CN113173979A - 一种结核分枝杆菌抗原蛋白Rv1808及其表位肽的应用 - Google Patents

一种结核分枝杆菌抗原蛋白Rv1808及其表位肽的应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种结核分枝杆菌抗原蛋白Rv1808及其表位肽的应用。由所述Rv1808蛋白及其表位肽制备的检测试剂可广泛用于结核病的辅助诊断、流行病学监测等相关领域，Rv1808蛋白及其表位肽制备的结核疫苗和抗结核药物可用于结核病的预防和治疗。

Description

一种结核分枝杆菌抗原蛋白Rv1808及其表位肽的应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种结核分枝杆菌抗原蛋白Rv1808及其表位肽的应用。
背景技术
结核病(Tuberculosis，TB)是由结核分枝杆菌(Mycobacterium Tuberculosis，MTB)感染引起的以呼吸道传染为主的传染病，是单因致病率最高的慢性传染性疾病。据WHO估计，全世界约有三分之一人口为结核带菌者，其中约5-10％的携带者可发展为活动性结核病。中国作为全球结核病高负担国之一，肺结核病人的数量仅次于印度而位居世界第二。因此，研发适合中国人群的结核病疫苗和新型检测方法刻不容缓。
结核分枝杆菌属于胞内寄生菌，对其有效控制主要依赖于细胞免疫，其中CD8+细胞毒性T细胞(CTL)在清除结核菌中发挥着重要作用。抗原特异性CD8+CTL数量的多少和功能的强弱直接反映了人体特异性细胞免疫的功能状态，在监测疾病进程、指导治疗方案、评价临床疗效、预测疾病慢性转归以及疫苗效果评估等方面都有着不同于抗体的重要参考价值。鉴于CD8+T细胞在抗结核中发挥的重要作用，筛选中国人群高频HLA分型对应的CTL表位肽及其组合，并定期评估CTL表位肽刺激机体产生抗结核特异性CD8+T细胞的数目及功能的动态变化，在结核疫苗研制及后期疗效评估、疾病进展检测中均具有重要的意义。
目前已知的结核菌CTL表位肽主要是在欧美人群中鉴定，多为HLA-A*0201限制性，而对于结核病流行最严重的非洲和东南亚人群，并没有合适的表位肽可使用。HLA-A*2402是世界上分布最广泛的HLA抗原之一，特别在亚洲人群中；然而，已发现的HLA-A*2402特异的结核菌CD8细胞表位非常少。因此，鉴定HLA-A*2402限制性CTL表位对于研发适合中国人群的表位肽疫苗具有非常重要的意义。
发明内容
一方面，本申请提供了结核分枝杆菌Rv1808蛋白在制备结核测试剂、疫苗和/或药物中的应用。
结核分枝杆菌RV1808基因编码的PPE家族蛋白32(PPE32)蛋白属于PPE_SVP亚家族成员之一。
在一些实施方案中，所述Rv1808蛋白选自SEQ ID NO：5所示的序列，或将SEQ IDNO：5所示的序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的且与SEQID NO：5所示的序列具有相同功能的蛋白质。
一方面，本申请提供了一种结核分枝杆菌的表位肽，所述表位肽选自如SEQ IDNO：1-4任一所示的序列，或将SEQ ID NO：1-4任一所示的序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的且与取代和/或缺失和/或添加前的序列具有相同功能的表位肽中的至少一种。
T细胞无法识别完整的结核菌和蛋白抗原，而是识别经过抗原递呈细胞摄取和加工后释放出的结核表位肽。表位肽是抗原中引起免疫应答的核心部份，也称为抗原决定簇，它与抗原递呈细胞(APC)表面的MHC分子结合形成肽-MHC复合物并被递呈在APC细胞表面，进而活化T细胞，诱发T细胞免疫反应。CD4+T细胞识别MHC-II类分子递呈的表位肽，而CD8+T细胞识别MHC-I类分子递呈的表位肽。T细胞对表位肽的识别及其活化要求表位肽与抗原递呈细胞表面MHC分子稳定结合，而肽与MHC分子的亲和力是形成肽-MHC复合物的关键。
在一些实施方案中，所述表位肽选自如SEQ ID NO：1所示的序列，或将SEQ ID NO：1所示的序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的且与SEQ IDNO：1所示的序列具有相同功能的表位肽。
