CN105031610B

CN105031610B - 侵润宫颈恶性肿瘤的t细胞所靶向的用于疫苗的hpv表位

Info

Publication number: CN105031610B
Application number: CN201510487487.5A
Authority: CN
Inventors: 斯约尔格德·亨利库斯·万德伯格; 戈玛·G·肯特尔; 柯内利斯·约翰尼斯·玛利亚·麦莱弗
Original assignee: Leids Universitair Medisch Centrum LUMC
Current assignee: Isa Pharmaceutical Co ltd
Priority date: 2007-05-31
Filing date: 2008-05-27
Publication date: 2020-06-19
Anticipated expiration: 2028-05-27
Also published as: JP2010527630A; WO2008147187A1; EP3584251A2; CA3167595A1; AU2008257792A1; CA3016942C; US10258684B2; CN101765607A; AU2008257792B2; EP3584251A3; EP2468763A3; ES2496916T3; JP2015147786A; US20200289640A1; EP2757109A2; ES2411059T3; JP6035503B2; CN105031610A; CN111686244A; US20150056234A1

Abstract

本发明涉及对HPV特异性E6和E7癌蛋白具有特异性的新的CD4⁺和CD8⁺T细胞表位，涉及包含这些新的T细胞表位的肽，以及涉及包含这些肽、用于预防和/或治疗HPV相关疾病的(疫苗)组合物。优选的表位由侵润宫颈瘤病变的T细胞或由来自引流淋巴结的T细胞识别，并由HLA‑DQ或HLA‑DP分子或HLA‑B呈递。

Description

侵润宫颈恶性肿瘤的T细胞所靶向的用于疫苗的HPV表位

发明领域

本发明涉及医药和免疫学领域。特别涉及可用于预防、治疗和/或诊断HPV相关疾病的新的HPV表位。

发明背景

宫颈癌是全世界第二高发的癌症(Bosch et al.2003)。在大约三分之二的患者中，宫颈癌的致病原因是高风险的16型和18型人乳头状瘤病毒(human papilloma virus,HPV)(Bosch et al.1995,Munoz et al.2003)。HPV基因组编码2种致癌蛋白，E6和E7，由于它们是恶性细胞表型的发作和维持所需的，因此其在高级宫颈病变和宫颈癌中组成性表达(Zur Hausen,1996)。

这些癌蛋白的肿瘤特异性表达，以及在几乎二分之一的宫颈癌患者的外周血中检测到低水平的E6-和E7特异循环性T细胞的存在(de Jong et al.2004,van der Berg etal.2001,Welters et al.2003,Welters et al.2006，Ressing et al.1996,Bontkes etal.2000,Luxton et al.1996)，表明它们可能充当肿瘤排斥抗原。然而，循环的HPV特异性T细胞的存在并不意味着它们有助于抗肿瘤应答。为了控制疾病，这些T细胞应当至少能够深入肿瘤位点。事实上，一定比例的宫颈癌为淋巴细胞所侵润(Bethwaite et al.1996,Chaoet al.1999,Piersma et al.2007)，但或许是由于从肿瘤组织中建立T细胞培养物相对困难，因而对侵润这些宫颈肿瘤的T细胞的特异性和类型尚缺少透彻的了解。然而，一些早期的先行者能够从肿瘤中分离到HPV特异性的肿瘤侵润性淋巴细胞(tumor infiltratinglymphocytes,TIL)，结果是鉴定出HPV16的两个单独的CD8⁺T细胞表位(Evans et al.1997,Oerke et al.2005)和两个低流行高风险HPV59和HPV33亚型的CD4T细胞表位(Hohn etal.1999,Hohn et al.2000)。然而，迫切需要对侵润宫颈组织侵润性淋巴细胞(cervicaltissue-infiltrating lymphocytes)开展更大规模的研究，以便了解HPV特异的适应性免疫应答在宫颈癌中的作用和角色。此外，这将允许合理地设计成功的免疫干涉策略。

最近的研究表明，两种细胞因子即IL-7和IL-15在CD4⁺和CD8⁺效应记忆T细胞(effector memory T cells)的扩增和存活中发挥主要作用。IL-7为效应T细胞提供存活信号(Li et al.2003)。IL-15是启动T细胞分裂的重要生长因子，并且与通常用于扩增TIL培养物的IL-2相反，其不限制T细胞的连续扩增(Li et al.2001)。而且，IL-15也能作为CD8(⁺)记忆T细胞的抗原非依赖性激活剂(Liu et al.2002)。总之，IL-7和IL-15能够与非常高效的效应记忆T细胞一起扩增，而中枢记忆T细胞的应答性更小并且天然T细胞不能对这些细胞因子的刺激作出应答(Geginat et al.2001,McKinlay et al.2007,Bacchetta etal.2002)。

以往的许多研究已经报道了II型MHC(MHC class II)限制来自外周血单核细胞(PBMC)的T细胞识别由HPV16和/或对E7蛋白的序列所组成的合成肽。

WO 02/070006公开了针对由HPV16E6蛋白的127-142位氨基酸组成的肽的DR1限制性应答，针对由HPV16E7蛋白的35-50位氨基酸组成的肽的DQ2限制性应答，针对由HPV16E7蛋白的43-77位氨基酸组成的肽的DR3限制性应答，以及针对由HPV16E7蛋白的50-62位氨基酸组成的肽的DR15限制性应答。

Strang等公开了无症状个体PBMC中针对由HPV16E6蛋白的42-57位氨基酸组成的肽的DR7限制性应答。

Altmann等公开了DR1/DR11型无症状个体PBMC中针对由HPV16E7蛋白的5-18位氨基酸组成的肽的应答，DR4/DR13型无症状个体PBMC中针对由HPV16E7蛋白的17-34位氨基酸组成的肽的应答，以及DR4/DR13型无症状个体PBMC中针对由HPV16E7蛋白的69-82位氨基酸组成的肽的应答。

WO 02/090382公开了来自HPV16E6和E7蛋白的一系列重叠肽对白种人群体中最普遍的HLA-DR分子的结合亲和性。WO 02/090382还报道了患有鲍恩样丘疹病(bowenoidpapulosis)患者的贫CD8PBMC中针对许多HPV 16E6和E7肽的应答。

然而仍需要对HPV相关恶性肿瘤中肿瘤侵润性淋巴细胞的存在、类型和特异性进行了解，优选对诸如HPV 16、18、31、33和45等更流行的高风险亚型进行了解。本发明的目的是提供作为肿瘤侵润性淋巴细胞的靶标并可以用于预防、治疗和/或诊断HPV相关疾病的HPV表位。

发明概述

本发明提供了新的T细胞表位，其是基于我们对一大组患有宫颈恶性肿瘤的70例患者中宫颈侵润性淋巴细胞的存在和HPV16或HPV18特异性的分析而鉴定的。我们发现，这些侵润性淋巴细胞包含HPV特异性T细胞。在更详细的分析中，我们鉴定出17个新的CD4⁺和CD8⁺T细胞表位及它们的HLA限制性元件(restriction elements)，而且还揭示了针对E6和E7癌蛋白所有部件的HPV特异性免疫应答。出乎预料的是，绝大数CD4⁺T细胞表位在HLA-DQ和HLA-DP分子较少表达的情况下呈递。由于所鉴定的T细胞表位构成了针对HPV16和HPV18阳性肿瘤的免疫应答中的生理靶标，对于优化HPV相关疾病的预防和HPV相关疾病患者的免疫疗法而言，它们是有价值的靶标。

