CN113207690A

CN113207690A - 一种以构树根系为外植体的高效一步再生方法

Info

Publication number: CN113207690A
Application number: CN202110572205.7A
Authority: CN
Inventors: 周玮; 邹金拓; 林佳娜; 陈晓阳; 张冰楠; 张俊杰; 阙青敏
Original assignee: South China Agricultural University
Current assignee: South China Agricultural University
Priority date: 2021-05-25
Filing date: 2021-05-25
Publication date: 2021-08-06
Anticipated expiration: 2041-05-25
Also published as: CN113207690B

Abstract

本发明公开了一种以构树根系为外植体的高效一步再生方法，其包括如下步骤：S1.不定芽诱导：选取构树无菌苗的根系为外植体，切出伤口，接种到不定芽诱导培养基上，诱导形成不定芽；S2.生根培养：将步骤S1中的不定芽分切并接种到生根培养基上进行诱导生根，将所述不定芽培养至生根形成再生苗。该方法以通过构树根系为外植体，通过不定芽诱导、不定芽生根、驯化移栽等步骤成功获得了构树离体再生植株，与以其它构树组织为外植体的培养方法相比，操作更简便、取材更广泛、扩繁更高效。

Description

一种以构树根系为外植体的高效一步再生方法

技术领域

本发明属于植物组织培养技术领域，具体涉及一种以构树根系为外植体的高效一步再生方法。

背景技术

构树(Broussonetia Papyrifera(L.)Vent.)别名毛桃、楮桃、纸桑、谷树等，为桑科(Moraceae)构属多年生落叶乔木。构树成年树高10～20m；树皮呈暗灰色；全株含乳汁；小枝密生柔毛；叶广卵形至长椭圆状卵形螺旋状排列，先端渐尖基部心形边缘具粗锯齿，小树之叶常有明显3～5裂，背面密被绒毛；叶柄长2.5～8cm密被糙毛；花雌雄异株；雄花序为柔荑花序，雌花序球形头状；肉质聚花果成熟时橙红色；花期在4～5月，果期在6～7月；根系较浅，侧根分布广，萌芽力和分蘖力强。构树为强阳性树种，具有速生、适应性强、分布广、易繁殖、热量高、轮伐期短的特点。其产于我国南北各地，在黄河、长江、珠江流域广有分布，可以野生或栽培。也广泛分布在东亚(日本、朝鲜等)、东南亚(锡金、缅甸、泰国、越南、马来西亚等)及太平洋岛屿等地区。

构树具有很高的综合利用价值，是一种初期投资少、受益时间长、生长周期短、收入见效快的特种经济林树种。构树树皮中纤维素含量高、纤维品质优良，色泽洁白、表面光滑、坚韧抗拉，适合纺纱和造纸。构树枝干可为作为木材原料用打造家具，也可作薪炭燃烧，其热值较高，是一种高效生物质燃料。构树枝叶生物量大、营养价值高、适口性好，是一种饲用价值很高的木本饲料资源。构树果实、枝干、树叶、树根和树皮均可供药用，在中医中记载有补肾健脾、清肝明目、强筋健骨、消肿利尿等功效。构树是一种典型的野生树种，适应性广、抗逆性强，具有耐干旱、耐湿热、耐贫瘠、耐盐碱等特点，可用于矿区、石漠化地区、荒漠化地区和盐碱地修复。构树枝叶繁茂表面粗糙，对尘埃吸附性好，抗污染能力强，耐烟尘污染，对二氧化硫、二氧化氮、氯气具有较强抗性，是城市园林、工矿绿化、尾矿修复的理想树种。

