CN113174388A

CN113174388A - 一种功能核酸纳米杆与功能核酸纳米花的制备及形貌转换方法

Info

Publication number: CN113174388A
Application number: CN202110715709.XA
Authority: CN
Inventors: 许文涛; 田晶晶; 朱龙佼; 贺晓云; 朱丽叶
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2021-06-28
Filing date: 2021-06-28
Publication date: 2021-07-27
Anticipated expiration: 2041-06-28
Also published as: CN113174388B

Abstract

本发明公开了一种功能核酸纳米杆与功能核酸纳米花的制备及形貌转换方法。以PCR反应处于指数扩增期的扩增子为模板可以制备得到双链的功能核酸纳米杆，且通过焦磷酸根的调控可以实现从功能核酸纳米杆到功能核酸纳米花的形貌转换；以PCR反应处于平台期的扩增子为模板可以制备得到双链的功能核酸纳米花，通过纯化去除焦磷酸镁可以实现从功能核酸纳米花到功能核酸纳米杆的形貌转换。本发明制备的双链功能核酸纳米材料，其成本低廉、制备方法简单，非常适用于不同形貌纳米材料的商业化制备与应用。

Description

一种功能核酸纳米杆与功能核酸纳米花的制备及形貌转换方法

技术领域

本发明涉及生物纳米材料领域，具体涉及一种功能核酸纳米杆与功能核酸纳米花的制备及形貌转换方法。

背景技术

纳米科技是21世纪科技领域的三大热点之一，是信息技术和生命科学等学科进一步发展的共同基础。纳米材料通常是指材料结构中至少有一个维度在1-100 nm之间。自从碳纳米管问世后，在全球范围内掀起了一场研究纳米材料的热潮。之所以能在最近十几年间激起全世界材料科学界广泛的研究兴趣，不仅是因为其独特且迷人的性能，而且这些特性随着纳米材料的尺寸和形貌的变化而发生变化。如在半导体材料中由于电子跃迁，产生于块体材料不同的特性；金纳米颗粒可以呈现等离激元效应，在拉曼增强领域应用广泛；过渡金属颗粒，随着尺寸的减小，颗粒的比表面积增大，在催化领域大有作为。因此，合成不同尺寸和形貌的纳米材料，已经成为纳米领域的研究热点。

功能核酸参与的纳米结构组装更是创造了大量的二维和三维纳米结构，其大小、形状和空间构象都得到了精确的控制。这些纳米结构能够应用于单分子水平化学反应的监测、酶级联激活和光子探测等领域。并且，纳米结构也能通过刺激响应的方式搭载和控制释放生物活性药物，用于疾病治疗。

综上，鉴于核酸技术和纳米科学技术的快速发展，核酸嵌入式纳米材料因其独特的结构特性及功能特性展现出了诸多优势，并且这些特性随着纳米材料的尺寸和形貌的变化而发生变化，对众多领域具有独特意义。本发明加法一种功能核酸纳米杆与功能核酸纳米花的制备及形貌转换方法，以PCR反应处于指数扩增期的扩增子为模板可以制备得到双链的功能核酸纳米杆，而且通过焦磷酸根的调控可以实现从功能核酸纳米杆到功能核酸纳米花的形貌转换；以PCR反应处于平台期的扩增子为模板可以制备得到双链的功能核酸纳米花，通过纯化去除焦磷酸镁可以实现从功能核酸纳米花到功能核酸纳米杆的形貌转换。本发明制备的双链功能核酸纳米材料，其成本低廉、制备方法简单，非常适用于不同形貌纳米材料的商业化制备与应用。

发明内容

本发明的目的是提供一种双链功能核酸纳米杆与功能核酸纳米花的制备及形貌转换的方法。

第一方面，涉及一种功能核酸纳米杆的制备方法，以PCR扩增子为模板，在20~40℃环境中孵育15h以上，进行双链核酸纳米杆的组装，随后加入去离子水离心、洗涤2~4次后，制备生成双链功能核酸纳米杆；