在一些实施方案中，本申请还提供了所述的表位肽在制备结核测试剂、疫苗和/或药物中的应用。
一方面，本申请提供了一种结核诊断试剂，所述诊断试剂中含有结核分枝杆菌蛋白Rv1808，或编码所述抗原蛋白Rv1808的DNA，或由含有所述DNA的重组菌产生的重组蛋白；和/或，所述表位肽，或编码所述表位肽的DNA，或由含有编码所述表位肽的DNA的重组菌产生的重组蛋白。
一方面，本申请提供一种结核疫苗，其有效成分为结核分枝杆菌蛋白Rv1808，或编码所述蛋白Rv1808的DNA，或由含有所述DNA的重组菌产生的重组蛋白；和/或，所述表位肽，或编码所述表位肽的DNA，或由含有编码所述表位肽的DNA的重组菌产生的重组蛋白。
一方面，本申请提供了一种检测受试者结核分枝杆菌感染的方法，包括检测对以下一个或几个选项的免疫应答：
(a)Rv1808蛋白；和
(b)SEQ ID NO：1-4任一所示的序列。
在一些实施方案中，所述方法包括检测对SEQ ID NO：1所示的序列的免疫应答。
在一些实施方案中，所述免疫应答为T细胞应答；在一些实施方案中，所述T细胞应答选自T细胞特异性识别MHC-抗原肽复合物、细胞因子分泌、T细胞增殖或T细胞杀伤中的至少一种；在一些实施方案中，所述T细胞特异性识别MHC-抗原肽复合物的检测方法为MHC四聚体检测；在一些实施方案中，所述细胞因子选自γ干扰素、白细胞介素2、白细胞介素4、白细胞介素10和肿瘤坏死因子α中的至少一种；所述细胞因子的检测方法选自酶联免疫斑点试验、酶联免疫吸附试验、免疫胶体金试验、细胞因子内染色和T细胞增殖试验中的至少一种；在一些实施方案中，所述T细胞增殖的检测方法选自CFSE细胞增殖实验；在一些实施方案中，所述T细胞杀伤的检测方法选自51Cr靶细胞杀伤实验。
在一些实施方案中，所述检测的样本选自外周血、静脉血、脑脊液、胸腔积液或胸水中的一种或几种。
本申请中的“检测”同诊断，包括结核的筛选、风险评估、预后、疾病识别、病症阶段的诊断和治疗性靶标的选择。
附图说明
图1为实施例2中4个表位肽在20个患者中的识别频数；
图2为实施例2中ELISpot检测SEQ ID NO：1IPGGWWLTF表位肽诱导结核患者T细胞分泌IFN-γ示意图
图3为实施例3中MHC四聚体检测结核患者PBMC中Seq ID No：1IPGGWWLTF特异性CD8+T细胞
具体实施方式
以下通过具体的实施例进一步说明本申请的技术方案，具体实施例不代表对本申请保护范围的限制。其他人根据本申请理念所做出的一些非本质的修改和调整仍属于本申请的保护范围。
实施例1
利用生物信息学方法，发明人研究分析了HLA-A*2402型MHC递呈的表位肽共计401个；对得分较高的40个表位肽利用Class I Immunogenicity进行免疫原性分析，选出了分值较高的4个9mer肽，如表1所示。用Net MHC 4.0分析表1中的4个肽与HLA-A*2402型MHC亲和力，其中Seq ID NO：1 IPGGWWLTF亲和力最高(％rank 0.4，BindLevel<＝SB)。
表1 9mer肽的基本信息
Figure BDA0003035009370000031
Figure BDA0003035009370000041
实施例2
ELISpot实验检测实施例1中的4条表位肽诱导T细胞分泌IFN-γ。
PBMC细胞分离及冻存：采用密度梯度法分离HLA-A*2402基因型结核患者外周血单核细胞(PBMC)。将收集的10ml外周血用PBS按1:1稀释，并将稀释后的外周血缓慢平铺至等体积淋巴细胞分离液上方，800g/min转速离心30min；用吸管小心吸取白膜层细胞至新的离心管中；加入5倍体积PBS洗涤，800g/min离心10min；重复洗涤一次，用冻存液(90％FBS+10％DMSO)冻存细胞，液氮存储。
ELISpot实验：复苏HLA-A*2402基因型患者PBMC，在37度，5％C02孵育箱中静置过夜。用去死细胞磁珠去除PBMC中的死细胞。细胞计数，完全培养基中重悬至1.25x106个/ml；向ELISA板中每孔加入200ul细胞悬液(2.5x105个/孔)，共12孔。将表1所示的4条候选多肽按10ug/ml浓度分别加入其中8孔中，每个肽段2个复孔；2个阳性对照孔分别加入4ug/ml植物凝集素(PHA)，2个阴性对照孔(NC)加入不含肽段的完全培养基；将ELISA培养板置培养箱中37度，5％CO2培养24h。取出ELISpot板，洗涤液洗3次，拍干后加入酶标抗IFN-γ抗体100ul，孵育2h，洗涤液洗3次，拍干加入100ul显色剂，待阳性对照孔出现明显斑点后，用超纯水终止反应；晾干，读板，计数，校正。特异性T细胞频率用106个PBMC细胞中斑点形成细胞(SFC/106)来表示。
