CN113185489A - 酸水解化合物的合成方法及其用于固相耦合糖蛋白、固相改性衍生和富集糖肽的方法 - Google Patents

酸水解化合物的合成方法及其用于固相耦合糖蛋白、固相改性衍生和富集糖肽的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种酸水解化合物的合成方法及其用于固相耦合糖蛋白、固相改性衍生和富集糖肽的方法，首先合成具有二氧戊环、胺基和羧基官能基团化合物6，然后将化合物与带有胺基硅胶通过还原胺化反应，得到与硅胶共价结合的化合物7，再用Schiff‑base反应将丙二醛与化合物7共价结合得到化合物8，再与糖蛋白或糖肽共价结合形成9，经过处理的糖肽与酸性溶液孵化，室温下在二氧戊环初水解洗脱得到带有标记的糖肽10。本方法对研究唾液酸糖蛋白或糖肽在各种疾病中的变化等方面有着重要意义。

Description

酸水解化合物的合成方法及其用于固相耦合糖蛋白、固相改 性衍生和富集糖肽的方法
技术领域
本发明属于生物分子分析试剂技术领域，具体涉及酸水解化合物的合成及用于固相分析糖蛋白合成的方法。
背景技术
蛋白糖基化与多种疾病密切相关，研究表明蛋白糖基化定义肿瘤的恶性程度。人体体液中与肿瘤特异性的糖蛋白，往往可显示疾病发生、发展和进程。因此研究糖蛋白在肿瘤标志物的筛查中有非常重要的意义。分析糖蛋白通常使用富集糖肽，再使用质谱定性定量检测其结构和丰度。然而体液或者细胞表明糖蛋白，往往含有高表达的唾液酸，研究这些重要的糖基化，需要对唾液酸加以保护，提高唾液酸在样本处理和质谱检测中的稳定性。使用溶液方法与唾液酸反应，样本后处理比较困难，尤其是有α2,3和α2,6链接唾液酸溶液中两步法很难实现。固相上实现两步法衍生α2,3和α2,6链接唾液酸非常有效，但对分析糖肽由于与硅胶共价结合而无法从固相上释放。本研究合成一种化合物，通过化合物与糖肽N端共价结合，两步法衍生唾液酸后，酸解可将糖肽洗脱而全面富集糖肽，避免直接将糖肽与固相共价结合造成糖肽信息的不完整，从而提高糖基化鉴定。
因此，针对上述问题，有必要提出进一步的解决方案。
发明内容
本发明目的是提供一种酸水解化合物的合成方法及其用于固相耦合糖蛋白、固相改性衍生和富集糖肽的方法，以解决现有技术中分析唾液酸糖肽的局限性。
本发明的技术方案是：一种酸水解化合物的合成方法，该方法包括如下步骤：
(a)将化合物原料1乙酰丙酸与甲苯基BnO，在DMF中混合并室温条件下反应4-6小时得到中间产物2；
(b)将所述中间产物2与C18H19NO4溶于DMF，并在室温条件下反应6-12小时，得到中间产物3；
(c)将所述中间产物3溶解在DMF中，加入哌啶室温条件下反应4-6小时得到中间产物4；
(d)将所述中间产物4溶解在DMF中，加入Fmoc-Sarosine，在室温条件下混合反应4-6小时，得到中间产物5；
(e)将所述中间产物5在Pd/C作用下得到具有二氧戊环、胺基和羧基官能基团的化合物6；
上述反应过程的化学式如下：
Figure BDA0003043415480000021
进一步的，在步骤(a)中，所述化合物原料1乙酰丙酸与所述甲苯基BnO的摩尔比为1：1。
进一步的，在步骤(b)中，所述中间产物2与所述C18H19NO4的摩尔比为1：1。
进一步的，在步骤(c)中，所述中间产物3与所述哌啶的摩尔比为1：1。
进一步的，在步骤(d)中，所述中间产物4与所述Fmoc-Sarosine的摩尔比为1：1。
本发明的另一技术方案是：一种酸水解化合物用于固相耦合糖蛋白方法，该方法包括如下步骤：
(a)将化合物6与带有胺基的硅胶通过还原胺化反应，得到与硅胶共价结合的化合物7；
(b)用Schiff-base反应将丙二醛与所述化合物7共价结合得到固相上基团8；
(c)将糖蛋白或糖肽与所述固相上基团8共价结合形成化合物9；
(d)所述化合物9与酸性溶液孵化，在温度为20-23℃、二氧戊环化合键水解下洗脱得到带有标记的糖肽10；