一方面，本发明由此涉及最近鉴定的HPV的CD4⁺Th和CD8⁺CTL细胞表位的氨基酸序列，以及HPV衍生的合成的肽，并且包含这些肽的免疫原性组合物也是本发明的一部分。在患有HPV相关疾病包括HPV相关恶性肿瘤的广泛患者中给药后，这类肽使CD8⁺CTL效应应答和记忆应答大幅改善、增强且延长。作为CD4⁺Th应答的结果，此类肽也能诱导更可能被效应细胞侵润的大幅改善的促炎微环境。

既然本发明的肽优选单独或组合用作疫苗或者用作免疫原性组合物的一部分，因此该肽优选称为疫苗肽，而该组合物则优选称为疫苗组合物。

高度优选将相对短的肽用于医药目的，因为这些相对短的肽可以在体外有效地合成，这对大于100个氨基酸的天然蛋白而言是不可能的或者是不经济的。肽的化学合成是常规方法并且本领域技术人员已知各种合适的方法。肽的化学合成也克服了与重组生产完整蛋白有关的问题，重组生产难于标准化并需要繁复的纯化和质量控制手段。如WO02/070006所阐述的那样，长度超过I型HLA和II型HLA表位长度(例如，具有下文所述长度)的肽特别有利于用作疫苗组分，因为它们大到足以被专门的抗原呈递细胞，特别是DC摄取，并且在所含的I型HLA和II型HLA表位发生细胞表面呈递前，就在DC中进行了加工。由此，应用本发明的具有本文所述长度(如Zwaveling et al.,2002,J.Immunol.169:350所示)的肽防止非抗原呈递细胞上最小I型HLA表位(minimal HLA I epitope)的系统性呈递不利地诱导T细胞耐受性(如Toes et al.,1996,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 93:7855和Toes et al.,1996,J.Immunol.156:3911所示)。包含不被呈递至CTL和/或Th细胞的T细胞受体的表位的肽，优选具有足以同时含有I型HLA表位和II型HLA表位的长度。

本发明的第一方面提供了包含连续氨基酸序列的肽，所述连续氨基酸序列选自HPV E6和E7蛋白中至少之一的全长氨基酸序列。优选所述连续氨基酸序列选自高风险HPV血清型例如血清型16、18、31、33或45的HPV E6和E7蛋白的全长氨基酸序列，更优选选自HPVE6和E7血清型16、18、31或33的氨基酸序列，最优选选自HPV血清型16或18的氨基酸序列，其中血清型16是最优选的。HPV血清型16的E6和E7蛋白的氨基酸序列分别记录在SEQ ID Nos:1和2中。HPV血清型18E6和E7蛋白的氨基酸分别记录在SEQ ID Nos:3和4中。

优选地，该肽包含至少一个II型HLA Th细胞表位和/或至少一个I型HLA细胞毒性T细胞表位，优选下文更详细限定的表位。优选该肽的长度不超过100个氨基酸，并包含选自上述HPV蛋白中之一的氨基酸序列的至少19个连续氨基酸，其中该肽优选包含II型HLA表位和I型HLA表位中至少之一，更优选既包含II型HLA表位中至少之一又包含至少一个I型HLA表位，最优选(但不是必需的)包含两个来自上述HPV蛋白之一的氨基酸序列的表位。更优选地，在肽中，至少一个II型HLA表位和至少一个I型HLA表位存在于来自上述HPV蛋白之一的氨基酸序列的连续氨基酸序列中。为了便于阐述，本发明的肽优选包含I型HLA呈递表位和/或II型HLA呈递表位。这些表位中的每一个都是可呈递的且在经过本文所述加工后将与存在于细胞上的相应特异性HLA分子结合。在本发明的上下文中，HLA单倍型特异性表位因而也可以称为与HLA单倍型结合、由其呈递和/或受其限制的表位。

在本发明的上下文中，“肽的长度不超过100个氨基酸”优选意指，源自HPV蛋白并存在于本文所述肽中的连续氨基酸的数量是100、98、96、94、92、90或更少。由此，通过限定，本文所述肽不同于全长HPV蛋白。除源自HPV蛋白的氨基酸外，此类肽还可以包含其他氨基酸，或者可以完全由源自HPV蛋白的氨基酸序列构成或组成。该肽所包含的来自上述HPV蛋白中之一的连续氨基酸序列的长度优选是至少19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44或45个氨基酸和/或优选不超过100、99、98、97、96、95、94、93、92、91、90、89、88、87、86、85、84、83、82、81、80、60、50、45、40、35、33或30个氨基酸，更优选该肽所包含的来自上述HPV蛋白中之一的连续氨基酸序列的长度是19-45，甚至更优选是22-40个氨基酸，甚至更优选30-35个，最优选33-35个氨基酸。在另一优选实施方案中，本发明的肽由任何来自本文所述HPV蛋白的连续氨基酸序列组成，由此可以理解，该来自HPV蛋白的连续氨基酸序列的任一末端都没有添加氨基酸，该氨基酸在天然HPV蛋白序列中不与这种氨基酸序列邻接。本发明的肽易于合成并大到足以被专门的抗原呈递细胞摄取，被蛋白酶体加工，并且具有的物理性能和长度足以含有至少一个I型HLA和/或至少一个II型HLA表位。任选地，肽可以包含N或C末端延伸，其可以是氨基酸、经修饰的氨基酸或其他例如可以增强生物利用度、细胞摄取、加工和/或溶解性的功能基团。

本发明优选肽的长度不超过100、98、96、94、92个氨基酸并包含来自HPV E6和E7蛋白中至少之一的氨基酸序列的至少19个连续氨基酸，其中该连续氨基酸序列包含T细胞识别的表位，所述T细胞侵润宫颈瘤病变，或所述T细胞存在于或分离自骨盆区的淋巴结，所述淋巴结从宫颈瘤病变中引流，优选所述T细胞存在于或分离自包含转移性肿瘤细胞的引流淋巴结。本发明的肽优选用于诱导T细胞应答。

在本发明另一优选的肽中，连续氨基酸序列包含选自如下的表位：HPV E6蛋白的11-32位氨基酸、HPV E6蛋白的37-68位氨基酸、HPV E6蛋白的52-61位氨基酸、HPV E6蛋白的51-72位氨基酸、HPV E6蛋白55-86的位氨基酸、HPV E6蛋白的61-82位氨基酸、HPV E6蛋白的71-92位氨基酸、HPV E6蛋白73-105的位氨基酸、HPV E6蛋白91-112的位氨基酸、HPVE6蛋白的101-122位氨基酸、HPV E6蛋白的121-142位氨基酸、HPV E6蛋白的129-138位氨基酸、HPV E7蛋白的1-32位氨基酸、HPV E7蛋白的21-42位氨基酸、HPV E7蛋白的51-72位氨基酸、HPV E7蛋白的76-86位氨基酸、HPV E6蛋白的13-22位氨基酸、HPV E6蛋白的29-38位氨基酸、HPV E6蛋白的52-61位氨基酸、HPV E6蛋白的129-138位氨基酸、HPV E6蛋白的137-146位氨基酸、HPV E6蛋白的149-158位氨基酸以及HPV E7蛋白的11-19位氨基酸。仍然在本发明另一优选的肽中，连续氨基酸序列包含选自SEQ ID Nos:5-26的表位。

