CN113201548A - 水稻OsTFIIAγ1基因启动子中的EBE位点及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及水稻OsTFIIAγ1基因启动子中的EBE位点及应用。本发明的白叶枯病感病基因OsTFIIAγ1启动子中EBE位点被编辑从而赋予水稻对白叶枯病的广谱抗性，与含有TALE蛋白编码基因的白叶枯病菌直接关联。白叶枯病感病基因OsTFIIAγ1启动子中EBE位点被编辑，在纯合状态下才能实现水稻由感病性转变为抗病性。基因编辑水稻白叶枯病感病基因OsTFIIAγ1启动子中的EBE位点，也缩短了水稻育种周期。同时基因编辑白叶枯病感病基因OsTFIIAγ1启动子中的EBE位点的水稻植株，没有明显的农艺性状变化，即EBE位点的编辑，不会造成明显的水稻农艺性状改变。

Description

水稻OsTFIIAγ1基因启动子中的EBE位点及应用
技术领域
本发明属于水稻基因组编辑育种领域，尤其是涉及水稻OsTFIIAγ1基因启动子中的EBE位点及应用。
背景技术
水稻白叶枯病由稻黄单胞菌稻致病变种(Xanthomonas oryzae pv.oryzae，Xoo)引起，可导致减产20％-50％，严重时绝产。培育和种植抗性品种是防治白叶枯病的最经济有效的措施。目前，国内外已报道了46个抗白叶枯基因，但因白叶枯病菌毒性变异而抗性易丧失，生产上急需广谱持久的抗白叶枯病新种质。
Xoo主效毒性因子是一类转录因子类似效应蛋白(Transcription activator-like effector，简称TALE)，被分泌进入水稻细胞后通过结合特定感病基因(Susceptiblegene,简称S基因)启动子区的EBE(Effector binding element)序列而激活S基因表达。这类S基因编码产物是一类SWEET家族蛋白，向水稻细胞外转运糖类物质为细菌提供营养从而利于病害发生和发展；另一类S基因编码水稻转录因子TFIIA转录复合体的小亚基TFIIAγ。水稻基因组中有两个编码OsTFIIAγ蛋白的基因OsTFIIAγ5和OsTFIIAγ1。其中，OsTFIIAγ5也被称为Xa5，对应的隐性基因为xa5，因xa5基因编码产物第39位氨基酸突变(V39E)，导致了大多数TALE蛋白不能与之互作，从而水稻抗白叶枯病。但研究发现，仍有白叶枯病菌可以克服xa5抗性，原因是这些白叶枯病菌携带有致病因子PthXo7，可以结合在OsTFIIAγ1基因启动子中的EBE序列上，诱导OsTFIIAγ1基因表达，而OsTFIIAγ1蛋白，可以弥补xa5的缺陷，保证其它TALE蛋白与水稻转录因子TFIIA形成复合体。因此，在含xa5的水稻品种中，通过阻断TALE蛋白与OsTFIIAγ1间的对应关系，可望能培育广谱持久的抗白叶枯病新种质。
CRISPR/Cas9(成簇、规律间隔短回文重复序列及相关蛋白)系统是来自原核生物的获得性免疫系统。近年来被发展为对基因组定点编辑的新技术，在多种领域都有广泛的研究和应用。CRISPR/Cas9系统通过引导RNA(sgRNA)锚定基因组特定序列，Cas9蛋白对被靶向的特征序列进行切割产生双链断裂，细胞启动DNA损伤修复机制，借助非同源末端连接方式引入突变。
目前，还没有发现该技术对水稻OsTFIIAγ1启动子进行编辑的报道。
发明内容
为了克服现有水稻抗性资源的不足，本发明提供水稻OsTFIIAγ1基因启动子中的EBE位点及应用。本发明还提供运用CRISPR/Cas9基因编辑技术修饰水稻OsTFIIAγ1基因启动子中能够被白叶枯病菌致病蛋白TALE结合的EBE位点，培育广谱抗白叶枯病水稻的方法。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
本发明首先提供水稻白叶枯病感病基因OsTFIIAγ1启动子中能够被白叶枯病菌致病蛋白TALE结合的EBE位点，所述EBE位点的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
本发明还提供水稻OsTFIIAγ1基因启动子中EBE位点的应用，在水稻中编辑水稻OsTFIIAγ1基因的EBE位点，用于培育水稻广谱抗白叶枯病。
