CN113234064A - 一种替加氟衍生物及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种替加氟衍生物及其制备方法与应用，所述衍生物由式Ⅰ表示，其分子式为C₁₇H₁₅FN₂O₆，以替加氟、阿司匹林酰氯、三乙胺为原料，通过绿色化学合成的方法使阿司匹林与替加氟结合，从而形成一种新的替加氟衍生物FT‑A，剂型包括有温敏性凝胶、脂质体、片剂、胶囊剂，在制备治疗肺癌、肝癌、乳腺癌、结肠癌和胃癌药物中的应用。

Description

一种替加氟衍生物及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种替加氟衍生物及其制备方法与应用。

背景技术

替加氟(Tegafur)是在5-FU的氮原子上增加一个呋喃基团制备而成。其在体内能干扰和拮抗DNA和RNA的合成，但在体外无药理作用。动物实验表明其毒性只有5-FU的1/4，化疗指数是5-FU的2倍。同时其对免疫系统的影响轻微，慢性毒性实验表明Tegafur没有严重的骨髓抑制。但是仍然存在导致外周水肿，呼吸困难以及爆发性肝炎的风险。因此对其进行结构修饰成为了开发新型化疗药物的热点。

阿司匹林是常用的解热镇痛抗药，其可以通过使COX酶发生不可逆的乙酰化失活从而抑制下游前列腺素的生成。近年来研究发现阿司匹林在抗肿瘤活性上有着一定的潜力。COX-2的异常表达与肿瘤生长有着一定联系。实验表明一定剂量下的阿司匹林能使COX-2活性中心的丝氨酸乙酰化而失活，减少前列腺素和血栓素的生成并阻断旁路分泌脂质，提高了免疫系统对肿瘤细胞的识别与清除能力，同时诱导肿瘤细胞凋亡发生。NF-κB是一种公认的炎症调节因子，大量研究发现肿瘤细胞中NF-κB被过度的激活从而造成肿瘤组织无法执行正常的凋亡程序。因此，阿司匹林可以通过影响COX-2的表达进而抑制NF-κB的过度表达激活肿瘤细胞体内的凋亡基因。这些研究均表明了阿司匹林是一种具有潜在抗肿瘤活性的新型活性小分子。

发明内容

本发明的第一目的是提供一种替加氟衍生物。

本发明的第二目的是提供一种替加氟衍生物的制备方法。

本发明的第三目的是探讨替加氟衍生物在制备治疗肺癌、肝癌、乳腺癌、结肠癌和胃癌药物中的应用。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种替加氟衍生物，所述衍生物由式Ⅰ表示，其分子式为C₁₇H₁₅FN₂O₆

进一步，具体步骤如下：

分别取1～80份的替加氟、1～90份的阿司匹林酰氯以及1～100份的三乙胺，将替加氟和三乙胺放入容器中，加入二氯甲烷溶解，得浓度为0.2～3mmol/mL的溶液M；

用二氯甲烷溶解阿司匹林酰氯得浓度为0.6～1.8mmol/mL的溶液N，将溶液N加入溶液M中，自加入溶液N时开始计时，合成反应进行至0.5～1h时终止合成反应，得反应液G；

将反应液G旋转蒸发挥干得替加氟衍生物粗品FT-A，加入预冷的无水乙醇溶液溶解替加氟衍生物粗品FT-A至饱和浓度，将饱和的替加氟衍生物粗品FT-A无水乙醇溶液在低温或常温体系下重结晶，得到纯化后的替加氟衍生物FT-A。

