CN112433014B - 一种基于超高效液相色谱串联质谱法测定茶叶和茶汤中茚虫威7种降解产物的方法 - Google Patents

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Abstract

一种基于超高效液相色谱串联质谱法测定茶叶和茶汤中茚虫威7种降解产物的方法，属于茶叶农药残留检测技术领域。本发明包括：1）样品提取净化：对鲜叶或茶叶样品，乙腈/水提取，C18与GCB分散固相萃取净化，浓缩后甲醇/水定容；或1）对茶汤样品PRP‑SPE柱富集净化淋洗，甲醇洗脱接收，浓缩后甲醇/水定容；2）采用C‑2色谱柱分离进行超高效液相色谱串联质谱检测茚虫威7种降解产物；3）计算茚虫威降解产物标准曲线和线性相关系数；4）计算添加回收率、相对标准偏差、方法的检测限和定量限。本发明方法满足残留分析要求，能够为茶鲜叶、茶叶和茶汤中茚虫威7种降解产物的研究检测提供分析方法。

Description

一种基于超高效液相色谱串联质谱法测定茶叶和茶汤中茚虫 威7种降解产物的方法
技术领域
本发明属于茶叶农药残留检测技术领域，具体涉及一种基于超高效液相色谱串联质谱法测定茶叶和茶汤中茚虫威7种降解产物的方法。
背景技术
我国是茶叶的起源地，也是世界第一茶叶生产国和消费国。茶叶对于广大茶区的经济发展、山区茶农的脱贫致富具有重要意义。茶叶是一种绿色健康饮料，其品质及质量安全关系着茶产业的长期可持续发展。茶叶生长喜湿热环境，病虫害相对容易发生，而喷施化学农药是防治茶树病虫害最快、最有效的方法。茚虫威结构独特新颖、蒸气压低(2.5*10- 5mPa,25℃)、水溶解度小(0.20mg/L,20℃)、杀虫效果好且用量低，是其中一种对茶树鳞翅目害虫假眼小绿叶蝉等有很好防治效果，且对天敌安全的噁二嗪类手性结构农药。茚虫威是通过在昆虫体内代谢为一种N-去甲氧羰基代谢物(DCJW，IN-JT333)，从而不可逆地阻断Na+通道，逐渐使目标害虫神经麻痹，影响摄食等活动直至死亡。通过前期研究，2013年我国对茚虫威在茶叶中的最大残留限量(MRL)规定为5mg/kg，并促成国际食品法典委员会CAC制定此MRL值，使欧盟的MRL值也从0.05mg/kg修订为5mg/kg，在近年来不断提倡的茶园水溶性农药使用替代中，茚虫威作为有机磷类高毒农药、新烟碱类高水溶解度农药的替代品，用于茶园害虫的防治应用，越来越广泛。
近年来，随着科学家的认识和科学研究的不断深入，农产品和食品中农药代谢降解产物越来越受到关注。国际农药残留联席会议JMPR的评估报告中将茚虫威残留物定义为茚虫威-S体和茚虫威-R体的总量，报告中同时给出了一些代谢降解产物，除IN-JT333外，还有羟基化代谢物、噁二嗪开环代谢物等。然而关于茚虫威残留研究，前期主要集中在其外消旋体的检测方法，包括采用气相色谱法、气相色谱串联质谱法、液相色谱法和液相色谱串联质谱法等；2007年以来，逐渐开始有越来越多的报道采用不同固定相制成的色谱柱对不同样品基质中的茚虫威对映体进行手性分析，如采用万古霉素晶体代谢物柱、(S)-α-甲基苯基氨基甲酸修饰的直链淀粉柱、直链淀粉-三-(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)(ChiralpakAD-RH)柱和纤维素-三-(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)(Chiralcel OD-H)柱等，不同农产品中茚虫威手性对映体的降解也引起科学家重视，相关报道逐渐增多。
