CN113219020B - 一种用于检测5-羟甲基糠醛的电化学生物传感器及其检测方法 - Google Patents

Abstract

一种用于检测5‑羟甲基糠醛的电化学生物传感器及其检测方法，包括由工作电极、参比电极和对电极组成的三电极体系，其特征在于：所述工作电极为铜镍双金属纳米粒子修饰的铜电极。本发明提供了一种基于铜镍双金属纳米粒子修饰电极的电化学生物传感器，可在碱性介质中检测5‑HMF。一方面，铜纳米粒子和镍纳米粒子同时电沉积到铜电极表面，可以增强铜电极的导电性，提高检测灵敏度；另一方面，铜‑镍双金属纳米粒子可在碱性介质中电化学氧化为高价的CuOOH/NiOOH，可催化氧化5‑HMF从而产生氧化峰电流。采用线性扫描伏安法或安培法记录信号，氧化峰电流I_P或电流变化△I与检测物5‑HMF的浓度呈正比，从而起到检测的目的。其中，安培法检测的灵敏度较高，检出限较低。

Description

一种用于检测5-羟甲基糠醛的电化学生物传感器及其检测方法

技术领域

本发明属于检测技术领域，涉及一种用于检测5-羟甲基糠醛的电化学生物传感器及其检测方法。

背景技术

5-羟甲基糠醛（简称5-HMF）是由碳水化合物在高温或弱酸等条件下脱水形成的一种醛类化合物。该化合物性质较为活泼，容易发生分解和聚合，广泛存在于蜂蜜、果汁、乳制品、饼干和咖啡等烘焙食品中。在食品加工过程中，随着5-HMF的产生，很多棕色物质和呈香物质会相继产生，因此它具有一定的增香调色作用。研究表明，少量的5-HMF具有良好的生物学效应如抗氧化活性、抗缺氧，但当5-HMF达到一定剂量时会对人体产生危害。大量的5-HMF被人体吸收后会转化为5-磺胺甲基糠醛，对人体的肝脏、肾脏、心脏等器官产生不良影响，还对眼黏膜、上呼吸道黏膜等产生刺激作用。另外，5-HMF是非酶褐变的一种中间产物和标志产物，5-HMF的量可以反映食品的褐变程度，从而反映食品的品质情况。基于5-HMF可能产生的毒性以及对食品质量的指示作用，在食品加工和贮藏的过程中应将其作为一个重要的物质加以监控。因此，需要建立一种简便，快速，高灵敏度的方法来对5-HMF进行检测。

目前，检测5-HMF的方法主要有紫外分光光度法、双波长法、气相色谱法、高效液相色谱法、气质联用（GC/MS）和液质联用（LC/MS）技术等。这些检测方法均有各自的优势但也存在不同层次上的不足。例如气质和液质联用技术具有良好的灵敏度和准确性，但是需要昂贵的仪器和熟练的技术人员，所以不能用于常规分析；如气相和液相色谱法进行分析需要利用液液萃取和固相萃取进行样品前处理，而且需要大量的挥发性有机溶剂，费时费力。因此需要找到一种无需大量人力和复杂设备，快速高效的5-HMF检测方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种一种基于铜镍双金属纳米粒子修饰电极的电化学生物传感器，可在碱性介质中检测5-HMF。一方面，铜纳米粒子和镍纳米粒子同时电沉积到铜电极表面，可以增强铜电极的导电性，提高检测灵敏度；另一方面，铜-镍双金属纳米粒子可在碱性介质中电化学氧化为高价的CuOOH/NiOOH，可催化氧化5-HMF从而产生氧化峰电流。采用线性扫描伏安法或安培法记录信号，氧化峰电流I_P或电流变化△I与检测物5-HMF的浓度呈正比，从而起到检测的目的。其中，安培法检测的灵敏度较高，检出限较低。。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供的技术方案是：一种用于检测5-羟甲基糠醛的电化学生物传感器，包括由工作电极、参比电极和对电极组成的三电极体系，所述工作电极为铜镍双金属纳米粒子修饰的铜电极。

优选的技术方案为：所述工作电极的制备方法包括将打磨抛光后的铜电极置于含有NiSO₄和 CuSO₄的H₂SO₄溶液中，然后利用循环伏安法进行连续扫描，从而将铜纳米粒子和镍纳米粒子同时电沉积到电极表面。

