CN113186345A - 一种快速检测病毒核酸的方法及其检测装置 - Google Patents

一种快速检测病毒核酸的方法及其检测装置 Download PDF

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Abstract

本发明提出一种快速检测病毒核酸的方法及其检测装置，属于病毒检测技术领域，能够解决常规的核酸检测方法存在对环境要求高、检测时间较长、操作难度大，难以实现现场快检等的技术问题。该检测方法包括：擦拭采样、样本裂解处理、检测与显色处理等步骤；该检测装置包括：基体、样本裂解腔、输送装置以及检测与显色腔。本发明具有操作简便、灵敏度高、检测时间短，且能够实现现场快检等特点。本发明能够应用于病毒核酸现场快检方面。

Description

一种快速检测病毒核酸的方法及其检测装置
技术领域
本发明属于病毒检测技术领域，尤其涉及一种快速检测病毒核酸的方法及其检测装置。
背景技术
近期国内复发的多起新冠肺炎疫情都是由于国外进口商品携带新冠病毒，进而传染给接触者造成的，而且由于冷链生鲜食品或相关环境中存在病毒载量较低，常规采样和检测方法存在漏检的风险，且常规的核酸检测方法(如PCR法)存在对环境要求高、检测时间较长、操作难度大，难以实现现场快检等缺陷。
然而，我国每天需要进口大量冷链商品和原料，对于进出口口岸、食品生产企业等机构部门而言，急需研发出一种操作简便、灵敏度高、检测时间短，且能够实现现场快检的病毒核酸检测方法，力求把疫情防控在最前线，将传染隐患扼杀在萌芽期。
发明内容
本发明针对常规的核酸检测方法存在对环境要求高、检测时间较长、操作难度大，难以实现现场快检等的技术问题，提出一种具有操作简便、灵敏度高、检测时间短，且能够实现现场快检的检测病毒核酸的方法及其检测装置。
为了达到上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种快速检测病毒核酸的方法，包括如下步骤：
采样膜片于待测样本表面擦拭采样；
将采样后的采样膜片放置于装有裂解液的样本裂解腔中进行裂解处理，得到核酸溶液；
经输送装置将所述核酸溶液分别输送至装有反应试剂的第一检测与显色腔和第二检测与显色腔中进行核酸检测与显色反应；
反应完成后，根据所述第一检测与显色腔和第二检测与显色腔内溶液的颜色变化进行判断，溶液显色或溶液颜色发生明显改变表明所述待测样本中含有待检病毒，其为阳性样本。
作为优选，所述待测样本包括但不限于物品表面、人或动物的口腔。
作为优选，所述裂解液含有蛋白酶K 20-100mg/L、吐温20 0.1％-1％、尿素2％-10％和TritonX-100 0.1％-1％，所述裂解处理的时间为2-10min，核酸检测与显色反应于60-70℃条件下进行，反应时间为20-30min。
作为优选，所述第一检测与显色腔和第二检测与显色腔可分别检测同一种病毒的两段基因片段、同一病毒的两种分型或两种不同的病毒；
第一检测与显色腔的反应试剂包括第一检测试剂和第一显色试剂，第二检测与显色腔内的反应试剂包括第二检测试剂和第二显色试剂。
作为优选，所述第一检测试剂含有引物AF3和AT7B3各0.2-2uM、引物AFIP和ABIP各0.1-1uM、dUTP/dATP/dTTP/dCTP/dGTP 0.2-2uM、ATP/UTP/CTP/GTP 0.02-2uM、MgCl2 2-10mM、T7 RNA聚合酶20-2KU/L、Bst DNA聚合酶20-2KU/L、UDG酶1-10K U/L以及显色试剂0.1-1％；
第二检测试剂含有引物BF3和BT7B3各0.2-2uM、引物BFIP和BBIP各0.1-1uM、dUTP/dATP/dTTP/dCTP/dGTP 0.2-2uM、ATP/UTP/CTP/GTP 0.02-2uM、MgCl2 2-10mM、T7 RNA聚合酶20-2KU/L、Bst DNA聚合酶20-2KU/L、UDG酶1-10K U/L以及显色试剂0.1-1％。