本申请人前期也通过研究建立了茶叶等基质中茚虫威对映体的残留分析方法，并用于田间实际样品分析中，发现茶鲜叶中茚虫威对映体之间存在降解差异。但这些方法和研究均只关注茚虫威母体，很少涉及到其降解产物的研究。因此，本发明针对茚虫威7种降解产物，建立了鲜叶、绿茶、红茶、绿茶茶汤和红茶茶汤中的UPLC-MS/MS残留分析方法，为以后研究茚虫威对映体在茶叶生长加工冲泡过程中的降解代谢及在其它农产品中的代谢分析提供分析方法，保障质量安全。
发明内容
针对上述现有技术中存在的缺陷，本发明的目的在于设计提供一种基于超高效液相色谱串联质谱法测定茶叶和茶汤中茚虫威7种降解产物的方法。通过比较不同酸碱度的提取溶剂、不同SPE柱富集净化、不同上样体积以及不同溶剂清洗净化的效果，建立了茶鲜叶、绿茶、红茶、绿茶汤和红茶汤中茚虫威降解产物的残留分析方法。
一种基于超高效液相色谱串联质谱法测定茶叶和茶汤中茚虫威7种降解产物的方法，其特征在于包括以下步骤：
1)样品提取净化：对鲜叶或茶叶样品，采用乙腈/水提取，C18与GCB分散固相萃取净化，浓缩后甲醇/水定容；
或1)样品提取净化：对茶汤样品采用PRP-SPE柱富集净化淋洗，甲醇洗脱接收，浓缩后甲醇/水定容；
2)采用
Figure BDA0002823155290000031
μm Cellulose-2色谱柱进行超高效液相色谱串联质谱检测茚虫威7种降解产物；
3)配制茚虫威7种降解产物标准储备液，分别用9/1(v/v)甲醇/水稀释成混合标准溶液20mg/L，然后将步骤1)处理后的鲜叶、茶叶或茶汤基质用9/1(v/v)甲醇/水分别配制成10、5.0、2.50、1.0、0.50、0.25、0.10、0.050、0.025和0.01mg/L的标准溶液，对映单体浓度为一半，UPLC-MS/MS进样分析，每个浓度测定3次，以浓度为横坐标x，峰面积平均值为纵坐标y，得到茚虫威降解产物标准曲线和线性相关系数；
4)计算添加回收率、相对标准偏差、方法的检测限和定量限，满足残留分析要求。
所述的一种基于超高效液相色谱串联质谱法测定茶叶和茶汤中茚虫威7种降解产物的方法，其特征在于所述1)中鲜叶或茶叶样品具体提取净化为：经磨碎后称取5g鲜叶或2g茶叶，至离心管中加入5mL纯净水，充分涡旋混匀后静置20min，再加入10mL乙腈，涡旋混匀后静置2h，加入5gNaCl后均质，涡旋混匀震荡5min后离心，吸取上层有机相溶液7mL加入装有0.525g C18和0.0875g GCB的10mL离心管中，涡旋震荡净化1min后离心，过膜吸取上清液5mL于50mL鸡心瓶中，旋转浓缩干后，加入1mL 9/1(v/v)甲醇/水定容，超声辅助溶解，过0.22μm滤膜至进样瓶中，UPLC-MS/MS待测。
所述的一种基于超高效液相色谱串联质谱法测定茶叶和茶汤中茚虫威7种降解产物的方法，其特征在于所述1)中茶汤样品具体提取净化为：用5mL甲醇和5mL水依次预淋洗活化PRP SPE柱，吸取100mL茶汤上样至PRP SPE柱上，待样液过柱完毕后，加入5mL4/6(v/v)甲醇/水清洗PRP SPE柱，弃去流出的样液和清洗液，缓慢气流吹干PRP SPE柱2min，再用20mL甲醇洗脱PRP SPE柱内待测目标物，接受洗脱液至100mL鸡心瓶中，旋转蒸发浓缩干后，加入1mL9/1(v/v)甲醇/水定容，超声辅助溶解，过0.22μm滤膜至进样瓶中，UPLC-MS/MS待测。
所述的一种基于超高效液相色谱串联质谱法测定茶叶和茶汤中茚虫威7种降解产物的方法，其特征在于所述步骤2)中色谱条件为：3μm×150mm×2mm
Figure BDA0002823155290000041
μmCellulose-2色谱柱；柱温40℃；进样量5μL；流速0.3mL/min；流动相A为0.1％甲酸甲醇，B为5mmol/L乙酸铵水溶液；梯度洗脱程序为：70％-80％A0-4.5min，80％-98％A 4.5-5.2min，保持98％A5.2-9.2min，98％-70％A9.2-9.3min，随后保持70％A2.6min。
