CN106474476A - 一种采用虫草多糖制备的抗病毒生物制剂及其生产工艺 - Google Patents

一种采用虫草多糖制备的抗病毒生物制剂及其生产工艺 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种采用虫草多糖制备的抗病毒生物制剂及其生产工艺，所述的生物制剂抗病毒活性达3.45×103～6.22×104 IU/mL；所述抗病毒生物制剂的生产工艺，包括枯草杆菌活化、菌种扩培、发酵、制得生物制剂步骤。所述的发酵步骤：采用的发酵培养基包括以下组分：15～25g/L虫草多糖、8～16g/L蛋白胨、4～12g/L谷朊粉、0.5～2g/L磷酸铁、水不足余量。本发明生物制剂的抗病毒本发明生物制剂的抗病毒活性高且稳定性好。

Description

一种采用虫草多糖制备的抗病毒生物制剂及其生产工艺
技术领域
本发明涉及一种生物制剂及其生产工艺，具体地说，涉及一种采用虫草多糖制备的抗病毒生物制剂及其生产工艺，属于生物发酵工程技术领域。
背景技术
近年来，传染病的发生与流行已成为阻碍我国畜牧业快速发展的重要因素，而禽类病毒性传染病是制约家禽养殖业发展的重要因素之一，目前国内外应用于禽类病毒病的化学药物主要是金刚烷胺和利巴韦林制剂，临床疗效不确切，而且存在如残留、影响蛋禽产蛋率恢复等毒副作用。治疗手段和方法的缺乏、化药残留较为严重以及人类对畜禽产品食用安全的高度关注，近年来业界一直关注兽用抗病毒药物的研发。
虫草多糖是一种甘露聚糖，主要由α-糖苷键连接的天然真菌多糖，具有广谱的生物学活性和功能，在整体水平上主要通过激活机体的免疫系统，诱导细胞因子的产生，显示抑制病毒的吸附活性。虫草多糖对病毒感染有体外灭活、治疗和综合阻断作用，对病毒感染预防有一定的效果。
硫酸酯化多糖是多糖的硫酸化衍生物，硫酸根阴离子是抗病毒活性的必需基团。许多研究证实，硫酸化多糖比未进行硫酸化修饰的多糖具有更强的抗病毒等生物学活性。但目前对硫酸化多糖的研究尚有很多不足之处，硫酸基团取代度、分子质量、硫酸基团的位置以及多糖的分支结构等都影响修饰多糖活性，使其抗病毒活性并不理想。
现有技术具有以下缺陷：虫草多糖以及虫草多糖衍生物的抗病毒活性较低。
发明内容
本发明针对以上不足，本发明提供一种采用虫草多糖制备的抗病毒生物制剂及其生产工艺，利用发酵工艺形成生物制剂提高抗病毒活性，实现以下发明目的：
提高虫草多糖制备的生物制剂的抗病毒活性。
为解决上述技术问题，本发明采取的技术方案如下：
一种采用虫草多糖制备的抗病毒生物制剂，所述的生物制剂抗病毒活性达3.45×103～6.22×104 IU/mL。
以下是对上述技术方案的进一步改进：
一种采用虫草多糖制备的抗病毒生物制剂的生产工艺：
包括枯草杆菌活化、菌种扩培、发酵、制得生物制剂步骤。
所述的发酵步骤：采用的发酵培养基的组分包括虫草多糖。
所述的发酵步骤：采用的发酵培养基包括以下组分：15～25g/L虫草多糖、8～16g/L蛋白胨、4～12g/L谷朊粉、0.5～2g/L磷酸铁、水不足余量。
所述发酵培养基包括以下组分：20 g/L虫草多糖、12 g/L蛋白胨、12g/L谷朊粉、0.5 g/L磷酸铁、水不足余量。
所述的发酵步骤：发酵温度为28～34℃，发酵液pH为6～7.5，发酵转速120～240r/min，发酵时间为16～28h。
所述的发酵步骤：发酵温度为32℃，发酵液pH为6.5，发酵转速为240 r/min，发酵时间为24 h。
所述的菌种扩培步骤：在36～38℃恒温振荡培养18～22h，转速为200～220rpm。
所述的制得生物制剂：在10000～11000rpm条件下离心分离8～10min，得到上清液，经0.22μm滤器过滤，得到生物制剂。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
