CN115286643B - 蛋白质靶向降解化合物及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

蛋白质靶向降解化合物及其制备方法和应用，结构如下所示：其中R1为疏水标记；R2为靶蛋白配体。本发明首次利用细胞内蛋白共价疏水标记的方法诱导靶向蛋白降解，通过对于致病蛋白水平调控，达到疾病研究、癌细胞生长抑制以及肿瘤治疗的效果。本发明采用化学方法制备基于配体辅助共价疏水标记的蛋白靶向降解的药物合成并将其应用于靶向降解细胞中蛋白以及调节细胞中蛋白水平的研究。

Description

蛋白质靶向降解化合物及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于蛋白质靶向降解技术领域，具体涉及一种蛋白质靶向降解化合物及其制备方法和应用。
背景技术
蛋白水平调控在基础研究和疾病治疗中发挥重要的作用，选择性靶向蛋白质降解有利于基础研究和药物发现。在过去二十年开发的方法中，疏水标记降解是一种独特的靶向蛋白降解的方法。通过将目标蛋白配体和高度亲脂性部分连接，配体引导结合时的亲脂性部分模拟蛋白质错误折叠状态，进而激活细胞内蛋白质质量控制系统。该方法已成功应用于降解多种内源性蛋白质靶标。然而由于亲脂部分与蛋白质的稳定结合促进降解过程，通过疏水标记的靶向蛋白降解更倾向于共价蛋白配体。鉴于超过85％的蛋白质难以靶向，而可靶向蛋白中只有不到10％具有共价配体，这种偏好严重限制了疏水性标记的适用性。
配体导向化学为活细胞中内源蛋白的选择性共价标记提供了一种有效的方法，而无需共价配体。在蛋白质-配体识别的邻近效应的驱动下，在蛋白质亲核侧链和反应性基团之间发生共价化学反应后，功能部分与蛋白质不可逆地共价连接。使得内源性蛋白质能够被共价标记。因此，我们开发了一种配体辅助共价疏水标记的靶向蛋白降解策略。我们通过将N-酰基-N-烷基磺酰胺(NASA)、非共价靶蛋白配体与疏水标签三部分连接。在NASA介导的共价键形成和伴随的配体释放后，共价连接的疏水标签通过细胞蛋白质质量控制机制进行蛋白水解降解。这种配体辅助共价疏水标记靶向蛋白降解方法具有推广性，并扩展了疏水性标记靶向蛋白降解的应用。
发明内容
解决的技术问题：本发明提供一种蛋白质靶向降解化合物及其制备方法和应用，适用于靶向降解细胞中蛋白以及调节细胞中蛋白水平的研究。
技术方案：蛋白质靶向降解化合物，结构如下所示：
其中R1为疏水标记；R2为靶蛋白配体。
上述疏水标记为亲脂基团。
上述亲脂基团为金刚烷基。
上述靶蛋白配体为非共价蛋白配体。
上述蛋白质靶向降解化合物，结构如式1或3所示：
上述蛋白质靶向降解化合物的制备方法，步骤为：标准化学合成流程合成基于NASA化学的靶向BRD4蛋白的金刚烷疏水标记降解药物分子1，通过酰胺缩合反应合成带有反应性NASA基团和金刚烷疏水基团的中间产物，并将JQ1配体部分通过一价铜催化点击反应偶联，制备BRD4靶向分子1；
具体步骤为：首先将原料对羧基苯磺酰胺(1eq)、炔丙胺(1.5eq)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC，2.5eq)、1-羟基苯并三唑(HOBt，2eq)、N,N-二异丙基乙胺(DIPEA，2.5eq)混合于N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液,室温反应12小时；柱层析纯化后产物(1eq)在加入金刚烷乙酸(1.6eq)、4-二甲氨基吡啶(DMAP，0.3eq)、EDC(2.5eq)和DIPEA(2.5eq)，溶于DMF和二氯甲烷(DCM)，室温反应12小时；柱层析纯化后产物(1eq)加入碘乙腈(4eq)和DIPEA(2.5eq)，溶于DMF中室温4小时，柱层析纯化得中间产物分子4；另将JQ1(1eq)和叠氮丙胺(2eq)在加入苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU，2,5eq)和DIPEA(2.5eq)后，溶于DMF室温反应12小时得JQ1叠氮中间产物；柱层析纯化后将JQ1叠氮中间产物(1eq)和分子4(1eq)、硫酸铜(2eq)、抗坏血酸钠(2eq)、三(3-羟丙基三唑基甲基)胺(THPTA，2eq)溶于H2O/二甲基亚砜(DMSO)中，室温反应2小时，高效液相色谱纯化，得到产物分子1。
上述化合物在制备于MV4-11细胞中对BRD4选择性降解药物中的应用。
有益效果：本发明首次利用细胞内蛋白共价疏水标记的方法诱导靶向蛋白降解，通过对于致病蛋白水平调控，达到疾病研究、癌细胞生长抑制以及肿瘤治疗的效果。本发明采用化学方法制备基于配体辅助共价疏水标记的蛋白靶向降解的药物合成并将其应用于靶向降解细胞中蛋白以及调节细胞中蛋白水平的研究。(1)基于配体辅助共价疏水标记的蛋白靶向降解药物的合成：选择BRD4的非共价配体JQ1作为示例配体进行合成，化学合成主要通过酰胺缩合反应和一价铜催化点击反应合成中间产物，并将配体部分偶联制备蛋白靶向降解药物。(2)基于配体辅助共价疏水标记的BRD4靶向降解药物的蛋白质共价标记：在溶液中，将合成的BRD4靶向降解药物分子与重组BRD4蛋白共孵育，并通过高分辨质谱检测药物分子对BRD4蛋白的共价标记。在细胞中，将合成的BRD4靶向生物素标记药物分子与细胞共孵育，通过蛋白下拉实验检测药物分子在细胞中对内源BRD4的共价标记。(3)基于配体辅助共价疏水标记的靶向蛋白降解药物在细胞中靶向蛋白降解的应用：将BRD4靶向降解药物分子与肿瘤细胞共孵育，检测细胞中BRD4的表达。通过定量蛋白质组学检测细胞中BRD4蛋白含量。