所述的一种基于超高效液相色谱串联质谱法测定茶叶和茶汤中茚虫威7种降解产物的方法，其特征在于所述步骤2)中质谱条件为：电喷雾电离正离子多反应检测模式ESI+-MRM；电喷雾毛细管电压3.5KV；离子源温度150℃；脱溶剂气N2温度350℃，流速750L/h；锥孔反吹气N2流速50L/h；碰撞气Ar流速0.25mL/min；电子倍增器倍增电压700V；二级母离子驻留时间0.04s。
所述的一种基于超高效液相色谱串联质谱法测定茶叶和茶汤中茚虫威7种降解产物的方法，其特征在于所述步骤2)中7种降解产物的化学式为：C20H15ClF3N3O5，C10H11O3N2F3，C8H5F3N2O2，C8H7F3N2O2，C10H10F3N3O4，C21H17ClF3N3O7，C19H15ClF3N3O5。
本发明方法不同基质中所有化合物的标准曲线线性相关系数均在0.999以上，平均添加回收率在76.9％-108.4％，相对标准偏差小于16.4％，方法定量限小于等于0.01mg/kg(1μg/L)。本方法满足残留分析要求，能够为茶鲜叶、茶叶和茶汤中茚虫威7种降解产物的研究检测提供分析方法。
附图说明
图1为4种不同提取溶剂提取鲜叶中茚虫威及其降解产物的对比结果；
图2为不同比例MeOH/H2O洗脱下茚虫威及其两种降解产物在PRP-SPE柱上的流出曲线；
图3为20eV下茚虫威及其降解产物母离子的UPLC-MS/MS二级质谱图；
图4为茚虫威对映体及其降解产物(0.10mg/L)的UPC-MS/MS色谱图。
具体实施方式
以下将结合附图和实施例对本发明作进一步描述。
实施例：
1、实验部分
1.1主要仪器与设备
UPLC/Quattra Premier XE超高效液相色谱-三重四极杆质谱联用仪：美国Waters公司产品，配有电喷雾电离(ESI)源，MassLynx 4.1质谱工作站；手性色谱柱：
Figure BDA0002823155290000051
3μmCellulose-1、
Figure BDA0002823155290000052
3μm Cellulose-2，3μm×150mm×2mm，美国Phenomenex公司产品；Strata-X 33u PRP(polymeric reversed phase)SPE柱：500mg/6mL，美国Phenomenex公司产品；BondElut C18 SPE柱，500mg/6mL，美国Agilent公司产品；3K-5冷冻高速离心机：德国Sigma公司产品；R-210旋转蒸发仪：瑞士BUCHI Labortechnik A G公司产品；KQ-250DB型数控超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司产品；Vortex Genie2型涡旋震荡器：美国Scientific公司产品；T-18高速均质匀浆器：德国IKA公司产品；DFT-200手提式高速万能粉碎机：浙江温岭市林大机械有限公司产品；电子分析天平：0.0001g，瑞士Mettler-Toledo公司产品；Filter Unit滤膜：0.22μm，天津博纳艾杰尔科技有限公司产品；2mL进样瓶：美国Agilent有限公司。
1.2材料与试剂
无水硫酸镁、氯化钠：均为分析纯，上海试四赫维化工有限公司产品；石墨化炭黑(Graphitized carbon black,GCB)填料(100～150目)：120-400目，天津博纳艾杰尔科技有限公司产品；十八烷基键合硅胶(Octadecylsilane,C18)填料：40-60μm，天津博纳艾杰尔科技有限公司产品；丙酮：色谱纯，美国Honey Well公司产品；甲醇：色谱纯，德国Merck公司产品；甲酸、乙酸铵：色谱纯，上海安普实验科技股份有限公司产品；纯净水：杭州娃哈哈有限公司产品；IN-JT333,IN-MK638,IN-MF014,IN-KG433,IN-MN470,IN-MK643和IN-JU873纯品：纯度均大于95％，委托合成制备。