本发明优选的肽包含至少II型HPV特异性CD4⁺Th细胞表位。优选地，包含于本发明肽中的II型CD4⁺Th细胞表位能够诱导或激活HPV相关疾病人类患者和/或健康对照中的CD4⁺Th细胞。所述激活优选离体(ex vivo)或在体内进行评估，更优选地在患有诸如HPV相关恶性肿瘤之类的HPV相关疾病的人类患者中评估，其中感染的细胞和/或肿瘤细胞表达上述HPV蛋白。最优选地，II型HLA表位能够激活CD4⁺Th记忆应答和/或CD4⁺Th效应应答，即激活CD45RO阳性CD4⁺Th细胞。这将通过“杀伤许可”(license to kill)信号经DC的CD40触发(Lanzavecchia,1998)导致更强的CD8⁺效应和记忆CTL应答。在另一情况(setting)中，激活的CD4⁺Th细胞可以激活免疫系统的非HLA限制性杀伤细胞(non-HLA restricted killercell)。

包含于本发明肽(的连续序列)中的优选II型CD4⁺Th细胞表位选自：HPV E6蛋白的11-32位氨基酸、HPV E6蛋白的37-68位氨基酸、HPV E6蛋白的52-61位氨基酸、HPV E6蛋白的51-72位氨基酸、HPV E6蛋白的55-86位氨基酸、HPV E6蛋白的61-82位氨基酸、HPV E6蛋白的71-92位氨基酸、HPV E6蛋白的73-105位氨基酸、HPV E6蛋白的91-112位氨基酸、HPVE6蛋白的101-122位氨基酸、HPV E6蛋白的121-142位氨基酸、HPV E6蛋白的129-138位氨基酸、HPV E7蛋白的1-32位氨基酸、HPV E7蛋白的21-42位氨基酸、HPV E7蛋白的51-72位氨基酸以及HPV E7蛋白的76-86位氨基酸。包含于本发明肽(的连续序列)中的更优选的II型CD4⁺Th细胞表位选自SEQ ID Nos:5-21。

包含于本发明肽(的连续序列)中的另一优选II型CD4⁺Th细胞表位是受选自DR4、DR7、DR12、DR15、DP1、DP0201、DP4、DP14、DP1401、DP17、DQ5、DQ6、DP1901、DQ*0301、DQ*0302、DQ*0308、DQ*0501的单倍型限制的表位。包含于本发明肽(的连续序列)中的另一优选II型CD4⁺Th细胞表位是受DP或DQ单倍型限制的表位，其中DP1、DP0201、DP4、DP14、DP1401、DP17、DQ5、DQ6、DP1901、DQ*0301、DQ*0302、DQ*0308以及DQ*0501是更优选的。之前公开的HLA-DQ限制性表位(WO 02/070006)由HPV16E7蛋白的35-50位氨基酸组成。然而该表位是由外周T细胞识别的表位，而不是由侵润宫颈瘤病变的T细胞或存在于或分离自骨盆区淋巴结的T细胞识别的表位，所述淋巴结从宫颈瘤病变中引流。因此本发明肽的连续序列优选不包含由HPV16E7蛋白的35-50位氨基酸组成的表位。因此，包含于本发明肽(的连续序列)中的优选II型CD4⁺Th细胞表位是受DP或DQ单倍型限制而不是受DR单倍型限制的表位。已知HLA-DR分子的表达在肿瘤细胞中被上调。此处的呈递，与非专门的抗原呈递细胞(AntigenPresenting Cells,APC)中的抗原呈递一样，导致耐受性的诱导。HLA-DP或-DQ分子的表达低得多，但在诸如DC之类专门的APC上呈递时，HLA-DQ和HLA-DP表位可以导致有效的免疫应答。

包含于本发明肽(的连续序列)中的仍然另一优选II型CD4⁺Th细胞表位是受DP或DQ单倍型限制的表位，且是HPV E6或E7蛋白的表位，更优选HPV血清型16、18、31、33或45的E6或E7蛋白的表位，以及最优选HPV血清型16或18的E6或E7蛋白的表位，其中HPV血清型16是最优选的。

包含于本发明肽(的连续序列)中的又一优选II型CD4⁺Th细胞表位是选自下述的表位：HPV E6蛋白的11-32位氨基酸、HPV E6蛋白的37-68位氨基酸、HPV E6蛋白的52-61位氨基酸、HPV E6蛋白的51-72位氨基酸、HPV E6蛋白的61-82位氨基酸、HPV E6蛋白的71-92位氨基酸、HPV E6蛋白的73-105位氨基酸、HPV E6蛋白的91-112位氨基酸、HPV E6蛋白的101-122位氨基酸、HPV E6蛋白的121-142位氨基酸、HPV E7蛋白的1-32位氨基酸以及HPVE7蛋白的51-72位氨基酸。包含于本发明肽(的连续序列)中的更优选的II型CD4⁺Th细胞表位选自SEQ ID Nos:5、6、7、9、10、11、12、13、16、18、19、20和21。

在另一优选的实施方案中，本发明的肽包含至少I型HPV特异性CD8⁺CTL表位。另外，所述I型HLA表位优选能够激活CD8⁺CTL应答。最优选地，在健康对照个体中，甚至更优选在患有诸如HPV相关恶性肿瘤的HPV相关疾病的人类患者中，CTL的激活能力已经离体和/或体内证明，其受感染的细胞和/或肿瘤细胞表达上述HPV蛋白。由于在发动和维持有效CTL细胞应答中的协同作用，已经发现在一种肽中同时存在I型HLA和II型HLA表位是特别有利的(如Zwaveling et al.,2002所示)。

包含表位的肽优选满足多项要求，所述表位将被呈递至CTL和/或Th细胞的T细胞受体。肽的长度优选足以含有I型HLA和II型HLA表位。此外，肽优选在其I型HLA结合部分中包含锚定残基，以便能分别结合I型分子。肽和呈递的MHC分子之间相互作用的稳定性优选足以产生显著而有效的免疫应答。因而在本发明的上下文中，肽和呈递的MHC分子之间相互作用的稳定性优选为肽具有中度至高度结合亲和性，由此IC₅₀≤约5μM被认为是高度亲和性，约5μM<IC₅₀≤约15μM被认为是中度结合亲和性，约15μM<IC₅₀≤100μM被认为是低结合亲和性，而IC₅₀>约100μM则被认为是没有结合亲和性，据此肽对MHC分子的结合亲和性按照vander Burg et al.,1995和Kessler et al.,2003所述来确定。

产生表位C末端的特异性蛋白酶体切割位点优选正好处于表位氨基酸序列之后，以便从更大的肽中得以释放并呈递于I型HLA分子上。对II型HLA呈递的表位而言，长度要求则宽松的多，因此对精确地酶促产生II型结合肽的需要，没那么绝对。这些要求已经应用于本发明中，以便在HPV蛋白的全长序列中特别是在HPV E6和E7蛋白中定位和设计肽，所述肽包含优选的CTL和Th细胞表位和/或其组合并由此成为高度适合接种目的的肽。

