CN113186134A - 一种蓝藻气囊提取方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物医学技术领域，尤其涉及一种蓝藻气囊提取方法及其应用。本申请建立了一个快速、高效提取微囊藻气囊的方法(“H2O2法”)。具体步骤包括：S1：调整藻细胞浓度为(0.5‑8.0)×107个/mL；S2：加入0.02‑3.5mol/L的过氧化氢；S3：摇晃处理5‑240min；S4：将处理后的藻液低温离心；S5：取离心后的上层白色乳状物与PBS溶液等比例混合，低温离心，保留白色漂浮层即为气囊。该技术为进一步开发生物合成的超声造影剂提供了技术支撑，展现出较好的工业潜力，同时也对研究气囊的精细结构提供了原材料。

Description

一种蓝藻气囊提取方法及其应用
技术领域
本发明属于生物医学技术领域，尤其涉及一种蓝藻气囊提取方法及其应用。
背景技术
超声成像作为临床诊断和生物学研究的常用手段，具有高时空分辨率、深穿透性和低成 本等优点，特别是超声造影剂的靶向修饰可在分子水平上无创显示血栓、炎症及肿瘤血管， 进行靶向检测和治疗，拓宽了传统成像模式的诊断能力和实用性。除了超声诊断外，携带药 物的微泡造影剂在受到低强度的超声辐射时，发生爆破并释放药物，其发生的空化效应使附 近的毛细血管和细胞通透性增高，提高了相应组织对药物的摄取率。因而，超声造影剂在脑 部、心血管和癌症等重大疾病的检测和治疗中具有重要的应用前景。
目前，临床上使用较多的造影剂是人工合成的由脂质、聚合物或蛋白外壳包裹气体的直 径为几微米(1-8μm)的微泡。因其体积较大，只能在血管内成像，无法穿过血管壁进入非 血管肿瘤部位。因此这类微泡在生物医学上的应用受到了限制，同时还存在生物安全性的问 题。
最近的研究发现，来源于蓝藻和古菌内的气囊能显著增强超声成像的效果，使其具有作 为纳米级超声造影剂的潜质。气囊是由蛋白质外壳包裹气体形成的中空纺锤体状或圆柱体状 结构，长度为200nm-2000nm，直径为45nm–200nm。因气囊内部气体和周围介质之间的 声阻抗不同使得气囊能够散射声波，产生谐波信号，可以显著增强含气囊区域的对比度，并 提供可区分的超声信号。由于其纳米级尺寸和谐波产生能力，使气囊在肿瘤成像中展现出巨 大的潜力。
气囊主要存在于蓝藻和古菌中，目前研究发现参与气囊形成的基因有gvpA1A2A3CNKJKFGWV，其中Gvp A和Gvp C是形成气囊的主要结构组成蛋白。Gvp A具有 很强的疏水性，在气囊壁上形成间距为4.6nm的棱纹结构。Gvp C位于气囊的外表面，与Gvp A相互作用增强气囊壁的强度。其他相关蛋白功能未知。为了将气囊广泛应用于临床研究中，2018年Shapiro团队通过基因工程的方法将表达气囊的基因簇(ARG1)密码子优化后在大肠杆菌中表达，发现这些表达气囊的大肠杆菌也具有超声造影属性。随后,他们在肠道益生菌ECN(E.coli strain Nissle 1917)中表达了ARGs,来验证表达ARGs的细胞在体内的可检测性， 实现了活体微生物超声成像。另外，Farhadi等采用多质粒共转染系统，将mARGs(哺乳动 物声学报告基因，包括来自于巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium的gvpBNFGLSKJU)稳定表 达于HEK-293T人体肾脏细胞，成功表达了气囊。随后将上述HEK细胞注射于免疫缺陷小鼠 腿部构建肿瘤模型。结果显示在超声成像下，报告基因的信号可清晰地勾勒出肿瘤组织的轮 廓。这说明作为一种新型的超声造影剂，气囊为超声分子成像和疾病检测提供了新的技术手 段。
除上述在异源细胞中表达气囊的操纵子获得气囊以外，另一种策略是直接从蓝藻或古菌 中提取气囊，直接或修饰后进行超声成像。因藻类易于培养，且气囊含量丰富，是理想的气 囊制备原料。现有的从蓝藻中提取气囊的方法包括：
2017年，《微生物学通报》公开了一种水华蓝藻气囊的分离纯化方法：这里称为“高渗 裂解法”，具体步骤为：