作为优选，所述第一显色试剂和第二显色试剂均选自GeneFinder核酸染料、Gelgreen核酸染料、goldview核酸染料或钙黄绿素中的任意一种。
作为优选，所述快速检测病毒核酸的方法的检测病毒种类为新冠病毒、诺如病毒、甲流病毒或乙流病毒。
作为优选，检测病毒种类为新冠病毒时，第一检测试剂中的引物AF3和AT7B3、引物AFIP和ABIP为针对N基因特异性片段扩增的引物，第二检测试剂中的引物BF3和BT7B3、引物BFIP和BBIP为针对ORF基因特异性片段扩增的引物；
所述检测病毒种类为诺如病毒时，第一检测试剂中的引物AF3和AT7B3、引物AFIP和ABIP为针对诺如病毒GⅠ型设计的引物，第二检测试剂中的引物BF3和BT7B3、引物BFIP和BBIP为针对诺如病毒GⅡ型设计的引物；
所述检测病毒种类为甲流病毒和乙流病毒时，第一检测试剂中的引物AF3和AT7B3、引物AFIP和ABIP为针对甲流病毒的保守区域设计的引物，第二检测试剂中的引物BF3和BT7B3、引物BFIP和BBIP为针对乙流病毒的保守区域设计的引物。
本发明还提供了一种用于快速检测病毒核酸的检测装置，包括：
基体，其内部设有多个腔室，
样本裂解腔，设置于所述基体内部上方的空腔结构，且在底部开设二开口，
输送装置，设置于所述样本裂解腔下方的可旋转圆柱体结构，且在所述样本裂解腔底部的二开口位置对应设置二凹槽，及
检测与显色腔，设置于所述输送装置下方，包括第一检测与显色腔和第二检测与显色腔。
作为优选，所述第一检测与显色腔和第二检测与显色腔分别与所述输送装置的二凹槽的对应设置，所述输送装置为可180°旋转的圆柱体结构。
与现有技术相比，本发明的优点和积极效果在于：
1、本发明提供了一种快速检测病毒核酸的方法，该检测方法结合了将环介导等温扩增技术(LAMP)与实时荧光核酸恒温扩增检测技术(SAT)的优势，同时选用T7 RNA聚合酶和bstDNA聚合酶作为反应试剂，可在5-30min内实现“样本进、结果出”的现场快速检测过程；
2、本发明提供的快速检测病毒核酸的方法扩增速度快，检测时间短，与目前应用最广泛的荧光PCR技术相比，可将检测时间从2-4h缩短至5-30min；
3、本发明提供的快速检测病毒核酸的方法灵敏度高，可检测到10个以内病毒剂量的样本，而普通PCR的灵敏度一般在1000个病毒剂量左右；
4、本发明提供的快速检测病毒核酸的方法假阳性率低，免核酸提取直扩技术省略了繁琐的样品核酸提取步骤，将样品的核酸提取和扩增集成于一管，不用开盖即可检测，因此可有效降低由于操作误差和气溶胶引入的假阳性率；
5、本发明提供的用于快速检测病毒核酸的检测装置结构精简、操作简单，且占据空间较少，便于携带。
附图说明
图1为本发明实施例所提供的用于快速检测病毒核酸的检测装置的透视图；
图2为本发明实施例所提供的用于快速检测病毒核酸的检测装置的透视图；
图3为本发明实施例所提供的用于快速检测病毒核酸的检测装置的透视图；
图4为本发明实施例所提供的用于快速检测病毒核酸的检测装置的立体图。
以上各图中：1、基体；2、样本裂解腔；3、输送装置；4、凹槽；5、第一检测与显色腔；6、第二检测与显色腔。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明实施例提供了一种快速检测病毒核酸的方法，包括如下步骤：
S1、采样膜片于待测样本表面擦拭采样；
在上述S1步骤中，所用的采样膜片选用whatman公司的FTA膜片，待测样本包括但不限于物品表面、人或动物的口腔，同时，本发明实施例所提供的检测方法待测样本也可以是水样，将采样膜片置于水样中几秒后，即完成采样过程。
S2、将采样后的采样膜片放置于装有裂解液的样本裂解腔2中进行裂解处理，得到核酸溶液；