优选的技术方案为：含有NiSO₄和 CuSO₄的H₂SO₄溶液的制备方法包括将NiSO₄和CuSO₄溶于H₂SO₄溶液中，使NiSO₄和CuSO₄的浓度分别为0.2-0.3M和0.35-0.4M。

优选的技术方案为：循环伏安法进行连续扫描的工艺参数为：电势范围为0.5至-0.6V，循环次数为20 cycle，扫描速率为70 mV s^-1。

优选的技术方案为：所述参比电极为饱和Ag/AgCl电极，所述对电极为铂电极。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供的技术方案是：一种用于检测5-羟甲基糠醛的电化学生物传感器的检测方法，电化学测量时将含有5-羟甲基糠醛的0.1M氢氧化钠缓冲溶液作为检测底液；采用检测5-羟甲基糠醛的电化学生物传感器，然后采用线性扫描伏安法或安培法作为电化学检测方法；线性扫描伏安法的测量电势范围为0至0 .8V，扫描速率为100 mV s-1；安培法测量恒定电势为0.45V。

优选的技术方案为：所述电化学检测选用的是CHI660型电化学工作站。

优选的技术方案为：将含有5-HMF的待测液加入5 mL 0.1M氢氧化钠中，利用线性扫描伏安法或安培法进行测定，得到峰值电流Ip或梯度电流I，带入相应的浓度与电流之间的线性方程，即可得到待测液中5-HMF的量。

由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有的优点是：

本发明提供了一种基于铜镍双金属纳米粒子修饰电极的电化学生物传感器，可在碱性介质中检测5-HMF。一方面，铜纳米粒子和镍纳米粒子同时电沉积到铜电极表面，可以增强铜电极的导电性，提高检测灵敏度；另一方面，铜-镍双金属纳米粒子可在碱性介质中电化学氧化为高价的CuOOH/NiOOH，可催化氧化5-HMF从而产生氧化峰电流。采用线性扫描伏安法或安培法记录信号，氧化峰电流I_P或电流变化△I与检测物5-HMF的浓度呈正比，从而起到检测的目的。其中，安培法检测的灵敏度较高，检出限较低。

附图说明

图1：控制实验：裸铜电极(a)、CuNPs 修饰的电极(b)、NiNPs修饰的电极（c）、CuNi双金属纳米粒子修饰的电极(d)分别在无5-HMF（图1的A）和有5mM 5-HMF（图1的B）的0.1MNaOH缓冲溶液中进行线性伏安扫描（LSV），扫描速率：100 mV s^-1。

图2：LSV来优化电沉积的条件：图2的A为优化沉积液中NiSO₄的浓度；图2的B为优化沉积液中Cu²⁺和Ni²⁺的比例；图2的C为优化电沉积的CV扫描速率；图2的D为优化电沉积的CV扫描圈数。方法：将不同电沉积条件下得到的修饰电极在含5 mM 5-HMF的0.1M NaOH缓冲溶液进行LSV，扫描速率为100 mV s^-1，观察峰值电流的变化。

图3：时间-电流法来优化检测条件：图3的A为优化NaOH检测液的浓度；图3的B为优化恒定电位。方法：向连续搅拌的检测液中加入50μM的5-HMF，观察电流梯度的变化。

图4：线性扫描伏安法建立5-HMF的浓度与峰电流的线性关系：图4的A为在含有不同浓度5-HMF的0.1M的氢氧化钠检测液进行LSV；图4的另一幅图为建立的线性关系，线性范围为0.5 至 5mM，线性方程为I_p = 22.42022C_5-HMF -7.29425。方法：将5-HMF溶液用0.1M的氢氧化钠溶液稀释至5mL 0.5 、0.6、0.8、1、3、5mM，将其作为检测液。将生物传感器浸入检测液中，利用线性扫描伏安法（LSV）进行电化学检测，扫描的电势范围为0至0 .8V，扫描速率为100 mV s^-1。观察产生的峰值电流I_p，并建立5-HMF的浓度与峰值电流I_p之间的线性关系。