上述反应过程的化学式如下：
Figure BDA0003043415480000031
进一步的，在步骤(a)中，所述化合物6与所述带有胺基的硅胶的摩尔比为1：1。
进一步的，在步骤(b)中，所述丙二醛与所述化合物7的摩尔比为1：1。
本发明的另一技术方案是：一种酸水解化合物用于固相改性衍生和富集糖肽的方法，该方法包括如下步骤：
(a)将化合物6溶于1xPBS溶液，并与带有胺基的硅胶混合，加入N-(3-二甲基氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺，pH控制在6-7，混合后在室温下反应4小时至过夜，即得产物7；
(b)将丙二醛溶于1xPBS缓冲液，pH控制在7.2-7.4，溶解后与所述产物7混合，再加入NaCNBH3，在室温下反应4-8小时，得到产物8；
(c)将所述产物8与糖肽或糖蛋白反应，得到产物11；
(d)在1xPBS溶液中加入对苯甲胺、EDC，将所述产物11与对苯甲胺反应，控制pH在6-7之间，在室温下反应4小时或过夜，得到产物12；
(e)将所述产物12与TFA混合，控制pH小于2，将混合物在温度为37℃的条件下，摇床震荡8-12小时，得到水解终产物糖肽或糖蛋白13；
上述反应过程的化学式如下：
Figure BDA0003043415480000041
进一步的，在步骤(a)和(d)中，所述pH通过加入浓度为36-38％的盐酸液或EDC来调节。
本发明提供了酸水解化合物的合成方法及其用于固相耦合糖蛋白、固相改性衍生和富集糖肽的方法。其优点是：
1、分析具有高丰度唾液酸糖蛋白，比如血液中潜在的疾病标志物(AFP)，尿液中的PSA等；
2、定量分析含有α2,3和α2,6链接的唾液酸，比如在禽流感病毒HA和NA上所带的唾液酸类别，对人体受体结合起重要作用；
3、酸性中水解，有利于在液相和高通量样本制备中使用。
附图说明
图1为本发明所述的酸水解化合物的合成方法的流程示意图；
图2为本发明中酸水解化合物用于固相耦合糖蛋白的方法的流程示意图；
图3为本发明中酸水解化合物用于固相改性衍生和富集糖肽的方法的流程示意图。
具体实施方式
如图1所示，本发明公开了一种酸水解化合物的合成方法，该方法包括如下步骤：
将化合物原料1乙酰丙酸(Levulinic acid)与甲苯基BnO以摩尔比1：1的比例，在DMF中混合，室温条件反应4-6小时得到中间产物2；
通过中间产物2与C18H19NO4以摩尔比为1：1的配比溶于DMF，在室温反应6-12小时得到中间产物3；
将中间产物3溶解在DMF中，中间产物3与哌啶(Piperidine)摩尔比为1：1。加入哌啶室温条件下反应4-6小时得到中间产物4；
将中间产物4溶于DMF中，加入Fmoc-Sarosine(九芴甲氧羰基-沙罗辛)，中间产物4与Fmoc-Sarosine两者摩尔比为1：1，混合后室温反应4-6小时得到中间产物5；
中间产物5在Pd/C作用下得到化合物6，该化合物分子量为482.53g/mol。
如图2所示，本发明公开了一种酸水解化合物用于固相耦合糖蛋白方法，依次从合成化合与胺基硅胶结合，用丙二醛与化合物胺基共价反应，使得糖肽的N-端或赖氨酸与醛基结合，最后在酸性条件下，二氧戊环处水解洗脱得到糖肽。具体方法包括如下步骤：
化合物6的结构中含有二氧戊环、胺基和羧基官能基团；然后将化合物6与带有胺基硅胶以摩尔比1：1的配比通过还原胺化反应，得到与硅胶共价结合的化合物7；用Schiff-base反应将丙二醛与化合物7以摩尔比1：1的配比结合得到固相上基团8；将糖蛋白或糖肽与固相上基团8共价结合形成化合物9；化合物9与酸性溶液孵化，在20-23℃的温度下在二氧戊环化合键中水解洗脱得到带有标记的糖肽10。
如图3所示，本发明公开了一种酸水解化合物用于固相改性衍生和富集糖肽的方法，首先将聚糖通过丙二醛的醛基与糖肽肽段胺基反应得到产物11，再用对苯甲胺(p-Toluidine)与聚糖唾液酸反应，形成稳定结构12。最后用酸性溶液将糖肽水解得到13。其中，Gal是半乳糖、GalNAc是N-乙酰半乳糖、NeuAc是N-乙酰神经氨酸。S,T,A,P,A是单字母氨基酸。具体方法包括如下步骤：