在上述S2步骤中，样本裂解腔2内添加的裂解液为0.5-1.0mL。
S3、经输送装置3将所述核酸溶液分别输送至装有反应试剂的第一检测与显色腔5和第二检测与显色腔6中进行核酸检测与显色反应；
在上述S3步骤中，输送装置3上的两个输送腔容积相同，为10-50μl。第一检测与显色腔5和第二检测与显色腔6的容积也相同，为50-100μl。
S4、反应完成后，根据所述第一检测与显色腔5和第二检测与显色腔6内溶液的颜色变化进行判断，溶液显色或溶液颜色发生明显改变表明所述待测样本中含有待检病毒，其为阳性样本。
例如，当待检病毒为新冠病毒时，第一检测与显色腔5和第二检测与显色腔6内溶液均显色或颜色发生明显改变，待测样本为阳性，第一检测与显色腔5和第二检测与显色腔6内溶液均不显色或颜色未发生改变，待测样本为阴性，第一检测与显色腔5内溶液显色或第二检测与显色腔6内溶液显色或颜色发生明显改变，重新检测所述待测样本。
在一优选实施例中，所述裂解液含有蛋白酶K 20-100mg/L、吐温200.1％-1％、尿素2％-10％和TritonX-100 0.1％-1％，所述裂解处理的时间为2-10min，核酸检测与显色反应于60-70℃条件下进行，反应时间为20-30min。
在一优选实施例中，所述第一检测与显色腔5和第二检测与显色腔6可分别检测同一种病毒的两段基因片段、同一病毒的两种分型或两种不同的病毒；
所述第一检测与显色腔5的反应试剂包括第一检测试剂和第一显色试剂，第二检测与显色腔6内的反应试剂包括第二检测试剂和第二显色试剂。
在上述优选实施例中，第一检测与显色腔5和第二检测与显色腔6为平行并列关系，具体地，可分别检测同一种病毒的两段基因片段，也可分别检测同一病毒的两种分型、还可分别检测两种不同的病毒。
在一优选实施例中，所述第一检测试剂含有引物AF3和AT7B3各0.2-2uM、引物AFIP和ABIP各0.1-1uM、dUTP/dATP/dTTP/dCTP/dGTP 0.2-2uM、ATP/UTP/CTP/GTP 0.02-2uM、MgCl2 2-10mM、T7 RNA聚合酶20-2KU/L、Bst DNA聚合酶20-2KU/L、UDG酶1-10K U/L以及显色试剂0.1-1％；
第二检测试剂含有引物BF3和BT7B3各0.2-2uM、引物BFIP和BBIP各0.1-1uM、dUTP/dATP/dTTP/dCTP/dGTP 0.2-2uM、ATP/UTP/CTP/GTP 0.02-2uM、MgCl2 2-10mM、T7 RNA聚合酶20-2KU/L、Bst DNA聚合酶20-2KU/L、UDG酶1-10K U/L以及显色试剂0.1-1％。
在上述优选实施例中，所述引物的设计原理为：在被检测病毒系列中找到一段100-200bp的特异性保守区域，使用primerexplorer或LAMP Designer在该区域找到合适的F3、F2、F1和B1c、B2c、B3c并确定需要的引物序列：F3、FIP(F1c-F2)和B3、BIP(B2-B1c)，在B3引物序列的5’端连上T7启动子序列TAATACGACTCACTATAGGGAGA形成T7B3。
当RNA模板与检测试剂反应时，BstDNA聚合酶利用其逆转录功能，利用T7B3引物，逆转录合成一条带T7启动子的单链DNA，再利用其解链和合成功能，利用F3引物，合成出一条带T7启动子的双链DNA。T7 RNA聚合酶以这条双链DNA为模板进行转录，每个cDNA分子可以转录出100～1000个拷贝的RNA，合成出的RNA与分子信标结合，发出荧光。与此同时，新合成的RNA继续在BstDNA聚合酶和T7 RNA聚合酶的作用下循环逆转录和转录的过程。如此往复，以达到高效扩增的目的。
另一方面，BstDNA聚合酶利用F3、FIP、T7B3、BIP引物，在前面形成的cDNA双链上进行成环扩增，合成出的DNA与分子信标结合，发出荧光。
将两种扩增反应相结合，会显著提高扩增效率和灵敏度，缩短扩增时间。