附图说明
图1为基于配体辅助共价疏水标记的靶向BRD4降解药物分子的合成方法；
图2为上述药物在溶液中与BRD4蛋白反应后的高分辨质谱图；
图3为上述药物处理后在MV4-11细胞中下拉实验；
图4为上述药物处理后在MV4-11细胞中BRD4表达；
图5为上述药物处理后在MV4-11细胞中定量蛋白质组学结果；
图6为化合物1在MV4-11细胞中对BRD4的降解情况；
图7为化合物1在MV4-11细胞中定量蛋白质谱检测示意图；
图8为本发明蛋白质靶向降解化合物制备方法示意图。
具体实施方式
实施例1、基于配体辅助共价疏水标记的靶向BRD4降解药物的结构及合成方法
如图1所示，标准化学合成流程合成基于NASA化学的靶向BRD4蛋白的金刚烷疏水标记降解药物分子化合物1，不含有NASA反应基团的参照药物分子化合物2，以及生物素替换的标记分子化合物3。
选择BRD4的非共价配体JQ1作为示例配体进行合成，化学合成主要通过酰胺缩合反应合成带有反应性NASA基团、非反应性基团和金刚烷疏水基团、生物素基团的中间产物，并将配体部分通过一价铜催化点击反应偶联JQ1配体，制备BRD4靶向分子1、2、3。
原料对羧基苯磺酰胺(1eq)、炔丙胺(1.5eq)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC，2.5eq)、1-羟基苯并三唑(HOBt，2eq)、N,N-二异丙基乙胺(DIPEA，2.5eq)混合于N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液,室温反应12小时；柱层析纯化后产物(1eq)在加入金刚烷乙酸(1.6eq)、4-二甲氨基吡啶(DMAP，0.3eq)、EDC(2.5eq)和DIPEA(2.5eq)，溶于DMF和二氯甲烷(DCM)，室温反应12小时；柱层析纯化后产物(1eq)加入碘乙腈(4eq)和DIPEA(2.5eq)，溶于DMF中室温4小时，柱层析纯化得中间产物分子4；另将JQ1(1eq)和叠氮丙胺(2eq)在加入苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU，2,5eq)和DIPEA(2.5eq)后，溶于DMF室温反应12小时得JQ1叠氮中间产物；柱层析纯化后将JQ1叠氮中间产物(1eq)和分子4(1eq)、硫酸铜(2eq)、抗坏血酸钠(2eq)、三(3-羟丙基三唑基甲基)胺(THPTA，2eq)溶于H2O/二甲基亚砜(DMSO)中，室温反应2小时，高效液相色谱纯化，得到产物分子1，分子2、3合成步骤相同。
实施例2、基于配体辅助共价疏水标记的BRD4靶向降解药物的蛋白质共价标记
在溶液中的蛋白标记。将8μM化合物1和1μM BRD4重组蛋白在20mM HEPES缓冲溶液中反应3小时后，通过高效液相色谱-高分辨质谱表征分析，如图2所示，化合物1分子反应后出现共价修饰一个(47％)、两个(32％)和三个(7％)金刚烷基团的产物峰。而对照分子化合物2在同样条件下的溶液中对BRD4没有明显标记，在添加10倍于化合物1的过量浓度80μM的JQ1存在的竞争条件下，化合物1的标记效率显著下降(<5％)。结果表明基于配体辅助共价疏水标记策略的化合物1在溶液中快速高效标记BRD4蛋白。
在细胞中的蛋白标记。用10μM化合物3处理MV4-11细胞3小时后提取细胞裂解液。裂解物与链霉亲和素磁珠在结合缓冲液中在4℃下孵育2小时，随后洗脱杂蛋白。将全细胞裂解物和下拉富集样品对照，对BRD4进行蛋白质印迹检测分析。如图3所示，化合物3处理后细胞中共价标记生物素的BRD4被磁珠富集。
实施例3、基于配体辅助共价疏水标记的靶向蛋白降解药物在细胞中靶向BRD4降解的应用
在MV4-11细胞中加入10μM化合物1孵育不同时间后，如图4所示，蛋白印迹检测细胞中BRD4随着孵育时间增加而明显下调，在12小时孵育后达到约98％的最大降解率。在MV4-11细胞中加入不同浓度化合物1分子孵育12小时后，如图5所示，蛋白印迹检测结果显示化合物1对于细胞内BRD4降解效果随其浓度增大而增强，并确定化合物1的半降解浓度约为3μM。验证了在MV4-11细胞中，化合物1分子对BRD4降解呈时间依赖性和浓度依赖性，该结果表明化合物1对MV4-11细胞内BRD4的共价疏水标记触发了其随后的蛋白降解。
如图6所示，对照化合物2处理或同时加入10μM JQ1的竞争对照处理组没有明显BRD4水平下调，和体外实验蛋白标记效率结果一致。验证了化合物1在MV4-11细胞中实现对BRD4降解。
在MV4-11细胞中加入10μM化合物1孵育12小时后，通过基于同位素标记相对和绝对定量的定量蛋白质谱检测，分析结果如图7所示，在检测到的蛋白质组中BRD4显著且特异性下调，化合物1分子显着降低了MV4-11细胞中组学实验定量到5010种蛋白质中的10种，其中，BRD4减少了约70％，与蛋白质印迹结果一致。验证了化合物1在MV4-11细胞中对BRD4的选择性降解。
上述具体实施方式不以任何形式限制本发明的技术方案，凡是采用等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案均落在本发明的保护范围。

