备
称取3.7gBHI培养基粉末和3.7g琼脂加蒸馏水定容至100mL，121℃下高压灭菌20min，待温度冷却至50℃左右，倒平板中备用。
(3)TSA培养基的制备
称取胰胨1.5g、植物蛋白胨0.5g、氯化钠3g、琼脂1.5g加蒸馏水定容至100mL，不断搅拌加热至煮沸1min，分装于试管中121℃，高压灭菌20min，冷却后备用。
(4)乳酸菌发酵液上清液对变形链球菌的抑菌实验
采用牛津杯双层平板法。无菌平皿中加入10mL琼脂培养基，待培养基凝固后放入牛津杯；取100μL浓度为1×108CFU/mL变形链球菌指示菌菌液与10mL的BHI固体培养基混匀倒入平皿，待液体凝固后取出牛津杯，将100μL乳酸菌发酵液上清液加入孔中，37℃厌氧培养20～24h后对抑菌圈直径进行测量。
(5)乳酸菌发酵液上清液对具核梭杆菌、伴放线放线杆菌的抑菌实验
采用琼脂扩散法。取100μL浓度为1×108CFU/mL指示菌菌液均匀涂布在含有脱纤维羊血的TSA固体培养基上，放入牛津杯并取100μL乳酸菌发酵液上清液加入孔中，37℃厌氧培养3～5d后对抑菌圈直径进行测量。
(6)调节液体MRS培养基的pH为5.5时，其抑菌效果消失，作为空白对照组，打孔直径为7mm，牛津杯直径7mm。
参见图1，图1为以上乳酸菌发酵液抑菌实验结果的示意图。在图1中，以液体MRS培养基作为空白对照组，抑菌圈直径代表抑菌能力强弱，抑菌圈直径越大则抑菌能力越强。图1显示的实验结果表明，鼠李糖乳杆菌LRH09乳酸菌发酵液对三株菌口腔指示菌均有较强抑菌活性。
鼠李糖乳杆菌LRH09凝集实验
(1)自凝集实验
将鼠李糖乳杆菌菌液及致病菌菌液分别3000r/min离心处理10min，收集菌体用PBS洗涤并重悬，测定波长600nm处吸光度，调节菌悬液吸光度为0.60±0.02静置培养，每间隔1h吸取上清液测定吸光度，计算菌体自凝集率。
(2)共凝集实验
将鼠李糖乳杆菌菌液和致病菌菌液3000r/min离心处理10min，收集菌体用PBS洗涤并重悬，测定波长600nm处吸光度，调节菌悬液吸光度为0.60±0.02，将两种菌悬液等体积混合，充分震荡2min后静置培养，每间隔1h吸取上清液测定吸光度，计算鼠李糖乳杆菌与致病菌的共凝集率。
上述自凝集实验和共凝集实验的结果参见图2。图2显示的实验结果表明，随时间增长，菌株的自凝集率逐渐增加。具核梭杆菌菌株本身有较强的自凝集能力，LRH09与具核梭杆菌产生共凝集反应，一定程度上减弱了该菌株的自凝集，从而减少其在牙周袋中聚集形成生物膜。除具核梭杆菌外LRH09的自凝集能力最强，LRH09能够与变形链球菌以及伴放线放线杆菌发生共凝集反应，可以有助于使这些菌排出口腔从而达到预防牙周病的目的。
实施例1：
1)调配：按照如下配方执行：
全脂奶粉8g；乳清蛋白粉1g；酵母抽提物0.5g；低聚异麦芽糖浆4g；低聚果糖1g；低聚半乳糖2g；食品添加剂1g；补水至100g。
2)灭菌：88℃，30min。
3)冷却：冷却至42℃
4)接菌：接入鼠李糖乳杆菌LRH09，使得原始菌数在1.0×104cfu/ml。
5)发酵：发酵温度34℃，时间18h。
6)灌装。
7)将步骤6)制得鼠李糖乳杆菌LRH09乳酸菌发酵液在制备食品以及日化用品中的应用，其总用量为最终产品总重量的5％。
实施例2：
1)调配：按照如下配方执行：
全脂奶粉12g；乳清蛋白粉1g；酵母抽提物0.5g；低聚异麦芽糖浆4g；低聚果糖2g；低聚半乳糖3g；食品添加剂1g；补水至100g。
2)灭菌：90℃，20min。
3)冷却：冷却至42℃
4)接菌：接入鼠李糖乳杆菌LRH09，使得原始菌数在1.0×105cfu/ml。
5)发酵：发酵温度40℃，时间15h。
6)灌装。
7)将步骤6)制得鼠李糖乳杆菌LRH09乳酸菌发酵液在制备食品以及日化用品中的应用，其总用量为最终产品总重量的5％。
实施例3
1)调配：按照如下配方执行：
全脂奶粉16g；乳清蛋白粉2g；酵母抽提物1g；低聚异麦芽糖浆5g；低聚果糖2g；低聚半乳糖3g；食品添加剂2g；补水至100g。
2)灭菌：90℃，20min。
3)冷却：冷却至42℃。
4)接菌：接入鼠李糖乳杆菌LRH09，使得原始菌数在1.0×105cfu/ml。
5)发酵：发酵温度45℃，时间14h。
6)灌装。
7)将步骤6)制得鼠李糖乳杆菌LRH09乳酸菌发酵液在制备食品以及日化用品中的应用，其总用量为最终产品总重量的8％。
实施例4
1)调配：按照如下配方执行：
全脂奶粉16g；乳清蛋白粉2g；酵母抽提物2g；低聚异麦芽糖浆6g；低聚果糖2g；低聚半乳糖4g；食品添加剂2g；补水至100g。
2)灭菌：92℃，15min。
3)冷却：冷却至42℃
4)接菌：接入鼠李糖乳杆菌LRH09，使得原始菌数在1.0×105cfu/ml。
5)发酵：发酵温度45℃，时间14h。
6)灌装。
7)将步骤6)制得鼠李糖乳杆菌LRH09乳酸菌发酵液在制备食品以及日化用品中的应用，其总用量为最终产品总重量的10％。
上述虽然对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。

Claims (7)

1.鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)LRH09在制备具有预防牙周病产品中的应用，所述鼠李糖乳杆菌LRH09(Lactobacillus rhamnosus)已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.19423。
2.采用权利要求1所述鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)LRH09制备的乳酸菌发酵液，其特征在于通过如下方法制备：
1)调配：全脂奶粉10～16g，乳清蛋白粉1～2g，酵母抽提物0.5～2g，低聚异麦芽糖浆4～6g，低聚果糖1～2g，低聚半乳糖2～4g，食品添加剂1～2g，水补至100g；
2)灭菌；
3)冷却：冷却至42～45℃；
4)接种：在发酵底物接入鼠李糖乳杆菌LRH09，使得原始菌数为1.0×104cfu/ml～1.0×105cfu/ml；
5)发酵：34～45℃发酵14～18小时；
6)灌装。
3.如权利要求2所述的乳酸菌发酵液，其特征在于步骤2)是在88～92℃下灭菌15～30分钟。
4.采用权利要求2-4任意一项所述乳酸菌发酵液制备的具有预防牙周病的产品，其特征在于其中乳酸菌发酵的重量含量为5～10％。
5.如权利要求4所述的具有预防牙周病的产品，其特征在于为食品或日化产品。
6.如权利要求5所述的具有预防牙周病的产品，其特征在于所述食品为酸奶、果冻、口香糖或含片。
7.如权利要求5所述的具有预防牙周病的产品，其特征在于所述日化品为牙膏或漱口水。
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