CN113181222A - 一株隐球酵母的胞外多糖代谢产物在抗病毒上的应用 - Google Patents

一株隐球酵母的胞外多糖代谢产物在抗病毒上的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株隐球酵母的胞外多糖代谢产物在抗病毒上的应用，属于生物技术领域。本发明发现保藏编号为CCTCC NO：M 2018911的隐球酵母(Cryptococcus heimaeyensis)S20菌株的胞外多糖对口蹄疫病毒、冠状病毒和流感病毒都具有明显的抑制作用，且对细胞无明显毒性作用，其可用于制备抗病毒药物。本发明为探寻抗病毒药物开拓了新思路及新研究领域。

Description

一株隐球酵母的胞外多糖代谢产物在抗病毒上的应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一株隐球酵母(Cryptococcusheimaeyensis)S20菌株的胞外多糖代谢产物在抗病毒上的应用。
背景技术
胞外多糖(Exopolysaccharide，EPS)是生物的一级或次级代谢产物，是分泌到体外周边环境中的由碳水化合物残基组成的高分子聚合物，其分子量大小在500到2000kDa不等。胞外多糖具有很多生物活性，可以作为微生物的细胞聚集中心，可以作为营养物质为微生物提供营养，同时还可以保护细胞抵抗严峻的外界环境等。近年的研究发现细菌胞外多糖还具有抗氧化、抗辐射、免疫调节、降血糖、降血脂，以及抗肿瘤、抗肝炎病毒等特殊的生物学活性。
近年来，随着上世纪50年代真菌的胞外多糖被发现具有抗病毒活性以来，研究微生物胞外多糖的抗病毒作用越来越多。胞外多糖的抗病毒作用一般是通过抑制病毒的吸附、刺激白细胞产生干扰素或者激活巨噬细胞等方式来发挥作用的。Raposo等发现蓝藻多糖上面糖蛋白的碱性氨基酸可以与包膜病毒阴离子基团之间发生相互作用，从而对包膜病毒具有较强的抑制作用[Raposo M F,de Morais A M,de Morais R M.2014,101(1-2):56-63.]。Witvrouw等人发现硫酸化多糖的葡萄糖醛酸的羟基还原为葡萄糖后可以使病毒活性消失，其抗病毒活性与分子量和硫酸化程度有关[Witvrouw M,de Clercq E.1997,29:497-511.]。Yu等研究证明，泰山马尾松花粉多糖(TPPPS)是一种从泰山马尾松花粉中提取的天然多糖，通过测试显示TPPPS可能通过与ALV-J的糖蛋白85蛋白相互作用，从而抑制病毒对宿主细胞的吸附[Yu.C,Wei K,Liu L,et al.2017,7:44353.]。大量的研究表明，胞外多糖具有增强免疫力、抗病毒的功效，研制效果好、毒性低的抗病毒多糖药物，对于病毒防控与治疗具有重大意义。
隐球酵母可以定植在南极以及冰岛等寒冷地区的土壤中，它们通常可以在土壤环境中建立生长优势，有利于促进土壤聚合物的形成。隐球酵母因为生活在南极、冰岛等寒冷地区，该属的酵母通过产生胞外多糖等方式来适应寒冷的环境。目前关于该属多糖的研究主要集中在条件致病菌新型隐球酵母(Cryptococcus neoformans)和罗伦隐球酵母(Cryptococcus laurentii)的荚膜多糖的结构和提取条件优化等方面上。Cryptococcusneoformans的主要多糖组成是甘露糖(78.87％)、葡萄糖(7.75％)和木糖(10.9％)，Cryptococcus laurentii的主要多糖组成是木糖(45.2％)、甘露糖(33.6％)和葡萄糖(18.4％)[Susana F,Leonardo N,Nathan B,et al.2007,7:2.]。
对隐球酵母的代谢产物，尤其是其胞外多糖的抗病毒方面的研究属于首次。
发明内容
本发明的目的在于提供一株隐球酵母(Cryptococcus heimaeyensis)S20菌株的胞外多糖代谢产物在抗病毒上的应用，为探寻抗病毒药物开拓了新思路及新研究领域。
为了达到上述目的，本发明采取的技术方案为：
隐球酵母(Cryptococcus heimaeyensis)S20菌株从南极土壤中分离获得，该菌株现保存于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO：M 2018911。隐球酵母S20菌株的胞外代谢产物经过分离纯化，得到一种含量较高的中性糖(EPS0)和三种含量相对较低的酸性多糖(EPS1、2、3)，现已发现该菌株的胞外多糖具有广泛的抗肿瘤活性(ZL201910211986.X，一株隐球酵母及其胞外多糖与应用)。
本发明进一步研究发现隐球酵母S20菌株的胞外多糖对多种病毒均具有明显的抑制作用。