目前，构树主要的繁殖方式有播种育苗、扦插、根繁等。播种育苗是直接从母树采集种子，通过人工促萌繁殖出大量的幼苗，但构树种子在自然条件下发芽率低，且幼苗需留床培养较长时间才能出圃定植。而种子播种育苗，实生群体性状分离严重，栽培后生长不均，难以规范化管理，也无法进行机械化采收。构树半木质扦插成活较容易，但硬枝扦插成活率较低且对母株伤害较大。根繁是将构树母根埋于育苗基质，进而促进根系不定芽萌发成嫩梢，然后对合适高度的嫩梢切割后进行扦插得到完整植株。但是根繁也存在诱导率不稳定、增殖系数不高等问题。构建高效的构树再生体系可提高扩繁效率，能在短期内获得大量优良的无性系，能为实现构树无性快繁扩大种源生产提供有效途径，也能为构树遗传转化进行分子育种方面研究及多倍体育种实现种质资源的改良打下坚实的基础。

目前针对构树再生体系选用的外植体的研究主要集中在杂交构树的茎段、幼茎、叶片等部位。在现有报道中，万文等人以优良母株的具腋芽茎段为外植体，对杂交构树茎段进行了离体培养和繁殖^[1]；陶文丞等人以构树优良母株的幼茎为外植体，直接诱导萌发出芽进而增殖获得大量的丛生芽^[2]；张伟等人利用杂交构树茎段进行了离体培养和繁殖^[3]；刘芸等以杂交构树叶片为外植体，建立了杂交构树叶片再生体系^[4]；魏会琴以杂交构树叶片和茎尖为外植体，初步建立了杂交构树的再生体系^[5]；黄悦等以无菌苗叶片为外植体进行组织培养，优化杂交构树叶片组培快速繁殖技术^[6]。但是，以构树的茎段、幼茎、叶片等部位作为外植体进行组织培养，存在育苗可重复性差、扩繁效率不高等问题。与茎段、幼茎和叶片等部位相比，植物根是由体细胞构成的组织，通过根系诱导不定芽再生的植株遗传稳定，可重复性好。以构树根系为外植体构建再生体系的研究目前仅有一例报道(专利公开号为CN 108812260 B)，该专利公开了一种构树根系组培快速育苗方法，但是其是常规环境下的开放式育苗，处理炼苗移栽全程用的都是根段而不是再生苗，更像是根萌芽繁殖，而不是一般意义上所说的组培概念，而根萌芽繁殖存在诱导率不稳定、增殖系数不高等问题。为了解决目前构树使用播种育苗、扦插、根繁等繁殖方式存在的问题，以及解决使用以杂交构树的茎段、幼茎、叶片等部位作为外植体进行组织培养的繁殖技术存在的问题，本发明提供了一种以构树根系为外植体的高效一步再生方法。

以下给出相关的参考文献：

[1]万文,刘忠华,魏会琴.杂交构树茎段组培快繁体系的建立[J],福建林业科技，2010,37(1): 72-76,109.

[2]陶文丞,韦景枫,程友忠,等.构树组培快繁技术[J]，黑龙江生态工程职业学院学报， 2010,23(5):27-28

[3]张伟.杂交构树组培快繁技术概况[J]，农业科技通讯,2016(6):295-296.

[4]刘芸,郭龙妹,任淼辉,等.杂交构树组培快繁体系的建立[J],山西农业科学,2016,44(8):1073-1076.

[5]魏会琴,刘忠华,马岚,等.杂交构树叶片愈伤诱导及植株再生[J],北京林业大学学报,2010,32(5):116-120.

[6]黄悦,张洪卫,陶小买,等.杂交构树叶片组培快速繁殖体系的建立[J],贵州农业科学,2018,46(2):46-48.