a)在三角瓶中各加入20μL的青霉素G(0.16mg/L)和Mg2+(1mmol/L)，在光照培养箱中振荡培养5h，转速为65转/min。b)将藻液分装至15mL离心管中，配平之后，4℃、400 g低速离心15min。c)用注射器吸取上层漂浮的藻细胞于50mL离心管中，倾去中间的液体， 并用500μL的BG11培养基重悬沉淀，最终用BG11培养基将体积补至10mL。d)加入10μL 的终浓度为1mg/mL的溶菌酶，裂解细胞壁。在37℃恒温孵育至少1小时。e)用烧杯称取 0.9209g的甘油(终浓度为1mol/L)，将经溶菌酶裂解的藻液倒入烧杯并混匀。f)迅速加入 三倍体积的40mmol/L Tris-HCl(pH 7.7)，对藻细胞进行渗透冲击。置于4℃，静置过夜。 g)次日，将裂解后的藻细胞分装至15mL离心管中，配平，4℃、400g离心6h后，用注 射器收集表层呈弯月形的藻液层。h)将收集的藻液层分装至1.5mL离心管中，4℃、400g离 心1h，用注射器吸取上层藻液层于新的1.5mL离心管中，以1：1的比例与PBS混匀，多 次离心，直至气囊颜色为乳白色。
该方法虽然可以提取出微囊藻的气囊，但提取效率极低，且操作繁琐，只适用于微囊藻， 不具有广谱性。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种蓝藻气囊提取方法及其应用，目的在于解 决现有技术中的一部分问题或至少缓解现有技术中的一部分问题。
本发明是这样实现的，一种蓝藻气囊提取方法，包括以下步骤：
S1：调整藻细胞浓度为(0.5-8.0)×107个/mL；
S2：加入0.02-3.5mol/L的过氧化氢；
S3：摇晃处理5-240min；
S4：将处理后的藻液低温离心；
S5：取离心后的上层白色乳状物与PBS溶液等比例混合，低温离心，保留白色漂浮层即 为气囊。
进一步地，步骤S1中藻细胞浓度为3×107个/mL。
进一步地，步骤S2中过氧化氢浓度为1mol/L。
进一步地，步骤S3中摇晃处理时间为60min。
进一步地，步骤S4中低温离心条件为4℃，400g，离心2h。
进一步地，步骤S5中用PBS处理操作重复多次；步骤S5中低温离心条件为4℃，400g， 离心1h。
本发明还提供了如上述的一种蓝藻气囊提取方法在蓝藻气囊提取中的应用。
进一步地，所述蓝藻包括微囊藻和束丝藻中的至少一种。
进一步地，所述微囊藻包括铜绿微囊藻、珠海微囊藻、水华微囊藻以及含有胶鞘壁的群 体微囊藻中的至少一种。
本发明还提供了上述的一种蓝藻气囊提取方法提取的气囊在制备造影剂中的应用。
本申请建立了一个快速、高效提取微囊藻气囊的方法(“H2O2法”)。该技术为进一步开 发生物合成的超声造影剂提供了技术支撑，展现出较好的工业潜力，同时也对研究气囊的精 细结构提供了原材料。
综上所述，本发明的优点及积极效果为：
1、时间成本低。本方法使用过氧化氢处理微囊藻悬液1小时，便可分离纯化气囊。而“高 渗裂解法”分离气囊前要耗费18个小时，体现在向生长到对数期的藻细胞悬液中加入Mg2+和青霉素摇床处理5个小时后，离心浓缩耗费0.5h，溶菌酶处理至少1h，加入甘油混匀15min， 过夜处理至少12h。因此“H2O2法”将提取气囊的时间从24h缩短为7h，降低了时间成本， 有利于后期工业上的生产。
2、提取效率高，气囊的得率提高了三倍以上。使用“H2O2法”提取气囊之后，藻细胞沉淀中基本不含有气囊的残留，降低了损耗，大大提高了气囊纯化的效率。
3、该方法具有广谱性。不仅适用于实验室培养的微囊中气囊的提取，同时适用于提取含 有胶鞘壁的群体微囊藻的气囊。这都是“高渗裂解法”中无法实现的。
4、易于放大，大规模制备气囊。将为研究不同藻类气囊的理化性质及应用带来极大的便 利。
附图说明
图1是微囊藻气囊新提取方法的建立；
图2是“H2O2法”与“高渗裂解法”的效果比较；
图3是“H2O2法”用于提取其他蓝藻气囊的实验结果；
