CN113176352A - 丁苯吗啉对映体拆分及在农产品中的残留分析方法 - Google Patents

丁苯吗啉对映体拆分及在农产品中的残留分析方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了丁苯吗啉对映体拆分及在农产品中的残留分析方法，拆分步骤为：1）配制丁苯吗啉消旋体溶液；2）丁苯吗啉外消旋体的分离及确证。该拆分能有效分离丁苯吗啉手性对映单体，具有分离单体纯度高、制备量大的特点，可用于单体的活性、毒性以及残留代谢分析研究。手性农药残留分析方法包括：1）样品提取净化；2）采用C‑3色谱柱梯度洗脱分离，进行超高效液相色谱串联质谱检测丁苯吗啉对映体；3）计算不同基质溶液中丁苯吗啉对映体的标准曲线和线性相关系数；4）计算添加回收率、相对标准偏差、方法的检测限和定量限。该残留分析方法满足残留分析要求，能够为茶叶等农产品中丁苯吗啉对映体残留的研究检测提供分析方法。

Description

丁苯吗啉对映体拆分及在农产品中的残留分析方法
技术领域
本发明属于手性化合物对映体拆分和茶叶等农产品中农药残留分析技术领域，具体涉及一种丁苯吗啉对映体的拆分制备和其在茶叶等农产品中的残留分析方法。
背景技术
丁苯吗啉(fenpropimorph，(±)-cis-4-[3-(4-tert-butylphenyl)-2 -methylpropyl]-2,6-dimethylmorpholine,C20H33NO,CAS No. 67564-91-4)是1979年首次由K.Bohnen和A.Pfiffner报道，巴斯夫公司在1983年德国上市的一种具有保护、内吸和防治作用的吗啉类杀菌剂和麦角甾醇还原抑制剂，用于防治谷物、豆类和甜菜等作物苗期重要病害，如锈病、白粉病、棉花立枯病、谷类黑穗病等。丁苯吗啉化学结构独特，尽管其结构中有3个手性碳中心，但是其吗啉环上的两个甲基具有顺式构型，因此，丁苯吗啉只有一个不对称碳中心(式中*标记位置)，具有一对手性对映体，结构式如下：
Figure BDA0003014003600000011
英文通用名：fenpropimorph；
CAS登录号：67306-03-0，67564-91-4；
分子式：C20H33NO；
英文化学名称：
(±)-cis-4-[3-(4-tert-butylphenyl)-2-methylpropyl]-2,6-dimethylmorpholine；
中文化学名称：
(±)顺-4-(3-(4-特丁基苯基)-2-甲基丙基)-2,6-二甲基吗啉；
丁苯吗啉的ADI值为0.003mg/kg bw(GB 2763-2019)和0.004 mg/kg bw(JMPR2016)，ARfD值为0.1mg/kg bw(育龄女士)和0.4 mg/kg bw(一般人士)(JMPR 2016)。
丁苯吗啉理化性质：纯品为无色油状液体，具有芳香味。沸点 120℃，蒸气压2.3×10-3Pa(20℃)，相对密度0.931(20℃)，折射率 n20 D1.4940，闪点105℃。25℃时，在丙酮、氯仿、环己烷、乙醚、乙醇、乙酸乙酯、甲苯等有机溶剂中的溶解度均>1kg/kg。在水中的溶解度为4.3mg/kg(pH＝7)。分配系数为11500，pKa7.02。对光稳定。在 pH值为3、7、9条件下，50℃时不水解。室温下密闭容器中稳定3 年以上。
目前针对丁苯吗啉的分析研究中都是集中在对其外消旋体进行的研究，如国内外对其外消旋体的检测方法有Method 137 (1978/10076),Method 156(1979/10088),Method241(87/10142), Method 241/1(1993/11464),Method 241/3(2000/1012400),Method456/0(2001/1000985),Method 535/1(2001/1039427))，定量限为 0.01-0.05mg/kg(JMPREvaluation，2017)；《食品安全国家标准食品中烯啶虫胺、呋虫胺等20种农药残留量的测定液相色谱-质谱/质谱法》(GB 23200.37-2016)适用于进出口大米、糙米、玉米、大麦和小麦等，检出限为0.005mg/kg；《粮谷中486种农药及相关化学品残留量的测定液相色谱-串联质谱法》(GB/T 20770-2008)适用于大麦、小麦、燕麦、大米、玉米，检出限为0.002～0.96mg/kg。但是分析检测方法均未涉及到对映体层面，也不清楚其R体或S体的杀菌活性差异、对有益生物的毒性以及在农产品和环境中的对映体残留差异，可能原因是无法获得单体样品以及没有专门针对对映体的残留分析方法。
发明内容