在本发明的一个实施方式中，本发明还提供水稻OsTFIIAγ1基因启动子中EBE位点的应用，所述水稻OsTFIIAγ1基因启动子中EBE位点能够被白叶枯病菌致病蛋白TALE结合，所述EBE位点的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
在本发明的一个实施方式中，本发明还提供水稻OsTFIIAγ1基因启动子中EBE位点的应用，在CRISPR/Cas9基因编辑系统中，引入靶向感病基因OsTFIIAγ1启动子EBE位点的引导RNA序列，所述引导RNA序列核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，构建的CRISPR/Cas9系统通过农杆菌介导的方法转入含有隐性抗病基因xa5水稻中，获得白叶枯病感病基因OsTFIIAγ1的EBE位点被编辑的水稻植株。
在本发明的一个实施方式中，本发明提供的水稻OsTFIIAγ1基因启动子中EBE位点的应用中，利用引物对γ1gRNA-F和γ1gRNA-R，合成双链的DNA gRNA，构建在CRISPR/Cas9系统中，通过农杆菌介导的方法转入感病水稻中，获得含感病基因EBE位点被编辑的再生水稻植株，提高对水稻白叶枯病的抗性。
在本发明的一个实施方式中，白叶枯病感病基因OsTFIIAγ1的EBE位点被编辑的水稻植株，抗所有白叶枯病菌菌株。即，剪叶接种白叶枯病病菌，无论含有的TALE蛋白类型如何，基因编辑的水稻，抗白叶枯病。
本发明还提供靶向水稻OsTFIIAγ1基因启动子中EBE位点的引导RNA序列，所述引导RNA序列核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
本发明利用基因工程方法获得靶向感病基因OsTFIIAγ1启动子EBE位点的引导RNA序列的核苷酸序列，对培育抗白叶枯病水稻具有重要作用。
本发明还提供制备所述靶向水稻OsTFIIAγ1基因启动子中EBE位点的引导RNA序列的方法，利用引物对γ1gRNA-F和γ1gRNA-R，合成双链的DNA gRNA；
引物对γ1gRNA-F和γ1gRNA-R序列分别如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示。
本发明的一些实施方式中，在CRISPR/Cas9基因编辑系统中，引入靶向感病基因OsTFIIAγ1启动子EBE位点的引导RNA序列。
本发明的一些实施方式中，利用引物对γ1gRNA-F和γ1gRNA-R，合成双链的DNAgRNA，构建在CRISPR/Cas9系统中。
本发明的一些实施方式中，构建的CRISPR/Cas9系统，通过农杆菌侵染水稻愈伤组织，获得水稻再生植株，感病基因OsTFIIAγ1启动子中EBE位点发生变化的，可视为基因编辑水稻。EBE位点发生变化即表示SEQ ID No.1所示的DNA序列发生了变化。
本发明还提供运用CRISPR/Cas9基因编辑技术修饰水稻OsTFIIAγ1基因启动子中能够被白叶枯病菌致病蛋白TALE结合的EBE位点，培育广谱抗白叶枯病水稻的方法：在CRISPR/Cas9基因编辑系统中，引入靶向感病基因OsTFIIAγ1启动子EBE位点的引导RNA序列，所述引导RNA序列核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，构建的CRISPR/Cas9系统通过农杆菌介导的方法转入含有隐性抗病基因xa5水稻中，获得白叶枯病感病基因OsTFIIAγ1的EBE位点被编辑的水稻植株。
在本发明的一个实施方式中，含有隐性抗病基因xa5水稻品种是指既含有xa5基因，同时还有含有感病基因OsTFIIAγ1启动子中的EBE位点的水稻，例如水稻IRBB5等。
在本发明的一个具体实施方式中，通过在含有xa5基因的水稻品种IRBB5中基因编辑OsTFIIAγ1启动子中的EBE位点，来提高水稻抗白叶枯病的能力。
为了进一步确认白叶枯病感病基因OsTFIIAγ1启动子中EBE位点被编辑后的抗病功能，本申请在感白叶枯病水稻IRBB5中，通过农杆菌介导的转基因方法，获得了白叶枯病感病基因OsTFIIAγ1启动子中EBE位点被编辑的水稻植株，对其剪叶接种白叶枯病菌，进行抗性鉴定。抗性鉴定结果显示，无论白叶枯病菌含有何种TALE蛋白类型，白叶枯病感病基因OsTFIIAγ1启动子中EBE位点被编辑的水稻植株，抗所有白叶枯病菌小种的侵染，说明白叶枯病感病基因OsTFIIAγ1启动子中EBE位点与水稻白叶枯病抗性呈正相关。同时发现，白叶枯病感病基因OsTFIIAγ1启动子中EBE位点被编辑的水稻，并没有出现明显的农艺性状变化。