1、本发明生物制剂的抗病毒活性较虫草多糖提高103～1863倍，其抗病毒活性达到3.45×103～6.26×104 IU/mL；
2、本发明生物制剂的抗病毒活性稳定性高，存放12个月后产品活性基本没有损失；
3、本发明生物制剂可有效预防禽类的病毒性疾病，有效保护率达到100%；
4、本发明生物制剂对治疗禽类传染性喉气管炎的有效率为96.7%；
5、本发明制备生物制剂的方法环保无毒；
6、本发明制备生物制剂的方法工艺简单，原材料成本低廉，而且全发酵过程可控，不受外部环境条件限制，适合工业化生产及推广应用。
具体实施方式
实施例中所述的枯草芽孢杆菌发酵菌种，购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，菌种保藏号CICC10071。
实施例1 一种采用虫草多糖制备抗病毒生物制剂的工艺
步骤1 枯草芽孢杆菌活化
用接种环将-80℃保存的枯草芽抱杆菌接种于固体YPD培养基上，37℃培养24h进行活化。
所述YPD固体培养基的组分如下：葡萄糖20 g/L、酵母粉10 g/L、蛋白胨20 g/L、琼脂20 g/L、去离子水补足余量。
步骤2 菌种扩培
从平板上挑取一环活化后的枯草芽抱杆菌接种于装有菌种扩培培养基的250mL的锥形瓶中，每个锥形瓶内装有菌种扩培培养基50mL，在37℃恒温振荡培养20h，转速为200rpm，得到种子液。
其中所述菌种扩培培养基组成如下：以去离子水为介质，葡萄糖20 g/L、酵母粉10g/L、蛋白胨20 g/L。
步骤3发酵
1）制备发酵培养基
所述发酵培养基包括以下的组分：虫草多糖10g/L、葡萄糖10g/L、蛋白胨12g/L、尿素8g/L、氯化铁0.5g/L、磷酸氢二钾0.5g/L、去离子水补足余量；
所述的虫草多糖：纯度为90%；
按培养基配方称取各组分，混合并搅拌均匀，115℃条件下灭菌30min；
2）制备发酵液
将发酵液pH调节至7.0，将种子液接种于摇瓶中，接种比例为体积比1：10；摇瓶的容积为1L；摇瓶的装液量为200mL，即：装液量为摇瓶容积的1/5。
在发酵温度30℃、转速200rpm条件下发酵培养24h，得到发酵液。
步骤4制得生物制剂
取步骤3制得的发酵液，10000rpm条件下离心分离10min，得到菌体和上清液，将上清液经0.22μm滤器过滤，得到的滤液即为生物制剂产品。
结果检测：
对照组1：未经发酵的虫草多糖溶液，浓度为10g/L。
对照组2：生物制剂的制备方法与实施例1相同，只改变发酵步骤中的发酵培养基为：
发酵培养基：葡萄糖20g/L、蛋白胨12g/L、尿素8 g/L、氯化铁0.5g/L、磷酸氢二钾0.5g/L、去离子水补足余量；
检测结果见表1；
表1生物制剂的抗病毒活性
由表1可知，采用本实施例发酵方法制备生物制剂的抗病毒活性为3.45×103IU/mL，生物制剂的抗病毒活性较虫草多糖提高103倍。
本发明采用细胞病变抑制法的CEF/VSV系统检测生物制剂的抗病毒活性，进而计算出样品的效价，参照《中华人民共和国药典》2005年版。
实施例2 发酵培养基的碳源单因素分析实验
采用实施例1的方法制备生物制剂，只改变发酵步骤中发酵培养基的碳源进行实施例2-6；实施例1采用的发酵培养基的碳源为：10/L虫草多糖、10 g/L葡萄糖；
实施例2-6采用的发酵培养基的碳源，见表2；
表2 实施例2-6采用的发酵培养基的碳源
经检测，实施例1-6制备的生物制剂的抗病毒活性见表3；
表3 实施例1-6制备的生物制剂的抗病毒活性
由表2、3可知，实施例2为优选实施例；发酵培养基的碳源对生物制剂的抗病毒活性影响较大，碳源优选为20g/L虫草多糖。