此外，优选利用体外或离体T细胞实验证实本发明肽诱导CD4⁺Th和CD8⁺CTL实质性应答能力。由此本发明在选择相对短的肽方面提供了明显改善，所述相对短的肽可以化学合成的包含最具潜力并可最广泛使用的衍生于HPV E6和E7肿瘤抗原的I型HLA和/或II型HLA呈递的T细胞表位。肽在蛋白酶体切割方面进行特别优化并优选含有I型HLA和II型HLA表位中至少之一并且更优选既含有I型HLA表位又含有II型HLA表位。本发明肽所含有的CTL表位经20S蛋白酶体释放C末端而提供具有CD8⁺CTL刺激能力的I型HLA结合片段。

本发明HPV肽中的I型HLA表位优选能呈递于在待治疗人类群体中占优势的HLA等位基因上。源自本发明肽的HPV中的优选I型H LA表位是能结合HLA-A2、HLA-B7、HLA-B14、HLA-B32、HLA-B57和HLA*0201的表位。最优选的I型HLA CTL表位是结合HLA-B的HPV表位，其中HLA-B7、HLA-B14、HLA-B32、HLA-B57是最优选的。I型HLA表位优选具有高度肽结合能力(IC₅₀≤约5μM的肽)或具有至少中度亲和性(5μM<IC₅₀≤约15μM的肽)。包含于本发明肽(的连续序列)中的优选的I型CTL表位是如上所述受I型单倍型限制的表位，并且是HPV E6或E7蛋白的表位，更优选是HPV血清型16、18、31、33或45的E6或E7蛋白的表位，最优选HPV血清型16或18的E6或E7蛋白的表位，其中血清型16是最优选的。

包含于本发明肽(的连续序列)中的优选的I型CTL表位选自：HPV E6蛋白的11-32位氨基酸、HPV E6蛋白的29-38位氨基酸、HPV E6蛋白的52-61位氨基酸、HPV E6蛋白的129-138位氨基酸、HPV E6蛋白的137-146位氨基酸、HPV E6蛋白的149-158位氨基酸以及HPV E7蛋白的11-19位氨基酸。包含于本发明肽(的连续序列)中更优选的II型CD4⁺Th细胞表位选自SEQ ID Nos:7、14、22-26。

包含于本发明肽中的优选表位是由HLA-B分子呈递的表位。优选地，HLA-B分子是HLA-B7、HLA-B14、HLA-B27或HLA-B57分子。此类表位选自SEQ ID Nos:7、22、24、25和26。

包含于本发明肽中的另一优选表位是由HLA-A分子呈递的表位。优选地，HLA-A分子是HLA-A2或HLA*0201分子。此类表位选自SEQ ID Nos:23和26。

根据更优选的实施方案，本发明肽的长度不超过100、98、96、94、92个氨基酸，并包含来自HPV蛋白的连续氨基酸序列，所述连续氨基酸序列选自：HPV E6蛋白的1-32位氨基酸、HPV E6蛋白的19-50位氨基酸、HPV E6蛋白的41-65位氨基酸、HPV E6蛋白的55-80位氨基酸、HPV E6蛋白的71-95位氨基酸、HPV E6蛋白的85-109位氨基酸、HPV E6蛋白的91-122位氨基酸、HPV E6蛋白的109-140位氨基酸、HPV E6蛋白的127-158位氨基酸、HPV E7蛋白的1-35位点氨基酸、HPV E7蛋白的22-56位氨基酸、HPV E7蛋白的43-77位氨基酸以及HPV E7蛋白的64-98位氨基酸。更优选，本发明的肽由来自HPV蛋白的连续氨基酸序列组成，所述连续氨基酸序列选自：HPV E6蛋白的1-32位氨基酸、HPV E6蛋白的19-50位氨基酸、HPV E6蛋白的41-65位氨基酸、HPV E6蛋白的55-80位氨基酸、HPV E6蛋白的71-95位氨基酸、HPV E6蛋白的85-109位氨基酸、HPV E6蛋白的91-122位氨基酸、HPV E6蛋白的109-140位氨基酸、HPV E6蛋白的127-158位氨基酸、HPV E7蛋白的1-35位点氨基酸、HPV E7蛋白的22-56位氨基酸、HPV E7蛋白的43-77位氨基酸以及HPV E7蛋白的64-98位氨基酸。HPV E6或E7蛋白的连续氨基酸序列优选是HPV血清型16、18、31、33或45的连续氨基酸序列，最优选HPV血清型16或18的连续氨基酸序列，其中HPV血清型16是最优选的。

对本领域技术人员来说显而易见的是，一旦本文所限定的肽中的表位存在于所述肽中，则本文所限定的肽便具有与所述肽中的表位(例如本发明中，被鉴定为HLA-DQ和HLA-DP分子中至少之一所呈递的和/或侵润宫颈瘤病变的T细胞或来自引流淋巴结的T细胞所识别的表位)存在有关的期望且有利的性质。本发明的肽优选用于诱导T细胞应答。

本领域技术人员应当理解，即便本申请没有鉴定出每个可设计成包含本文所鉴定的期望表位或由该表位组成的肽，但本发明囊括了本文所限定的包含本文所鉴定的表位或由所述表位组成的任何肽。在优选实施方案中，肽不同于HPV蛋白。在另一优选实施方案中。肽不包含HPV16E7的35-50位氨基酸或不是由所述氨基酸组成。

例如，一优选表位是SEQ ID NO:5(HPV 16E6的11-32位氨基酸)。该段是阐述性的且可应用于本文所鉴定的每一表位。包含SEQ ID No:5的任何肽都包括于本发明中，且可以根据本发明来使用。在该优选实施方案中，肽与HPV蛋白不同。本发明肽的优选氨基酸长度已经在本文中作了限定。当设计本发明的肽时，该肽可以从本发明所鉴定的给定表位的N末端位点开始或者在本文所鉴定的给定表位的C末端结束。可选地，给定的表位(例如SEQ IDNO:5)可以包含于本发明的肽中。以SEQ ID NO:5为例，如果我们设计长度为45个氨基酸的肽，此类肽可以包含来自HPV16E6的11-56、1-45、2-46、3-47、4-48、5-49、5-50位氨基酸或由其组成。本发明的肽还可以包含本文所限定的或本领域技术人员已知的任何其他HPV表位。

在该优选实施方案中(SEQ ID NO:5作为表位)，肽不包含US2005/0142541所公开的HPV16E6的9-33位氨基酸或由其组成。在该优选实施方案中，肽不包含EP451550所公开的HPV16E6的1-37位氨基酸或由其组成。在该优选实施方案中，肽不包含括US5,629,161所公开的HPV16E6的8-37位氨基酸或由其组成。在优选实施方案中，包含SEQ ID NO:5的肽包含10-32、1-32、1-45、11-56、2-46、3-47、5-49、5-50或由其组成，数字表示HPV16E6的启始或终止氨基酸。