针对上述现有技术中存在的问题，本发明的目的在于设计提供一种丁苯吗啉对映体的拆分制备方法和其在茶叶等农产品中的残留分析方法。本发明方法从丁苯吗啉外消旋体中分离出其(+)-和(-)- 对映单体。在液相色谱方法下，采用合适的色谱柱和流动相、柱温、流速等条件，从而实现对映体拆分，并制备出单体化合物。得到的单体纯度高，有助于后续进行单体的活性、毒性及残留代谢分析研究。针对不同的样品基质，采用提取净化方法，得到外消旋体残留溶液，采用超高效液相色谱串联质谱法测定，用于不同样品中的残留量测定。
本发明通过以下技术方案加以实现：
所述的丁苯吗啉对映体拆分，其特征在于包括以下步骤：
1)丁苯吗啉外消旋体溶液的配制：称取丁苯吗啉外消旋体样品，采用甲醇或乙腈配制成丁苯吗啉外消旋体溶液，备用；
2)丁苯吗啉外消旋体的分离：以步骤1)配制的丁苯吗啉外消旋体溶液为标准溶液进样，利用液相色谱紫外检测器在一定的色谱条件下洗脱分离丁苯吗啉外消旋体，得到两个峰值，分别为丁苯吗啉外消旋体中的两个对映单体，同时在馏分收集器中收集丁苯吗啉手性单体馏分；
3)丁苯吗啉外消旋体两个单体的确证：以步骤1)配制的丁苯吗啉外消旋体溶液为标准溶液进样，利用液相色谱激光偏振仪检测器在一定的色谱条件下洗脱分离检测丁苯吗啉外消旋体，确定先流出的为(-)-丁苯吗啉，后流出的为(+)-丁苯吗啉。
所述的丁苯吗啉对映体拆分，其特征在于步骤1)中丁苯吗啉外消旋体溶液浓度为0.0025-10000mg L-1。
所述的丁苯吗啉对映体拆分，其特征在于步骤2和步骤3)中一定的色谱条件为采用Superchiral S-OJ色谱柱分离，色谱柱规格为 0.46cm I.D.×15cm L,5μm，流动相为甲醇/二乙胺，体积比为 100/0.05，流速0.80mL min-1，进样量20μL，柱温30℃，紫外检测器波长230nm，激光偏振仪检测器波长670nm。
所述的丁苯吗啉对映体在农产品中的残留分析方法，其特征在于包括以下步骤：
1)农产品样品的提取净化，将农产品样品采用酸化水溶液和乙腈混合提取，盐析后，C18、PSA和GCB分散固相萃取净化，浓缩后乙腈/水定容，用带质谱检测器的液相色谱仪基质外标法检测；
2)取权利要求1配制好的丁苯吗啉外消旋体溶液，分别用体积比4：6的乙腈/水稀释成混合标准溶液20mg/L，然后将步骤1)处理后农产品样品基质用体积比4:6的乙腈/水分别配制成5.0、2.50、 1.0、0.25、0.05、0.010和0.0025mg/L的基质标准溶液，对映单体浓度为一半，超高效液相色谱串联质谱仪UPLC-MS/MS进样分析，每个浓度测定3次，以浓度为横坐标x，峰面积平均值为纵坐标y，得到不同基质中丁苯吗啉对映体标准曲线和线性相关系数；
3)计算添加回收率、相对标准偏差、方法的检测限和定量限，满足残留分析要求；将按照步骤1)处理后的农产品实际样品中的丁苯吗啉对映体采用基质外标法计算残留量。
所述的丁苯吗啉对映体在产品中的残留分析方法，其特征在于步骤1)中农产品样品的提取净化的具体过程为：将农产品样品磨碎后称取2-10g至离心管中，加入10mL的2％甲酸水溶液，充分涡旋混匀后，再加入20mL乙腈，涡旋混匀后均质，再加入5gNaCl，涡旋混匀后均质再离心，吸取8mL上层溶液至装有0-100mg C18、0-100mg GCB 和0-100mg PSA的10mL离心管中，涡旋震荡净化1min后离心，过膜吸取上清液6mL于50mL鸡心瓶中，旋转浓缩干后，加入1.2mL体积比为4：6的乙腈/水超声辅助溶解定容，过0.22μm滤膜至进样瓶中， UPLC-MS/MS基质外标法定量待测。
所述的丁苯吗啉对映体在产品中的残留分析方法，其特征在于步骤2)中超高效液相色谱条件为：3μm×150mm×2mm
Figure BDA0003014003600000051
3μm Cellulose-3色谱柱；柱温50℃；进样量5μL；流速0.35mL/min；流动相A为5mmol/L乙酸铵水溶液，B为0.1％甲酸乙腈；梯度洗脱程序为：0-10.0min，16％-22％B；10.0-11.0min，22％-95％B，保持3min的95％B；14.0-14.2min，95％-16％B，随后保持1.8min的16％B，整个分析时间16min。
所述的丁苯吗啉对映体在产品中的残留分析方法，其特征在于步骤2)中质谱仪的质谱条件为：电喷雾正电离多反应检测模式 ESI+-MRM；电喷雾毛细管电压3.5kV；离子源温度150℃；脱溶剂气N2(99.5％)温度350℃，流速700L/h；锥孔反吹气N2流速50L/h；碰撞气Ar(99.995％)流速0.30mL/min；电子倍增器倍增电压700V；二级母离子驻留时间0.02s；丁苯吗啉对映体母离子m/z 304.2，锥孔电压30V，定量子离子m/z 147和定性子离子m/z 98，碰撞电压均为 30eV。