所述PCR扩增子是PCR反应指数扩增期的扩增子，所述指数扩增期是指通过PCR扩增的10~20个循环；

优选地，PCR反应是以沙门氏菌基因组为模板，在上游引物1和下游引物1存在的条件下进行PCR扩增；

其中上游引物1为5’-GTGAAATTATCGCCACGTTCGGGCAA-3’，如SEQ ID NO.1所示；

其中下游引物1为5’-TCATCGCACCGTCAAAGGAACC-3’，如SEQ ID NO.2所示；

其中PCR扩增的50μL体系为：1μL基因组模板，0.025 U/μL rTaq DNA 聚合酶, 0.4μM上游引物和0.4 μM下游引物，250 μM dNTPs, 5 μL 10×PCR Buffer (Mg²⁺ plus)，38.5μL ddH₂O;

其中PCR扩增的反应程序为：95℃ 5min，95℃ 1min，58℃ 1min，72℃ 1min，15个循环，72℃ 10min，4℃降温；

所述洗涤过程是加入20 μL的去离子水在4℃条件下离心，12000 rpm/min，30min，弃上清；

所述功能核酸纳米杆呈现出长而直的棒状，少数呈微弧状，含核酸成分。

第二方面，涉及一种功能核酸纳米花的制备方法，以PCR扩增子为模板，在20~40℃环境中孵育15h以上，进行双链核酸纳米花的组装，随后加入去离子水离心、洗涤2~4次后，制备生成双链功能核酸纳米花；

所述PCR扩增子是PCR反应平台期的扩增子，所述平台期是指通过PCR扩增达到30个循环以上；

其中PCR扩增的50 μL体系为：1 μL基因组模板，0.025 U/μL rTaq DNA 聚合酶,0.4 μM上游引物和0.4 μM下游引物，250 μM dNTPs, 5 μL 10×PCR Buffer (Mg²⁺ plus)，38.5 μL ddH₂O;

其中PCR扩增的反应程序为：95℃ 5min，95℃ 1min，58℃ 1min，72℃ 1min，30个循环，72℃ 10min，4℃降温；

所述功能核酸纳米花大部分呈现三维、多孔、分层、球形的纳米结构，平均直径为3微米左右，含核酸成分。

第三方面，涉及一种功能核酸纳米杆到功能核酸纳米花的形貌转换方法，以PCR指数期扩增期的扩增子为模板，添加0.5~2.0 mM焦磷酸根，置于20~40℃环境中孵育10~72 h，进行双链核酸纳米花的组装，随后加入去离子水离心、洗涤2~4次后，制备生成双链功能核酸纳米花；

其中PCR反应是以沙门氏菌基因组为模板，在上游引物1和下游引物1存在的条件下进行PCR扩增；

所述功能核酸纳米花的生长条件为：将PCR反应扩增得到的双链扩增子中添加0.5~2.0 mM焦磷酸根，置于30℃环境中孵育10~72 h，蒸馏水离心、洗涤2~4次后，制备生成双链功能核酸纳米花；

所述功能核酸纳米花呈现三维、多孔、分层、球形的纳米结构，具有更加浓密的骨架结构，含核酸成分。

第四方面，涉及一种功能核酸纳米花到功能核酸纳米杆的形貌转换方法，以PCR平台期的扩增子为模板，通过纯化步骤获得纯化子，置于功能核酸纳米杆生长体系中，20~40℃环境中孵育10~72 h，进行双链核酸纳米杆的组装，随后加入去离子水离心、洗涤2~4次后，制备生成双链功能核酸纳米杆；

其中纯化步骤为试剂盒纯化PCR扩增产物；

其中功能核酸纳米杆生长体系为：143 μL ddH₂O，20 μL PCR Buffer，17 μL Mg²⁺，20 μL PCR反应纯化子；

另一方面，功能核酸纳米杆的制备方法、功能核酸纳米花的制备方法、功能核酸纳米花到功能核酸纳米杆的转换和功能核酸纳米花到功能核酸纳米杆的转换在纳米材料制备及形貌转换中的应用。