实施例7发酵培养基的氮源单因素分析实验
采用实施例1的方法制备生物制剂，只改变发酵步骤中发酵培养基的氮源进行实施例7-16；实施例1的发酵培养基的氮源为：12 g/L蛋白胨、8 g/L尿素；
实施例7-16采用的发酵培养基的氮源，见表4；
表4 实施例7-16采用的发酵培养基的氮源
经检测，实施例7-16制备的生物制剂的抗病毒活性见表5；
表5 实施例7-16制备的生物制剂的抗病毒活性
由表4、5可知，实施例13为优选实施例；发酵培养基的氮源优选为12 g/L蛋白胨、8 g/L谷朊粉。
实施例17发酵培养基的无机盐单因素分析实验
采用实施例1的方法制备生物制剂，只改变发酵步骤中发酵培养基的无机盐进行实施例17-23；实施例1的发酵培养基的无机盐为0.5g/L氯化铁、0.5g/L磷酸氢二钾；
实施例17-23采用的发酵培养基的无机盐，见表6；
表6 实施例17-23采用的发酵培养基的无机盐
经检测，实施例17-23制备的生物制剂的抗病毒活性见表7；
表7 实施例17-23制备的生物制剂的抗病毒活性
由表6、7可知，实施例19为优选实施例；发酵培养基的无机盐优选为1g/L磷酸铁。
实施例24 一种采用虫草多糖制备抗病毒生物制剂的工艺
步骤1 枯草芽孢杆菌活化
步骤2种子液培养
步骤1、2的操作方法与实施例1相同。
步骤3发酵
1）制备发酵培养基
所述发酵培养基包括以下的组分：虫草多糖20g/L、蛋白胨12 g/L 、谷朊粉8 g/L、磷酸铁1g/L、去离子水补足余量；
所述的虫草多糖：纯度为90%；
按培养基配方称取各组分，混合并搅拌均匀，115℃条件下灭菌30min；
2）制备发酵液
将发酵液pH调节至7.0，将种子液接种于摇瓶中，接种比例为体积比1：10；摇瓶的容积为1L；摇瓶的装液量为200mL，即：装液量为摇瓶容积的1/5。
在发酵温度30℃、转速200rpm条件下发酵培养24h，得到发酵液。
步骤4制得生物制剂
取步骤3制得的发酵液，10000rpm条件下离心分离10min，得到菌体和上清液，将上清液经0.22μm滤器过滤，得到的滤液即为生物制剂产品。
经检测，生物制剂产品的抗病毒活性为7.89×103 IU/mL
实施例25 发酵培养基各组分含量的正交试验
采用实施例24的工艺制备抗病毒生物制剂，只改变发酵步骤中发酵培养基各组分的含量，进行正交试验，正交试验因素水平见表8，正交试验结果见表9；
表8 正交试验因素水平表
表9正交试验结果与分析
从表8、9中的数据可以知道，生物制剂活性的4个影响因素中影响程度由大到小为虫草多糖＞谷朊粉＞蛋白胨＞磷酸铁；经试验，发酵培养基各组分的含量优选为20 g/L虫草多糖、12 g/L蛋白胨、12g/L谷朊粉、0.5 g/L磷酸铁；
在此条件下制备生物制剂的活性为：2.25×104 IU/mL，生物制剂的抗病毒活性较虫草多糖提高670倍。
实施例26制备发酵液的条件的正交试验
采用实施例24的工艺制备抗病毒生物制剂，只改变发酵步骤中制备发酵液的条件，进行正交试验，正交试验因素水平见表10，正交试验结果见表11；
表10正交试验因素水平表
表11正交试验结果与分析
从表10、11中的数据可以知道，生物制剂活性的5个影响因素中影响程度由大到小为发酵温度＞发酵时间＞发酵液pH＞发酵转速＞装液量；
经试验，发酵步骤中制备发酵液的条件优选为：发酵温度32℃，发酵液pH为6.5，发酵转速240 r/min，发酵时间为24 h，装液量为150 mL；在此条件下制备的生物制剂活性为：4.25×104 IU/mL，生物制剂的抗病毒活性较未发酵的虫草多糖提高1265倍。
实施例27 一种采用虫草多糖制备抗病毒生物制剂的工艺
步骤1 枯草芽孢杆菌活化
步骤2种子液培养
步骤1、2的操作方法与实施例1相同。
步骤3发酵
1）制备发酵培养基