本发明提供了一种能有效分离、且具备制备一定规模的丁苯吗啉手性对映单体和茶叶等农产品中其对映体的残留分析方法。色谱柱采用手性固定相为纤维素-三(4-甲基苯甲酸酯)的涂覆型硅胶柱，流动相为甲醇、乙腈和水等，在特定的流动相流速和检测器等条件下对丁苯吗啉两个手性对映体达到有效分离，是国内外首次对丁苯吗啉手性对映体进行分离拆分制备及对茶叶等农产品中其对映体残留分析的方法。纯化后的获得的丁苯吗啉手性对映体单体，可用作对映体标样，用于对单体的活性、毒性以及残留代谢分析研究，单体制剂应用于田间，实现手性农药的增效减施，在化工和农业生产上具有广阔的应用前景。本发明具有分离获得丁苯吗啉单体纯度高、制备量大的特点。
本发明方法适用于茶叶等农产品中丁苯吗啉对映体残留分析，具有快速、灵敏、准确的特点，不同基质中丁苯吗啉对映体的标准曲线线性相关系数均在0.99以上，平均添加回收率在77.8％-112.0％，相对标准偏差小于16.7％，方法定量限小于等于0.0025mg/kg。本方法满足残留分析要求，能够为绿茶、干辣椒、小麦粉、豌豆和长叶莴苣等农产品中丁苯吗啉对映体的研究检测提供分析方法。
附图说明
图1为丁苯吗啉外消旋体(1000mg L-1)在液相色谱紫外检测器下的分离色谱图(Superchiral S-OJ柱，UV 230nm)；
图2为丁苯吗啉外消旋体(1000mg L-1)在液相色谱激光偏振仪检测器下的分离谱图(Superchiral S-OJ柱，ALPR 270nm)；
图3为(-)-丁苯吗啉单体(500mg L-1)在液相色谱紫外检测器下的谱图(Superchiral S-OJ柱，UV 230nm)；
图4为(+)-丁苯吗啉单体(500mg L-1)在液相色谱紫外检测器下的谱图(Superchiral S-OJ柱，UV 230nm)；
图5为丁苯吗啉外消旋体(1mg L-1)在超高效液相色谱串联质谱检测器下的分离谱图(
Figure BDA0003014003600000071
Cellulose-3柱)；
图6为(-)-丁苯吗啉单体(2.0mg L-1)在超高效液相色谱串联质谱检测器下的谱图(
Figure BDA0003014003600000072
Cellulose-3柱)；
图7为(+)-丁苯吗啉单体(2.0mg L-1)在超高效液相色谱串联质谱检测器下的谱图(
Figure BDA0003014003600000073
Cellulose-3柱)；
图8为干辣椒样品中丁苯吗啉外消旋体(0.0025mg L-1)在超高效液相色谱串联质谱检测器下检出的谱图(
Figure BDA0003014003600000074
Cellulose-3柱)；
图9为小麦粉样品中丁苯吗啉外消旋体(0.0025mg L-1)在超高效液相色谱串联质谱检测器下检出的谱图(
Figure BDA0003014003600000081
Cellulose-3柱)；
图10为不同流动相比例下丁苯吗啉在超高效液相色谱质谱检测器下检出的谱图(
Figure BDA0003014003600000082
Cellulose-3柱)；
图11为不同流动相温度下丁苯吗啉在超高效液相色谱质谱检测器下检出的谱图(
Figure BDA0003014003600000083
Cellulose-3柱)；
图12为不同酸碱度水溶液下丁苯吗啉对映体的提取效果结果图；
图13为不同填料和不同用量下丁苯吗啉外消旋体的回收率结果图；
图14为不同碰撞能量下丁苯吗啉质谱母离子与子离子响应对比结果图；
图15为不同碰撞能量下丁苯吗啉母离子m/z 304.2的子离子全扫描图谱。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步具体说明。本发明中所述实施例仅用于说明解释本发明而不对本发明的范围构成限制。
实施例1：液相色谱紫外检测器分离丁苯吗啉外消旋体
在液相色谱仪上，进样1000mg L-1丁苯吗啉外消旋体标准溶液，采用SuperchiralS-OJ色谱柱(0.46cm I.D.×15cm L,5μm)分离，流动相为甲醇/二乙胺(100/0.05)，流速0.80mL min-1，进样量20μL，柱温30℃，紫外检测器波长230nm，色谱图见图1，丁苯吗啉对映体分离数据结果见表1。表明丁苯吗啉外消旋体标准溶液在4.114min 和4.649min具有峰值，分别为丁苯吗啉外消旋体中的两个对映单体。
表1液相色谱紫外检测器分离丁苯吗啉外消旋体的数据
Figure BDA0003014003600000091
实施例2：液相色谱激光偏振仪检测器分离检测丁苯吗啉外消旋体