在本申请以前，中国专利CN108374021A公开了一种修饰水稻OsTFIIAγ1基因培育广谱抗白叶枯病水稻的方法。不同于之前的方案，本申请修饰水稻OsTFIIAγ1启动子，与编辑OsTFIIAγ1基因相比，其优点主要体现在，阻断了来源于病原菌的TALE蛋白对靶标基因OsTFIIAγ1的转录激活的同时，保证了OsTFIIAγ1作为水稻基础转录因子的生物功能。在本申请以前还没有发现该技术对水稻OsTFIIAγ1启动子进行编辑的报道。本发明可在不改变水稻农艺性状的基础上增强其对白叶枯病的抗性。
与现有技术相比，本发明具有以下优点及有益效果：
本发明的白叶枯病感病基因OsTFIIAγ1启动子中EBE位点被编辑从而赋予水稻对白叶枯病的广谱抗性，与含有TALE蛋白编码基因的白叶枯病菌直接关联。白叶枯病感病基因OsTFIIAγ1启动子中EBE位点被编辑，在纯合状态下才能实现水稻由感病性转变为抗病性。基因编辑水稻白叶枯病感病基因OsTFIIAγ1启动子中的EBE位点，也缩短了水稻育种周期。同时基因编辑白叶枯病感病基因OsTFIIAγ1启动子中的EBE位点的水稻植株，没有明显的农艺性状变化，即EBE位点的编辑，不会造成明显的水稻农艺性状改变。
附图说明
图1包括图1A、图1B、图1C；
图1A为OsTFIIAγ1基因结构、EBE位点序列和引导RNA靶标序列。
图1B为OsTFIIAγ1基因启动子EBE位点编辑后的水稻接种白叶枯病菌后的抗病性测定。突变体水稻TF1P-1和TF1P-6接种PXO99A、PXO86、GX4及GX4(pthXo7)后病斑统计结果，同时以含有xa5基因的水稻IRBB5为对照。
图1C为水稻白叶枯病病斑长度统计结果，不同字母表示在P<0.05时，病斑长度有显著差异。
图2为PCR筛选含有Cas9基因的转基因植株。
图3为纯合突变体水稻植株的OsTFIIAγ1基因靶序列突变，-表示缺失；IRBB5为受体水稻，TF1P-1和TF1P-6为OsTFIIAγ1基因启动子EBE被修饰后的纯合体水稻。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。
这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
下列实施例中如无特殊说明的实验方法，均为常规方法。
实施例1、利用CRISPR/Cas9系统在水稻OsTFIIAγ1基因启动子EBE位点进行定点突变
(1)sgRNA靶点的选择
登陆NCBI网站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)，查询水稻OsTFIIAγ1基因(OsI_05377)的序列。根据OsTFIIAγ1基因启动子序列可知，其含有TALE蛋白结合的EBE位点，可被PthXo7结合(图1)。EBE序列为SEQ ID NO.1，即5’-TATAATCCCCAAATCCCCTCCTC-3’。为满足CRISPR/Cas9的sgRNA的靶点要求，在OsTFIIAγ1基因启动子EBE下游有NGG的靶点，选择的sgRNA的序列为SEQ ID NO.2,即5’-GTTTAGGGGAGGAGGGAAGG-3’(图1)。
(2)sgRNA片段的克隆
根据选定的sgRNA靶点序列，合成引物：γ1gRNA-F(见SEQ ID NO.3)和γ1gRNA-R(见SEQ ID NO.4)。将引物γ1gRNA-F和γ1gRNA-R通过退火方法合成双链DNA gRNA-γ1，合成的双链含有与BtgZI处理过的DNA相同的粘性末端。将pENTR:gRNA4质粒经BtgZI酶切后与DNA gRNA-γ1连接，以达到双链靶序列插入到pENTR:gRNA4载体U6p1启动子下游的目的。通过gateway方法将pENTR:gRNA4载体上U6p1启动子及sgRNA克隆到pBY02-OsCas9-ccdB载体上，获得重组载体Cas9-gRNA4-γ1。