在上述优选实施例中，第一检测试剂和第二检测试剂中选用T7 RNA聚合酶作为组分之一的原因在于：①此种聚合酶具有RNA聚合酶活性，分子量约99kDa，能专门催化5'→3'方向的RNA形成过程；②具有高温活性；③T7RNA聚合酶具有高度启动子专一性，且只会转录位于T7启动子下游的的DNA或DNA复制品。此外，本发明实施例选用的T7 RNA聚合酶为货号NEB M0658的产品，但本发明不仅局限于此种货号，也可使用其他厂家具有高温活性的T7RNA聚合酶。同时，此酶在合成RNA的过程中，需要DNA模板与镁离子(Mg2+)作为辅因子。
在第一检测试剂和第二检测试剂中选用BstDNA聚合酶作为组分之一的原因在于：①具有更佳的等温扩增活性和更强的逆转录活性，无论以DNA还是RNA为模板，BstDNA聚合酶3.0都具有5’-3’的DNA聚合酶活性和强烈的链置换活性，但该酶5’-3’和3’-5’的外切酶活性缺失；②在以RNA为模板的LAMP实验中，可实现单酶系统反应；③该酶在60-70℃之间具有很好的反转录活性，可有效解决具有二级复杂结构的RNA模板的反转录。此外，本发明实施例选用的BstDNA聚合酶为BstDNA聚合酶3.0。
在第一检测试剂和第二检测试剂中选用UDG酶作为组分之一的原因在于：UDG酶，全称为尿嘧啶DNA糖基酶(Uracil N-Glycosylase,UNG)，为来源于E.coli uracil N-glycosylase基因的重组表达蛋白，分子量为26kDa。它可催化含尿嘧啶的单链和双链DNA释放游离尿嘧啶，但对RNA无活性。UNG酶主要用于PCR扩增产物的防污染，其作用原理为：如果在PCR反应中以dUTP替代dTTP掺入DNA中，形成了含dU碱基的PCR扩增产物，该酶能选择性断裂单链和双链DNA中U基的糖苷键，降解该PCR扩增产物。
还需进一步说明的是，本发明实施例提供的检测方法在检测新冠病毒时，以新型冠状病毒SARS-CoV-2的核衣壳蛋白N基因和ORF1ab基因为检测靶基因，利用两个靶基因保守区段上分别设计了3对引物，分别为OFIP、OBIP、OF3、OT7B3和NFIP、NBIP、NF3、NT7B3(具体序列详见核酸序列表)。两个靶基因的引物需要分别跟其他组分搭配放置在两个不同的检测与显色腔内。
在一优选实施例中，所述第一显色试剂和第二显色试剂均选自GeneFinder核酸染料、Gelgreen核酸染料、goldview核酸染料或钙黄绿素中的任意一种，且在同一次检测过程中，第一显色试剂和第二显色试剂需选择同一种染色试剂。
在一优选实施例中，所述快速检测病毒核酸的方法的检测病毒种类为新冠病毒、诺如病毒、甲流病毒或乙流病毒。
在一优选实施例中，所述检测病毒种类为新冠病毒时，第一检测试剂中的引物AF3和AT7B3、引物AFIP和ABIP为针对N基因特异性片段扩增的引物，第二检测试剂中的引物BF3和BT7B3、引物BFIP和BBIP为针对ORF基因特异性片段扩增的引物；
所述检测病毒种类为诺如病毒时，第一检测试剂中的引物AF3和AT7B3、引物AFIP和ABIP为针对诺如病毒GⅠ型设计的引物，第二检测试剂中的引物BF3和BT7B3、引物BFIP和BBIP为针对诺如病毒GⅡ型设计的引物；
所述检测病毒种类为甲流病毒和乙流病毒时，第一检测试剂中的引物AF3和AT7B3、引物AFIP和ABIP为针对甲流病毒的保守区域设计的引物，第二检测试剂中的引物BF3和BT7B3、引物BFIP和BBIP为针对乙流病毒的保守区域设计的引物。
本发明实施例还提供了一种用于快速检测病毒核酸的检测装置，包括：
基体1，其内部设有多个腔室，
样本裂解腔2，设置于所述基体1内部上方的空腔结构，且在底部开设二开口，
输送装置3，设置于所述样本裂解腔2下方的可旋转圆柱体结构，且在所述样本裂解腔2底部的二开口位置对应设置二凹槽4，及
检测与显色腔，设置于所述输送装置3下方，包括第一检测与显色腔5和第二检测与显色腔6。