图5：时间-电流法建立5-HMF的浓度与梯度电流的线性关系：图5的第一幅图为在0.45V的恒定电位下，向0.1M NaOH 检测液中连续加入50μL不同浓度的5-HMF；图5的第二幅图为建立的线性关系，线性范围为0.8 -608.4 μM，线性方程为I= 0.02945C_5-HMF +0.12503。方法：将5-HMF溶液用0.1M的氢氧化钠溶液稀释至不同浓度。将生物传感器浸入连续搅拌的5mL 0.1M的氢氧化钠溶液中，每隔50s用注射器加入50 μL 不同浓度的5-HMF溶液，加入后的浓度为0.8-608.4 μM。在0.45V恒定电位下，利用i-t法进行电化学测定。观察加入5-HMF后产生的梯度电流I，并建立5-HMF的浓度与梯度电流I之间的线性关系。

图6：干扰实验：利用时间-电流法分别测定10 μM 5-HMF和实际样品中可能存在的干扰物，如果糖、蔗糖、葡萄糖、半乳糖、木糖、抗坏血酸产生的梯度电流。

图7：电化学传感器的重复性：三个工作电极利用同样的方法来修饰并构建传感器，利用时间-电流法来比较三个传感器对50 μM 5-HMF产生的电流响应，每个传感器重复测定三次。

图8：电化学传感器的稳定性：将工作电极在密封避光的环境中分别放置0、3、6、9、12天，分别利用时间-电流法来比较放置时间对50 μM 5-HMF产生的电流响应。

具体实施方式

以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效。

请参阅图1-8。须知，本说明书所附图式所绘示的结构、比例、大小等，均仅用以配合说明书所揭示的内容，以供熟悉此技术的人士了解与阅读，并非用以限定本发明可实施的限定条件，故不具技术上的实质意义，任何结构的修饰、比例关系的改变或大小的调整，在不影响本发明所能产生的功效及所能达成的目的下，均应仍落在本发明所揭示的技术内容得能涵盖的范围内。同时，本说明书中所引用的如“上”、“下”、“左”、“右”、“中间”及“一”等的用语，亦仅为便于叙述的明了，而非用以限定本发明可实施的范围，其相对关系的改变或调整，在无实质变更技术内容下，当亦视为本发明可实施的范畴。

实施例1：一种用于检测5-羟甲基糠醛的电化学生物传感器及其制备方法

如图1-图8所示，一种用于检测5-羟甲基糠醛的电化学生物传感器，包括由工作电极、参比电极和对电极组成的三电极体系，其所述工作电极为铜镍双金属纳米粒子修饰的铜电极。

优选的技术方案为：所述工作电极的制备方法包括将打磨抛光后的铜电极置于含有NiSO₄和 CuSO₄的H₂SO₄溶液中，然后利用循环伏安法进行连续扫描，从而将铜纳米粒子和镍纳米粒子同时电沉积到电极表面。首先将直径为3mm的铜电极用3000目砂纸打磨去氧化膜，再依次用粒径为1.0、0.3和0.05µm的Al₂O₃抛光至光亮，再分别用乙醇和超纯水超声清洗1min，氮气吹干。将洁净的铜电极浸入含有0.25M的NiSO₄和0.375M的CuSO₄的0.1M的H₂SO₄溶液中，利用循环伏安法进行连续扫描，扫描的电势范围为0.5至-0.6V，循环次数为20cycle，扫描速率为70 mV s^-1，从而将铜纳米粒子和镍纳米粒子同时电沉积到电极表面。即制得铜镍双金属纳米粒子修饰的铜电极作为工作电极。

优选的实施方式为：含有NiSO₄和 CuSO₄的H₂SO₄溶液的制备方法包括将0.25M的NiSO₄和0.375M的CuSO₄溶于5mL 0.1M H₂SO₄溶液中。

优选的实施方式为：循环伏安法进行连续扫描的工艺参数为：电势范围为0.5至-0.6V，循环次数为20 cycle，扫速为70 mV s^-1。

优选的实施方式为：所述参比电极为饱和Ag/AgCl电极，所述对电极为铂电极。

一种用于检测5-羟甲基糠醛的电化学传感器，电化学测量时将待测液（含未知浓度的5-HMF）加入5mL 0.1M的氢氧化钠缓冲液中，将其作为检测液；采用用于检测5-HMF的电化学传感器，将线性扫描伏安法或安培法作为检测方法；线性扫描伏安法的测量电势范围为0至0 .8V，扫描速率为100 mV s^-1；安培法测量恒定电势为0.45V。