所述载体pENTR:gRNA4和pBY02-OsCas9-ccdB来源于农业科学院植物保护研究所周焕斌实验室，已在文献《Huanbin Zhou,Bo Liu,Donald P.Weeks,Martin H.Spaldingand Bing Yang.2014,Large chromosomal deletions and heritable small geneticchanges induced by CRISPR/Cas9 in rice.Nucleic Acids Research,42(17):10934-10914》中公开。
(3)重组根癌农杆菌的获得
将(2)中的重组载体Cas9-gRNA4-γ1通过冻融法转化进入农杆菌EHA105菌株中，获得含有重组表达载体Cas9-gRNA4-TF的重组农杆菌，命名为EHA105-Cas9-gRNA4-γ1。
(4)农杆菌介导的水稻转化
用重组根癌农杆菌EHA105-Cas9-gRNA4-γ1F侵染水稻品种IRBB5成熟胚诱导的愈伤组织，在含潮霉素的培养基上成功再生及生根的植株为转基因阳性植株，将其命名为TF1P。
(5)转基因水稻及突变位点检测
提取再生植株叶片基因组DNA，分别以Cas9检测引物Cas9-F和Cas9-R，通过PCR扩增Cas9部分序列。再以Cas9阳性植株基因组为模板，扩增包括靶位点在内的DNA序列，送PCR产物测序，通过测序序列及其峰图判断靶位点是否发生突变。
扩增结果见图2，第一、二泳道表示转基因植株中第1号和第6号，分别将其命名为TF1P-1和TF1P-6；第三泳道表示受体水稻IRBB5；第四泳道表示DNA分子Marker(条带大小由上向下依次为1000bp、750bp、500bp)。将上述含OsTFIIAγ1基因启动子区EBE位点的PCR产物进行桑格测序，结果见图3。结果显示，两个转基因植株的OsTFIIAγ1基因启动子的EBE序列，均在PAM位点(即AGG序列)附近出现了缺失突变，且两条染色体同时发生了缺失突变。TF1P-1植株两条染色体上的OsTFIIAγ1基因启动子的EBE，缺失了3个碱基；TF1P-6植株OsTFIIAγ1基因启动子的EBE缺失了2个碱基。
实施例2、TF1P水稻对含PthXo7致病因子的白叶枯病菌的抗性检测及其应用
选取四株代表性Xoo菌株用于接种TF1P水稻，具体包括PXO99A、PXO86、GX4及GX4(pthXo7)。其中，PXO99A为菲律宾菌株，含有激活OsTFIIAγ1基因的PthXo7毒性因子；PXO86为菲律宾菌株，不含PthXo7；GX4为中国菌株，不含PthXo7；GX4(pthXo7)为导入pthXo7基因的GX4菌株。
采用剪叶接种方法，对TF1P-1、TF1P-6和IRBB5水稻接种菌液浓度为OD600值等于0.6的4个Xoo菌株。具体方法为：菌液润湿灭菌的剪刀后剪去叶尖约2cm。每株水稻接种3-5片叶，十天后调查病斑长度，最后取多个叶片的平均值，做t-test差异分析(P<0.05)。结果如图1所示，与IRBB5相比，TF1P-1和TF1P-6显著增加了对PXO99A和GX4(pthXo7)菌株的抗性，表明TF1P水稻的抗性比IRBB5水稻更高、更广谱。
由此，利用本发明提供的含sgRNA序列SEQ ID NO.2的CRISPR/Cas9系统可转入xa5遗传背景的水稻中，通过基因编辑OsTFIIAγ1基因启动子中EBE位点，可以增加水稻的抗性及抗谱。
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 上海交通大学
<120> 水稻OsTFIIAγ1基因启动子中的EBE位点及应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 水稻(Oryza sativa Indica)
<400> 1
tataatcccc aaatcccctc ctc 23
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ggaagggagg aggggatttg 20
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tgttggaagg gaggagggga tttg 24
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