进一步，所述替加氟为40份，阿司匹林酰氯为60份，三乙胺为40份，溶液M的浓度为1mmol/mL，溶液N的浓度为1mmol/mL，合成反应时间为0.75h。

进一步，所述的一种替加氟衍生物在制备治疗肺癌、肝癌、乳腺癌、结肠癌和胃癌药物中的应用。

进一步，所述的一种替加氟衍生物制备的剂型包括有温敏性凝胶、脂质体、片剂、胶囊剂。

由于采用了上述技术方案，本发明具有如下的优点：

1、本发明以替加氟、阿司匹林酰氯、三乙胺为原料，通过绿色化学合成的方法使阿司匹林与替加氟结合，从而形成一种新的替加氟衍生物FT-A。

2、本发明的替加氟衍生物FT-A结构新颖、抗肿瘤活性强、合成方法简单、操作简便、绿色环保、生产成本低廉、适合大规模生产。

3、本发明的替加氟衍生物FT-A的成药性好，能制备为固体分散、脂质体、温敏性凝胶等一系列新型药物制剂。

本发明的其它优点、目标和特征在某种程度上将在随后的说明书中进行阐述，并且在某种程度上，基于对下文的考察研究对本领域技术人员而言将是显而易见的，或者可以从本发明的实践中得到教导。本发明的目标和其他优点可以通过下面的说明书和权利要求书来实现和获得。

附图说明

本发明的附图说明如下：

图1为本发明所述替加氟衍生物FT-A的HPLC色谱图。

图2为本发明所述替加氟衍生物FT-A的紫外吸收UV图。

图3为本发明所述替加氟衍生物FT-A的Q-TOF的总离子图。

图4为本发明所述替加氟衍生物FT-A的Q-TOF中的正离子TIC+图。

图5为本发明所述替加氟衍生物FT-A对MCF-7细胞周期抑制图。

图6为肿瘤块的HE染色病理切片和免疫组化图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明，但不应该将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例，凡基于本发明上述内容实现的技术均属于本发明的范围。

实施例1：替加氟衍生物FT-A的制备

分别取32份的替加氟、20份的阿司匹林酰氯以及10份的三乙胺，将替加氟和三乙胺放入容器中，加入二氯甲烷溶解，得浓度为0.2mmol/mL的溶液M；

用二氯甲烷溶解阿司匹林酰氯得浓度为1.5mmol/mL的溶液N，将溶液N加入溶液M中，自加入溶液N时开始计时，合成反应进行至0.5h时终止合成反应，得反应液G；

将反应液G旋转蒸发挥干得替加氟衍生物粗品FT-A，加入预冷的无水乙醇溶液溶解替加氟衍生物粗品FT-A至饱和浓度，将饱和的替加氟衍生物粗品FT-A无水乙醇溶液在低温或常温体系下重结晶，得到纯化后的替加氟衍生物FT-A。

实施例2：替加氟衍生物FT-A的制备

分别取40份的替加氟、60份的阿司匹林酰氯以及40份的三乙胺，将替加氟和三乙胺放入容器中，加入二氯甲烷溶解，得浓度为1mmol/mL的溶液M；

用二氯甲烷溶解阿司匹林酰氯得浓度为1mmol/mL的溶液N，将溶液N加入溶液M中，自加入溶液N时开始计时，合成反应进行至0.75h时终止合成反应，得反应液G；

将反应液G旋转蒸发挥干得替加氟衍生物粗品FT-A，加入预冷的无水乙醇溶液溶解替加氟衍生物粗品FT-A至饱和浓度，将饱和的替加氟衍生物粗品FT-A无水乙醇溶液在低温或常温体系下重结晶，得到纯化后的替加氟衍生物FT-A。

实施例3：替加氟衍生物FT-A的制备

分别取10份的替加氟、45份的阿司匹林酰氯以及25份的三乙胺，将替加氟和三乙胺放入容器中，加入二氯甲烷溶解，得浓度为2mmol/mL的溶液M；

用二氯甲烷溶解阿司匹林酰氯得浓度为0.6mmol/mL的溶液N，将溶液N加入溶液M中，自加入溶液N时开始计时，合成反应进行至1h时终止合成反应，得反应液G；

将反应液G旋转蒸发挥干得替加氟衍生物粗品FT-A，加入预冷的无水乙醇溶液溶解替加氟衍生物粗品FT-A至饱和浓度，将饱和的替加氟衍生物粗品FT-A无水乙醇溶液在低温或常温体系下重结晶，得到纯化后的替加氟衍生物FT-A。