所述发酵培养基包括以下的组分：虫草多糖20 g/L、蛋白胨12 g/L、谷朊粉12 g/L、磷酸铁0.5 g/L、去离子水补足余量；
所述的虫草多糖：纯度为90%；
按培养基配方称取各组分，混合并搅拌均匀，115℃条件下灭菌30min；
2）制备发酵液
将发酵液pH调节至6.5，将种子液接种于摇瓶中，接种比例为体积比1：10；摇瓶的容积为10L；摇瓶的装液量为150mL，即：装液量为摇瓶容积的3/20;
在发酵温度32℃、转速240 rpm条件下发酵培养24h，得到发酵液。
步骤4制得生物制剂
取步骤3制得的发酵液，10000rpm条件下离心分离10min，得到菌体和上清液，将上清液经0.22μm滤器过滤，得到的滤液即为生物制剂产品。
本实施例制备的生物制剂活性为：6.26×104 IU/mL，生物制剂的抗病毒活性较未发酵的虫草多糖提高1863倍。
对本发明生物制剂抗病毒稳定性进行测定，取生物制剂样品分别存放3、6、9、12个月，并检测其抗病毒活性，检测结果见表12；
表12生物制剂的稳定性
从表12可见，本发明方法制备的生物制剂不但具备较强的抗病毒活性，而且稳定性好，存放12个月后生物制剂效价仍能达到为6.22×104 IU/mL。
抗病毒生物制剂对健康鸡的影响实验：
选择13日龄、健康的不带病原体的鸡，随机分成三组，即对照组A、对照组B、试验组C；每组30只，每组设三个重复组；
对照组A：给予正常的饮用水，不加生物制剂，连续饮用7天；
对照组B：给予含虫草多糖的饮用水，将浓度为0.5%的虫草多糖与水按1：20的体积比混合；现配现用，在0.5h～1.5h内饮完，连续饮用7天；
试验组C：给予含生物制剂的饮用水，将本发明生物制剂与水按1：20的体积比混合，现配现用，最好控制在0.5h～1.5h内饮完，连续饮用7天；
三组鸡在同一条件下饲养，控制鸡舍温度28-31℃，鸡舍湿度58-62%。每日向各个鸡舍提供等量的足量饲料和水；
饲养第3天开始，三组动物统一投喂等量含禽流感病毒的饲料，含病毒饲料的投喂量占饲料总量的1/2；三组动物的饮水方式如上述进行，每天记录每组鸡发病情况，具体见表13；
表13 每组鸡的发病情况
如表13所示，对照组A鸡的发病率为100%，累计死亡率为80%，对照组B鸡的发病率为99%，累计死亡率为76.7%；而实验组C鸡没有发病和死亡，说明本发明生物制剂对预防鸡禽流感病毒性疾病的有效保护率达到100%。
抗病毒生物制剂对患病鸡的影响实验：
选择5日龄、患有初期（感染1天内）传染性喉气管炎的5日龄鸡，随机分成三组，分别为对照组1、对照组2、试验组3；每组20只，每组设三个重复组；
对照组1：给予正常的饮用水，不加生物制剂；
对照组2：给予含虫草多糖的饮用水，将浓度为0.5%的虫草多糖与水按1：20的体积比混合；现配现用，在0.5h～1.5h内饮完，连续饮用7天；
试验组3：给予含生物制剂的饮用水，将本发明生物制剂与水按1：20的体积比混合，现配现用，最好控制在0.5h～1.5h内饮完，连续饮用7天。
组鸡在同一条件下饲养，控制鸡舍温度29-32℃，鸡舍湿度55-60%；每日向各个鸡舍提供等量的足量饲料和水；
三组动物的饮水方式如上述进行，每天记录每组鸡发病情况，具体见表14；
表14 每组鸡的发病情况
如表14所示，对照组1和对照组2鸡的累计死亡率分别达到93.5%和63.3%，实验组3的累计死亡率为3.3%，表明本发明生物制剂具有较强的抗病毒治疗作用，有效的降低死亡率，对治疗鸡传染性喉气管炎的有效率为96.7%。
实施例28 一种采用虫草多糖制备抗病毒生物制剂的工艺
步骤1 枯草芽孢杆菌活化
步骤2种子液培养
步骤1、2的操作方法与实施例1相同。
步骤3发酵
1）制备发酵培养基