在另一优选实施方案中(以SEQ ID NO:8作为表位，HPV16E6的55-86位氨基酸)，肽不包含uniprot所公开的登录号为Q919B2(1-99，该数字代表HPV16E6的启始或终止氨基酸)或Q80882(1-84)的HPV 16E6的片段或由其组成。对于该实施方案来说，包含SEQ ID NO:8的肽也可以从该表位N末端位点启始，或者在该表位的C末端位点结束，或者该表位可以存在于该肽中。例如，如果我们设计长度为45个氨基酸的肽，此类肽可以包含55-100、41-86、45-90或由其组成，数字表示HPV16E6蛋白氨基酸序列的启始或终止氨基酸。

本发明HPV衍生的肽可以通过一个或多个氨基酸的缺失或取代或者通过其它氨基酸或功能基团在N末端或C末端延伸来进行修饰，所述其它氨基酸或功能基团可以提高生物利用度从而靶向T细胞，或者包含或释放提供辅助或(共)刺激作用的免疫调节物质。N末端和/或C末端处可选的其它氨基酸优选不存在于HPV蛋白天然氨基酸序列的相应位置上，更优选它们不是来自任何HPV E6或E7氨基酸序列(例如SEQ ID Nos:1-4)。本领域技术人员应当理解，各种HPV血清型的HPV氨基酸序列都清楚地包括于本发明中。

本发明HPV衍生的肽可通过化学合成和随后纯化的方式而得到(例如，参见实施例1)。本发明HPV衍生的肽优选可以溶解于生理上可接受的包含不超过35％、20％、10％、5％或0％DMSO的水溶液中(例如PBS)。在此类溶液中，肽优选是可溶的，浓度至少为0.5、1、2、4或8mg/ml肽。更优选地，一种以上不同的本发明HPV衍生肽的混合物在此类溶液中是可溶的，浓度至少为0.5、1、2、4或8mg/ml肽。

本发明肽的优选用途是作为药物的用途，由此，更优选地，肽用作疫苗或其活性组分。每种肽都可以单独也可以优选地与至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、13、15及最多20种不同的本发明肽组合用于治疗和/或预防癌症，制备药物，优选治疗或预防HPV相关疾病的疫苗。本发明的此类药物和/或抗肿瘤疫苗可用于治疗患有下述非广延名录疾病或处于发展下述非广延名录疾病风险的患者：宫颈上皮内瘤变(CIN)、外阴上皮内瘤变(VIN)、阴道上皮内瘤变(VaIN)、肛门上皮内瘤变(AIN)及阴茎上皮内瘤变(PIN)，以及宫颈癌、外阴癌、阴道癌、肛门癌、阴茎癌和头颈癌。

在另一方面，本发明还涉及可以用于治疗和/或接种人类个体的组合物，其包含至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、13、15及最多20种不同的上文所限定的本发明肽，以及任选地一种或多种药学上可接受的赋形剂，特别是佐剂和免疫调节剂。优选地，组合物是药物组合物和/或意图用作药物。药物组合物优选意图用来接种。药物组合物优选用于治疗和/或预防癌症，制备药物，优选用于治疗或预防HPV相关疾病的疫苗。非穷尽的HPV相关疾病列表已在本文给出。

由此，本发明一方面涉及肽在制备用于预防和/或治疗HPV相关疾病的药物中的用途，其中肽的长度不超过100、98、96、94、92个氨基酸并包含来自HPV E6和E7蛋白中至少之一的氨基酸序列的至少19个连续氨基酸，其中所述连续氨基酸序列包含HLA-DQ和HLA-DP分子中至少之一所呈递的表位。优选地，该表位不是HLA-DQ2中所呈递的和由HPV16E7蛋白的35-50位氨基酸组成的表位。可选择地或在另一实施方案中和前述优选实施方案组合，连续氨基酸序列包含侵润宫颈瘤病变的T细胞或来自引流淋巴结的T细胞所识别的表位。肽、连续氨基酸序列和表位优选如上述所限定的。

本发明另一方面涉及肽在制备用于预防和/或治疗HPV相关疾病的药物中的用途，其中的肽长度不超过100、98、96、94、92个氨基酸并包含来自HPV E6和E7蛋白中至少之一的氨基酸序列的至少19个连续氨基酸，其中所述连续氨基酸序列包含侵润宫颈瘤病变的T细胞或者引流淋巴结中的T细胞所识别的表位。肽、连续氨基酸序列以及表位优选如上文所限定的。

药物的配制、给药方法以及药学上可接受的辅料的用途都是本领域已知并常用的，且描述于例如Remington；The Science and Practice of Pharmacy(雷明顿：药物学和实践)，21^st Editon2005,University of Sciences in Philadelphia。尽管能够想到使用其它给药途径，如通过注射肌肉给药或/和通过注射皮内(intradermal)和/或皮内(intracutaneous)给药，但本发明的药物组合物和药物优选配制成适用于静脉内给药或皮下给药或肌肉内给药。本文优选皮内给药。与皮内给药具体相关的优点和/或优选的实施方案稍后在名为“皮内给药(intradermal administration)”的单独一节中进行限定。

本发明包括，可以作为单次给药，给予本发明的至少一种肽和/或至少一种组合物。可选择地，如果需要，可以重复给予至少一种肽和/或至少一种组合物，和/或可以依次给予本发明不同的肽和/或组合物。

本发明的药物组合物(也称为药物)可优选地包含至少一种刺激免疫应答的化合物或佐剂。有利的是，本发明的药物组合物可以另外包含一种或多种合成的佐剂。这些佐剂可以混合到本发明的药物组合物中或可以单独给予待治疗的哺乳动物或人。已知经由Toll样受体和/或经由RIG-1(维甲酸诱导基因-1)蛋白和/或经由内皮受体发挥作用的佐剂是特别优选的。能够激活固有免疫系统的免疫修饰化合物能够通过Toll样受体(TLR’s)包括TLR’s 1-10而得到很好的激活。能激活TLR受体的化合物以及其修饰物和衍生物在本领域中已有详细记载。TLR1可以被细菌脂蛋白及其乙酰化形式激活，此外TLR2可以被革兰氏阳性菌的糖脂、LPS、LPA、LTA、纤毛(fimbriae)、外膜蛋白、细菌或宿主的热休克蛋白以及分支杆菌聚阿拉伯糖甘露糖脂(Mycobacterial lipoarabinomannan)激活。TLR3可被dsRNA特别是被病毒来源的dsRNA激活，或被poly(I:C)化合物激活。TLR4可以被革兰氏阴性菌的细菌或宿主LPS、LTA、来自宿主或细菌的热休克蛋白、病毒包被或包膜蛋白、泰克索(taxol)或其衍生物、含寡糖的透明质酸及纤连蛋白激活。TLR5可以用细菌鞭毛或鞭毛蛋白激活。TLR6可以被分枝杆菌脂蛋白及B组链球菌热不稳定性可溶因子(GBS-F)或链球菌调制蛋白(modulins)激活。TLR7可以被咪唑喹啉(imidazoquinolines)激活。TLR9可被未甲基化的CpG DNA或染色质-IgG复合物激活。特别是，TLR3、TLR7和TLR9在介导针对病毒感染的固有免疫应答中发挥重要作用，并且特别优选能够激活这些受体的化合物用于本发明的治疗方法和本发明的组合物或药物中。特别优选的佐剂包括但不限于：经合成所产生的化合物，其含有dsRNA、poly(I:C)、引发TLR3和TLR9受体的未甲基化的CpG DNA；IC31、TLR9激动剂、IMSAVAC、TLR4激动剂、Montanide ISA-51、Montanide ISA720(Seppic 7产佐剂，法国)。已知RIG-1蛋白通过如TLR3之类的ds-RNA激活(Immunity,(2005),1:19-28)。在另一优选实施方案中，合成的佐剂化合物与本发明的肽物理性连接。佐剂及共刺激化合物或功能基团与包含I型HLA和II型HLA表位的肽之间的物理性连接通过同时刺激抗原呈递细胞从而提供增强的免疫应答，所述抗原呈递细胞特别是内在化、代谢与展示抗原的树突状细胞。另一优选的免疫修饰化合物是诸如BQ-788的内皮素受体抑制剂(Buckanovich RJ et al.NatureMedicine(2008),14:28-36,Ishikawa K,PNAS(1994)91:4892)。BQ-788即N-顺式-2,6二甲基piperidinocarbonyl-L-γ-甲基亮氨酰基-D-1-甲氧基羰基色氨酰-D-己氨酸。然而任何BQ-788衍生物或修饰的BQ-788化合物也包括于本发明范围内。