实施例2：一种用于检测5-羟甲基糠醛的电化学传感器及其检测5-HMF的方法

传感器的制备方法以及检测方法：

电极预处理：首先将直径为3mm的铜电极用3000目砂纸打磨去氧化膜，再依次用粒径为1.0、0.3和0.05µm的Al₂O₃抛光至光亮，再分别用乙醇和超纯水超声清洗1min，氮气吹干。将饱和Ag/AgCl电极作为参比电极，铂电极作为对电极。

工作电极的制备：将预处理后的铜电极置于含有0.25M的NiSO₄和0.375M的CuSO₄的5mL 0.1M的H₂SO₄溶液中，利用循环伏安法（CV）进行连续扫描，扫描的电势范围为0.5至-0.6V，循环次数为20 cycle，扫速为70 mV s^-1，从而将铜纳米粒子和镍纳米粒子同时电沉积到电极表面。

实际样品中5-HMF的提取和富集：将4mL的蜂蜜或酒转移至100 mL容量瓶中，分别加入2.0 mL 2.0 mol L^-1 HClO₄，2.0 mL 0.25 mol L^-1铁氰化钾和乙酸锌（即Carrez-I andII 溶液），加水至100mL，在45℃下磁力搅拌15min，用1.5 mol L^-1NaOH溶液调节Ph至7，在3500rpm下离心10min取上清液，再用0.45μm的微孔滤膜过滤。将滤液与1.6 mL pH 4.0的0.1 mol L⁻¹ 邻苯二甲酸缓冲液, 0.4 mL 1.0 × 10⁻³ mol L⁻¹ 的SDS, 0.6 mL 5.0% (v/v)的Triton X-45, 8.0 mL of 0.01 mol L⁻¹ 的Na₂SO₄ 溶解在离心管中，使最终的浓度为50 mL。将溶液在 40℃，250 W, 40 Hz的超声条件下处理 5 min，4000rpm下离心10 min，并在冰箱中冷却10min，从而分离水相和富活性剂相。取富活性剂相，加入1mL乙腈溶剂来降低其黏度，从而得到样品提取液。最后将样品提取液溶解在0.1 M NaOH溶液中进行电化学检测。

利用LSV电化学检测5-HMF: 向500μL待测液(含未知浓度的5-HMF)中加入0.1M的氢氧化钠缓冲溶液至5mL。将生物传感器浸入5mL的缓冲液中，利用线性扫描伏安法（LSV）进行电化学检测，扫描的电势范围为0至0.8V，扫描速率为100 mV s^-1，观察产生的氧化峰电流I_p，带入线性方程I_p = 22.42022C_5-HMF -7.29425，再将求得的C_5-HMF×10即可得到待测液中5-HMF的含量。其中线性方程的浓度范围为：0.5 至 5mM。

利用安培法电化学检测5-HMF:将5mL 0.1M氢氧化钠缓冲溶液作为检测底液，将生物传感器浸入底液中，用注射器向连续搅拌的5mL 0.1M氢氧化钠底液中加入50μL 的待测液，利用安培法（i-t）在0.45V的恒定电位下进行电化学检测，观察产生的梯度电流I，带入线性方程I= 0.02945C_5-HMF +0.12503，即可得到待测液中5-HMF的量。其中线性方程的浓度范围为：0.8 至 608.4 μM。

实施例3：一种用于检测5-羟甲基糠醛的电化学传感器及其检测5-HMF的方法

一种用于检测5-羟甲基糠醛的电化学生物传感器，包括由工作电极、参比电极和对电极组成的三电极体系，所述工作电极为铜镍双金属纳米粒子修饰的铜电极。

所述工作电极的制备方法包括将打磨抛光后的铜电极置于含有NiSO₄和 CuSO₄的H₂SO₄溶液中，然后利用循环伏安法进行连续扫描，从而将铜纳米粒子和镍纳米粒子同时电沉积到电极表面。

含有NiSO₄和 CuSO₄的H₂SO₄溶液的制备方法包括将0.33g NiSO₄和0.47g的CuSO₄溶于5mL 0.1M H₂SO₄溶液中，使NiSO₄和CuSO₄的浓度分别为0.25M和0.375M。