发明内容

为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的目的在于提供一种以构树根系为外植体的高效一步再生方法。该方法以通过构树根系为外植体，通过不定芽诱导、不定芽生根、炼苗驯化移栽等步骤成功获得了构树离体再生植株，与以往其它构树组织为外植体的培养方法相比，操作更简便、取材更广泛、扩繁更高效。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种以构树根系为外植体的一步再生方法，包括如下步骤：

S1.不定芽诱导:选取构树无菌苗的根系为外植体，切出伤口，接种到不定芽诱导培养基上，诱导形成不定芽；

S2.生根培养：将步骤S1中的不定芽分切并接种到生根培养基上进行诱导生根，将所述不定芽培养至生根形成再生苗。

步骤S1所述的不定芽诱导培养基含有：1/2MS+(0.5～1.5mg/L)6-BA+ (0.05～0.25mg/L)NNA+(0.01～0.1mg/L)IBA+(20～30g/L)蔗糖+(4.0～ 6.0g/L)琼脂，其PH值为5.8～6.2。

优选地，步骤S2中所述的生根培养基含有：1/2MS+(0.1～0.5mg/L)NNA+ (15～30g/L)蔗糖+(4.0～6.0g/L)琼脂，pH为5.8～6.2。

优选地，步骤S1中所述诱导形成不定芽的条件为：温度为25～28℃、光照强度为1500～2500lx，光照时间为每天12～15小时。

优选地，步骤S2中将所述不定芽培养至生根的步骤和条件为：先在全暗环境下培养3～5d，然后每天置于光照下，其中光照时间为每天12～15小时，光照强度为1500～2500lx，整个生根培养过程的培养温度为25～28℃。

优选地，步骤S1中所述接种的方式为横放方式，所述切出的伤口数为2～3 个。

优选地，步骤S2中所述不定芽的长度为2～4cm。

本发明还包括以下步骤：

S3.将步骤S2中长至6～8cm的再生苗置于自然光照下进行炼苗后，洗掉其根部上的培养基，移栽到湿润的灭过菌的基质中，并在再生苗所在的培养盆上覆盖保鲜膜，进行驯化后，将再生苗移栽到大田中继续培养。

所述炼苗时间为5～7d，驯化时间为2～3个星期。

本发明所述的1/2MS是指MS标准培养基浓度一半培养基；6-BA是指6- 苄氨基腺嘌呤；NAA是指奈乙酸；IBA是指吲哚丁酸。

本发明利用植物组织培养技术进行构树种苗规模化生产，建立了以构树根系为外植体的组织培养快繁方法，具有简单、易行、高效、经济的特点。通过本发明育成的构树组培苗移栽成活率达90％以上，可以为构树规模化种植提供优质种苗保障。

本发明与现有技术相比，其有益效果体现在：

(1)本发明通过研究培养基类型、外源激素的种类和浓度、外植体发育阶段等因素对外植体再生效率的影响，构建了一套全新的高效的不定芽直接发生体系。与其它构树组织培养方法相比，本发明的方法操作更简便、取材更广泛、扩繁更高效，从外植体到形成完整植株总过程仅需45d左右，移栽成活率可达90％以上。

(2)本发明体系打破常规，通过最优激素配比可直接诱导外植体形成不定芽，无需经过通常的外植体诱导愈伤组织-愈伤组织诱导不定芽技术流程，并且在不定芽诱导增殖过程中无需更换培养基，简便了操作流程，大大缩短了再生时间，30d左右不定芽即可形成并长至2-4cm。该再生体系不定芽诱导率达80％以上，增殖系数在4以上，大幅提高了构树再生体系的增殖系数。

(3)本发明以根系作为外植体具有取材方便、操作容易、来源广泛，有利于再生及遗传转化的重复进行等巨大的优势。因此，本发明以构树根系为外植体，通过不定芽诱导、不定芽生根、炼苗移栽等过程成功获得了构树离体再生植株，建立构树高效再生体系，对于进行构树优良品种的快速繁殖和大面积推广、促进构树的产业化发展具有重要意义，并且为构树遗传转化体系的构建奠定了基础，从而为在构树中进行基因功能等分子生物学研究提供平台。