图4是气囊超声成像实验结果。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行 进一步详细说明，各实施例及试验例中所用的设备和试剂如无特殊说明，均可从商业途径得 到。此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
根据本申请包含的信息，对于本领域技术人员来说可以轻而易举地对本发明的精确描述 进行各种改变，而不会偏离所附权利要求的精神和范围。应该理解，本发明的范围不局限于 所限定的过程、性质或组分，因为这些实施方案以及其他的描述仅仅是为了示意性说明本发 明的特定方面。实际上，本领域或相关领域的技术人员明显能够对本发明实施方式作出的各 种改变都涵盖在所附权利要求的范围内。
为了更好地理解本发明而不是限制本发明的范围，在本申请中所用的表示用量、百分比 的所有数字、以及其他数值，在所有情况下都应理解为以词语“大约”所修饰。因此，除非特 别说明，否则在说明书和所附权利要求书中所列出的数字参数都是近似值，其可能会根据试 图获得的理想性质的不同而加以改变。各个数字参数至少应被看作是根据所报告的有效数字 和通过常规的四舍五入方法而获得的。本发明中，“约”指给定值或范围的10％以内，优选 为5％以内。
本发明下述各实施例中未特别限定温度时，则均为常温条件。常温是指四季中自然室温 条件，不进行额外的冷却或加热处理，一般常温控制在10～30℃，最好是15～25℃。
本发明披露了一种蓝藻气囊提取方法及其应用，具体如下实施例所示。
实施例1微囊藻气囊新型提取方法的建立
通过预实验，本实施例选用微囊藻FACHB-2329开展气囊提取实验(图1A所示)。主要通过摸索以下三个条件建立提取气囊的新方法：1)过氧化氢处理的最适细胞浓度；2)过氧化氢的最适终浓度；3)最适处理时间。
1)、过氧化氢处理下最适藻细胞浓度的优化
为了有效提取出气囊，结合过氧化氢对铜绿微囊藻的抑制生长浓度(0.0028-0.045 mmol/L)以及预实验，本实验初步选用0.02mol/L过氧化氢处理藻细胞。如图1B所示，当 藻细胞浓度为3×107个/mL时，收获的气囊的质量最多，为109.17μg蛋白。因此，随后 的其他条件的优化，均以藻细胞浓度为3×107个/mL来进行。
2)、过氧化氢终浓度的优化
在一定细胞浓度下，过低的过氧化氢终浓度只能在一定时间内抑制藻细胞的生长，不能 使藻细胞释放气囊；若使用浓度过高，后续PBS溶液洗涤气囊溶液并不能完全去除残留的过 氧化氢，后期去除成本较高。因此本实施例中比较了不同过氧化氢终浓度对收获气囊的质量 的关系(图1C)。在相同的藻细胞下，过氧化氢终浓度从0.002mol/L增加到0.02mol/L时， 气囊产量明显增加，在1mol/L时收获的气囊的质量最多，约174.30μg蛋白。当增加至3.5 mol/L时，气囊的产量明显降低。上述结果显示1mol/L为最适提取微囊藻气囊的过氧化氢终 浓度。
3)、处理时间的优化
要将“H2O2法”应用于工业生产，要尽量降低时间成本。因此，适当的处理时间至关重 要。本实施例中比较了不同处理时间下对收获气囊产量的影响，在使用1mol/L的H2O2处理 浓度为3×107个/mL的藻液时，当处理时间为60min时，收获的气囊的量最多，为132.57μg蛋白(图1D)。因此，当藻液浓度为3×107个/mL时，使用终浓度为1mol/L的过氧 化氢处理60min为最佳的纯化微囊藻气囊的条件。
4)、经“H2O2法”纯化的气囊呈现出乳白色(如图1E)，利用含有10％SDS 2×样 品缓冲液将其溶解后，进行SDS-PAGE电泳并使用Gvp C抗体进行检测。结果显示纯化的气 囊条带在25kDa左右，与预测的分子量一致(图1F)。综上所述，本申请成功建立了新型 的提取微囊藻气囊方法，并命名为“H2O2法”。
综上，本发明通过“H2O2”法对微囊藻气囊进行提取的具体操作步骤为：
1、取一瓶生长到对数期的微囊藻，通过BG11培养基将细胞浓度稀释或通过离心浓缩将 细胞浓度调整为3×107个/mL。