阳性反应判断标准：①SFC/106>50；②肽刺激孔斑点数大于等于阴性对照孔的两倍。同时满足①②，反应判断为阳性。
用4个候选表位肽分别刺激20个HLA-A*2402结核患者PBMC，统计候选表位肽在20个患者中的识别频数。肽识别率＝阳性反应数/总的检测人数x100％，结果如图1所示。从图1中可以看出，本发明的4个表位肽均能被HLA-A*2402结核患者识别。
Seq ID NO：1(IPGGWWLTF)表位肽诱导HLA-A*2402结核患者T细胞分泌IFN-γ的结果如图2所示。
结合图1图2可见，Seq ID NO：1(IPGGWWLTF)表位肽可作为表位肽特异性的刺激HLA-A*2402结核患者PBMC分泌IFN-γ。
实施例3
MHC四聚体检测结核特异性T细胞。
复苏HLA-A*2402(+)基因型结核患者和HLA-A*2402(-)基因型结核患者PBMC，在10％FBS的RPMI-1640培养基中加入IL-2和PHA，扩培PBMC；分别用HLA-A*2402-MHCIPGGWWLTF四聚体检测HLA-A*2402(+)和HLA-A*2402(-)结核患者PBMC细胞；用HLA-A*2402-MHCKFIDTTSKF四聚体作为非相关肽段对照。
MHC四聚体检测Seq NO1(IPGGWWLTF)表位肽特异性CD8+T细胞：①离心收集PBMC细胞，用PBS洗涤2次，并以2-5×107/ml的密度重悬于FACS Buffer(PBS+2％小牛血清+0.1％叠氮钠)，制备成细胞悬浮液；②取25ul细胞悬浮液滴加入FACS试管；③制备2X StainingCocktail：FACS Buffer+MHC四聚体(稀释比例为1:50～1:100)+Anti-CD8/FITC抗体(Tonbo,catalog N:35-0086)；④取25ul 2x Staining Cocktail，滴加入步骤2中的FACS试管，与细胞悬浮液混匀；⑤在冰上或其他已通过实验优化确认的最佳温度条件下，避光孵育60分钟；⑥每孔加入150ul FACS Buffer至微孔培养板或2-3ml FACS Buffer至FACS试管，轻柔混匀，避免形成气泡，1200rpm离心5min，小心除去上清液，尽可能不要触碰到细胞沉淀，减少细胞损失；⑦重复步骤6，再洗涤2次；⑧将细胞重悬于200ul固定液(PBS+1％多聚甲醛(PFA))中，使用流式细胞仪进行样本分析。
结果显示，HLA-A*2402(+)结核患者PBMC中可以检测到明显数量的Seq ID NO：1(IPGGWWLTF)表位肽特异性CD8+T细胞，且特异性CD8+T细胞数量均显著高于在HLA-A*2402(-)结核患者PBMC中检测到的结果和用无关表位肽四聚体(HLA-A*2402-KFIDTTSKF-Tetramer)在HLA-A*2402(+)结核患者PBMC中检测到的结果。
鉴于可以应用所公开的发明的原理的许多可能的实施例，应当认识到，所示的实施例仅是本申请的优选示例，而不应视为限制本申请的范围。相反，本申请的范围由所附权利要求书限定。因此，我们要求保护所有落入这些权利要求的范围和精神内的发明。
序列表
<110> 广州好芝生物科技有限公司
<120> 一种结核分枝杆菌抗原蛋白Rv1808及其表位肽的应用
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 9
<212> PRT
<213> Mycobacterium tuberculosis
<400> 1
Ile Pro Gly Gly Trp Trp Leu Thr Phe
1 5
<210> 2
<211> 9
<212> PRT
<213> Mycobacterium tuberculosis
<400> 2
Ala Ala Ala Ala Ala Trp Asp Ala Leu
1 5
<210> 3
<211> 9
<212> PRT
<213> Mycobacterium tuberculosis
<400> 3
