CN113230463A - 一种模仿角膜内皮载体的水凝胶支架材料及其制备方法 - Google Patents

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南开辉
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Abstract

一种模仿角膜内皮载体的水凝胶支架材料及其制备方法，制备得到的角膜内皮载体支架生物相容性好，具有适合角膜内皮的机械强度，具有高透光率，能与临床角膜内皮载体的需求应用相匹配。本发明提供的制备方法简单，制备过程绿色环保、无污染、无毒。

Description

一种模仿角膜内皮载体的水凝胶支架材料及其制备方法
技术领域
本发明涉及角膜组织工程技术领域，具体涉及一种模仿角膜内皮载体的水凝胶支架材料及其制备方法。
背景技术
角膜内皮细胞（CECS）是存在于房水内角膜后表面的一种扁平、多边形细胞。它通过调节基质水化在维持角膜透明度方面发挥关键作用。衰老、疾病或创伤等许多角膜问题都可能导致角膜内皮细胞明显缺失以及角膜水肿。成年以后，人角膜内皮细胞无体内增殖能力，一旦功能丧失，想要恢复视力就需要角膜移植。临床上有多种移植的方法，从全角膜的替换到仅病变细胞层的替换。
由于全层角膜移植创伤性高（穿透性角膜移植术，PK），微创手术变得越来越受欢迎。例如，角膜内皮移植术，其中最常见的是角膜后弹力层剥除联合深板层内皮移植术（DSEK），它仅仅将受体的后弹力层和内皮的复合体从角膜去除，并植入来源于供体的薄角膜基质-后弹力层-内皮的复合体。因为只有一层薄层组织通过小切口被替换，故该技术创伤更小、视力恢复更快、感染风险更低。在美国，角膜内皮移植术已经超越了穿透性角膜移植术成为内皮功能障碍的首选，占2011年角膜移植手术量的47%。然而，全世界都面临着角膜供体的缺乏问题。另一方面，角膜内皮细胞已被证明在一定条件下可以体外增殖，体外重建组织工程角膜内皮作为角膜内皮的等效替代物，是目前角膜内皮盲患者恢复光明的希望。
目前，体外培养的内皮细胞已经用于动物试验。然而，由于细胞获取技术难度大以及细胞膜片易碎的特点，在临床上尚未成功应用。因此，需要一种可以精确植入和固定移植物的载体来帮助单层细胞的移植。一种理想的角膜内皮细胞载体应该是没有细胞毒性、机械性能强、生物相容性好、透明、可以渗透营养物和氧气。目前，已有研究表明选择合适的生物材料在角膜内皮细胞载体的形成中起到关键作用。脱细胞角膜、人羊膜、胶原膜、交联明胶、壳聚糖、丝素膜、软水凝胶镜片、丙交酯和共聚物、聚己内酯等都被用于角膜内皮细胞的培养。其中，水凝胶因其具有类似于体内组织的多孔结构，能提供细胞生长的三维微环境、适当的渗透能力和力学性能，是组织工程应用中的优良生物材料。目前，已有很多方法制备可以成为角膜内皮细胞载体的水凝胶，如，化学交联、冻融法、热交联、酶交联和光交联。近些年，点击化学因为其高反应性、超选择性和温和的反应条件已被认为是制备具不同设计性能水凝胶最有前景的方法。
近年来，国内外不少学者采用各种方法制备角膜内皮载体支架材料，以期能应用于临床。发明专利CN201310753693阐述了一种构建组织工程角膜内皮的方法，该法利用活羊膜上皮片构建组织工程角膜内皮，以活羊膜上皮片为角膜内皮载体，存在原料不易得，并且存在免疫排斥问题。发明专利CN 111110921 A“一种组织工程后板层角膜的体外构建方法”以带有后弹力层的脱细胞猪角膜基质为载体支架，其支架的制备工艺复杂、制备条件要求高，存在免疫源性争议。发明专利CN 112156228 A“基于角膜基质为载体的角膜内皮膜片”以人角膜基质为内皮载体，通过准分子激光/角膜刀切削等方式制得薄片，再在薄片表面引入阻隔水和促细胞粘附的修饰层，从而制备得到角膜内皮载体，但是通过该法得到的角膜内皮载体支架对原料来源要求高，制备过程中对技术条件和操作者的技术要求条件高，并且存在供体角膜来源少的问题。
发明内容
为了解决现有技术存在的技术缺陷，本发明提供了一种模仿角膜内皮载体的水凝胶支架材料及其制备方法，本发明制备的角膜内皮载体支架材料具有良好生物相容性并且兼具优良机械性能和透光性，制备方法绿色环保、无污染，原料来源广泛。
本发明采用的技术解决方案是：一种模仿角膜内皮载体的水凝胶支架材料，所述的水凝胶支架材料为基于硫醇-烯交联结构的水凝胶支架材料。
一种模仿角膜内皮载体的水凝胶支架材料的制备方法，包括以下步骤：对带有氨基的生物可降解高分子材料进行丙烯酸化改性处理，再将经过丙烯酸化改性处理的原料与二硫苏糖醇充分混合并在紫外灯辐照下进行光固化交联，最终得到所述的模仿角膜内皮载体的水凝胶支架材料。
所述的带有氨基的生物可降解高分子材料为多肽、透明质酸、明胶中的一种或几种。
所述的丙烯酸化改性处理的的带有氨基的生物可降解高分子材料与二硫苏糖醇混合的摩尔比为1:2-2:1。
所述的二硫苏糖醇以磷酸盐平衡生理盐水（PBS）为溶剂，配制浓度为50wt%以上。
所述的带有氨基的生物可降解高分子材料以PBS为溶剂，配制浓度为20wt%。
所述的光固化交联的紫外光辐照强度150mW，辐照时间为3-5min。
所述的光固化交联的光引发剂为I2959，其浓度为5wt%。