此外，优选将WO 99/61065和WO 03/084999中所述抗原呈递细胞(共)刺激分子与本发明的肽和组合物联合使用。特别是，优选将4-1-BB和/或CD40配体、激动性抗体、OX40配体或其功能性片段及其衍生物以及具有类似激动活性的合成化合物单独或与本发明的肽一起给予患者，以便进一步刺激患者最佳免疫应答的发动。

另外，优选的实施方案包括在诸如矿物油(例如Montanide ISA 51)或PLGA的缓释媒介中送递肽，与或不与额外的免疫刺激剂，例如TLR配体和/或抗CD40/抗-4-1BB抗体一起。可选择地，本发明的肽可通过例如注射方式与或不与免疫刺激剂(佐剂)一起经皮内送递。优选地，为进行皮内送递，本发明的肽采用组合物的形式给药，组合物由所述肽和一种或多种免疫上惰性的药学上可接受的载体组成，所述载体例如是具有生理性离子强度和/或重量摩尔渗透压浓度的缓冲水溶液(例如PBS)。

皮内给药

在优选的实施方案中，本发明所用的肽或包含肽的组合物或药物，都如本文所限定的，将它们配制成适用于皮内给药或应用。皮内对本领域技术人员而言是已知的。在本发明上下文中，皮内(intradermal)是皮内(intracutaneous)的同义词，并与皮下不同。物质最表面的应用是上表皮上(epicutaenous)，然后是皮内应用(在皮肤中或进到皮肤中)，然后是皮下应用(仅在皮肤下的组织中)，然后是肌肉内应用(进入肌肉体中)。皮内应用通常采用注射进行，物质的皮内注射通常用于测试可能的反应，对其的过敏性和/或细胞免疫性。皮下给药通常也采用注射方式进行：将针刺入皮肤下的组织中。

在另一优选实施方案中，用于本发明的药物不含任何诸如Montanide ISA-51之类的佐剂，这意味着药物配制更简单：在所用的药物中优选没有基于油-水的乳剂。因此，本发明所用药物不包含诸如Montanide ISA-51之类的佐剂和/或不包含基于水包油的乳剂。因此，在优选实施方案中，本发明所用药物是具有生理性离子强度和/或重量摩尔渗透压浓度的包含一种或多种前述肽或由其组成的缓冲水溶液，例如PBS(磷酸盐缓冲液)。本领域技术人员知道如何制备此类溶液。

本发明所用药物具有另一优点，即通过皮内给予低量本文早先所限定的肽仍能实现免疫原性作用。所使用的每一种肽的量优选在1-1000μg之间，更优选在5-500μg之间，甚至更优选在10-100μg之间。

在另一优选实施方案中，药物包含本文早先所限定的肽以及至少一种佐剂，所述佐剂不配制于本文早先所限定的基于水包油的乳剂中和/或不是水包油乳剂类型佐剂。可选地，如果需要，本文早先所限定的肽和/或佐剂可以重复给药，和/或不同的肽和/或不同的佐剂可以依次给药。本发明还包括，皮内给予本发明的肽，而依次给予本文所限定的佐剂。佐剂可以皮内给药。然而任何其它给药途径都可以用于佐剂。

由于实现在尽可能处于或尽可能靠近导致引流淋巴结的疾病局部激活、导致免疫系统更强的局部激活的疾病位点注射疫苗，因而肽的皮内给药是非常受欢迎的。特别是对于VIN、VAIN、AIN、PIN、阴茎癌、外阴癌、肛门癌、头颈癌而言。

在优选实施方案中，皮内给药直接在病变或疾病位点实施。本文的在病变位点理解为在距离病变位点不超过5、2、1、0.5、0.2或0.1cm内。

皮内给予本文所限定的药物后，不仅引发Th2应答也引发Th1应答。这是令人惊奇的，因为已经发现，通过基因枪引发皮肤抗原导致选择性Th2免疫应答(Alvarez D.et al,2005)。此外，所观察到的免疫应答不仅仅局限于皮肤，如基于(Alvarez D.et al,2005)所预期的。我们证明，分泌IFNγ的特异性T细胞循环通过第二淋巴系统，因为在激发后的外周血中检测到它们。

本发明药物的另一重要优点是，可以以简单制剂、单发形式(one single shot)，给予相对低量的肽，而无需已知会带来不利副作用的任何佐剂如Montanide ISA-51。不期望受任何理论约束，我们认为本发明所用的HPV皮内肽(intradermal peptide(s))特异性地且直接靶向存在于表皮中的表皮朗格汉斯细胞(Langerhans cell,LC)。朗格汉斯细胞是可表现出启动初级免疫应答的显著能力的特定DC亚型(Romani N.et al.1992)。这些LC可以看作本发明所用药物招募的天然佐剂。

在本发明的另一优选实施方案中，本发明涉及HPV-E2、-E6和/或-E7蛋白衍生的肽在制备用于治疗或预防HPV相关疾病的药物中的用途，其中如本文早前所限定的，该药物用于皮内给药，此外，其中HPV-E2、-E6和/或-E7蛋白衍生的肽，进一步用于制备用于治疗或预防HPV相关疾病的药物，其中该药物用于皮下给药。

本文已经对用于皮内给药的药物作了限定。用于皮下给药的肽与用于皮下给药的肽相同，且已经在本文中作了限定。本领域技术人员知道如何配制适于皮下给药的药物。优选地，适于皮下给药的药物包含与佐剂组合使用的已在本文中限定的肽。优选的佐剂已在本文提及。其他优选的佐剂是诸如弗氏不完全佐剂或IFA、Montanide ISA-51或MontanideISA720(Seppic法国)之类水包油的乳剂类型的佐剂。在另一优选的实施方案中，适于皮下给药的药物包含一种或多种肽、佐剂(两者都如本文早前所限定的)以及药学上可接受的惰性载体和/或赋形剂(它们都如本文早前所限定的)。药物的配制以及药学上可接受的赋形剂的应用是本领域已知且惯用的，例如描述于Remington；The Science and Practice ofPharmacy,21nd Edition 2005,University of Sciences in Philadelphia。将本发明所用的第二药物配制成适于皮下给药。