在液相色谱仪上，进样1000mg L-1丁苯吗啉外消旋体标准溶液，采用SuperchiralS-OJ色谱柱(0.46cm I.D.×15cm L,5μm)分离，流动相为甲醇/二乙胺(100/0.05)，流速0.80mL min-1，进样量20μL，柱温30℃，激光偏振仪检测器波长670nm，谱图见图2，可确定先流出的为(-) -丁苯吗啉，后流出的为(+)-丁苯吗啉。
实施例3：液相色谱紫外检测器检测拆分制备后获得的(-)-丁苯吗啉单体
在液相色谱仪上，进样实施例1拆分制备获得的(-)-丁苯吗啉单溶液，采用Superchiral S-OJ色谱柱(0.46cm I.D.×15cm L,5μm) 分离，流动相为甲醇/二乙胺(100/0.05)，流速0.80mL min-1，进样量20μL，柱温30℃，紫外检测器波长230nm，色谱图见图3，丁苯吗啉对映体分离数据结果见表2。表明(-)-丁苯吗啉单体溶液在 4.135min具有峰值，纯度达到99％以上。
表2液相色谱紫外检测器检测拆分制备后获得的(-)-丁苯吗啉单体的数据
Figure BDA0003014003600000092
实施例4：液相色谱紫外检测器检测拆分制备后获得的(+)-丁苯吗啉单体
在液相色谱仪上，进样实施例1拆分制备获得的(+)-丁苯吗啉单体溶液，采用Superchiral S-OJ色谱柱(0.46cm I.D.×15cm L,5μm) 分离，流动相为甲醇/二乙胺(100/0.05)，流速0.80mL min-1，进样量20μL，柱温30℃，紫外检测器波长230nm，色谱图见图4，丁苯吗啉对映体分离数据结果见表3。表明(+)-丁苯吗啉单体溶液在 4.675min具有峰值，纯度达到99％以上。
表3液相色谱紫外检测器检测拆分制备后获得的(+)-丁苯吗啉单体的数据
Figure BDA0003014003600000101
实施例5：超高效液相色谱质谱在流动相梯度条件下分离检测丁苯吗啉外消旋体
在超高效液相色谱质谱仪上，进样1.0mg L-1丁苯吗啉外消旋体标准溶液，采用
Figure BDA0003014003600000102
Cellulose-3色谱柱(150mm×2mm,3μm)分离，柱温50℃，进样量5μL，流速0.35mL/min，流动相A为5mmol/L 乙酸铵水溶液，B为0.1％甲酸乙腈，梯度洗脱程序为：0-10.0min，16％-22％B；10.0-11.0min，22％-95％B，保持3min的95％B； 14.0-14.2min，95％-16％B，随后保持1.8min的16％B，整个分析时间16min。质谱全扫描提取特征离子模式测定，谱图见图5。
实施例6：超高效液相色谱串联质谱测定(-)-丁苯吗啉单体(2.0mg L-1)
在超高效液相色谱质谱仪上，进样实施例1拆分制备获得的2.0 mg L-1(-)-丁苯吗啉单体溶液，采用
Figure BDA0003014003600000103
Cellulose-3色谱柱(150mm×2 mm,3μm)分离，柱温50℃，进样量5μL，流速0.35mL/min，流动相A为5mmol/L乙酸铵水溶液，B为0.1％甲酸乙腈，梯度洗脱程序为： 0-10.0min，16％-22％B；10.0-11.0min，22％-95％B，保持3min的 95％B；14.0-14.2min，95％-16％B，随后保持1.8min的16％B，整个分析时间16min。质谱全扫描提取特征离子模式测定，谱图见图6，(-) -体的纯度在99％以上。
实施例7：超高效液相色谱串联质谱测定(+)-丁苯吗啉单体(2.0 mg L-1)
在超高效液相色谱质谱仪上，进样实施例1拆分制备获得的2.0 mg L-1(+)-丁苯吗啉单体溶液，采用
Figure BDA0003014003600000111
Cellulose-3色谱柱(150mm×2 mm,3μm)分离，柱温50℃，进样量5μL，流速0.35mL/min，流动相 A为5mmol/L乙酸铵水溶液，B为0.1％甲酸乙腈，梯度洗脱程序为： 0-10.0min，16％-22％B；10.0-11.0min，22％-95％B，保持3min的 95％B；14.0-14.2min，95％-16％B，随后保持1.8min的16％B，整个分析时间16min。质谱全扫描提取特征离子模式测定，谱图见图7，(+) -体的纯度在99％以上。
实施例8：超高效液相色谱串联质谱流动相梯度检测干辣椒中丁苯吗啉对映体
在超高效液相色谱串联质谱仪上，进样1.0mg L-1丁苯吗啉外消旋体基质标准溶液，采用
Figure BDA0003014003600000112