另一方面，以PCR双链扩增子为模板在功能核酸纳米材料制备及转换中的应用。

借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：

1. 本申请首次利用双链PCR反应扩增子制备纳米粒子，且实现了不同形貌纳米粒子的转换；

2. 本申请利用PCR反应处于指数扩增期的扩增子为模板，成功制备了功能核酸纳米杆；

3. 本申请利用PCR反应处于平台期的扩增子为模板，成功制备了功能核酸纳米花；

4. 本申请以PCR指数期的扩增子为模板，通过焦磷酸根的引入实现了纳米杆到纳米花的形貌转换；

5. 本申请以PCR平台期的扩增子为模板，通过纯化、去除焦磷酸镁实现了纳米花到纳米杆的形貌转换；

6. 本申请利用PCR反应获得纳米材料合成的模板，实现了不同形貌的纳米材料的简便、灵活制备，为生物纳米材料的低成本、大规模制备及应用提供了借鉴。

附图说明

图1为PCR反应指数期的功能核酸制备双链功能核酸纳米杆的形貌扫描电镜图(SEM)与透射电镜图(TEM)。

图2 为指数期功能核酸纳米杆的扫描透射电镜(STEM)及能量色散X射线光谱(EDX)。

图3为指数期功能核酸纳米花的扫描电镜(SEM)结果：添加0.5 mM的PPi 时的双链功能核酸纳米花形貌。

图4为指数期功能核酸纳米花的扫描电镜(SEM)结果：添加1.0 mM的PPi 时的双链功能核酸纳米花形貌。

图5为指数期功能核酸纳米花的扫描电镜(SEM)结果：添加2.0 mM的PPi 时的双链功能核酸纳米花形貌。

图6为指数期功能核酸纳米花的扫描透射电镜(STEM)及能量色散X射线光谱(EDX)。

图7为PCR反应平台期的功能核酸制备双链功能核酸纳米花的形貌扫描电镜图(SEM)。

图8为PCR反应平台期的功能核酸制备双链功能核酸纳米花的透射电镜图(TEM)。

图9为平台期的PCR反应制备的双链功能核酸纳米花的扫描透射电镜图。

图10为平台期的PCR反应制备的双链功能核酸纳米花的能量色散X射线光谱定性图。

图11为平台期的PCR反应制备的双链功能核酸纳米花的能量色散X射线光谱定量图。

图12为利用平台期的PCR反应制备的双链功能核酸纳米杆的扫描电镜图。

图13为利用平台期的PCR反应制备的双链功能核酸纳米杆的透射电子显微镜图。

图14为利用平台期的PCR反应制备的双链功能核酸纳米杆的扫描透射电镜及能量色散X射线光谱定性图。

图15为利用平台期的PCR反应制备的双链功能核酸纳米杆中不同元素相对原子比的柱状图。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1 PCR反应指数期功能核酸纳米杆的制备方法

实验中以沙门氏菌基因组作为扩增模板，利用上游引物1与下游引物1进行扩增；实验中用到的dNTPs、rTaq DNA聚合酶、10×PCR buffer均购自TaKaRa公司，细菌基因组DNA提取试剂盒购买自天根生化科技(北京)有限公司，而上游引物1与下游引物1的序列分别为：

上游引物1：5’-GTGAAATTATCGCCACGTTCGGGCAA-3’

下游引物1：5’-TCATCGCACCGTCAAAGGAACC-3’。

PCR扩增体系如下所示：

反应程序：95℃ 5min，95℃ 1min，58℃ 1min，72℃ 1min，15个循环，72℃ 10min，4℃降温。

功能核酸纳米杆的生长：将PCR扩增产物置于30℃环境中孵育20 h，进行双链核酸纳米杆的组装。随后使用冷冻离心机于4℃下12000 rpm/min离心30min，弃上清；加入20 μL的去离子水充分洗涤，于4℃下12000 rpm/min离心30min，弃上清；重复一次上述步骤，后晾干过夜备用。