所述的硫醇-烯水凝胶支架经酒精溶液清洗3min，再存于2%双抗的PBS溶液中，制备得到的角膜内皮载体支架材料为无菌支架。
本发明的有益效果是：本发明提供了一种模仿角膜内皮载体的水凝胶支架材料及其制备方法，制备得到的角膜内皮载体支架生物相容性好，具有适合角膜内皮的机械强度，具有高透光率，能与临床角膜内皮载体的需求应用相匹配。本发明提供的制备方法简单，制备过程绿色环保、无污染、无毒。
附图说明
图1为制备得到的角膜内皮载体支架扫面电镜图。
图2为制备得到的角膜内皮载体支架的透光率检测结果。
图3为制备得到的角膜内皮载体支架透光性实物效果图。
图4 为制备得到的角膜内皮载体支架的机械性能。
图5为制备得到的角膜内皮载体支架各个性能数据汇总结果。
图6为制备得到的角膜内皮载体支架的生物相容性。
图7为角膜内皮细胞在该支架上生长的免疫荧光染色结果。
具体实施方式
下面通过实施例进一步描述本发明，但本发明不仅限于此。
二硫苏糖醇（DTT）与丙烯酸化明胶交联制备角膜内皮载体支架GE-AA
首先将光引发剂I2959溶于含50%乙醇的PBS水溶液中，配制成5%的引发剂溶液（溶液1）。同时，将丙烯酸化明胶溶解在PBS溶液中，配制成20wt%的溶液（溶液2），将二硫苏糖醇溶解在PBS溶液中，配制成50wt%的溶液（溶液3），其次，将溶液1和溶液2和溶液3混合，使双键与巯基的比例为1:2，得到溶液4。最后取200uL的溶液4置于圆形紫外可透过的模具中，在UV下照射3分钟固化成胶。
二硫苏糖醇（DTT）与戊烯酸化明胶交联制备角膜内皮载体支架GE-PA
首先将光引发剂I2959溶于含50%乙醇的PBS水溶液中，配制成5%的引发剂溶液（溶液1）。同时，将戊烯酸化明胶溶液溶解在PBS溶液中，配制成20wt%的溶液（溶液2），将二硫苏糖醇溶解在PBS溶液中，配制成50wt%的溶液（溶液3），其次，将溶液1和溶液2和溶液3混合，使双键与巯基的比例为2:1，得到溶液4。最后取200uL的溶液4置于圆形紫外可透过的模具中，在UV下照射3分钟固化成胶。
角膜内皮细胞种植于该内皮载体支架上
首先取上述实施例中制备得到的支架材料经酒精清洗3min，存于含2%双抗的PBS溶液中，制备得到无菌角膜内皮支架；将其铺展于24孔板底部。其次，将新鲜剥离的角膜内皮细胞（BCEC）以10000个/孔的密度种植于该内皮支架上，培养3天后得到角膜内皮细胞均匀铺展于该支架上的角膜内皮层。
免疫荧光染色
培养的角膜内皮细胞-水凝胶复合体在室温下用4%多聚甲醛固定10分钟，PBS清洗3次后用0.1% Triton X-100通透样品5分钟，再次清洗后用1%牛血清蛋白封闭非特异性抗原60分钟；PBS清洗3次后，室温下用小鼠抗ZO-1单克隆抗体（1：200）以及小鼠抗Na+/K+-ATP酶抗体（1：500）孵育2小时。然后将细胞-水凝胶复合体在山羊抗鼠IgG抗体中孵育1小时，再次清洗3次。所有步骤中，内皮细胞面朝上，避免损伤。样品用PBS清洗后铺在载玻片上，并用尼康TE-2000U显微镜观察。
各位技术人员须知：虽然本发明已按照上述具体实施方式做了描述，但是本发明的发明思想并不仅限于此发明，任何运用本发明思想的改装，都将纳入本专利专利权保护范围内。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种模仿角膜内皮载体的水凝胶支架材料，其特征在于，所述的水凝胶支架材料为基于硫醇-烯交联结构的水凝胶支架材料。
2.一种权利要求1所述的模仿角膜内皮载体的水凝胶支架材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：对带有氨基的生物可降解高分子材料进行丙烯酸化改性处理，再将经过丙烯酸化改性处理的原料与二硫苏糖醇充分混合并在紫外灯辐照下进行光固化交联，最终得到所述的模仿角膜内皮载体的水凝胶支架材料。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述的带有氨基的生物可降解高分子材料为多肽、透明质酸、明胶中的一种或几种。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述的丙烯酸化改性处理的带有氨基的生物可降解高分子材料与二硫苏糖醇混合的摩尔比为1:2-2:1。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述的二硫苏糖醇以磷酸盐平衡生理盐水（PBS）为溶剂，配制浓度为50wt%以上。
6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述的带有氨基的生物可降解高分子材料以PBS为溶剂，配制浓度为20wt%。
7.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述的光固化交联的紫外光辐照强度150mW，辐照时间为3-5min。
8.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述的光固化交联的光引发剂为I2959，其浓度为5wt%。
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