在该优选的实施方案中，适于皮内给药的药物可与适于皮下给药的药物同时给药。可选地，这两种药物可以先皮内给药、后皮下给药，或反之亦可(先皮下给药，后皮内给药)。在前述用于描述皮内给药的优选实施方案中，如果需要，可按对本文早前所限定的肽和/或佐剂进行重复的皮内和/或皮下给药，和/或可以依次对不同的肽和/或不同的佐剂进行皮内和/或皮下给药。本发明还包括，本发明的肽皮内和/或皮下给药，而本文早前所限定的佐剂依次给药。佐剂可以皮内和/或皮下给药。然而，任何其他给药途径也可用于佐剂。

我们预期，本发明药物皮内和皮下给药的组合是有益的。表皮的DC显然与真皮和真皮下层的DC不同。皮内(皮内(intradermal))免疫会引起抗原加工和表皮DC(朗格汉斯阳性朗格汉斯细胞)的激活，它们通过其树突状网络与角质细胞紧密接触。这也将最佳地激活朗格汉斯细胞和角质细胞之间相互作用的炎性通路，随后将抗原负载和激活的朗格汉斯细胞胞内转运至皮肤引流淋巴结。

皮下给药会激活其他DC亚型(subset)，其也将变为负载抗原的并独立地行进至皮肤引流淋巴结。令人信服的是，使用既可以皮内给药也可皮下给药的药物，可以通过不同DC亚型导致这些引流淋巴结中T细胞的协同刺激。

本发明另一方面涉及编码上文所限定的肽和/或表位的核酸。优选地，该核酸不编码野生型全长HPV E6或E7蛋白而是编码本发明的或者侧翼为与野生型HPV E6或E7蛋白不邻接的氨基酸的肽和/或表位。此类侧翼氨基酸可以来自除野生型HPV E6或E7蛋白以外的蛋白和/或它们可以来自野生型蛋白E6或E7蛋白的其他位置，所述其他位置不和两端为侧翼氨基酸序列的肽/表位邻接。在优选实施方案中，该核酸编码两个或多个如成串珠(beads-on-string)排列的本发明的肽和/或表位，据此本发明的肽和/或表位(珠)直接连接在一起和/或通过接头序列连接，所述接头序列来自除野生型HPV E6或E7蛋白以外的蛋白，和/或来自野生型HPV E6或E7蛋白中与两端是接头序列的肽/表位不相邻接的其他位置。位于肽/表位侧翼或与其连接的氨基酸序列可以包含蛋白水解切割位点。此类核酸可以用于以各种方式送递本发明的肽/表位。它们可以例如用于在合适的宿主(例如E.coli)中制备并纯化重组蛋白。可选地，该核酸可操作地连接于表达调节序列(启动子等)并与并入人细胞的表达构建体。可离体转染或转导此类(自体)细胞，以便将其(再)给予需要它们的患者。可选地，表达构建体可以并入到合适的基因治疗载体中。对基因转导而言，与非病毒载体相比，病毒载体(基于缺陷病毒)是更有效的媒介。合适的病毒表达构建体包括，例如基于腺病毒、腺相关病毒(AAV)、逆转录酶病毒或修饰的安卡拉疫苗(MVA)的载体。

在另一实施方案中，本发明提供了从能与本文所述的本发明HPV表位相互作用的T细胞中分离HPV特异性T细胞受体(T cell receptor,TCR)分子的工具。本发明的TCR优选在处于HLA分子中和/或受HLA分子展示时能和包含肽的HPV表位相互作用，反应优选在体外或体内活细胞中进行。T细胞受体以及特别是编码本发明TCR’s的核酸可以例如用于将此类TCR转移至患者的T细胞中，否则该患者无法提高针对本发明所述HPV表位的T细胞免疫。通过这种TCR克隆方法，可以提供与待用该T细胞克隆进行治疗的患者实质上同基因的T细胞克隆，即该TCR表达T细胞克隆与患HPV相关疾病的患者是自体的。由此该方法提供能够识别本发明HPV表位的T细胞克隆，该T细胞克隆是在需要其的个体中针对表达HPV表位的肿瘤和/或HPV感染细胞而产生的且能够被其特异性地靶向。在优选的实施方案中，从个体分离T细胞并用本文所述识别本发明HPV表位的TCR转导。在筛选和扩增后，其是本领域技术人员所知的，可以将这些正表达可以识别HPV诱导的肿瘤细胞或HPV感染细胞的TCR的自体T细胞，再次输注给患者，它们在患者体内特异性地靶向肿瘤和HPV感染的细胞。因此，本发明提供了编码和表达能与本文所述HPV表位相互作用的T细胞受体的T淋巴细胞，优选在HLA分子中。所述T淋巴细胞可以是重组体或天然选择的T淋巴细胞。本发明的T淋巴细胞也可以用于本发明的方法和药物组合物中。由此本说明书提供了至少两种制备本发明细胞毒性T淋巴细胞的方法，包括在利于激发免疫应答的环境下，使未分化的淋巴细胞与本发明HPV表位(或含该表位的肽)接触，其可以例如用本发明的肽在接受植入的患者体内或体外实施。可选地，该方法可以通过将编码与本发明HPV表位特异性相互作用的TCR的基因克隆入宿主细胞和/或宿主淋巴细胞，优选自体淋巴细胞且任选地分化为细胞毒T淋巴细胞(CTL)而实施，所述基因可以从前述方法所获得的细胞中得到或者可以从表现出针对HPV表位的免疫应答的个体中获得。本实施方案方法的细节描述于例如De Witte et al.2006和Schumacher etal.2002。

在另一实施方案中，本发明涉及编码本发明肽和/或表位的核酸、识别本发明表位的T细胞受体、编码该T细胞受体的核酸、表达此类核酸的T细胞(克隆)作为药物的用途。优选地，该药物用于治疗和/或预防HPV相关疾病。本发明的此类药物可以用于治疗患有下列非广延名录疾病或处于发展该疾病风险的患者：宫颈(CIN)、外阴(VIN)、阴道(VaIN)、肛门(AIN)及阴茎(PIN)，以及宫颈癌、外阴癌、阴道癌、肛门癌、阴茎癌和头颈癌。

在本文及其权利要求中，词语“包含”以及变形均采用其非限制性意义，意指包括该词后的项目，但并不排除没有被特别提到的项目。此外，词语“由…组成”可以由“基本上由...组成”替换，意指除特别指明的组分以外本文所限定的肽或组合物可以包含其它组分，所述其它组分不改变本发明的独特性质。此外，涉及用不定冠词“一(a)”或“一(an)”所限定的元素(element)并不排除存在超过一种该元素(element)的可能性，除非上下文明确要求存在一个且仅一个该元素。因而不定冠词“一(a)”或“一(an)”通常表示“至少一”。