在一优选实施例中，所述第一检测与显色腔5和第二检测与显色腔6分别与所述输送装置3的二凹槽4的对应设置，其中，凹槽4的容积为5-10μl，所述输送装置3为可180°旋转的圆柱体结构。
为了更清楚详细地介绍本发明实施例所提供的快速检测病毒核酸的方法及其检测装置，下面将结合具体实施例进行描述。
对比例1
本对比例提供了一种常规PCR-荧光探针法检测新冠病毒核酸的方法，本对比例以目前市售的新型冠状病毒(2019-nCoV)核酸测定试剂盒作为检测试剂盒，具体为：
1、检测原理：
对新型冠状病毒(2019-nCoV)ORF 1ab及编码核衣壳蛋白N基因的特异性保守序列为靶区域，进行了双靶标基因的设计，同时本试剂盒采用核酸释放剂快速裂解、释放样本中核酸；配以PCR反应液，在荧光定量PCR仪上，应用实时荧光定量RT-PCR检测技术，通过荧光信号的变化实现样本RNA的检测。
新型冠状病毒(2019-nCoV)核酸测定试剂盒的试剂组分及用量：
表1新型冠状病毒(2019-nCoV)核酸测定试剂盒的主要试剂组分
序号 试剂名称 规格与装量
1 2019-nCoV-FAST-样本核酸释放剂 1mL/管
2 2019-nCoV-PCR-FAST-反应液 624μL/管
3 2019-nCoV-PCR-FAST-酶混合液 96μL/管
4 2019-nCoV-PCR-FAST-阳性对照 500μL/管
5 2019-nCoV-PCR-FAST-阴性对照 500μL/管
2、试剂准备：
(1)取出盒中的各组分，室温放置，待其温度平衡至室温后，混匀后备用；
(2)根据待测样本数量，阳性对照和阴性对照数量，按比例
(2019-nCoV-PCR-FAST-反应液26μL/人份
+2019-nCoV-PCR-FAST-酶混合液4μL/人份)取相应量的组分，充分混匀成PCR混合液，瞬时离心后备用；
(3)将上述准备好的试剂转移至样本处理区，待用。
3、样本处理：
(1)取出样本核酸释放剂，待平衡至室温后，混匀；
(2)样本预处理：
血清、血浆样本、咽拭子样本(TE/生理盐水基质)：取出样本后混匀，取10μL待测样本和10μL 2019-nCoV-FAST-样本核酸释放剂到PCR扩增管中，枪头吹打3～5次，作为待测样本备用；
拭子样本(病毒保存液等其他基质)：取出样本后混匀，取100～200待测样本于1.5mL离心管中，12000rpm离心10min；弃上清后往沉淀中加入50μL 2019-nCoV-FAST-样本核酸释放剂震荡混匀，静置10min，作为待测样本备用；
取上述中处理后的产物：将30μL配制好的PCR-混合液加入到20μL的待测样本PCR扩增管中，在荧光PCR仪上进行荧光定量PCR的检测。
4、PCR扩增：
将PCR反应管放入扩增仪样品槽，按对应顺序设置阳性对照、阴性对照及待测样本，并设置样本名称；
荧光检测通道选择：选择FAM(ORF-1ab区域)和ROX(N基因)通道检测2019-nCoV病毒核酸；
选择HEX通道检测内标。
表2 PCR循环参数设定
Figure BDA0003049021850000101
5、质量控制：
2019-nCoV-PCR-FAST-阴性对照：FAM、ROX通道及内标(HEX)通道均无Ct值或Ct＞40；
2019-nCoV-PCR-FAST-阳性对照：FAM、ROX及内标(HEX)通道均Ct≤35；
以上要求需在同一次实验中同时满足，否则，本次实验无效，需重新进行。
6、结果分析：
反应结束后自动保存结果，对检测靶标以及内标的扩增曲线分别进行分析。根据分析后图像调节Baseline的Start值、End值以及Threshold值(用户可根据实际情况自行调整，Start值可以在3-15、End值可设在5-20，调整阴性对照的扩增曲线使其平直或低于阈值线)，点击Analyze进行分析，使各项参数符合下述“5.质量控制”中的要求，然后到Plate窗口下记录定性结果。