Claims (4)

1.蛋白质靶向降解化合物，其特征在于，结构如式1所示：
。
2.权利要求1所述蛋白质靶向降解化合物的制备方法，其特征在于，步骤为：通过酰胺缩合反应合成带有反应性NASA基团和金刚烷疏水基团的中间产物，并将JQ1配体部分通过一价铜催化点击反应偶联，制得蛋白质靶向降解化合物；
。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，具体步骤为：首先将原料对羧基苯磺酰胺1 eq、炔丙胺1.5 eq、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺2.5 eq、1-羟基苯并三唑2eq、N, N-二异丙基乙胺2.5 eq混合于N, N-二甲基甲酰胺溶液, 室温反应12小时；再将柱层析纯化后产物1 eq、金刚烷乙酸1.6 eq、4-二甲氨基吡啶0.3 eq、EDC2.5 eq和DIPEA 2.5eq，溶于DMF和二氯甲烷，室温反应12小时；柱层析纯化后产物1 eq加入碘乙腈4 eq和DIPEA2.5 eq，溶于DMF中室温4小时，柱层析纯化得中间产物分子4；另将JQ1 1 eq和叠氮丙胺2eq在加入苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐 2,5 eq和DIPEA 2.5 eq后，溶于DMF室温反应12小时得JQ1叠氮中间产物；柱层析纯化后将JQ1叠氮中间产物1 eq和分子4 1eq、硫酸铜 2 eq、抗坏血酸钠2 eq、三(3-羟丙基三唑基甲基)胺 2 eq溶于H2O/二甲基亚砜中，室温反应2小时，高效液相色谱纯化，得到产物分子1。
4.权利要求1所述化合物在制备于MV4-11细胞中对BRD4选择性降解药物中的应用。
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