Cellulose-3色谱柱(150mm×2mm,3μm) 分离，柱温50℃，进样量5μL，流速0.35mL/min，流动相A为5mmol/L 乙酸铵水溶液，B为0.1％甲酸乙腈，梯度洗脱程序为：0-10.0min，16％-22％B；10.0-11.0min，22％-95％B，保持3min的95％B； 14.0-14.2min，95％-16％B，随后保持1.8min的16％B，整个分析时间16min，串联质谱MRM模式测定，二级质谱参数见表4，谱图见图8。
表4超高效液相色谱串联质谱检测丁苯吗啉对映体的二级质谱参数条件
Figure BDA0003014003600000121
实施例9：超高效液相色谱串联质谱流动相梯度检测小麦粉中丁苯吗啉对映体
在超高效液相色谱串联质谱仪上，进样1.0mg L-1丁苯吗啉外消旋体基质标准溶液，采用
Figure BDA0003014003600000122
Cellulose-3色谱柱(150mm×2mm,3μm) 分离，柱温50℃，进样量5μL，流速0.35mL/min，流动相A为5mmol/L 乙酸铵水溶液，B为0.1％甲酸乙腈，梯度洗脱程序为：0-10.0min， 16％-22％B；10.0-11.0min，22％-95％B，保持3min的95％B； 14.0-14.2min，95％-16％B，随后保持1.8min的16％B，整个分析时间 16min，串联质谱MRM模式测定，二级质谱参数见表4，谱图见图9。
实施例10：不同流动相等度比例下
Figure BDA0003014003600000123
Cellulose-3超高效液相色谱串联质谱分离丁苯吗啉对映体
在超高效液相色谱串联质谱仪上，进样5.0mg L-1丁苯吗啉外消旋体标准溶液，采用
Figure BDA0003014003600000124
Cellulose-3色谱柱(150mm×2mm,3μm)分离，流动相为0.1％甲酸乙腈(A)和5mmol/L乙酸铵水溶液(B)，在不同等度比例下进行洗脱，流速0.35mL min-1，进样量5μL，柱温40℃，质谱检测，谱图见图10(从下往上，流动相A/B比例依次为25/75,22/78, 20/80,18/82,16/84,14/86,v/v)，可知随着有机相比例的升高，对映体保留时间越短，分离度越低，实际拆分过程中，可根据需要选择来制备单体。
实施例11：不同色谱柱温度下
Figure BDA0003014003600000131
Cellulose-3超高效液相色谱质谱分离丁苯吗啉对映体
在超高效液相色谱质谱仪上，进样1.0mg L-1丁苯吗啉外消旋体标准溶液，采用
Figure BDA0003014003600000132
Cellulose-3色谱柱(150mm×2mm,3μm)分离，流动相为0.1％甲酸乙腈(A)和5mmol/L乙酸铵水溶液(B)，在不同色谱柱温度下进行洗脱，流速0.35mL min-1，进样量5μL，质谱检测，谱图见图11(从下往上，色谱柱温度依次为25,30,35,40,45,50℃)，对映体分离度分别为0.814,1.203,1.522,1.682,1.945和2.110。可知随着色谱柱柱温的升高，对映体分离度增加，实际拆分过程中，可根据需要选择来制备单体。
实施例图12：绿茶等不同农产品中的丁苯吗啉对映体残留的超高效液相色谱串联质谱分析
实验部分
主要仪器与设备：超高效液相色谱-三重四极杆质谱联用仪：美国Waters公司产品H-Class UPLC Xevo TQ-S micro MS/MS，配有电喷雾电离(ESI)源，MassLynx 4.1质谱工作站；手性色谱柱：
Figure BDA0003014003600000133
3μm Cellulose-3，3μm×150mm×2mm，美国Phenomenex公司产品；3K-5 冷冻高速离心机：德国Sigma公司产品；R-210旋转蒸发仪：瑞士BUCHI LabortechnikA G公司产品；KQ-250DB型数控超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司产品；VortexGenie2型涡旋震荡器：美国 Scientific公司产品；T-18高速均质匀浆器：德国IKA公司产品； DFT-200手提式高速万能粉碎机：浙江温岭市林大机械有限公司产品；电子分析天平：0.0001g，瑞士Mettler-Toledo公司产品；0.22μm Filter Unit滤膜，天津博纳艾杰尔科技有限公司产品；2mL进样瓶：美国 Agilent有限公司。