aaaccaaatc ccctcctccc ttcc 24

Claims (10)

1.一种水稻OsTFIIAγ1基因启动子中的EBE位点，其特征在于，水稻OsTFIIAγ1基因启动子中EBE位点能够被白叶枯病菌致病蛋白TALE结合，所述EBE位点的核苷酸序列如SEQ IDNo.1所示。
2.水稻OsTFIIAγ1基因启动子中EBE位点的应用，其特征在于，在水稻中编辑水稻OsTFIIAγ1基因的EBE位点，用于培育水稻广谱抗白叶枯病，所述EBE位点的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
3.根据权利要求2所述水稻OsTFIIAγ1基因启动子中EBE位点的应用，其特征在于，所述水稻OsTFIIAγ1基因启动子中EBE位点能够被白叶枯病菌致病蛋白TALE结合。
4.根据权利要求2所述水稻OsTFIIAγ1基因启动子中EBE位点的应用，其特征在于，在CRISPR/Cas9基因编辑系统中，引入靶向感病基因OsTFIIAγ1启动子EBE位点的引导RNA序列，所述引导RNA序列核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，构建的CRISPR/Cas9系统通过农杆菌介导的方法转入含有隐性抗病基因xa5水稻中，获得白叶枯病感病基因OsTFIIAγ1的EBE位点被编辑的水稻植株。
5.根据权利要求4所述水稻OsTFIIAγ1基因启动子中EBE位点的应用，其特征在于，利用引物对γ1gRNA-F和γ1gRNA-R，合成双链的DNA gRNA，构建在CRISPR/Cas9系统中，通过农杆菌介导的方法转入感病水稻中，获得含感病基因EBE位点被编辑的再生水稻植株，提高对水稻白叶枯病的抗性；引物对γ1gRNA-F和γ1gRNA-R序列分别如SEQ ID No.3和SEQ IDNo.4所示。
6.靶向水稻OsTFIIAγ1基因启动子中EBE位点的引导RNA序列，其特征在于，所述引导RNA序列核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
7.制备如权利要求6所述靶向水稻OsTFIIAγ1基因启动子中EBE位点的引导RNA序列的方法，其特征在于，利用引物对γ1gRNA-F和γ1gRNA-R，合成双链的DNA gRNA；
引物对γ1gRNA-F和γ1gRNA-R序列分别如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示。
8.一种引物对，其特征在于，引物对γ1gRNA-F和γ1gRNA-R序列分别如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示；
所述引物对γ1gRNA-F和γ1gRNA-R，用于合成双链的DNA gRNA，双链的DNA gRNA用于构建在CRISPR/Cas9系统中，通过农杆菌介导的方法转入感病水稻中，获得含感病基因EBE位点被编辑的再生水稻植株，提高对水稻白叶枯病的抗性。
9.一种培育广谱抗白叶枯病水稻的方法，其特征在于，运用CRISPR/Cas9基因编辑技术修饰水稻OsTFIIAγ1基因启动子中能够被白叶枯病菌致病蛋白TALE结合的EBE位点，培育广谱抗白叶枯病水稻的方法，具体包括：
在CRISPR/Cas9基因编辑系统中，引入靶向感病基因OsTFIIAγ1启动子EBE位点的引导RNA序列，所述EBE位点的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述引导RNA序列核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，构建的CRISPR/Cas9系统通过农杆菌介导的方法转入含有隐性抗病基因xa5水稻中，获得白叶枯病感病基因OsTFIIAγ1的EBE位点被编辑的水稻植株。
10.根据权利要求9所述培育广谱抗白叶枯病水稻的方法，其特征在于，含有隐性抗病基因xa5水稻品种是指既含有xa5基因，同时还有含有感病基因OsTFIIAγ1启动子中的EBE位点的水稻。
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