附图说明

图1为本发明的以构树根系为外植体的高效一步再生过程；其中图A为构树无菌苗的根系，用作本发明中的外植体材料；图B是在1/2MS+0.5～1.5 mg/L 6-BA+0.05～0.25mg/L NAA+0.01～0.1mg/L IBA+20～30g/L蔗糖+ 4.0～6.0g/L琼脂，pH为5.8～6.2的不定芽诱导培养基上长出不定芽的愈伤组织；图C是在1/2MS+0.1～0.5mg/L NAA+15～30g/L蔗糖+4.0～6.0g/L琼脂，pH为5.8～6.2的生根培养基上的不定芽诱导生根情况；图D为即将出瓶炼苗的再生植株；图E为移栽至灭菌基质中的再生植株；图F为移栽到大田的构树再生植株。

具体实施方式

为了使本技术领域人员更好理解本发明的方案，下面结合附图和实施方式对本发明作进一步的描述。除非特别说明，实施例中采用的方法和原料为本领域常规使用的方法和原料。

实施例1

(1)诱导不定芽：选取构树无菌苗的根系为外植体，切2～3刀增加伤口；以横放的方式接种到不定芽诱导培养基上，在温度为25℃、光照强度为2500lx，光照时间为每天12h的条件下培养，直至诱导形成不定芽。所述的不定芽诱导培养基为：1/2MS+1.0mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA+0.05mg/L IBA+30g/L 蔗糖+6.0g/L琼脂，pH为5.8。

(2)生根培养：将步骤(1)中长至2cm的不定芽分切并接种到生根培养基上进行诱导生根，接种后先在25℃条件下全暗培养3d，然后置于每天光照12h，光照强度为1500lx，培养温度为25℃的条件下培养至生根。所述的生根培养基为：1/2MS+0.1mg/L NAA+20g/L蔗糖+4.0g/L琼脂，pH为5.8。

(3)炼苗移栽：将长至6cm、生根良好的再生苗的培养瓶瓶盖拧松，置于自然光下炼苗5d后，将再生苗从培养瓶中小心移出，用清水小心洗掉根部上的培养基；然后将再生苗移栽到湿润的灭过菌的基质中，在其所在的培养盆上覆盖保鲜膜以保持较高的湿度；驯化2周后，将再生苗移栽到大田中继续培养，待再生苗重新生长出新的顶芽标志组培苗移栽成活。

实施例2

(1)诱导不定芽：选取构树无菌苗的根系为外植体，切2～3刀增加伤口；以横放的方式接种到不定芽诱导培养基上，在温度为25℃、光照强度为2500lx，光照时间为每天15h的条件下培养，直至诱导形成不定芽。所述的不定芽诱导培养基为：1/2MS+1.5mg/L 6-BA+0.05mg/L NAA+0.01mg/L IBA+20g/L 蔗糖+6.0g/L琼脂，pH为6.0。

(2)生根培养：将步骤(1)中长至4cm的不定芽分切并接种到生根培养基上进行诱导生根，接种后先在25℃条件下全暗培养3d，然后置于每天光照15h，光照强度为2500lx，培养温度为28℃的条件下培养至生根；生根率达85％。所述的生根培养基为：1/2MS+0.1mg/LNAA+15g/L蔗糖+4.0g/L 琼脂，pH为6.2。

(3)炼苗移栽：将长至8cm、生根良好的再生苗的培养瓶瓶盖拧松，置于自然光下炼苗7d后，将再生苗从培养瓶中小心移出，用清水小心洗掉其根部上的培养基；然后将再生苗移栽到湿润的灭过菌的基质中，在其所在的培养盆上覆盖保鲜膜以保持较高湿度；驯化2周后，将再生苗移栽到大田中继续培养，待再生苗重新生长出新的顶芽标志组培苗移栽成活。

实施例3

(1)诱导不定芽：选取构树无菌苗的根系为外植体，切2～3刀增加伤口；以横放的方式接种到不定芽诱导培养基上，在温度为28℃、光照强度为1500lx，光照时间为15h条件下培养，直至诱导形成不定芽。所述的不定芽诱导培养基为：1/2MS+1.5mg/L 6-BA+0.2mg/LNAA+0.1mg/L IBA+25g/L蔗糖+ 6.0g/L琼脂，pH为6.2。