将化合物6溶于1xPBS溶液，并与胺基硅胶混合，加入N-(3-二甲基氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺(EDC，100％)，pH控制在6-7，过低或过高通过加入浓盐酸液滴(36-38％)或EDC来调节，混合后在室温下反应4小时至过夜，即得到产物7；将丙二醛(Glutaraldehyde)溶于1xPBS缓冲液(pH7.2-7.4)，溶解后与产物7混合，再加入NaCNBH3，在室温下反应4-8小时，得到产物8；将产物8与糖肽或糖蛋白反应，200-300ug糖肽溶于得到产物11；将产物11与对苯甲胺(p-Toluidine)反应，在1xPBS溶液中加入p-Toluidine，加入EDC，pH控制在6-7之间，过高用36-38％HCl调节或过低用EDC提高，反应在室温4小时或过夜，得到产物12。在本步骤中，对苯甲胺反应将带有唾液酸的糖肽衍生，形成稳定结构。通常使用碳二亚胺偶联反应；将产物12与TFA混合(pH低于2)，将混合物在37℃摇床震荡8-12小时，得到水解终产物糖肽或糖蛋白13。
表1为唾液酸糖肽鉴定方法比较表，数值估计以溶液方法为基准(1)，数值表示鉴定可增加的倍数。详细比较见下表1：
Figure BDA0003043415480000061
Figure BDA0003043415480000071
表1
由此可知，如果未对含有唾液酸糖蛋白衍生保护，大约20-30％的唾液酸将在样本处理过程中水解，在质谱分析中，由于使用酸性缓冲液，进一步降低唾液酸含量(10-20％)。此外，聚糖上唾液酸水解后，形成不带唾液酸的聚糖，人为造成聚糖额外种类和改变聚糖真实分布丰度。直接将糖蛋白固定在固相上衍生，存在蛋白酶解效率低、且与固相结合的N-端糖肽将无法收集；将糖肽固定在固相上，衍生后不能将糖肽从固相上剥离下来，因此将会丢失大量糖肽信息。而本发明方法有利于分析具有高丰度唾液酸糖蛋白。
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合实施例进一步说明本发明的技术方案。但是本发明不限于所列出的实施例，还应包括在本发明所要求的权利范围内其他任何公知的改变。
此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。
实施例1
本实施案例按如下步骤展示一种酸水解化合物的合成方法，所述方法包括如下步骤：
将58.06mg化合物原料1乙酰丙酸与54.07mg甲苯基BnO，在DMF中混合，并在室温条件下反应4-6小时得到中间产物2；将96.15mg中间产物2与156.56mg C18H19NO4溶于DMF，在室温反应6小时得到产物3；将250.78mg中间产物3溶解在500DMF中，在室温下加入42.58mg哌啶反应4-6小时得到中间产物4；将132.5mg中间产物4溶于500ul DMF中，再与155.66mgFmoc-Sarosine混合后室温反应4小时得到中间产物5；中间产物5在Pd/C作用下得到化合物分子量为482.53g/mol的终产物6。
实施例2
本实施案例按如下步骤展示一种酸水解化合物的合成方法，所述方法包括如下步骤：
将116.12mg化合物原料1乙酰丙酸与108.14mg甲苯基BnO，在DMF中混合，并在室温条件下反应4-6小时得到中间产物2；将192.21mg中间产物2与313.35mg C18H19NO4溶于DMF，在室温反应12小时得到产物3；将501.57mg中间产物3溶解在1000ul DMF中，在室温下加入85.15mg哌啶反应4-6小时得到产物4；将265.3mg中间产物4溶于1000ul DMF中，与311.33mgFmoc-Sarosine混合后室温反应6小时得到中间产物5；中间产物5在Pd/C作用下得到化合物分子量为482.53g/mol的终产物6。