1.3样品提取净化
1.3.1鲜叶、茶叶称取经食品粉碎机磨碎后的5.00g鲜叶(或2.00g绿茶或红茶)至50mL离心管，加入5mL纯净水，充分涡旋混匀后静置20min，再加入10mL乙腈，涡旋混匀后静置2h，加入5g NaCl后17400r/min均质1min，涡旋混匀震荡5min，5000r/min离心5min。吸取上层有机相溶液7mL加入装有0.525g C18和0.0875g GCB的10mL离心管中，涡旋震荡净化1min，5000r/min离心5min，吸取过膜后的上清液5.0mL于50mL鸡心瓶中，旋转浓缩近干后，加入1.0mL甲醇/水(9/1，v/v)定容，超声辅助溶解，过0.22μm滤膜至进样瓶中，UPLC-MS/MS待测。
1.3.2茶汤将茶叶按照茶水比1:50的标准加入沸水冲泡，10min后滤纸抽滤，获得茶汤。先用5mL甲醇、5mL水依次预淋洗活化PRP SPE柱，吸取100mL茶汤样品上样至PRP SPE柱上，待上样液过柱完毕后，加入5mL甲醇/水(4/6，v/v)清洗PRP SPE柱，弃去流出的上样液和清洗液，缓速气流吹干PRP SPE柱2min，再用20mL甲醇洗脱PRP SPE柱内待测目标物，接收洗脱液至100mL鸡心瓶中，旋转蒸发浓缩近干后，加入1.0mL甲醇/水(9/1，v/v)定容，超声辅助溶解，过0.22μm滤膜至进样瓶中，UPLC-MS/MS待测。
1.4色谱质谱条件
1.4.1色谱条件
Figure BDA0002823155290000071
μm Cellulose-2色谱柱(3μm×150mm×2mm)；柱温40℃；进样量5μL；流速0.30mL/min；流动相：A为0.1％甲酸甲醇，B为5mmol/L乙酸铵水溶液；梯度洗脱程序为：0～4.5min(70％～80％A)，4.5～5.2min(80％～98％A)，5.2～9.2min保持98％A，9.2-9.4min(98％～70％A)，随后保持2.6min 70％A。茚虫威7种降解产物的保留时间见表1。
1.4.2质谱条件电喷雾电离正离子多反应监测模式(ESI+-MRM)；电喷雾毛细管电压3.5KV；离子源温度150℃；脱溶剂气(N2)温度350℃，流速750L/h；锥孔反吹气(N2)流速50L/h；碰撞气(Ar)流速0.25mL/min；电子倍增器倍增电压700V；二级母离子驻留时间0.040s；茚虫威7种降解产物的其余二级质谱参数见表1。
表1茚虫威7种降解产物相关信息和色谱质谱参数
Figure BDA0002823155290000072
注：P.I.表示母离子；D.I表示子离子；CE表示裂解能量。
1.5标准溶液的配制与标准曲线
分别称取一定量的茚虫威7种降解产物标准品于50mL容量瓶中，用乙腈溶解定容，配置成200mg/L的标准储备液，-18℃保存。将标准储备液用甲醇/水(9/1，v/v)稀释成混合标准溶液20mg/L，然后用按照1.3节方法处理后得到的茶鲜叶、红茶、绿茶、红茶茶汤和绿茶茶汤基质以及甲醇/水(9/1，v/v)溶剂配制系列标准溶液(10、5.0、2.50、1.0、0.50、0.25、0.10、0.050、0.025和0.01mg/L，对映单体浓度为一半)，UPLC-MS/MS进样分析，每个浓度测定3次，以浓度为横坐标(x)，峰面积平均值为纵坐标(y)，得到茚虫威7种降解产物标准曲线和线性相关系数。
采用下列公式计算基质效应(Matrix effect)：
ME＝(A/B-1)×100％
式中A为基质标准曲线的斜率，B为溶剂标准曲线的斜率。若ME大于0，说明存在基质增强效应，反之，ME小于0，说明存在基质减弱效应。