Thr Gly Gly Ile Ala Arg Ala Ile Tyr
1 5
<210> 4
<211> 9
<212> PRT
<213> Mycobacterium tuberculosis
<400> 4
Ala Ser Ala Gly Trp Asp Thr Val Leu
1 5
<210> 5
<211> 409
<212> PRT
<213> Mycobacterium tuberculosis
<400> 5
Met Asp Phe Gly Ala Leu Pro Pro Glu Ile Asn Ser Gly Arg Met Tyr
1 5 10 15
Ala Gly Pro Gly Ser Gly Pro Leu Leu Ala Ala Ala Ala Ala Trp Asp
20 25 30
Ala Leu Ala Ala Glu Leu Tyr Ser Ala Ala Ala Ser Tyr Gly Ser Thr
35 40 45
Ile Glu Gly Leu Thr Val Ala Pro Trp Met Gly Pro Ser Ser Ile Thr
50 55 60
Met Ala Ala Ala Val Ala Pro Tyr Val Ala Trp Ile Ser Val Thr Ala
65 70 75 80
Gly Gln Ala Glu Gln Ala Gly Ala Gln Ala Lys Ile Ala Ala Gly Val
85 90 95
Tyr Glu Thr Ala Phe Ala Ala Thr Val Pro Pro Pro Val Ile Glu Ala
100 105 110
Asn Arg Ala Leu Leu Met Ser Leu Val Ala Thr Asn Ile Phe Gly Gln
115 120 125
Asn Thr Pro Ala Ile Ala Ala Thr Glu Ala His Tyr Ala Glu Met Trp
130 135 140
Ala Gln Asp Ala Ala Ala Met Tyr Gly Tyr Ala Gly Ser Ser Ala Thr
145 150 155 160
Ala Ser Gln Leu Ala Pro Phe Ser Glu Pro Pro Gln Thr Thr Asn Pro
165 170 175
Ser Ala Thr Ala Ala Gln Ser Ala Val Val Ala Gln Ala Ala Gly Ala
180 185 190
Ala Ala Ser Ser Asp Ile Thr Ala Gln Leu Ser Gln Leu Ile Ser Leu
195 200 205
Leu Pro Ser Thr Leu Gln Ser Leu Ala Thr Thr Ala Thr Ala Thr Ser
210 215 220
Ala Ser Ala Gly Trp Asp Thr Val Leu Gln Ser Ile Thr Thr Ile Leu
225 230 235 240
Ala Asn Leu Thr Gly Pro Tyr Ser Ile Ile Gly Leu Gly Ala Ile Pro
245 250 255
Gly Gly Trp Trp Leu Thr Phe Gly Gln Ile Leu Gly Leu Ala Gln Asn
260 265 270
Ala Pro Gly Val Ala Ala Leu Leu Gly Pro Lys Ala Ala Ala Gly Ala
275 280 285
Leu Ser Pro Leu Ala Pro Leu Arg Gly Gly Tyr Ile Gly Asp Ile Thr
290 295 300
Pro Leu Gly Gly Gly Ala Thr Gly Gly Ile Ala Arg Ala Ile Tyr Val
305 310 315 320
Gly Ser Leu Ser Val Pro Gln Gly Trp Ala Glu Ala Ala Pro Val Met
325 330 335
Arg Ala Val Ala Ser Val Leu Pro Gly Thr Gly Ala Ala Pro Ala Leu