实施例4：替加氟衍生物FT-A用于制备温敏性凝胶

1、实验材料

实施例2中的条件下所制得的替加氟衍生物FT-A、泊洛沙姆F127、泊洛沙姆F68、难溶性药物

2、实验方法

1)按泊洛沙姆F127︰泊洛沙姆F68＝5︰1的质量比称取该两种物质，将泊洛沙姆F127和泊洛沙姆F68放入容器中，加入适过量有机试剂溶剂使之溶解溶液Ⅰ；

2)将所需配制成药物浓度量的难溶性药物加入到溶液Ⅰ中，超声时使之完全溶解得溶液Ⅱ，将溶液Ⅱ在30℃，转速为110r/min的条件下旋转蒸发出去有机试剂得固体分散体O，将固体分散体O在35℃、真空的条件下固化24h；

3)向固体分散体中O加入70份的无菌用水，涡旋混匀并在4℃的条件下溶胀24h得的温敏性凝胶。

实施例5：替加氟衍生物FT-A检测

1、实验材料

实施例2中的条件下所制得的替加氟衍生物FT-A、乙腈、磷酸

2、实验方法

高效液相色谱检测：色谱条件：色谱柱为Inertsil ODS-SP C18柱(4.6mm×250mm)，保护柱为Phenomenex C18(4.0mm×3.0mm)，流动相为：乙腈︰0.1％磷酸＝51︰49，流速为0.55mL/min，柱温30℃，取替加氟衍生物FT-A进样量20μL，UV检测波长为250nm；

质谱检测：取替加氟衍生物FT-A用ESI-MS(正离子模式)进行质谱检测。

3、实验结果

产率为27.7％、熔程为115±0.3℃、溶解度为113.96±2.96μg/mL、脂水分配系数Log P＝0.625±0.009；

高效液相色谱检测：由图1可以看出，替加氟衍生物FT-A的出峰时间为13.08min其纯度大于99.9％；

质谱检测：如图2-4所示，替加氟衍生物FT-A的分子量：[M+H⁺]＝363.0944，分子式为C₁₇H₁₅FN₂O₆，核磁共振氢谱数据为：¹H-NMR(400MHz,DMSO)δ8.15(d,J＝4.8Hz,1H),8.10(d,J＝5.5Hz,1H),7.82(d,J＝6.5Hz,1H),7.47(t,J＝6.0Hz,1H),7.37(d,J＝6.1Hz,1H),5.90(s,1H),4.30(s,1H),3.83(d,J＝5.7Hz,1H),3.35(s,3H),2.25–1.80(m,4H)。

实施例6：替加氟衍生物FT-A的毒理学评价

1、实验材料

MCF-7、HepG2、A549、Caco2、TMK-1细胞株、替加氟FT、实施例2中的条件下所制得的替加氟衍生物FT-A

2、实验方法

将MCF-7、HepG2、A549、Caco2、TMK-1细胞株均培养在37℃、5％CO₂细胞培养箱中，取对数生长期细胞用于MTT增殖实验，将各个肿瘤细胞种于96孔板中，细胞浓度5000个/孔，细胞培养箱孵育24h，分别在各个孔中加入相同浓度(32.25μM、61.5μM、125μM、250μM、500μM)的FT和FT-A药物干预各肿瘤细胞。计算24h、48h各个药物的肿瘤细胞抑制率。

3、实验结果

表1替加氟FT、替加氟衍生物FT-A在体外对MCF-7肿瘤细胞的增殖抑制作用

表2替加氟FT、替加氟衍生物FT-A在体外对HepG2肿瘤细胞的增殖抑制作用

表3替加氟FT、替加氟衍生物FT-A在体外对A549肿瘤细胞的增殖抑制作用

表4替加氟FT、替加氟衍生物FT-A在体外对Caco2肿瘤细胞的增殖抑制作用

表5替加氟FT、替加氟衍生物FT-A在体外对TMK-1肿瘤细胞的增殖抑制作用

注：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.000 1，表示FT-A与FT比较有显著性差异

实验结果由表1-表5所示，替加氟衍生物FT-A在MCF-7、HepG2、A549、Caco2、TMK-1细胞的抑制效果相比于替加氟均有明显的提高，并体现出了明显的浓度和时间依赖性，表明FT-A具有更好的肿瘤抑制作用，同时FT-A对MCF-7乳腺癌最为敏感。