7、阳性判断值：
通过参考值的研究确定本试剂盒检测目标基因的Ct参考值为40，内标Ct的参考值为40。
8、检验结果的解释：
先分析内标在HEX通道是否有扩增曲线，且Ct≤40，若有，表示本次检测有效，可继续进行后续分析；
若FAM或ROX通道检测到典型的S型扩增曲线，且Ct≤40，表示2019-nCoV病毒为阳性；
若FAM且ROX通道未检测到典型的S型扩增曲线(NoCt)，或Ct＞40，表示2019-nCoV病毒为阴性。
若内标在HEX通道没有检测到Ct或Ct＞40，表示本次检测样本浓度太低或者有干扰物质抑制反应，需重新准备实验。
对于阳性样本及病毒培养物，内标检测结果不作要求；对于阴性样本，其内标检测应为阳性，若其内标检测为阴性，则该样本的检测结果无效，应查找并排除原因，并对此样本重新采样，进行重复实验。
灰度区结果判定：如果某样本在FAM、ROX通道荧光信号有明显增幅，但Ct值大于40，则该样本处于灰度区，需要复检，如复检结果仍处于灰度区，则判断为阳性。
实施例1
本实施例提供了一种快速检测新冠病毒核酸的方法，具体包括如下步骤：
(1)采样膜片于待测样本表面擦拭采样；
(2)将采样后的采样膜片放置于装有裂解液的样本裂解腔2中进行裂解处理5min，得到核酸溶液，其中，裂解液含有蛋白酶K 20mg/L、吐温20 0.1％、尿素2％和TritonX-1000.1％；
(3)经输送装置3将上述核酸溶液分别输送至装有反应试剂的第一检测与显色腔5和第二检测与显色腔6中进行核酸检测与显色反应，反应时间为30min，反应于60℃条件下进行(可置于60℃恒温箱或水浴锅中)，其中，第一检测与显色腔5内的反应试剂包括：引物AF3和AT7B3各0.2-2uM、引物AFIP和ABIP各0.1-1uM、dNTPs0.2-2uM、NTPs 0.02-2uM、MgCl22-10mM、T7 RNA聚合酶20-2KU/L、Bst DNA聚合酶20-2KU/L、UDG酶1-10K U/L以及显色试剂0.1-1％；第二检测与显色腔6内的反应试剂包括：引物BF3和BT7B3各0.2-2uM、引物BFIP和BBIP各0.1-1uM、dNTPs0.2-2uM、NTPs 0.02-2uM、MgCl2 2-10mM、T7 RNA聚合酶20-2KU/L、Bst DNA聚合酶20-2KU/L、UDG酶1-10K U/L以及显色试剂0.1-1％；
(4)根据第一检测与显色腔5和第二检测与显色腔6内溶液的颜色变化进行判断，第一检测与显色腔5和第二检测与显色腔6内溶液均显色或颜色发生明显改变，待测样本为阳性，第一检测与显色腔5和第二检测与显色腔6内溶液均不显色，待测样本为阴性，第一检测与显色腔5内溶液显色或第二检测与显色腔6内溶液显色或颜色发生明显改变，重新检测待测样本。
实施例2
本实施例提供了一种快速检测诺如病毒核酸的方法，具体包括如下步骤：
(1)采样膜片于待测样本表面擦拭采样；
(2)将采样后的采样膜片放置于装有裂解液的样本裂解腔2中进行裂解处理5min，得到核酸溶液，其中，裂解液含有蛋白酶K 20mg/L、吐温20 0.1％、尿素2％和TritonX-1000.1％；
(3)经输送装置3将上述核酸溶液分别输送至装有反应试剂的第一检测与显色腔5和第二检测与显色腔6中进行核酸检测与显色反应，反应时间为30min，反应于60℃条件下进行，其中，第一检测与显色腔5内的反应试剂包括：引物AF3和AT7B3各0.2-2uM、引物AFIP和ABIP各0.1-1uM、dNTPs0.2-2uM、NTPs 0.02-2uM、MgCl2 2-10mM、T7 RNA聚合酶20-2KU/L、Bst DNA聚合酶20-2KU/L、UDG酶1-10K U/L以及显色试剂0.1-1％；第二检测与显色腔6内的反应试剂包括：引物BF3和BT7B3各0.2-2uM、引物BFIP和BBIP各0.1-1uM、dNTPs0.2-2uM、NTPs 0.02-2uM、MgCl2 2-10mM、T7 RNA聚合酶20-2KU/L、Bst DNA聚合酶20-2KU/L、UDG酶1-10K U/L以及显色试剂0.1-1％；