实施例3
本实施案例按如下步骤展示一种酸水解化合物用于固相耦合糖蛋白方法，将方法包括如下步骤：
将500ul质量为241.26mg的化合物6与100mg带有胺基硅胶通过还原胺化反应，得到与硅胶共价结合的；用Schiff-base反应将500ul质量为36.03mg的丙二醛与化合物7共价结合得到固相上基团8；将200ug糖蛋白或糖肽与固相上基团8共价结合形成化合物9；经过处理的糖肽化合物9与500ul酸性溶液孵化(如1M TFA)，在温度为20℃的条件下与二氧戊环化合键水解洗脱得到带有标记的糖肽10。
实施例4
本实施案例按如下步骤展示一种酸水解化合物用于固相耦合糖蛋白方法，将方法包括如下步骤：
将1000ul质量为482.53mg的化合物6与200mg带有胺基硅胶通过还原胺化反应，得到与硅胶共价结合的；用Schiff-base反应将1000ul质量为72.06mg的丙二醛与化合物7共价结合得到固相上基团8；将300ug糖蛋白或糖肽与固相上基团8共价结合形成化合物9；经过处理的糖肽化合物9与1000ul酸性溶液孵化(如2M TFA)，在温度为23℃的条件下与二氧戊环化合键水解洗脱得到带有标记的糖肽10。
实施例5
本实施案例按如下步骤展示一种酸水解化合物用于固相改性衍生和富集糖肽的方法，该方法包括如下步骤：
将130mg化合物6溶于500ul 1xPBS水溶液，并与100mg胺基硅胶混合，加入50ul N-(3-二甲基氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺(EDC，100％)，pH控制在6-7，过低或过高通过加入浓盐酸液滴(36％)或EDC来调节，混合后在室温下反应4小时至过夜，即得到产物7；将50.06mg丙二醛溶于500微升1xPBS缓冲液(pH 7.2),溶解后与硅胶物7混合，再加入12.5ul1M NaCNBH3，在室温下反应4小时，得到产物8；将产物8与糖肽或糖蛋白反应，200ug糖肽溶于产物8得到产物11；将产物11与对苯甲胺反应，在500ul 1xPBS水溶液中加入56.6mg对苯甲胺，加入50ul EDC，pH控制在6-7之间，过高用36％HCl调节或过低用EDC提高，反应在室温4小时或过夜，得到产物12；将产物12与500ul 1M TFA混合(pH低于2)，将混合物在37℃摇床震荡8小时，得到水解终产物糖肽或糖蛋白13。
实施例6
本实施案例按如下步骤展示一种酸水解化合物用于固相改性衍生和富集糖肽的方法，该方法包括如下步骤：
将260mg化合物6溶于1000ul 1xPBS溶液，并与200mg胺基硅胶混合，加入100ul N-(3-二甲基氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺(EDC，100％)，pH控制在6-7，过低或过高通过加入浓盐酸液滴(38％)或EDC来调节，混合后在室温下反应4小时至过夜，即得到产物7；
将100.12mg丙二醛溶于1000微升1xPBS缓冲液(pH 7.4)，溶解后与硅胶物7混合，再加入25ul 1M NaCNBH3，在室温下反应8小时，得到产物8；
将产物8与糖肽或糖蛋白反应，300ug糖肽溶于产物8得到产物11；
将产物11与对苯甲胺反应，在1000ul 1xPBS溶液中加入107.1mg对苯甲胺，加入10ul EDC，pH控制在6-7之间，过高用38％HCl调节或过低用EDC提高，反应在室温4小时或过夜，得到产物12；
将产物12与1000ul 1M TFA混合(pH低于2)，将混合物在37℃摇床震荡12小时，得到水解终产物糖肽或糖蛋白13。
应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (10)

1.一种酸水解化合物的合成方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：