1.6添加回收率、精密度与方法定量限
称取(量取)经测定不含茚虫威及其降解产物的茶鲜叶、绿茶、红茶、绿茶茶汤、红茶茶汤空白样品，分别添加相当于表4中添加水平的混合标准溶液，涡旋混匀后放置2h以更接近于实际样品中农药残留情况，然后按照1.3节方法加入水和乙腈进行提取净化测定，每个浓度重复6次；同时将处理后得到的空白茶鲜叶、绿茶、红茶、绿茶汤和红茶汤样品溶液加入相应浓度的标准溶液后定容，配制成相应的基质标准溶液进行测定，计算添加回收率、相对标准偏差、方法的检测限和定量限。
2、结果与讨论
2.1前处理条件的优化
2.1.1茶鲜叶和茶叶提取条件的优化
提取溶剂的酸碱性直接影响到样品中残留化合物的提取效果。我们参考前期方法进行提取时，发现IN-JT333等化合物的回收率无法满足方法需要。因此，我们分别称取茶鲜叶5.0g，加入1.0mL 1mg/L的茚虫威及其降解产物混合标样，涡旋静置1h，对比了四种不同提取方式(A：加入5mL 2％甲酸水，涡旋浸泡20min，再加入10mL 5％氨水乙腈提取；B：加入5mL纯水，涡旋浸泡20min，再加入10mL 5％氨水乙腈提取；C：加入5mL纯水，涡旋浸泡20min，再加入10mL乙腈提取；D：加入5mL纯水，涡旋浸泡20min，再加入10mL 2％甲酸乙腈提取)下提取，按照1.3节净化后，各个化合物的提取回收率结果见图1。
结果表明：虽然氨水乙腈提取液相对更干净，但对IN-JT333、IN-JU873和INKG433影响较大，导致回收率低；乙腈和酸化乙腈都能带来较好的回收率，但是酸化乙腈提取重复间偏差较大，因此选择方案C。我们最终采用5.0mL水和10.0mL乙腈提取5.0g茶鲜叶，茚虫威对映体及其降解产物的回收率和精密度都能满足要求，同时亦适用于茶叶的提取。
2.1.2茶汤富集净化条件的优化
固相萃取柱富集和上样量的选择参考前期方法，选择以3种极性不同的化合物茚虫威、IN-JT333和IN-MK638为代表，采用BondElut C18-SPE柱和PRP-SPE柱，上样不同体积的茶汤(25,50,100mL)进行对比研究，回收率结果见2，虽然C18-SPE柱对茚虫威保留富集较好，但是对IN-JT333和IN-MK638的保留富集不够，尤其是IN-MK638的回收率无法满足要求，从上样量变化带来的结果看，是C18-SPE柱吸附能力不够导致；PRP-SPE柱采用高聚合物填料，能够大大增强对IN-MK638等弱极性化合物的吸附富集，从而提高回收率，满足残留分析要求。最终选择选择PRP-SPE柱对对100mL茶汤中的茚虫威及其降解产物进行富集净化，最大限度提高富集倍数，提高方法灵敏度。
PRP-SPE柱净化清洗洗脱溶剂的优化：茶汤样品上样至PRP-SPE柱之后，柱内吸附较多咖啡碱、色素等杂质，如果上样后采用甲醇直接洗脱，会带来很多共流出杂质，影响待测物响应。因此在不影响目标物质的情况下，将一部分咖啡碱、色素等杂质先淋洗下来，再洗脱目标化合物从而降低基质效应和减少杂质影响。因此，采取将茚虫威、IN-JT333和IN-MK638的混合标准溶液、茶汤分别上样至PRP-SPE柱上，依次吸取5mL不同比例(0:10、1:9、2:8、3:7、4:6、5:5、6:4、7:3、8:2、9:1、10:0，v/v)的甲醇/水溶液进行洗脱接收，测定过柱后各部分洗脱液中的目标物浓度，绘制洗脱曲线见图2。结果表明：水溶性的色素在前期水比例高的淋洗中大部分被洗脱下来；随着甲醇比例的升高，IN-MK638最先被洗脱下来，当甲醇/水比例上升至5:5时开始有检出，在6:4下全部流出，之后在8:2开始有茚虫威洗脱出，最后是IN-JT333被洗脱下来，在纯甲醇洗脱时被全部洗脱下来。因此，考虑到既要尽可能的去除样品中咖啡碱、色素等杂质，又要尽量避免目标物损失，最终确定上样后最佳清洗溶剂为5mL甲醇/水(4/6，v/v)，然后采用甲醇洗脱待测目标化合物。