(2)生根培养：将步骤(1)中长至3cm的不定芽分切并接种到生根培养基上进行诱导生根，接种后先在28℃条件下全暗培养5d，然后每天置于光照12h，在光照强度为2500lx，培养温度为25℃的条件下培养至生根。所述的生根培养基为：1/2MS+0.4mg/L NAA+30g/L蔗糖+6.0g/L琼脂，pH为 5.8。

(3)炼苗移栽：将长至7cm、生根良好的再生苗的培养瓶瓶盖拧松，置于自然光下炼苗7d后，将再生苗从培养瓶中小心移出，用清水小心洗掉根部上的培养基；然后将再生苗移栽到湿润的灭过菌的基质中，在其所在的培养盆上覆盖保鲜膜以保持较高湿度；驯化2周后，将再生苗移栽到大田中继续培养，待再生苗重新生长出新的顶芽标志组培苗移栽成活。

实施例4

(1)诱导不定芽：选取构树无菌苗的根系为外植体，切2～3刀增加伤口；以横放的方式接种到不定芽诱导培养基上，在温度为28℃、光照强度为2500lx，光照时间为12h条件下培养，直至诱导形成不定芽。所述的不定芽诱导培养基为：1/2MS+0.5mg/L 6-BA+0.25mg/L NAA+0.1mg/L IBA+25g/L蔗糖+ 4.0g/L琼脂，pH为6.0。

(2)生根培养：将步骤(1)中长至4cm的不定芽分切并接种到生根培养基上进行诱导生根，接种后先在28℃条件下全暗培养3d，然后每天置于光照 12h，在光照强度为2500lx，培养温度为25℃的条件下培养至生根。所述的生根培养基为：1/2MS+0.5mg/L NAA+30g/L蔗糖+6.0g/L琼脂，pH为5.0。

实施例1-实施例4中的构树根从外植体到形成完整植株总过程为45d左右。

对比例1

跟实施例1的不同在于：将1/2MS培养基改为B5培养基。

对比例2

跟实施例1的不同在于：将1/2MS培养基改为MS培养基。

对比例3

跟实施例1的不同在于：所述的不定芽诱导培养基为：1/2MS+0.1mg/L NAA+0.05mg/L IBA+30g/L蔗糖+6.0g/L琼脂。

对比例4

跟实施例1的不同在于：所述的不定芽诱导培养基为：1/2MS+1.0mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA+30g/L蔗糖+6.0g/L琼脂。

对比例5

跟实施例1的不同在于：所述的不定芽诱导培养基为：1/2MS+1.0mg/L 6-BA+0.05mg/L IBA+30g/L蔗糖+6.0g/L琼脂。

对比例6

跟实施例1的不同在于：所述的不定芽诱导培养基为：1/2MS+3.0mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA+0.05mg/L IBA+30g/L蔗糖+6.0g/L琼脂，pH为5.8。

对比例7

跟实施例1的不同在于：所述的不定芽诱导培养基为：1/2MS+1.0mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA+0.05mg/L IBA+30g/L蔗糖+6.0g/L琼脂，pH为5.8。

对比例8

跟实施例1的不同在于：所述的不定芽诱导培养基为：1/2MS+1.0mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA+0.2mg/L IBA+30g/L蔗糖+6.0g/L琼脂，pH为5.8。