实施例7：替加氟衍生物FT-A的肿瘤细胞周期抑制实验

1、实验材料

人乳腺癌癌细胞株MCF-7、替加氟FT、实施例2中的条件下所制得的替加氟衍生物FT-A

2、实验方法

取生长旺盛的MCF-7乳腺癌细胞种于细胞六孔板中，每个孔的肿瘤细胞浓度为1.5×10⁵/mL孔。待肿瘤细胞于细胞培养箱培养24h后，依次向各个孔中加入1mL的同浓度的ASP(阿司匹林)，FT，FT-A(125μM)。待药物作用于肿瘤细胞24h后，用胰酶消化各个孔的细胞并用PBS清洗各个细胞孔两次，加入70％的乙醇溶液并在-4℃的条件下固定各个孔的细胞24h，倾倒掉各个组的乙醇溶液后，用PBS清洗两次，于室温条件下，每个样品管内加入500μLPI/RNase染色缓冲液，吹打均匀后于37℃水浴下避光染色30min。待样品完成检测后，通过modifit软件处理数据。

3、实验结果

如图5所示，FT把MCF-7细胞阻滞在S期的效果明显低于FT-A，使肿瘤细胞无法完成正常的有丝分裂。图5(B)的结果显示，FT-A对MCF-7细胞S期的阻滞效果明显高于FT(P<0.05)，结果表明了替加氟衍生物FT-A进一步提升了母体药物对细胞周期的影响。

实施例8：替加氟衍生物(FT-A)、FT-A温敏性凝胶(FT-A-TSG)的裸鼠体内抗肿瘤实验

1、实验材料

SPF级四周龄裸鼠(由成都达硕生物科技有限公司提供，动物合格证号：SCXK(川)2013-24)、人乳腺癌癌细胞株MCF-7、替加氟FT、FT温敏性凝胶(FT-TSG)、实施例2中的条件下所制得的替加氟衍生物FT-A、实施例4的条件下所制得的FT-A温敏性凝胶(FT-A-TSG)、实施例8的条件下所制得的呋喃氟尿嘧啶衍生物BFT-1

2、实验方法

1、肿瘤细胞液的制备

取对数生长期MCF-7乳腺癌细胞，消化，吹打，离心，去上清液，用PBS缓冲液洗涤2次，将PBS缓冲液和基质胶按照1:1的比例混合后加入细胞中配成细胞浓度为1.0×10⁸个/mL。

2、肿瘤动物模型的构建与分组

将MCF-7乳腺癌细胞(浓度为1.0×10⁸个/mL)，用1mL注射器抽取0.1mL(细胞个数为1.0×10⁷个)瘤细胞悬液在超净工作台上接种于经75％酒精消毒后的裸小鼠右臀部皮下，置于SPF动物房中喂养。

3、给药剂量及方式

对荷瘤鼠每两天注射给药1次，体积0.1mL，空白对照组给予生理盐水，其余三组分别给予替加氟(FT)、替加氟衍生物(FT-A)和FT温敏性凝胶(FT-TSG)和FT-A温敏性凝胶(FT-A-TSG)剂量为50mg/kg。其中FT和FT-A组为口服给药，FT-TSG和FT-A-TSG为癌旁注射给药。

每3日定时测量各组小鼠体重，瘤块体积。游标卡尺测量皮下瘤的长径a(mm)，横径b(mm)，计算公式：肿瘤体积＝π/6*(ab²)计算肿瘤体积。

在连续用药18日后，将模型鼠于超净工作台上，处死小鼠，切开荷瘤小鼠皮肤，游离瘤旁组织，完整暴露瘤体并整体剥离瘤组织，除去瘤组织上的附着的非瘤组织，电子天平称重，计算其抑瘤率，抑瘤率＝(对照组平均瘤重-治疗组平均瘤重)/对照组平均瘤重×100％。

3、实验结果

表6 FT、FT-A、FT-TSG、FT-A-TSG的裸鼠皮下瘤体积变化

表7裸鼠各个时间点的体重(

n＝5)