表2.不同SPE柱和不同上样量时3种代表性化合物的回收率比较
Figure BDA0002823155290000101
2.2色谱质谱条件的优化
前期研究中，我们虽然采用
Figure BDA0002823155290000102
3μm Cellulose-1柱实现了对茚虫威对映体的拆分，也明确了乙腈拆分效果不如甲醇。但是本研究中发现
Figure BDA0002823155290000103
3μm Cellulose-1柱很难实现对IN-JT333对映体的拆分，重新对比了其它手性柱的效果，发现
Figure BDA0002823155290000111
3μmCellulose-2既能实现对茚虫威对映体的拆分，又能实现对IN-JT333对映体的拆分和对IN-JU873对映体的基本并肩峰分离；两种色谱柱上茚虫威两个对映体流出顺序不同，
Figure BDA0002823155290000112
3μm Cellulose-1柱上茚虫威-R体比茚虫威-S体先洗脱出来，而在
Figure BDA0002823155290000113
3μm Cellulose-2柱上恰恰相反，这主要是两种色谱柱填料中苯环取代基及位置不同而造成选择性分离差别。最终选择1.4.1节中的流动相梯度程序来实现对茚虫威对映体及其降解产物的分离。
本实施例采用UPLC-ESI+-MS/MS对茚虫威7种降解产物进行分析，优化锥孔电压和喷雾电压，分别得到准分子离子峰[M+H]+，对准分子离子峰进行二级质谱子离子扫描，得到碎片离子信息，优化碰撞裂解能量，20eV碰撞电压下茚虫威及其7种降解产物的ESI+-MS/MS质谱图见图3，最终优化后二级质谱条件见表1。
2.3标准曲线、灵敏度和基质效应
在优化条件后，考察了茚虫威对映体及降解产物在0.01、0.025、0.05、0.10、0.25、0.50、1.0、2.5、5.0、10mg/L(对映单体浓度为一半)浓度范围下的进样溶剂、茶鲜叶、红茶、绿茶、红茶茶汤和绿茶茶汤基质标准溶液，UPLC-MS/MS测定得到相关线性方程和相关系数见表3，结果表明：在上述各种基质中，茚虫威7种降解产物线性关系良好，相关系数(R2)均在0.9991以上，均能够满足要求。
茶叶等样品经过净化后，结果表明还是存在一定基质减弱效应。因此需要采用基质标准外标法定量分析。UPLC-MS/MS测定茚虫威对映体及其降解产物的典型色谱图见图4。
表3.UPLC-MS/MS测定不同基质溶液中茚虫威对映体及其降解产物的线性方程、相关系数和基质效应
Figure BDA0002823155290000114
Figure BDA0002823155290000121
注：C.R.表示浓度范围。
2.4回收率和精密度
按照上述对茶鲜叶、绿茶、红茶、绿茶茶汤、红茶茶汤中茚虫威7种降解产物进行低、中、高浓度水平下6次平行添加回收率试验，平均添加回收率(A.R.)、相对标准偏差(RSD)结果见表4。结果表明：在0.005、0.05、0.50mg/kg(茶汤中为0.5、5、50μg/L)添加浓度下，IN-JT333-1和IN-JT333-2、IN-JU873-1和IN-JU873-2在茶鲜叶中的A.R.在94.5％-108.4％，RSD在1.6％-8.2％；在绿茶中的A.R.在90.0％-105.3％，RSD在0.4％-16.4％；在红茶中的A.R.在77.6％-101.3％，RSD在1.0％-15.4％；在绿茶汤中A.R.在76.9％-100.2％，RSD在1.3％-15.8％；在红茶汤中A.R.在86.4％-101.4％，RSD在3.1％-7.9％。