340 345 350
Ala Ala Glu Ala Pro Gly Ala Leu Phe Gly Glu Met Ala Leu Ser Ser
355 360 365
Leu Ala Gly Arg Ala Leu Ala Gly Thr Ala Val Arg Ser Gly Ala Gly
370 375 380
Ala Ala Arg Val Ala Gly Gly Ser Val Thr Glu Asp Val Ala Ser Thr
385 390 395 400
Thr Thr Ile Ile Val Ile Pro Ala Asp
405

Claims (9)

1.结核分枝杆菌Rv1808蛋白在制备结核测试剂、疫苗和/或药物中的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述Rv1808蛋白选自SEQ ID NO：5所示的序列，或
将SEQ ID NO：5所示的序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的且与SEQ ID NO：5所示的序列具有相同功能的蛋白质。
3.一种结核分枝杆菌的表位肽，其特征在于，所述表位肽选自如SEQ ID NO：1-4任一所示的序列，或
将SEQ ID NO：1-4任一所示的序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的且与取代和/或缺失和/或添加前的序列具有相同功能的表位肽中的至少一种。
4.如权利要求3所述的表位肽，其特征在于，所述表位肽选自如SEQ ID NO：1所示的序列，或
将SEQ ID NO：1所示的序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的且与SEQ ID NO：1所示的序列具有相同功能的表位肽。
5.如权利要求3或4任一所述的表位肽在制备结核测试剂、疫苗和/或药物中的应用。
6.一种结核诊断试剂，其特征在于，所述诊断试剂中含有结核分枝杆菌蛋白Rv1808，或编码所述抗原蛋白Rv1808的DNA，或由含有所述DNA的重组菌产生的重组蛋白；和/或，
权利要求3或4任一所述表位肽，或编码所述表位肽的DNA，或由含有编码所述表位肽的DNA的重组菌产生的重组蛋白。
7.一种结核疫苗，其特征在于，其有效成分为结核分枝杆菌蛋白Rv1808，或编码所述蛋白Rv1808的DNA，或由含有所述DNA的重组菌产生的重组蛋白；和/或，
权利要求3或4任一所述表位肽，或编码所述表位肽的DNA，或由含有编码所述表位肽的DNA的重组菌产生的重组蛋白。
8.一种检测受试者结核分枝杆菌感染的方法，包括检测对以下一个或几个选项的免疫应答：
(a)Rv1808蛋白；和
(b)SEQ ID NO：1-4任一所示的序列。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，包括检测对SEQ ID NO：1所示的序列的免疫应答；
优选地，所述免疫应答为T细胞应答；
优选地，所述T细胞应答选自T细胞特异性识别MHC-抗原肽复合物、细胞因子分泌、T细胞增殖或T细胞杀伤中的至少一种；
优选地，所述T细胞特异性识别MHC-抗原肽复合物的检测方法为MHC四聚体检测；
优选地，所述细胞因子选自γ干扰素、白细胞介素2、白细胞介素4、白细胞介素10和肿瘤坏死因子α中的至少一种；
优选地，所述细胞因子的检测方法选自酶联免疫斑点试验、酶联免疫吸附试验、免疫胶体金试验、细胞因子内染色和T细胞增殖试验中的至少一种；
优选地，所述T细胞增殖的检测方法选自CFSE细胞增殖实验；
优选地，所述T细胞杀伤的检测方法选自51Cr靶细胞杀伤实验。
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US20140004151A1 (en) * 2011-09-30 2014-01-02 La Jolla Institute For Allergy And Immunology Antigens and Epitopes Derived From Mycobacterium Tuberculosis
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