(4)根据第一检测与显色腔5和第二检测与显色腔6内溶液的颜色变化进行判断，第一检测与显色腔5和第二检测与显色腔6内溶液只要有显色现象出现，则表明待测样本为阳性，第一检测与显色腔5和第二检测与显色腔6内溶液均不显色，表明待测样本为阴性。
由上述实施例及对比例所述的病毒核酸检测方法可知，对比例1提供的常规PCR-荧光探针法检测新冠病毒核酸的方法具有操作步骤复杂、耗时较长等缺陷，无法实现病毒核酸的现场快速检测，而利用本发明实施例所提供的检测方法及检测装置能够彻底解决现有技术存在的检测时间较长、操作难度大，难以实现现场快检等的技术问题。由此可见，本发明所提供的快速检测病毒核酸的方法及其检测装置在病毒核酸快速检测方面有广阔的应用前景。
序列表
<110>青岛浩铂生物科技有限公司
<120>一种快速检测病毒核酸的方法及其检测装置
<160> 8
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 50
<212> DNA
<213> OFIP
<400> 1
AGAGT TGAAA GGCAC ATTTG GTTGT TTTTT TATGG GTAGA ATTCG ATCTG
<210> 2
<211> 50
<212> DNA
<213> OBIP
<400> 2
CAGAC GGGCG ATTTT GTTAA AGCTT TTCAC CTTCT TTAGT CAAAT TCTCA
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> OF3
<400> 3
GAAAA GAAAA AGCTT GATGG C
<210> 4
<211> 48
<212> DNA
<213> OT7B3
<400> 4
TAATA CGACT CACTA TAGGG AGATT TTGGT AAGTA ACCAC AAGTA GTG
<210>5
<211> 45
<212> DNA
<213> NFIP
<400> 5
TCTGG CCCAG TTCCT AGGTA GTTTT TGACG AATTC GTGGT GGTGA
<210>6
<211> 44
<212> DNA
<213> NBIP
<400> 6
AGACG GCATC ATATG GGTTG CATTT TGCGG GTGCC AATGT GATC
<210>7
<211> 19
<212> DNA
<213> NF3
<400> 7
TGGCT ACTAC CGAAG AGCT
<210>8
<211> 47
<212> DNA
<213> NT7B3
<400> 8
TAATA CGACT CACTA TAGGG AGATT TTTGC AGCAT TGTTA GCAGG AT

Claims (10)

1.一种快速检测病毒核酸的方法，其特征在于，包括如下步骤：
采样膜片于待测样本表面擦拭采样；
将采样后的采样膜片放置于装有裂解液的样本裂解腔中进行裂解处理，得到核酸溶液；
经输送装置将所述核酸溶液分别输送至装有反应试剂的第一检测与显色腔和第二检测与显色腔中进行核酸检测与显色反应；
反应完成后，根据所述第一检测与显色腔和第二检测与显色腔内溶液的颜色变化进行判断，溶液显色或溶液颜色发生明显改变表明所述待测样本中含有待检病毒，其为阳性样本。
2.根据权利要求1所述的快速检测病毒核酸的方法，其特征在于，所述待测样本包括但不限于物品表面、人或动物的口腔。