(a)将化合物原料1乙酰丙酸与甲苯基BnO，在DMF中混合并室温条件下反应4-6小时得到中间产物2；
(b)将所述中间产物2与C18H19NO4溶于DMF，并在室温条件下反应6-12小时，得到中间产物3；
(c)将所述中间产物3溶解在DMF中，加入哌啶室温条件下反应4-6小时得到中间产物4；
(d)将所述中间产物4溶解在DMF中，加入Fmoc-Sarosine，在室温条件下混合反应4-6小时，得到中间产物5；
(e)将所述中间产物5在Pd/C作用下得到具有二氧戊环、胺基和羧基官能基团的化合物6；
上述反应过程的化学式如下：
Figure RE-FDA0003118735120000011
2.根据权利要求1所述的一种酸水解化合物的合成方法，其特征在于：在步骤(a)中，所述化合物原料1乙酰丙酸与所述甲苯基BnO的摩尔比为1：1。
3.根据权利要求1所述的一种酸水解化合物的合成方法，其特征在于：在步骤(b)中，所述中间产物2与所述C18H19NO4的摩尔比为1：1。
4.根据权利要求1所述的一种酸水解化合物的合成方法，其特征在于：在步骤(c)中，所述中间产物3与所述哌啶的摩尔比为1：1。
5.根据权利要求1所述的一种酸水解化合物的合成方法，其特征在于：在步骤(d)中，所述中间产物4与所述Fmoc-Sarosine的摩尔比为1：1。
6.根据权利要求1-5任意一项所制得的一种酸水解化合物用于固相耦合糖蛋白方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：
(a)将化合物6与带有胺基的硅胶通过还原胺化反应，得到与硅胶共价结合的化合物7；
(b)用Schiff-base反应将丙二醛与所述化合物7共价结合得到固相上基团8；
(c)将糖蛋白或糖肽与所述固相上基团8共价结合形成化合物9；
(d)所述化合物9与酸性溶液孵化，在温度为20-23℃、二氧戊环化合键水解下洗脱得到带有标记的糖肽10；
上述反应过程的化学式如下：
Figure RE-FDA0003118735120000021
7.根据权利要求6所述的一种酸水解化合物用于固相耦合糖蛋白方法，其特征在于：在步骤(a)中，所述化合物6与所述带有胺基的硅胶的摩尔比为1：1。
8.根据权利要求6所述的一种酸水解化合物用于固相耦合糖蛋白方法，其特征在于：在步骤(b)中，所述丙二醛与所述化合物7的摩尔比为1：1。
9.根据权利要求1-5任意一项所制得的一种酸水解化合物用于固相改性衍生和富集糖肽的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：
(a)将化合物6溶于1xPBS水溶液，并与带有胺基的硅胶混合，加入N-(3-二甲基氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺，pH控制在6-7，混合后在室温下反应4小时至过夜，即得产物7；
(b)将丙二醛溶于1xPBS缓冲液，pH控制在7.2-7.4，溶解后与所述产物7混合，再加入NaCNBH3，在室温下反应4-8小时，得到产物8；
(c)将所述产物8与糖肽或糖蛋白反应，得到产物11；
(d)在1xPBS溶液中加入对苯甲胺、EDC，将所述产物11与对苯甲胺反应，控制pH在6-7之间，在室温下反应4小时或过夜，得到产物12；
(e)将所述产物12与TFA混合，控制pH小于2，将混合物在温度为37℃的条件下，摇床震荡8-12小时，得到水解终产物糖肽或糖蛋白13；
上述反应过程的化学式如下：
Figure RE-FDA0003118735120000031
10.根据权利要求9所述的一种酸水解化合物用于固相改性衍生和富集糖肽的方法，其特征在于：在步骤(a)和(d)中，所述pH通过加入浓度为36-38％的盐酸液或EDC来调节。
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