材料与试剂：无水硫酸镁、氯化钠：均为分析纯，上海试四赫维化工有限公司产品；C18(50μm),C18-N(40–60μm),GCB(120–140 mesh),PSA(40–60μm),PWAX(40–60μm)和SCX(40–60μm)，天津博纳艾杰尔科技有限公司产品；乙腈、甲醇：色谱纯，德国Merck 公司产品；甲酸、乙酸铵：色谱纯，上海安普实验科技股份有限公司产品；纯净水：杭州娃哈哈有限公司产品；丁苯吗啉标准品：纯度均大于98％，德国Dr.Ehrenstorfer GmbH公司产品。
样品提取净化：经磨碎后称取2g绿茶或干辣椒(5g小麦粉或豌豆，10g长叶莴苣)至离心管中，加入10mL的2％甲酸水溶液，充分涡旋混匀后，再加入20mL乙腈，涡旋混匀后均质，再加入5gNaCl，涡旋混匀后均质再离心，吸取8mL上层溶液至装有50mg C18,20mg PSA和20mg GCB的10mL离心管中，涡旋震荡净化1min后离心，过膜吸取上清液6mL于50mL鸡心瓶中，旋转浓缩干后，加入1.2mL 4/6(v/v)乙腈/水超声辅助溶解定容，过0.22μm滤膜至进样瓶中， UPLC-MS/MS基质外标法定量待测。
色谱质谱条件
色谱条件：
Figure BDA0003014003600000151
3μmCellulose-3色谱柱(3μm×150mm×2mm)；柱温50℃；进样量5μL；流速0.35mL/min；流动相A为5mmol/L 乙酸铵水溶液，B为0.1％甲酸乙腈；梯度洗脱程序为：0-10.0min， 16％-22％B；10.0-11.0min，22％-95％B，保持3min的95％B； 14.0-14.2min，95％-16％B，随后保持1.8min的16％B，整个分析时间16min。
质谱条件：电喷雾正电离多反应检测模式ESI+-MRM；毛细管电压3.5kV；离子源温度150℃；脱溶剂气N2(99.5％)温度350℃，流速700L/h；锥孔反吹气N2流速50L/h；碰撞气Ar(99.995％)流速0.30 mL/min；电子倍增器倍增电压700V；二级母离子驻留时间0.02s；丁苯吗啉对映体母离子m/z 304.2，锥孔电压30V，定量子离子m/z 147 和定性子离子m/z 98，碰撞电压均为30eV。
标准溶液的配制与标准曲线：分别称取一定量的丁苯吗啉标准品于50mL容量瓶中，用乙腈溶解定容，配置成200mg/L的标准储备液，-18℃保存。将标准储备液用乙腈/水(4/6，v/v)以及按照1.3 节方法处理后得到的绿茶、干辣椒、小麦粉、豌豆或长叶莴苣基质溶液配制系列标准溶液(5.0、2.50、1.0、0.25、0.050、0.010和0.0025 mg/L，对映单体浓度为一半)，UPLC-MS/MS进样分析，每个浓度测定3次，以浓度为横坐标(x)，峰面积平均值为纵坐标(y)，得到丁苯吗啉对映体标准曲线和线性相关系数。
添加回收率、精密度与方法定量限：称取(量取)经测定不含丁苯吗啉的绿茶、干辣椒、小麦粉、豌豆或长叶莴苣空白样品，分别添加相当于表5中添加水平的标准溶液，涡旋混匀后放置2h以更接近于实际样品中农药残留情况，然后按照样品提取净化方法加入水和乙腈进行提取净化测定，每个浓度重复6次；同时将处理后得到的空白绿茶、干辣椒、小麦粉、豌豆或长叶莴苣样品溶液加入相应浓度的标准溶液后定容，配制成相应的基质标准溶液进行测定，计算添加回收率、相对标准偏差、方法的检测限和定量限。
结果与讨论
样品前处理条件的优化：在农药残留分析中，提取溶剂的酸碱性直接影响到样品中残留化合物的提取效果。我们比较了不同提取溶液与乙腈混合对丁苯吗啉的提取效果，如1％、2％和5％的甲酸水溶液， 1％、2％和5％的乙酸水溶液，1％的氨水溶液和纯水，结果见图12，表明甲酸水溶液有助于丁苯吗啉的提取，而且对其对映体之间影响没有差别，乙酸水溶液次之，纯水提取效果最差。
提取液净化时，不同填料净化效果差异很大。研究中比较了不同净化填料C18、C18-N、GCB、PSA、PWAX和SCX在不同用量下(100、 50、30、20和10mg)对提取液的净化和丁苯吗啉回收率的效果，结果见图13，结果表明除去50和100mg下的SCX、100mg C18和C18-N 之外，其余填料和用量大多数情况下差异不大，丁苯吗啉回收率在 85％到105％之间。
色谱质谱条件的优化：通过比较
Figure BDA0003014003600000161
3μm Cellulose-2柱在0.1％甲酸乙腈和5mmol/L乙酸铵水溶液在不同比例下(30/70,25/75,22/78, 20/80,18/82,16/84,14/86,v/v)和不同色谱柱柱温下((25,30,35,40,45, 50℃))对丁苯吗啉对映体的拆分效果。图10给出了不同比例下丁苯吗啉对映体的拆分效果，图11给出了不同色谱柱温度下丁苯吗啉对映体的拆分效果。结果表明0.1％甲酸乙腈和5mmol/L乙酸铵水溶液比例大于30/70(v/v)，时，完全无法分离丁苯吗啉两个对映体，当比例小于16/84(v/v)时，色谱峰展宽，分析时间超过30分钟。最终选择了如实例5中的流动相梯度条件来进行分析。同时对比了不同进样溶剂(乙腈/水，10/0、8/2、6/4、4/6和2/8，v/v)比例对色谱峰的影响，最终表明4/6最适合用于进样分析。