基于此，本发明的目的之一是提供隐球酵母S20菌株或其胞外多糖具有制备抗病毒药物的应用。
本发明的目的之二是提供一种包含隐球酵母S20菌株胞外多糖的抗病毒药物。
进一步地，所述的抗病毒药物还包含药学上可接受的载体、助剂和/或赋形剂。
进一步地，所述的病毒包括口蹄疫病毒、冠状病毒、流感病毒等。
本发明的优点和有益效果：本发明发现了隐球酵母S20菌株胞外多糖具有抗病毒的新功能，其对口蹄疫病毒、冠状病毒、流感病毒等病毒有明显的抑制作用，且对细胞无明显毒性作用，可用于制备抗病毒药物。
附图说明
图1是不同浓度隐球酵母粗多糖抗口蹄疫病毒效果的光学显微镜图，其中，a、b、c、d的多糖浓度分别为0、62.5、125、250μg/mL。
图2是免疫印迹实验检测不同浓度隐球酵母粗多糖对口蹄疫病毒抑制作用的结果图。
图3是不同浓度隐球酵母粗多糖抗冠状病毒效果的光学显微镜图，其中，a、b、c、d的多糖浓度分别为0、62.5、125、250μg/mL。
图4是实时荧光定量PCR检测不同浓度隐球酵母粗多糖对冠状病毒抑制作用的结果图。
图5是不同浓度隐球酵母粗多糖抗流感病毒效果的光学显微镜图，其中，a、b、c、d的多糖浓度分别为0、62.5、125、250μg/mL。
图6是实时荧光定量PCR检测不同浓度隐球酵母粗多糖对流感病毒抑制作用的结果图。
具体实施方式
以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1隐球酵母S20菌株胞外多糖的提取
(1)将5mL生长至对数期的酵母接种到盛有300mL YM培养基的锥形瓶中，置于180rpm/min的20℃摇床中培养4-5天。
(2)将菌悬液12000rpm/min离心10min，去掉沉淀，取上清，加入3倍体积的无水乙醇，混匀后，置于4℃下静置24h。
(3)取出混合液，一般多糖呈絮状或者沉淀在底部，缓慢倒去大部分上清溶液，将下层液体离心去上清，获得的沉淀即是粗多糖。
实施例2隐球酵母S20菌株胞外多糖的细胞毒性和抗病毒检测
1、材料
根据隐球酵母粗多糖溶解情况，用细胞培养液溶解样品并用0.22μm滤膜过滤除菌，分别配成含有1000、500、250、125、62.5、32.5μg/mL的隐球酵母粗多糖溶液。
细胞株：乳仓鼠肾细胞BHK-21、人正常胚肺成纤维细胞MRC-5、牛肾细胞MDCK。
病毒：O型口蹄疫病毒Akesu/58/2002、冠状病毒HCoV-OC43 VR-1558、流感病毒H1N1VR-95。
2、实验
(1)细胞毒性实验
乳仓鼠肾细胞、人正常胚肺成纤维细胞和牛肾细胞于37℃、5％CO2及饱和湿度环境下培养于含10％胎牛血清的完全培养基，细胞呈对数增长时铺板，调整细胞浓度至5000个/孔接种100μL于96孔培养板。37℃培养24h后，待细胞贴壁生长后，去掉上清液，加入不同浓度的隐球酵母粗多糖溶液100μL。在加药后24h、48h、72h每孔分别加入10μL CCK8(CellCounting Kit-8，MCE，货号HY-K0301-100T)，孵育1h后检测吸光度值，计算隐球酵母S20胞外多糖(EPS)对不同细胞的抑制率。
细胞生长抑制率(％)＝100％-细胞存活率(％)，
细胞存活率(％)＝(加EPS孔的OD值-空白孔的OD值)/(未加EPS对照孔的OD值-空白孔的OD值)×100％。
(2)病毒抑制实验
乳仓鼠肾细胞、人正常胚肺成纤维细胞和牛肾细胞于37℃、5％CO2及饱和湿度环境下培养于含10％胎牛血清的完全培养基，细胞呈对数增长时铺板，调整细胞浓度至30000个/孔接种1mL于12孔培养板。37℃培养24h后，待细胞贴壁生长后，分别用口蹄疫病毒感染乳仓鼠肾细胞、冠状病毒感染人正常胚肺成纤维细胞、流感病毒感染牛肾细胞，感染稀释度为10-4的病毒液1h，去掉病毒液，加入不同浓度的隐球酵母粗多糖溶液1mL，18h后，通过相差显微镜观察细胞是否发生病变；收集细胞，加入裂解液，提取RNA和蛋白质，分别通过荧光定量PCR和免疫印迹实验检测不同浓度隐球酵母S20胞外多糖(EPS)对病毒的抑制作用。
3、结果
(1)不同浓度隐球酵母粗多糖对乳仓鼠肾细胞BHK-21的细胞毒性比较低。当浓度达到125μg/mL时抑制率也仅有12.44％，具体见表1。
表1不同浓度隐球酵母粗多糖对乳仓鼠肾细胞BHK-21的细胞毒性
Figure BDA0003039316550000041
不同浓度隐球酵母粗多糖对口蹄疫病毒(FMDV)的抑制作用效果明显，具体见表2。
表2不同浓度隐球酵母粗多糖对口蹄疫病毒的抑制作用
Figure BDA0003039316550000042
光学显微镜图片表明隐球酵母S20胞外多糖对口蹄疫病毒的抑制效果明显，具体见图1。