功能核酸纳米杆的表征：使用扫描电镜与投射电镜观察双链功能核酸纳米杆的形貌，使用扫描透射电镜（STEM）及能量色散X射线光谱（EDX）技术，确认双链功能核酸纳米杆的成分。

实验结果表明，组装的双链功能核酸纳米杆的形貌特征如图1所示：大部分呈现出长而直的棒状，少数呈微弧状。功能核酸纳米杆的相对原子比的定量元素信息如图2所示：氧(97.28%)、磷(1.14%)、钾(0.99%)和镁(0.60%)。由于P与Mg的比值大于Mg₂P₂O₇中的1.0，证实了功能核酸纳米杆中的DNA参与了纳米杆的形成。

实施例2 PCR反应平台期功能核酸纳米花的制备方法

实验中用到的dNTPs、rTaq DNA聚合酶、10×PCR buffer均购自TaKaRa公司，细菌基因组DNA提取试剂盒购买自天根生化科技(北京)有限公司，而上游引物1与下游引物1的序列分别为：

上游引物1：5’-GTGAAATTATCGCCACGTTCGGGCAA-3’

下游引物1：5’-TCATCGCACCGTCAAAGGAACC-3’。

PCR扩增体系如下所示：

反应程序：95℃ 5min，95℃ 1min，58℃ 1min，72℃ 1min，30个循环，72℃ 10min，4℃降温。

功能核酸纳米花的生长：将PCR反应结束后的体系置于30℃的金属浴中孵育20 h，进行功能核酸纳米花的组装。随后使用冷冻离心机于4℃下12000 rpm/min离心30min，弃上清；加入20 μL的去离子水充分洗涤，于4℃下12000 rpm/min离心30min，弃上清；重复一次上述步骤，后晾干过夜备用。

功能核酸纳米花的表征：使用扫描电镜与投射电镜观察双链功能核酸纳米花的形貌，使用扫描透射电镜（STEM）及能量色散X射线光谱（EDX）技术，确认双链功能核酸纳米花的成分。

实验结果表明，在PCR反应的平台扩增期，生成了三维、多孔、球形的纳米结构，平均直径是2.77 ± 0.64 μm，花瓣的平均厚度为28.42 ± 0.35 nm(图7）；透射电子显微镜图像表明，纳米花是分层的（图8)。通过扫描透射电镜及能量色散X射线光谱技术确认功能核酸纳米花的成分(图9和图10)，定量结果如图11所示，元素组成中磷/镁原子比值高于1.0，说明DNA也参与了纳米花的形成；纳米花边缘处的磷/镁原子比(20.68 ± 0.76% :13.78 ± 0.85%)大于其核心处的比值(15.50 ± 0.65% : 13.02 ± 0.77%)，说明DNA倾向于在纳米花的花瓣边缘沉积。

实施例3 PCR反应指数期功能核酸纳米杆到纳米花的转换制备方法

功能核酸纳米花的生长：是在PCR体系中，分别加入终浓度为0.5，1.5，2.0 mM的焦磷酸钾（PPi），于30℃的金属浴中孵育20h。其中PCR体系中的试剂、反应体系、反应程序、洗涤过程和表征手段与PCR反应指数期功能核酸纳米杆的条件完全相同。

实验结果表明，低浓度的PPi (0.5 mM)，厚度为38.45±5.52 nm的稀疏纳米薄片组装成清晰的花状轮廓（图3），当PPi浓度增加到1.0 mM时，54.76±2.52 nm厚的纳米片被包裹成致密的纳米花，并开始聚集成簇（图4），当PPi浓度增加到2.0 mM，纳米薄片生长成不同厚度的不规则花状纳米结构（图5），在特定位置，花瓣宽度(21.74±1.65 nm)较加入1.0mM PPi时更窄，这可能与DNA不均匀沉积有关。且PCR指数扩增期功能核酸纳米花的骨架更加密集、凌乱，元素成像表明含有O、P、Mg元素。P/Mg的原子比也大于1，表明DNA的存在（图6）。