2、加入终浓度为1mol/L的过氧化氢。
3、置于摇床上，以65r/min的转速，处理60min。
4、将藻液于4℃，400g，离心2h。
5、用注射器将藻液上层的白色乳状物吸取到1.5mL EP管中。
6、将白色乳状物与PBS溶液以1:1的比例混匀，400g离心(4℃，1h)后，用注射器 将上层白色漂浮层吸取到新的1.5mL EP管中，与PBS溶液以1:1的比例混匀，离心。重复 两次。
7、最终，将各实验组经洗涤的白色乳状物单独收集到不同的1.5mL离心管中。白色乳状 物即为气囊。
实施例2“H2O2法”与“高渗裂解法”的效果比较
为了探究H2O2法是否会影响气囊的结构，本实施例中将“H2O2法”提纯的气囊与使用 “高渗裂解法”提纯的气囊的结构进行了比较。首先，将两种方法提取纯化的气囊(图2A)在电镜下观察，对比二者的形态。结果显示二者都呈现完整的圆柱状结构(图2B和C)。 “高渗裂解法”提纯的气囊的长度690±209nm，直径为81±17nm。利用“H2O2法”提取 的气囊长度为691±201nm，直径为85±15nm(图2D和E)。这些结果证明，使用1mol/L 过氧化氢处理藻细胞不会对气囊结构造成损伤，能满足后续解析气囊结构以及造影实验的要 求。
为了比较两种方法分离气囊的效率，本申请同时使用“高渗裂解法”和“H2O2法”对20 mL(3×107个/mL)的藻液进行处理，将气囊分离纯化后，根据气囊体积和蛋白浓度，计算气囊蛋白的总量(μg)，进而比较两种方法提取气囊的效率。利用“高渗裂解法”得到气 囊83μg，利用“H2O2法”得到气囊为260μg(图2F)。上述结果表明“H2O2法”提取气 囊的效率是“高渗裂解法”的三倍以上。另外，本申请中利用Gvp C抗体，检测经两种方法提 取气囊的藻细胞沉淀中气囊蛋白的含量，具体方法参照文献(Xu M.Studies on the gas vesiclegene cluster in Microcystis sp[D].Wuhan:Institute of Hydrobiology,ChineseAcademy of Sciences,2006.)，进一步证明“H2O2法”的高效性。结果发现，经“H2O2法”提取过气囊的 藻细胞沉淀中基本检测不到Gvp C蛋白，而使用“高渗裂解法”提取过气囊的藻沉淀中仍含有 大量的GvpC蛋白(图2H，W代表未经提取过气囊的全细胞蛋白，R1代表经“H2O2法”提 取过气囊的藻细胞沉淀，R2代表经“高渗裂解法”提取过气囊的藻细胞沉淀，GVs代表气囊。)。 这说明了，“H2O2法”不仅具有高效性，而且还能将藻细胞的气囊提取地更加完全，可以满 足后续将气囊应用为超声造影剂的工业生产要求。
综上，“H2O2法”可以将气囊完整地从藻细胞中提取出来，对气囊结构无影响；同时具 有高效性，将气囊得率提升了三倍以上，且藻细胞沉淀中基本不含有气囊蛋白，降低了损耗， 而且实验时间由24小时缩短为7小时。
实施例3“H2O2法”提取气囊的应用
1、利用实施例1中描述的方法提取不同微囊藻(FACHB-928,FACHB-1326)的气囊。
2、利用实施例1中描述的方法提取束丝藻FACHB-1416的气囊。
具体步骤与实施例1中的区别仅在于，第一步中修改为“取一瓶生长到对数期的藻，通 过BG11培养基将细胞浓度稀释或通过离心浓缩将细胞OD500调整为1.0左右”。
3、利用实施例1中描述的方法提取群体微囊藻(珠海微囊藻和野外微囊藻)的气囊。
具体步骤与提取束丝藻气囊的步骤相同。
实验结果如图3所示。实验结果说明，本申请中的提取方法不仅可提取出经藻种库纯化 的藻(如图3A，铜绿微囊藻FACHB-928；图3B，铜绿微囊藻FACHB-1326；图3C，束丝 藻FACHB-1416；图3D，珠海微囊藻)的气囊；也可以提取出采样于野外的水华微囊藻的气 囊(如图3E，武汉官桥和图3F，江苏太湖)。这说明，“H2O2法”具有广谱性，可适用于 提取多种蓝藻的气囊。