在0.01、0.10、1.0mg/kg(茶汤中为1、10、100μg/L)添加浓度下，IN-MK638、IN-KG433、IN-MN470、IN-MK643和IN-MF014在茶鲜叶中的A.R.在96.0％-106.3％，RSD在0.8％-3.4％；在绿茶中的A.R.在92.3％-104.7％，RSD在2.7％-9.5％；在红茶中的A.R.在89.6％-99.1％，RSD在1.1％-15.7％；在绿茶汤中A.R.在91.6％-102.9％，RSD在0.9％-9.6％；在红茶汤中A.R.在89.4％-101.5％，RSD在2.4％-8.0％。
表4.不同样品中UPLC-MS/MS测定茚虫威7种降解产物的添加回收率和相对标准偏差
Figure BDA0002823155290000131
Figure BDA0002823155290000141
注1：茶汤样品中IN-JT333-1、IN-JT333-2、IN-JU873-1和IN-JU873-2的添加浓度为0.5、5和50μg/L。IN-MK638，IN-MF014，IN-KG433，IN-MN470，INMK643的添加浓度为1、10和100μg/L。
2.5方法检出限与定量限
按照最低添加浓度水平下的响应，计算信噪比S/N＝3时，所得各化合物在茶鲜叶、红茶、绿茶和茶汤等不同基质中的检测限均小于0.002mg/kg(单体为0.00mg/kg)；以满足回收率和相对标准偏差要求下的最低添加浓度水平来定义方法定量限(LOQ)，IN-JT333-1和IN-JT333-2、IN-JU873-1和IN-JU873-2在鲜叶、绿茶和红茶中LOQ为0.005mg/kg，在绿茶汤和红茶汤中LOQ为0.5μg/L；IN-MK638，IN-MF014，IN-KG433，IN-MN470和IN-MK643在茶鲜叶、绿茶和红茶中LOQ为0.01mg/kg，在绿茶汤和红茶汤中LOQ为1μg/L。方法能够满足茚虫威7种降解产物在茶叶、茶汤等中残留分析要求。
2.6实际样品测定
利用本方法对茶园茶叶喷施100g/hm2剂量茚虫威S富集体(3S+1R)后，采集喷药后2h,2,5,7,10和14天的茶鲜叶样品，冷冻干燥后粉碎，进行检测，通过保留时间和质谱离子对比对定性，样品中检出有3种茚虫威降解产物IN-JT333-1、IN-MF014和IN-KG433，基质外标法定量得出样品中上述化合物残留量分别在0.009～0.050mg/kg、<LOQ～0.030mg/kg和<LOQ～0.013mg/kg。
3、结论
本发明通过优化提取净化条件，对鲜叶、红茶和绿茶样品采用乙腈/水提取，C18与GCB分散固相萃取净化，浓缩后甲醇/水定容；对茶汤采用PRP-SPE柱富集净化淋洗，甲醇洗脱接收，浓缩近干后甲醇/水定容，采用
Figure BDA0002823155290000142
3μm Cellulose-2柱对茚虫威7种降解产物进行色谱分离，UPLC-MS/MS基质外标法定量，建立了茶鲜叶、绿茶、红茶、绿茶汤和红茶汤等多种基质中茚虫威7种降解产物的残留分析方法。不同基质中所有化合物的标准曲线线性相关系数均在0.999以上，平均添加回收率在76.9％-108.4％，相对标准偏差小于16.4％，方法定量限小于等于0.01mg/kg(1μg/L)。结果表明方法满足残留分析要求，能够为茶鲜叶、茶叶和茶汤中茚虫威7种降解产物的研究检测提供分析方法。

Claims (5)

1.一种基于超高效液相色谱串联质谱法测定茶叶和茶汤中茚虫威7种降解产物的方法，其特征在于包括以下步骤：
1）样品提取净化：对鲜叶或茶叶样品，采用乙腈/水提取，C18与GCB分散固相萃取净化，浓缩后甲醇/水定容；
或1）样品提取净化：对茶汤样品采用PRP-SPE柱富集净化淋洗，甲醇洗脱接收，浓缩后甲醇/水定容，所述PRP-SPE柱为Strata-X 33u PRP -SPE柱；