循环伏安法进行连续扫描的工艺参数为：电势范围为0.5至-0.6V，循环次数为20cycle，扫描速率为70 mV s^-1。

所述参比电极为饱和Ag/AgCl电极，所述对电极为铂电极。

一种用于检测5-羟甲基糠醛的电化学生物传感器的检测方法，电化学测量时将含有5-羟甲基糠醛的0.1M氢氧化钠缓冲溶液作为检测底液；用于检测5-羟甲基糠醛的电化学生物传感器，然后采用线性扫描伏安法或安培法作为电化学检测方法；线性扫描伏安法的测量电势范围为0至0 .8V，扫描速率为100 mV s^-1；安培法测量恒定电势为0.45V。

所述电化学检测选用的是CHI660型电化学工作站。

将含有5-HMF的待测液加入5 mL 0.1M氢氧化钠中，利用线性扫描伏安法或安培法进行测定，得到峰值电流Ip或梯度电流I，带入相应的浓度与电流之间的线性方程，即可得到待测液中5-HMF的量。

以上所述者仅为用以解释本发明之较佳实施例，并非企图具以对本发明做任何形式上之限制，是以，凡有在相同之发明精神下所作有关本发明之任何修饰或变更，皆仍应包括在本发明意图保护之范畴。

Claims (3)

1.一种用于检测5-羟甲基糠醛的电化学生物传感器的检测方法，其特征在于：电化学测量时将含有5-羟甲基糠醛的0.1M氢氧化钠缓冲溶液作为检测底液；采用的电化学生物传感器包括由工作电极、参比电极和对电极组成的三电极体系，其特征在于：所述工作电极为铜镍双金属纳米粒子修饰的铜电极；

所述工作电极的制备方法包括将打磨抛光后的铜电极置于含有NiSO₄和 CuSO₄的H₂SO₄溶液中，然后利用循环伏安法进行连续扫描，从而将铜纳米粒子和镍纳米粒子同时电沉积到电极表面；

含有NiSO₄和 CuSO₄的H₂SO₄溶液的制备方法包括将NiSO₄和CuSO₄溶于H₂SO₄溶液中，使NiSO₄和CuSO₄的浓度分别为0.2-0.3M和0.35-0.4M；

循环伏安法进行连续扫描的工艺参数为：电势范围为0.5至-0.6V，循环次数为20cycle，扫描速率为70 mV s^-1；

所述参比电极为饱和Ag/AgCl电极，所述对电极为铂电极；

5-HMF的提取和富集：将4mL的蜂蜜或酒转移至100 mL容量瓶中，分别加入2.0 mL 2.0mol L^-1 HClO₄，2.0 mL 0.25 mol L^-1铁氰化钾和乙酸锌，加水至100mL，在45℃下磁力搅拌15min，用1.5 mol L^-1NaOH溶液调节Ph至7，在3500rpm下离心10min取上清液，再用0.45μm的微孔滤膜过滤；将滤液与1.6 mL pH 4.0的0.1 mol L⁻¹ 邻苯二甲酸缓冲液, 0.4 mL 1.0× 10⁻³ mol L⁻¹ 的SDS, 0.6 mL 5.0% (v/v)的Triton X-45, 8.0 mL of 0.01 mol L⁻¹的Na₂SO₄ 溶解在离心管中；将溶液在 40℃，250 W, 40 Hz的超声条件下处理 5 min，4000rpm下离心10 min，并在冰箱中冷却10min，从而分离水相和富活性剂相；取富活性剂相，加入1mL乙腈溶剂来降低其黏度，从而得到样品提取液；

然后采用线性扫描伏安法或安培法作为电化学检测方法；线性扫描伏安法的测量电势范围为0至0 .8V，扫描速率为100 mV s-1；安培法测量恒定电势为0.45V。

2.根据权利要求1所述的用于检测5-羟甲基糠醛的电化学生物传感器的检测方法，其特征在于：所述电化学检测选用的是CHI660型电化学工作站。

3.根据权利要求1所述的用于检测5-羟甲基糠醛的电化学生物传感器的检测方法，其特征在于：将含有5-HMF的待测液加入5 mL 0.1M氢氧化钠中，利用线性扫描伏安法或安培法进行测定，得到峰值电流Ip或梯度电流I，带入相应的浓度与电流之间的线性方程，即可得到待测液中5-HMF的量。

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