本申请进一步地对纯化出的气囊长度和直径进行分析，在束丝藻Aphanizomenonsp.FACHB-1416的气囊相对较长，平均长度为729.3±224.3nm，有的甚至长达1 500nm，平均直径为82.3±17.4nm；采样自江苏太湖的野生微囊藻的气囊长度较短，平均长度为577±154nm，最长的为1011nm，平均直径为101.6±12.6nm；采样自武汉官桥的野生微囊藻的气囊平均直径略大，为115.3±19.7nm，平均长度为612.7±156.6nm；铜绿微囊藻Microcystisaeruginosa FACHB-1326和铜绿微囊藻Microcystis aeruginosa FACHB-928气囊的平均长度分 别是666.1±236.8nm和660.0±204.7nm，平均直径为98.3±14.0nm和89.0±15.8nm；来自 于FACHB的珠海微囊藻的气囊平均长度为686.2±179.6nm，平均直径为111.3±12.4nm(如 图3G和H)。以上结果说明本申请建立的“H2O2法”可以广泛应用于从蓝藻中提取气囊。
实施例4气囊的体外造影
本申请通过“H2O2法”实现了从多种蓝藻细胞中高效率提取出高纯度的气囊，为了检测 其是否具有造影特性以及信号持续性的强弱，本实施例将来源于不同蓝藻的气囊在超声系统 下进行体外造影。
选取微囊藻FACHB-2329，FACHB-1326和FACHB-930为目的藻株，利用“H2O2法” 纯化其气囊，并在超声9L探头下进行体外造影(图4A)。结果发现这三株藻的气囊都具有 造影信号(图4B)。随后，通过超声造影定量分析测量随时间变化不同气囊造影信号的变 化情况。结果显示微囊藻FACHB-1326的气囊表现出较优的造影特性，在超声持续作用15s 后，气囊才完全坍塌，不再具有造影信号，而微囊藻FACHB-2329和微囊藻FACHB-930的 气囊仅在6s时，就已坍塌完全(图4C)。这可能与不同藻株气囊的稳定性相关，该特性对 后续测量不同气囊的抗压力实验具有一定的参考意义。
综上，经“H2O2法”提取的气囊可用于新型纳米级超声造影剂的制备。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原 则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种蓝藻气囊提取方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：调整藻细胞浓度为(0.5-8.0)×107个/mL；
S2：加入0.02-3.5mol/L的过氧化氢；
S3：摇晃处理5-240min；
S4：将处理后的藻液低温离心；
S5：取离心后的上层白色乳状物与PBS溶液等比例混合，低温离心，保留白色漂浮层即为气囊。
2.根据权利要求1所述的一种蓝藻气囊提取方法，其特征在于：步骤S1中藻细胞浓度为3×107个/mL。
3.根据权利要求1所述的一种蓝藻气囊提取方法，其特征在于：步骤S2中过氧化氢浓度为1mol/L。
4.根据权利要求1所述的一种蓝藻气囊提取方法，其特征在于：步骤S3中摇晃处理时间为60min。
5.根据权利要求1所述的一种蓝藻气囊提取方法，其特征在于：步骤S4中低温离心条件为4℃，400g，离心2h。
6.根据权利要求1所述的一种蓝藻气囊提取方法，其特征在于：步骤S5中用PBS处理操作重复多次；步骤S5中低温离心条件为4℃，400g，离心1h。
7.如权利要求1-6任一所述的一种蓝藻气囊提取方法在蓝藻气囊提取中的应用。
8.根据权利要求7中所述的应用，其特征在于，所述蓝藻包括微囊藻和束丝藻中的至少一种。
9.根据权利要求8中所述的应用，其特征在于，所述微囊藻包括铜绿微囊藻、珠海微囊藻、水华微囊藻以及含有胶鞘壁的群体微囊藻中的至少一种。
10.如权利要求1-6任一所述的一种蓝藻气囊提取方法提取的气囊在制备造影剂中的应用。
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