实施例4 PCR反应平台期功能核酸纳米花到纳米杆转换的制备方法

功能核酸纳米杆的生长：将功能核酸纳米杆反应体系置于30℃的金属浴中孵育36h，体系组分如下：

其中PCR反应纯化子是将两管50 μL的PCR反应扩增体系合并至一管中，使用试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司, DP204-02)纯化扩增产物，随后使用NanoDrop分析得到聚合酶链式反应纯化子的浓度为95.218 ng/μL。

通过扫描电镜与透射电子显微镜观察双链功能核酸纳米杆的形貌(图12和图13)。图像表明，功能核酸纳米花已完全转换成纳米杆，且大部分呈现出长而直的杆状，少数呈微弧状。通过扫描电镜及能量色散X射线光谱技术对功能核酸纳米杆进行元素分析(图14)。定量结果表明(图15)，功能核酸纳米杆中不同元素的相对原子比为氧(93.15%)、磷(4.34%)、钾(1.20%)和镁(1.32%)。由于磷与镁的比值大于Mg₂P₂O₇中的比值(1.0)，证实了功能核酸纳米杆中的DNA参与了纳米杆的形成。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 中国农业大学

<120> 一种功能核酸纳米杆与功能核酸纳米花的制备及形貌转换方法

<130> S010210617029Y

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gtgaaattat cgccacgttc gggcaa 26

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tcatcgcacc gtcaaaggaa cc 22

Claims

1.一种功能核酸纳米杆的制备方法，其特征在于：以PCR扩增子为模板，在20~40℃环境中孵育15h以上，进行双链核酸纳米杆的组装，随后加入去离子水离心、洗涤2~4次后，制备生成双链功能核酸纳米杆；

2.一种功能核酸纳米花的制备方法，其特征在于：以PCR扩增子为模板，在20~40℃环境中孵育15h以上，进行双链核酸纳米花的组装，随后加入去离子水离心、洗涤2~4次后，制备生成双链功能核酸纳米花；

所述洗涤过程是加入20 μL的去离子水在4℃条件下离心，12000 rpm/min， 30min，弃上清；

3.一种功能核酸纳米杆到功能核酸纳米花的形貌转换方法，其特征在于：以PCR指数期扩增期的扩增子为模板，添加0.5~2.0 mM焦磷酸根，置于20~40℃环境中孵育10~72 h，进行双链核酸纳米花的组装，随后加入去离子水离心、洗涤2~4次后，制备生成双链功能核酸纳米花；

4.一种功能核酸纳米花到功能核酸纳米杆的形貌转换方法，其特征在于：以PCR平台期的扩增子为模板，通过纯化步骤获得纯化子，置于功能核酸纳米杆生长体系中，20~40℃环境中孵育10~72 h，进行双链核酸纳米杆的组装，随后加入去离子水离心、洗涤2~4次后，制备生成双链功能核酸纳米杆；

所述纯化步骤为试剂盒纯化PCR扩增产物；

所述功能核酸纳米杆生长体系为：143 μL ddH₂O，20 μL PCR Buffer，17 μL Mg²⁺，20 μL PCR反应纯化子；

5.如权利要求1所述的功能核酸纳米杆的制备方法在杆状纳米材料制备中的应用。

6.如权利要求2所述的功能核酸纳米花的制备方法在花状纳米材料制备中的应用。

7.如权利要求3所述的功能核酸纳米杆到功能核酸纳米花的转换在纳米材料形貌控制中的应用。

8.如权利要求4所述的功能核酸纳米花到功能核酸纳米杆的转换在纳米材料形貌控制中的应用。

9.如权利要求1-4任一所述的以PCR双链扩增子为模板在功能核酸纳米材料制备及转换中的应用。