2）采用Lux®3 μm Cellulose-2色谱柱进行超高效液相色谱串联质谱检测茚虫威7种降解产物，色谱条件中流动相A为0.1%甲酸甲醇，B为5mmol/L乙酸铵水溶液；梯度洗脱程序为：70%-80%A0-4.5min，80%-98%A 4.5-5.2min，保持98%A5.2-9.2min，98%-70%A9.2-9.3min，随后保持70%A2.6min；
3）配制茚虫威7种降解产物标准储备液，分别用9/1 v/v甲醇/水稀释成混合标准溶液20 mg/L，然后将步骤1）处理后的鲜叶、茶叶或茶汤基质用9/1 v/v甲醇/水分别配制成10、5.0、2.50、1.0、0.50、0.25、0.10、0.050、0.025和0.01 mg/L的标准溶液，对映单体浓度为一半，UPLC-MS/MS进样分析，每个浓度测定3次，以浓度为横坐标x，峰面积平均值为纵坐标y，得到茚虫威降解产物标准曲线和线性相关系数；
4）计算添加回收率、相对标准偏差、方法的检测限和定量限，满足残留分析要求；
上述茚虫威7种降解产物的化学结构式为：
Figure DEST_PATH_IMAGE001
，
Figure 741284DEST_PATH_IMAGE002
，
Figure DEST_PATH_IMAGE003
，
Figure 596107DEST_PATH_IMAGE004
，
Figure DEST_PATH_IMAGE005
，
Figure 64260DEST_PATH_IMAGE006
和
Figure DEST_PATH_IMAGE007
。
2.如权利要求1所述的一种基于超高效液相色谱串联质谱法测定茶叶和茶汤中茚虫威7种降解产物的方法，其特征在于所述1）中鲜叶或茶叶样品具体提取净化为：经磨碎后称取5g鲜叶或2g茶叶，至离心管中加入5mL纯净水，充分涡旋混匀后静置20min，再加入10mL乙腈，涡旋混匀后静置2h，加入5gNaCl后均质，涡旋混匀震荡5min后离心，吸取上层有机相溶液7mL加入装有0.525 g C18和0.0875 g GCB的10mL离心管中，涡旋震荡净化1min后离心，过膜吸取上清液5mL于50mL鸡心瓶中，旋转浓缩干后，加入1mL 9/1 v/v甲醇/水定容，超声辅助溶解，过0.22μm滤膜至进样瓶中，UPLC-MS/MS待测。
3.如权利要求1所述的一种基于超高效液相色谱串联质谱法测定茶叶和茶汤中茚虫威7种降解产物的方法，其特征在于所述1）中茶汤样品具体提取净化为：用5mL甲醇和5mL水依次预淋洗活化PRP-SPE柱，吸取100mL茶汤上样至PRP-SPE柱上，待样液过柱完毕后，加入5mL4/6 v/v甲醇/水清洗PRP-SPE柱，弃去流出的样液和清洗液，缓慢气流吹干PRP-SPE柱2min，再用20mL甲醇洗脱PRP-SPE柱内待测目标物，接受洗脱液至100mL鸡心瓶中，旋转蒸发浓缩干后，加入1mL9/1 v/v甲醇/水定容，超声辅助溶解，过0.22μm滤膜至进样瓶中，UPLC-MS/MS待测。
4.如权利要求1所述的一种基于超高效液相色谱串联质谱法测定茶叶和茶汤中茚虫威7种降解产物的方法，其特征在于所述步骤2）中色谱条件为：3μm×150mm×2mm Lux®3 μmCellulose-2色谱柱；柱温40℃；进样量5μL；流速0.3mL/min。
5.如权利要求1所述的一种基于超高效液相色谱串联质谱法测定茶叶和茶汤中茚虫威7种降解产物的方法，其特征在于所述步骤2）中质谱条件为：电喷雾电离正离子多反应检测模式ESI+-MRM；电喷雾毛细管电压3.5KV；离子源温度150℃；脱溶剂气N2温度350℃，流速750L/h；锥孔反吹气N2流速50L/h；碰撞气Ar流速0.25mL/min；电子倍增器倍增电压700V；二级母离子驻留时间0.04s。
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