表9 FT-A及其凝胶剂与BFT-1对实体瘤的抑制率比较

从表6可以看出替加氟(FT)、替加氟衍生物(FT-A)、FT温敏性凝胶(FT-TSG)、FT-A温敏性凝胶(FT-A-TSG)与空白对照相比均抑制了肿瘤的增长(P<0.05)。相比于替加氟(FT)，替加氟衍生物(FT-A)、FT温敏性凝胶(FT-TSG)、FT-A温敏性凝胶(FT-A-TSG)抗肿瘤活性均有明显提升(P<0.05)，同时FT-A温敏性凝胶(FT-A-TSG)抗肿瘤活性也高于替加氟衍生物(FT-A)(P<0.05)，表明我们所合成的FT-A具有高效的抗肿瘤活性。同时可以看出FT-A-TSG的抗肿瘤效果要好于FT(P<0.05)；

从表7可知，FT-A在同等剂量下体重的减少量低于替加氟并且与空白组体重的相当。表明我们所制备的新型替加氟的安全性更好。同时，将该衍生物制备为温敏性凝胶后，其对裸鼠的体重的影响无空白组无差异，进一步证明了FT-A温敏性凝胶良好的生物安全性；

从表9可知，BFT-1的在110mg/kg下对实体移植瘤的抑制率为22.0～40.5％，FT-A在50mg/kg剂量下对实体移植瘤的抑制率达到53.10％，证明了FT-A对替加氟抗肿瘤活性的提升更加明显。同时我们发现将FT-A制备为温敏性凝胶后进一步提高了FT-A对实体瘤的抑制作用。

实施例9：呋喃氟尿嘧啶衍生物BFT-1与替加氟衍生物FT-A对比

1)呋喃氟尿嘧啶衍生物BFT-1的合成

称取邻甲基苯甲酸5.0g(0.037mL)置入250mL圆底烧瓶，加氯化亚砜10mL，50-55℃条件下反应5h，至不再冒白烟，减压蒸馏去除过量氯化亚砜，得黄色油状物邻甲基苯甲酰氯，将邻甲基苯甲酰氯溶于10mL氧六环中，备用；

称取替加氟(FT-207)7.3g(0.037mL)置于250mL＝颈圆底烧瓶，加入35mL二氧六环和7.4mL三乙胺，用滴液漏斗滴加上述的邻甲基苯甲酰氯的二氧六环混合液，立即析出白色沉淀，滴加时间至少10min，滴加完毕，继续搅拌1h，然后将反应液倾倒入1000mL水中，搅拌，放置30min，下部的黏稠物固化结块，1h后过滤，水洗2次，干燥，得淡黄色蜡状固体；

将上述淡黄色蜡状固体7.2g加入20mL无水乙醇，加热溶解后，冰水冷却，得白色固体为呋喃氟尿嘧啶衍生物BFT-1。

2)呋喃氟尿嘧啶衍生物BFT-1的抗肿瘤实验

选用小鼠体内移植性肿瘤S₁₈₀和H₂₂两瘤谱，采用灌胃给药，计量分别为150，130，110mg/kg。连续给药9d，重复实验并与替加氟(FT-207)l 10mg/kg进行比较；

结果：BFT-1 150mg/kg对小鼠S₁₈₀和H₂₂的抑制率分别为48.4～52.9％和57.2％～60.0％，本剂量条件下动物体重下降范围在10％～15％左右。BFT-1剂量130mg/kg时对上述瘤谱的抑制率为42.3％～45.3％和40.5％～60.7％，该剂量下体重不降或略增。BFT-1110mg/kg时抑制率为38.3％～39.1％和22.2％～40.5％，其体重与对照组无明显差异。FT-207剂量110mg/kg时对S₁₈₀和H₂₂的抑制率分别为41.5％～61.3％和27.0％～45.9％，体重下降范围在17.7％～21.8％。

3)呋喃氟尿嘧啶衍生物BFT-1与替加氟衍生物FT-A合成方法及结果对比

方法比较：以实施例2中的条件下所制得的替加氟衍生物FT-A与本实施例中呋喃氟尿嘧啶衍生物BFT-1的合成方法相比较，由表8可知，FT-A的合成方法与BFT-1的合成方法相比简单，所用原料物质少、用时短、反应试剂绿色环保、反应步骤简单、污染低、具有成本低廉、适合工业化生产等优势；