丁苯吗啉母离子在不同碰撞能量下裂解的二级质谱图对比见图 14和图15。最终选择表4中的二级质谱条件用于残留分析。
标准曲线、灵敏度、基质效应和检测限：在优化条件后， 0.00125～2.50mg/L浓度范围下的进样溶剂、绿茶、干辣椒、小麦粉、豌豆和长叶莴苣基质标准溶液，UPLC-MS/MS测定得到相关线性方程和相关系数见表5，结果表明：在上述各种基质中，丁苯吗啉线性关系良好，相关系数(R2)均在0.99以上，均能够满足要求，检测限小于0.3ug L-1。茶叶等样品经过净化后，结果表明还是存在一定基质减弱效应。因此需要采用基质标准外标法定量分析。UPLC-MS/MS 测定丁苯吗啉对映体的典型色谱图见图8和图9。
表5.UPLC-MS/MS测定不同基质中丁苯吗啉对映体的线性范围、线性方程、相关系数、基质效应和对映体分数
Figure BDA0003014003600000171
Figure BDA0003014003600000181
a:ME pertains to the values of slope of matrix/slope of solvent,wherematrix suppression takes place with ME less than 1.00and enhancement occurswith ME greater than 1.00.
b:EF＝peak areas of the(-)-fenpropimorph/[peak areas of the(-)-fenpropimorph+peak areas of the (+)-fenpropimorph],where(-)and(+)are peakareas of the(-)and(+)-fenpropimorph eluting from the chiral column.The EFscan range from 0to 1,with EF＝0.50representing the racemic mixture.
c.This result pertains to the values of slope of(-)-fenpropimorph/[slope of(-)-fenpropimorph+slope of (+)-fenpropimorph]
d.This result in parentheses pertains to the average EFs±SD valuesat nine concentration levels of (-)-fenpropimorph and(+)-fenpropimorph.
回收率、精密度和定量限：按照上述对绿茶、干辣椒、小麦粉、豌豆和长叶莴苣中丁苯吗啉对映体进行4个添加浓度水平下6次平行添加回收率试验，平均添加回收率(A.R.)、相对标准偏差(RSD) 结果见表6。结果表明：在不同添加浓度水平下，(-)-丁苯吗啉单体的添加回收率在83.2％-110.0％，RSD在2.3％-16.7％，(+)-丁苯吗啉单体的添加回收率在77.8％-112.0％，RSD在2.9％-15.3％。定量限分别为绿茶和干辣椒中0.0025mg kg-1，长叶莴苣中0.0005mg kg-1，豌豆和小麦粉中0.001mg kg-1。方法能够满足绿茶等不同农产品中丁苯吗啉对映体的残留分析需求。
表6.不同样品基质中丁苯吗啉对映体在不同添加浓度水平下的平均添加回收率(ARs)、标准偏差(SDs)和相对标准(RSDs)
Figure BDA0003014003600000182
Figure BDA0003014003600000191
a:The spiked concentrations at S1,S2,S3 and S4 of(-)-fenpropimorphand(+)-fenpropimorph were 0.0005mg kg-1,0.005mg kg-1,0.05mg kg-1 and 0.50mg kg-1in romaine lettuce；0.001mg kg-1,0.01mg kg-1,0.10mg kg-1 and 1.0mg kg-1 in peaand wheat flour；0.0025mg kg-1,0.025mg kg-1,0.25mg kg-1 and 2.50mg kg-1 in greentea and dry pepper,respectively.