由实施例1-实施例4及对比例1-对比例8得到的构树根系外植体再生体系的再生效果如表1所示。

表1

由表1可以看到，本发明的实施例1-实施例4中得到的构树根系外植体不定芽诱导率达80％以上，增值系数在4以上，最终的移栽成活率高达90％以上。与实施例1相比，对比例1和对比例2分别选择了B5和MS作为不定芽诱导培养基，得到的构树根系外植体的不定芽诱导率和增值系数较低，不定芽诱导效果较差；对比例3中的不定芽诱导培养基未添加6-BA，得到的构树根系外植体基本无愈伤组织形成，没有产生新的不定根，基本没有诱导出不定芽；对比例4中的不定芽诱导培养基未添加IBA，得到的构树根系外植体膨大，虽然有大量愈伤组织形成，产生了新的不定根，但是基本没有诱导出不定芽；对比例5中不定芽诱导培养基未添加NAA，得到的构树根系外植体膨大，虽然有大量愈伤组织形成，但是无新的不定根生成，只诱导出少量不定芽；对比例6 中的不定芽诱导培养基添加的6-BA浓度过高，得到的构树根系的不定芽诱导率和增值系数都较低，不定芽诱导效果较差；对比例7中的不定芽诱导培养基添加的NAA浓度过高，得到的构树根系的不定芽诱导率和增值系数都较低，不定芽诱导效果较差；对比例8中的不定芽诱导培养基添加的IBA浓度过高，得到的构树根系的不定芽诱导率和增值系数都较低，不定芽诱导效果较差。

实施例1-实施例4采用了组成为1/2MS+0.5～1.5mg/L 6-BA+0.05～0.25 mg/LNAA+0.01～0.1mg/L IBA+20～30g/L蔗糖+4.0～6.0g/L琼脂的不定芽诱导培养基，该不定芽诱导培养基能诱导构树根系外植体发育成带有不定根和大量不定芽的愈伤组织，这种愈伤组织自带不定根，可直接从培养基中吸收营养物质，其上的不定芽芽体性状佳，在切接后仍能萌出大量不定芽。

本发明建立了以构树根系为外植体的组织培养快繁方法，具有简单、易行、经济的特点，为构树规模化种植提供了优质种苗保障。

上述实施例为本发明较佳的实现方案，除此之外，本发明还可以其它方式实现，在不脱离本发明构思的前提下任何显而易见的替换均在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种以构树根系为外植体的高效一步再生方法，其特征在于，包括如下步骤：

S2.生根培养：将步骤S1中形成的不定芽分切并接种到生根培养基上进行诱导生根，将所述不定芽培养至生根形成再生苗；

步骤S1所述的不定芽诱导培养基含有：1/2MS+(0.5～1.5mg/L)6-BA+(0.05～0.25mg/L)NNA+(0.01～0.1mg/L)IBA+(20～30g/L)蔗糖+(4.0～6.0g/L)琼脂，其PH值为5.8～6.2。

2.根据权利要求1所述的一步再生方法，其特征在于，步骤S2中所述的生根培养基含有：1/2MS+(0.1～0.5mg/L)NNA+(15～30g/L)蔗糖+(4.0～6.0g/L)琼脂，pH为5.8～6.2。

3.根据权利要求1所述的一步再生方法，其特征在于，步骤S1中所述诱导形成不定芽的条件为：温度为25～28℃，光照强度为1500～2500lx，光照时间为每天12～15h。

4.根据权利要求2所述的一步再生方法，其特征在于，步骤S2中将所述不定芽培养至生根的步骤和条件为：先在全暗环境下培养3～5d，然后每天置于光照下12～15h，光照强度为1500～2500lx，整个生根培养过程的培养温度为25～28℃。

5.根据权利要求1所述的一步再生方法，其特征在于，步骤S1中所述的接种的方式为横放方式，所述切出的伤口数为2～3个。

6.根据权利要求2所述的一步再生方法，其特征在于，步骤S2中所述不定芽的长度为2～4cm。

7.根据权利要求1～6任一项所述的一步再生方法，其特征在于，还包括以下步骤：

S3.炼苗移栽：将步骤S2中长至6～8cm的再生苗置于自然光照下进行炼苗后，洗掉其根部上的培养基，移栽到湿润的灭过菌的基质中，并在再生苗所在的培养盆上覆盖保鲜膜，进行驯化后，将再生苗移栽到大田中继续培养。

8.根据权利要求7所述的一步再生方法，其特征在于，所述炼苗时间为5～7d，驯化时间为2～3个星期。