免疫印迹实验(Western blotting experiment)同样表明隐球酵母S20胞外多糖具有较强的抗口蹄疫病毒的作用，见图2。
(2)不同浓度隐球酵母粗多糖对人正常胚肺成纤维细胞MRC-5的细胞毒性较低。当多糖浓度达到500μg/mL时，对细胞的抑制率也仅有24.46％，具体见表3。
表3不同浓度隐球酵母粗多糖对肺胚成纤维细胞MRC-5的细胞毒性
Figure BDA0003039316550000043
不同浓度隐球酵母粗多糖对冠状病毒的抑制作用效果明显，具体见表4。
表4不同浓度隐球酵母粗多糖对冠状病毒的抑制作用
Figure BDA0003039316550000051
光学显微镜图片表明隐球酵母S20胞外多糖对冠状病毒的抑制效果明显，具体见图3。
实时荧光定量PCR(Quantitive Real-time PCR)同样表明隐球酵母S20胞外多糖具有较强的抗冠状病毒的作用，见图4。其中，实时荧光定量PCR所用引物序列如下：
HCoV-OC43 FP：AGCGTGGTTTTCTTGACAGG，
HCoV-OC43 RP：TCTCAACAATGCGGTGTCCA；
GAPDH FP：AAGGCCATCACCATCTTCCA，
GAPDH RP：GCCAGTAGACTCCACAACATAC。
(3)不同浓度隐球酵母粗多糖对牛肾细胞MDCK的细胞毒性较低。当多糖浓度达到500μg/mL时，对细胞的抑制率也仅有24.46％，具体见表5。
表5不同浓度隐球酵母粗多糖对牛肾细胞MDCK的细胞毒性
Figure BDA0003039316550000052
不同浓度隐球酵母粗多糖对流感病毒的抑制作用效果明显，具体见表6。
表6不同浓度隐球酵母粗多糖对流感病毒的抑制作用
Figure BDA0003039316550000053
光学显微镜图片表明隐球酵母S20胞外多糖对流感病毒的抑制效果明显，具体见图5。
实时荧光定量PCR(Quantitive Real-time PCR)同样表明EPS具有较强的抗流感病毒的作用，见图6。其中，实时荧光定量PCR所用引物序列如下：
H1N1 FP：CCGGCCATGGGTGTCTTTC，
H1N1 RP：TCCCTTTACTCCGTTTGCTCCATC；
GAPDH FP：AAGGCCATCACCATCTTCCA，
GAPDH RP：GCCAGTAGACTCCACAACATAC。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 武汉大学
<120> 一株隐球酵母的胞外多糖代谢产物在抗病毒上的应用
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
agcgtggttt tcttgacagg 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tctcaacaat gcggtgtcca 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
aaggccatca ccatcttcca 20
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gccagtagac tccacaacat ac 22
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ccggccatgg gtgtctttc 19
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tccctttact ccgtttgctc catc 24

Claims (6)

1.一株隐球酵母在制备抗病毒药物中的应用，其特征在于：所述的隐球酵母为保藏编号为CCTCC NO：M 2018911的隐球酵母(Cryptococcus heimaeyensis)S20。
2.一种胞外多糖在制备抗病毒药物中的应用，其特征在于：所述的胞外多糖为保藏编号为CCTCC NO：M 2018911的隐球酵母S20的胞外多糖。
3.一种抗病毒药物，其特征在于：包含保藏编号为CCTCC NO：M 2018911的隐球酵母S20的胞外多糖。
4.根据权利要求3所述的抗病毒药物，其特征在于：还包含药学上可接受的载体、助剂和/或赋形剂。
5.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述的病毒包括口蹄疫病毒、冠状病毒、流感病毒。
6.根据权利要求3或4所述的抗病毒药物，其特征在于：所述的病毒包括口蹄疫病毒、冠状病毒、流感病毒。
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