结果比较：肿瘤S₁₈₀、H₂₂、人乳腺癌癌细胞株MCF-7均属于实体瘤类，因此将其作为实体瘤类进行比较，由表9可知，BFT-1的在110mg/kg下对实体移植瘤的抑制率为22.0～40.5％，FT-A在50mg/kg剂量下对实体移植瘤的抑制率达到53.10％，证明了FT-A对替加氟抗肿瘤活性的提升更加明显，FT-A的有效剂量比BFT-1小。同时我们发现将FT-A制备为温敏性凝胶后进一步提高了FT-A对实体瘤的抑制作用。

表8替加氟衍生物FT-A与BFT-1合成方法的比较

表9 FT-A及其凝胶剂与BFT-1对实体瘤的抑制率比较

实施例10：裸鼠荷植瘤HE染色与免疫组化实验

1、实验材料

SPF级四周龄裸鼠(由成都达硕生物科技有限公司提供，动物合格证号：SCXK(川)2013-24)、人乳腺癌细胞株MCF-7、替加氟FT、FT温敏性凝胶(FT-TSG)、实施例2中的条件下所制得的替加氟衍生物FT-A、实施例4的条件下所制得的FT-A温敏性凝胶(FT-A-TSG)

2、实验方法

按实施例8的方法移植肿瘤并进行给药，18天后处死裸鼠，分离出肿瘤。瘤块称重后，用0.9％生理盐水冲洗后，吸水纸除去多余水分，再用10％甲醛固定肿瘤块，甲醛固定24h以上，取出进行石蜡包埋，将所选石蜡包埋标本进行3～5μm连续切片，HE染色制片，观察形态学上是否存在差异，同时对各个肿瘤块进行Ki67的免疫组化分析。

3、实验结果

如图6所示，空白组的肿瘤细胞生长旺盛，微血管丰富，给药组的肿瘤细胞虽未见明显的形态学改变，但可以看出，其微血管丰富程度为：空白组>FT组＞FT-A组＞FT-TSG组>FT-A-TSG组。同时免疫组化结果表明各个组对Ki67的阳性反应率为空白组>FT组＞FT-A组＞FT-TSG组>FT-A-TSG组。该结果表明：与替加氟相比，替加氟衍生物FT-A能更好的抑制肿瘤在裸鼠的体内生长。同时，将FT-A制备为温敏性凝胶后进一步提升了FT-A的抗肿瘤活性。

最后用说明的是：以上所述仅为本发明的优选实验而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行同等替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、同等替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种替加氟衍生物，其特征在于，所述衍生物由式Ⅰ表示，其分子式为C₁₇H₁₅FN₂O₆

2.如权利要求1所述的一种替加氟衍生物的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：

分别取1～80份的替加氟、1～90份的阿司匹林酰氯以及1～100份的三乙胺，将替加氟和三乙胺放入容器中，加入二氯甲烷溶解，得浓度为0.2～3mmol/mL的溶液M；

用二氯甲烷溶解阿司匹林酰氯得浓度为0.6～1.8mmol/mL的溶液N，将溶液N加入溶液M中，自加入溶液N时开始计时，合成反应进行至0.5～1h时终止合成反应，得反应液G；

将反应液G旋转蒸发挥干得替加氟衍生物粗品FT-A，加入预冷的无水乙醇溶液溶解替加氟衍生物粗品FT-A至饱和浓度，将饱和的替加氟衍生物粗品FT-A无水乙醇溶液在低温或常温体系下重结晶，得到纯化后的替加氟衍生物FT-A。

3.如权利要求2所述的一种替加氟衍生物的制备方法，其特征在于，所述替加氟为40份，阿司匹林酰氯为60份，三乙胺为40份，溶液M的浓度为1mmol/mL，溶液N的浓度为1mmol/mL，合成反应时间为0.75h。

4.如权利要求1-3所述的一种替加氟衍生物在制备治疗肺癌、肝癌、乳腺癌、结肠癌和胃癌药物中的应用。

5.如权利要求1-4所述的一种替加氟衍生物制备的剂型包括有温敏性凝胶、脂质体、片剂、胶囊剂。

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