Claims (7)

1.丁苯吗啉对映体拆分，其特征在于包括以下步骤：
1)丁苯吗啉外消旋体溶液的配制：称取丁苯吗啉外消旋体样品，采用甲醇或乙腈配制成丁苯吗啉外消旋体溶液，备用；
2)丁苯吗啉外消旋体的分离：以步骤1)配制的丁苯吗啉外消旋体溶液为标准溶液进样，利用液相色谱紫外检测器在一定的色谱条件下洗脱分离丁苯吗啉外消旋体，得到两个峰值，分别为丁苯吗啉外消旋体中的两个对映单体，同时在馏分收集器中收集丁苯吗啉手性单体馏分；
3)丁苯吗啉外消旋体两个单体的确证：以步骤1)配制的丁苯吗啉外消旋体溶液为标准溶液进样，利用液相色谱激光偏振仪检测器在一定的色谱条件下洗脱分离检测丁苯吗啉外消旋体，确定先流出的为(-)-丁苯吗啉，后流出的为(+)-丁苯吗啉。
2.如权利要求1所述的丁苯吗啉对映体拆分，其特征在于步骤1)中丁苯吗啉外消旋体溶液浓度为0.0025-10000mg L-1。
3.如权利要求1所述的丁苯吗啉对映体拆分，其特征在于步骤2和步骤3)中一定的色谱条件为采用SuperchiralS-OJ色谱柱分离，色谱柱规格为0.46cm I.D.×15cm L,5μm，流动相为甲醇/二乙胺，体积比为100/0.05，流速0.80mL min-1，进样量20μL，柱温30℃，紫外检测器波长230nm，激光偏振仪检测器波长670nm。
4.丁苯吗啉对映体在农产品中的残留分析方法，其特征在于包括以下步骤：
1)农产品样品的提取净化，将农产品样品采用酸化水溶液和乙腈混合提取，盐析后，C18、PSA和GCB分散固相萃取净化，浓缩后乙腈/水定容，用带质谱检测器的液相色谱仪基质外标法检测；
2)取权利要求1配制好的丁苯吗啉外消旋体溶液，分别用体积比4：6的乙腈/水稀释成混合标准溶液20mg/L，然后将步骤1)处理后农产品样品基质用体积比4:6的乙腈/水分别配制成5.0、2.50、1.0、0.25、0.05、0.010和0.0025mg/L的基质标准溶液，对映单体浓度为一半，超高效液相色谱串联质谱仪UPLC-MS/MS进样分析，每个浓度测定3次，以浓度为横坐标x，峰面积平均值为纵坐标y，得到不同基质中丁苯吗啉对映体标准曲线和线性相关系数；
3)计算添加回收率、相对标准偏差、方法的检测限和定量限，满足残留分析要求；将按照步骤1)处理后的农产品实际样品中的丁苯吗啉对映体采用基质外标法计算残留量。
5.如权利要求4所述的丁苯吗啉对映体在产品中的残留分析方法，其特征在于步骤1)中农产品样品的提取净化的具体过程为：将农产品样品磨碎后称取2-10g至离心管中，加入10mL的2％甲酸水溶液，充分涡旋混匀后，再加入20mL乙腈，涡旋混匀后均质，再加入5gNaCl，涡旋混匀后均质再离心，吸取8mL上层溶液至装有0-100mg C18、0-100mg GCB和0-100mg PSA的10mL离心管中，涡旋震荡净化1min后离心，过膜吸取上清液6mL于50mL鸡心瓶中，旋转浓缩干后，加入1.2mL体积比为4：6的乙腈/水超声辅助溶解定容，过0.22μm滤膜至进样瓶中，UPLC-MS/MS基质外标法定量待测。
6.如权利要求4所述的丁苯吗啉对映体在产品中的残留分析方法，其特征在于步骤2)中超高效液相色谱条件为：3μm×150mm×2mm
Figure FDA0003014003590000031
3μm Cellulose-3色谱柱；柱温50℃；进样量5μL；流速0.35mL/min；流动相A为5mmol/L乙酸铵水溶液，B为0.1％甲酸乙腈；梯度洗脱程序为：0-10.0min，16％-22％B；10.0-11.0min，22％-95％B，保持3min的95％B；14.0-14.2min，95％-16％B，随后保持1.8min的16％B，整个分析时间16min。
7.如权利要求4所述的丁苯吗啉对映体在产品中的残留分析方法，其特征在于步骤2)中质谱仪的质谱条件为：电喷雾正电离多反应检测模式ESI+-MRM；电喷雾毛细管电压3.5kV；离子源温度150℃；脱溶剂气N2(99.5％)温度350℃，流速700L/h；锥孔反吹气N2流速50L/h；碰撞气Ar(99.995％)流速0.30mL/min；电子倍增器倍增电压700V；二级母离子驻留时间0.02s；丁苯吗啉对映体母离子m/z 304.2，锥孔电压30V，定量子离子m/z 147和定性子离子m/z 98，碰撞电压均为30eV。
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