3.根据权利要求1所述的快速检测病毒核酸的方法，其特征在于，所述裂解液含有蛋白酶K 20-100mg/L、吐温20 0.1％-1％、尿素2％-10％和TritonX-100 0.1％-1％，所述裂解处理的时间为2-10min，核酸检测与显色反应于60-70℃条件下进行，反应时间为20-30min。
4.根据权利要求1所述的快速检测病毒核酸的方法，其特征在于，所述第一检测与显色腔和第二检测与显色腔可分别检测同一种病毒的两段基因片段、同一病毒的两种分型或两种不同的病毒；
所述第一检测与显色腔的反应试剂包括第一检测试剂和第一显色试剂，第二检测与显色腔内的反应试剂包括第二检测试剂和第二显色试剂。
5.根据权利要求4所述的快速检测病毒核酸的方法，其特征在于，所述第一检测试剂含有引物AF3和AT7B3各0.2-2uM、引物AFIP和ABIP各0.1-1uM、dUTP/dATP/dTTP/dCTP/dGTP0.2-2uM、ATP/UTP/CTP/GTP 0.02-2uM、MgCl2 2-10mM、T7 RNA聚合酶20-2KU/L、Bst DNA聚合酶20-2KU/L、UDG酶1-10K U/L以及显色试剂0.1-1％；
第二检测试剂含有引物BF3和BT7B3各0.2-2uM、引物BFIP和BBIP各0.1-1uM、dUTP/dATP/dTTP/dCTP/dGTP 0.2-2uM、ATP/UTP/CTP/GTP 0.02-2uM、MgCl2 2-10mM、T7 RNA聚合酶20-2KU/L、Bst DNA聚合酶20-2KU/L、UDG酶1-10K U/L以及显色试剂0.1-1％。
6.根据权利要求4所述的快速检测病毒核酸的方法，其特征在于，所述第一显色试剂和第二显色试剂均选自GeneFinder核酸染料、Gelgreen核酸染料、goldview核酸染料或钙黄绿素中的任意一种。
7.根据权利要求5所述的快速检测病毒核酸的方法，其特征在于，所述快速检测病毒核酸的方法的检测病毒种类为新冠病毒、诺如病毒、甲流病毒或乙流病毒。
8.根据权利要求7所述的快速检测病毒核酸的方法，其特征在于，所述检测病毒种类为新冠病毒时，第一检测试剂中的引物AF3和AT7B3、引物AFIP和ABIP为针对N基因特异性片段扩增的引物，第二检测试剂中的引物BF3和BT7B3、引物BFIP和BBIP为针对ORF基因特异性片段扩增的引物；
所述检测病毒种类为诺如病毒时，第一检测试剂中的引物AF3和AT7B3、引物AFIP和ABIP为针对诺如病毒GⅠ型设计的引物，第二检测试剂中的引物BF3和BT7B3、引物BFIP和BBIP为针对诺如病毒GⅡ型设计的引物；
所述检测病毒种类为甲流病毒和乙流病毒时，第一检测试剂中的引物AF3和AT7B3、引物AFIP和ABIP为针对甲流病毒的保守区域设计的引物，第二检测试剂中的引物BF3和BT7B3、引物BFIP和BBIP为针对乙流病毒的保守区域设计的引物。
9.一种用于快速检测病毒核酸的检测装置，其特征在于，包括：
基体，其内部设有多个腔室，
样本裂解腔，设置于所述基体内部上方的空腔结构，且在底部开设二开口，
输送装置，设置于所述样本裂解腔下方的可旋转圆柱体结构，且在所述样本裂解腔底部的二开口位置对应设置二凹槽，及
检测与显色腔，设置于所述输送装置下方，包括第一检测与显色腔和第二检测与显色腔。
10.根据权利要求9所述的用于快速检测病毒核酸的检测装置，其特征在于，所述第一检测与显色腔和第二检测与显色腔分别与所述输送装置的二凹槽的对应设置，所述输送装置为可180°旋转的圆柱体结构。
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WO2023092178A1 (en) * 2021-11-23 2023-06-01 Genetic Signatures Limited Improved isothermal amplification

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