所述发酵培养基包括以下的组分：虫草多糖20 g/L、蛋白胨12 g/L、谷朊粉12 g/L、磷酸铁0.5 g/L、维生素B7 0.1 g/L、组氨酸 0.1 g/L、去离子水补足余量；
所述的虫草多糖：纯度为90%；
按培养基配方称取各组分，混合并搅拌均匀，115℃条件下灭菌30min；
2）制备发酵液
将发酵液pH调节至6.5，将种子液接种于摇瓶中，接种比例为体积比1：10；摇瓶的容积为10L；摇瓶的装液量为150mL，即：装液量为摇瓶容积的3/20;
在发酵温度32℃、转速240 rpm条件下发酵培养24h，得到发酵液。
步骤4制得生物制剂
取步骤3制得的发酵液，10000rpm条件下离心分离10min，得到菌体和上清液，将上清液经0.22μm滤器过滤，得到的滤液即为生物制剂产品。
本实施例制备的生物制剂活性为：6.26×104 IU/mL，生物制剂的抗病毒活性较未发酵的虫草多糖提高1863倍。
对本发明生物制剂抗病毒稳定性进行测定，取生物制剂样品分别存放3、6、9、12个月，并检测其抗病毒活性，检测结果见表15；
表15生物制剂的稳定性
从表15可见，本发明方法制备的生物制剂不但具备较强的抗病毒活性，而且稳定性好，存放12个月后生物制剂效价仍能达到为6.26×104 IU/mL。
经试验，本发明生物制剂对禽类无任何副作用。
除特殊说明的外，本发明所述的百分数均为质量百分数。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种采用虫草多糖制备的抗病毒生物制剂，其特征在于：所述的生物制剂抗病毒活性达3.45×103～6.22×104 IU/mL。
2.根据权利要求1所述的一种采用虫草多糖制备的抗病毒生物制剂的生产工艺，其特征在于：包括枯草杆菌活化、菌种扩培、发酵、制得生物制剂步骤。
3.根据权利要求2所述的一种采用虫草多糖制备的抗病毒生物制剂的生产工艺，其特征在于：所述的发酵步骤：采用的发酵培养基的组分包括虫草多糖。
4.根据权利要求2所述的一种采用虫草多糖制备的抗病毒生物制剂的生产工艺，其特征在于：所述的发酵步骤：采用的发酵培养基包括以下组分：15～25g/L虫草多糖、8～16g/L蛋白胨、4～12g/L谷朊粉、0.5～2g/L磷酸铁、水不足余量。
5.根据权利要求4所述的一种采用虫草多糖制备的抗病毒生物制剂的生产工艺，其特征在于：所述发酵培养基包括以下组分：20 g/L虫草多糖、12 g/L蛋白胨、12g/L谷朊粉、0.5g/L磷酸铁、水不足余量。
6.根据权利要求2所述的一种采用虫草多糖制备的抗病毒生物制剂的生产工艺，其特征在于：所述的发酵步骤：发酵温度为28～34℃，发酵液pH为6～7.5，发酵转速120～240 r/min，发酵时间为16～28h。
7.根据权利要求6所述的一种采用虫草多糖制备的抗病毒生物制剂的生产工艺，其特征在于：所述的发酵步骤：发酵温度为32℃，发酵液pH为6.5，发酵转速为240 r/min，发酵时间为24 h。
8.根据权利要求2所述的一种采用虫草多糖制备的抗病毒生物制剂的生产工艺，其特征在于：所述的菌种扩培步骤：在36～38℃恒温振荡培养18～22h，转速为200～220rpm。
9.根据权利要求2所述的一种采用虫草多糖制备的抗病毒生物制剂的生产工艺，其特征在于：所述的制得生物制剂：在10000～11000rpm条件下离心分离8～10min，得到上清液，经0.22μm滤器过滤，得到生物制剂。
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方尚瑜，等: "碳氮源对液体培养蛹虫草生物合成虫草多糖的影响", 《食品科学》 *

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