据此将本说明书中所引用的所有专利和参考文献通过引用全文并入。仅处于阐述性目，提供下述实施例，并不意图以任何方式限制本发明的范围。

附图说明

图1

A)从4例不同患者宫颈组织中分离的初始T细胞培养物的增殖。在利用HPV16或18、E6或E7肽库及重组蛋白刺激后，所有T细胞培养物在三天的增殖分析中都能识别天然加工的抗原。C265识别HPV16E6肽库1-92，C334识别HPV 16E6肽库71-158，C284识别HPV 16E7肽库1-98，以及C228识别HPV 18E7肽库1-106。B)通过增殖和IFNγ产生测量利用单个肽的大批培养物的特异性的精细定位(finemapping)。C265肽HPV16E6 37-68的刺激作出应答，C334对HPV16E6肽137-158的刺激作出应答，C284对HPV16E7肽71-92的刺激作出应答，而C228对HPV18E7肽21-42的刺激作出应答。

图2

对HPV抗原作出应答的T细胞类型进行分析，如通过IFNγ的细胞内细胞因子染色所测量的。对于阳性肽和蛋白而言，肽HPV16E6 41-62和HPV 16E6蛋白用于C265，HPV16E6蛋白和肽137-158用于C334，HPV16E7蛋白和肽37-92用于C284，而HPV18E7蛋白和肽21-42用于C228。来自HPV负体(counterpart)的肽和蛋白用作阴性对照。C265的TIL培养物表现出CD4⁺和CD8⁺T细胞应答，所述应答都是对HPV16E6 41-62肽作出的。

图3

A)在3天的增殖分析中，通过II型HLA抗体封闭CD4限制性应答。用肽负载的自体B-LCL刺激C265衍生的T细胞，利用肽负载的仅和HLA-DR12匹配的单核细胞刺激C284衍生的T细胞，并用肽负载的单核细胞刺激C228衍生的T细胞，该单核细胞仅与HLA-DQ*0302匹配。B)TIL培养物的精细定位和HLA限制性。用经10-mer(单体单位)肽脉冲的自体B-LCL刺激患者C265的CD4⁺T细胞，并在ELISPOT(酶联免疫斑点法)分析中检测，所述10-mer肽涵盖了所识别的较长肽的氨基酸序列。为了测定这些CD4⁺T细胞的限制性，用仅与HLA-DP2匹配的单核细胞对它们进行刺激。同样，通过在ELISPOT分析孵育中这些T细胞和10-mer肽，测定C334的CD8T细胞所识别的最小肽表位。利用经肽脉冲的分离自与患者I型HLA分子部分匹配的健康个体的PBMC，测定C334CD8⁺T细胞应答的HLA限制性。

图4

存在于C427肿瘤引流淋巴结中的T细胞反应性分析。A)用HPV16E6肽脉冲的自体B-LCL刺激3周后T细胞培养物的反应性，其是在3天增殖分析中测量的。B)上图：T细胞培养物对用单一22–mer肽脉冲的自体B-LCL刺激的识别模式。下图：衍生于该初始LNMC培养物的T细胞克隆所识别的最小表位图。在3天增殖分析中，刺激并检测CD4T细胞克隆C427.47(左图)。在IFNγELISPOT分析中，检测CD8T细胞克隆C427.78(右图)。C)用胞内细胞因子染色测定T细胞应答类型。HPV16E6肽11-32(上图)和肽137-158(下图)用作阳性肽。HPV18E7肽和蛋白则用作阴性对照。D)利用II型HLA封闭性抗体对II型部分匹配的B-LCL(C427.478，上图)和I型HLA部分匹配的B-LCL(C427.78，下图)的限制性元件(restriction element)进行分析，表明CD4⁺T细胞应答受HLA-DP14限制而CD8⁺T细胞应答则受HLA-B14限制。

图5

19例健康供体(healthy donors,HD)组中数量、出现的天数以及注射的诱导了阳性皮肤反应的抗原的概括图。如果在注射后不少于2天时间里出现直径超过2mm的丘疹，则认为皮肤反应是阳性的。所示布局图用于8个肽库，指示了所用肽库蛋白的第一个和最后一个氨基酸。粗体表示的布局图分表示该时间框架中的至少一个阳性反应；实心方形代表新发生的所示肽库的阳性皮肤反应。

图6

利用IFNγELIspot在健康供体预激发的血样中检测到HPV16特异性T细胞,与所识别肽库的早期阳性皮肤反应(early positive skin reaction)十分相关(p＝0.0003,双尾Fisher精确检验(two tailed Fisher`s Extract test))。通过从实验孔中的斑点平均数减去培养基对照的平均斑点数+2×SD,计算特异性应答。给出了每100,000个PBMC中特异性斑点的数量。如果在100,000个PBMC中肽库特异性T细胞的频率≥5,则认为应答为阳性的。

图7

健康供体激发后的血样中阳性皮肤反应和同时检测(IFNγELIspot)循环HPV特异性T细胞间的关系(p<0.0001,双尾Fisher精确检验)。总共88例皮肤测试中，有39例是阳性的。39例反应中有25例与ELIspot中的阳性反应相关(在100,000PBMCs中，T细胞的频率≥5)。在49个不显示皮肤反应的皮肤测试中，10个与阳性ELIspot相关。

图8

A.在健康供体激发后的血样中通过IFNγELIspot所检测到的HPV16特异性T细胞应答，表现出阳性皮肤反应。对每100,000个PBMCs中斑点平均数作了描述。记忆应答混合物(Memory response mix,MRM)用作阳性对照。实心柱表示阳性皮肤反应位点，从该位点中获得了穿孔活检(punch biopsy)并进行培养。

B.在细胞因子所驱动的14-28天扩增期后，检测从穿孔活检中渗出(exfiltrate)的T淋巴细胞在受到如皮肤测试中所注射的肽(10μg/ml)或蛋白(20μg/ml)脉冲的单核细胞刺激时的增殖能力。植物血凝素(phytohemaggutin,PHA)充当阳性对照。利用[³H]胸苷掺入对增殖进行测量，并将增殖应答特定限定为刺激指数(stimulation index,SI)≥3。健康供体17(HD17)是阳性皮肤反应位点由非特异性T细胞组成的实例。

C.利用流式细胞珠阵列分析在B中增殖应答的上清液中IFNγ、白细胞介素4(IL4)、IL5和肿瘤坏死因子α、IL2、IL10的存在(未示出)。临界值(cut-off values)以不同细胞因子的标准曲线为基础(对于剩余的细胞因子而言，100pg/ml IFNγ和20pg/ml)。抗原特异性细胞因子的产生被限定为细胞因子的浓度超过临界水平并>2×培养基对照的浓度。健康供体15(HD15)表现出高IL5背景水平，单在抗原刺激后增加>2×。

图9

健康供体15(HD15)的库4皮肤活检的T细胞培养物由HPV16特异性CD4⁺和CD8⁺T细胞两者组成。对与注射皮肤测试一致的蛋白(20μg/ml)和肽(10μg/ml)，在细胞内细胞因子染色中检测培养物的特异性。明显地，在4份活检的3份中检测到CD8⁺HPV16特异性T细胞。

实施例

实施例1：新PHV表位的鉴定和表征

1.方法

1.1个体

在莱顿大学医学中心的妇科部(epartment of Gynaecology of the LeidenUniversity Medical Centre)以及海牙leyenburg医院(Leyenburg Hospital theHague)，表现出经组织学证实的患宫颈瘤的妇女参与了CIRCLE研究，该研究在提供知情同意书后调查针对HPV 16阳性宫颈病变的免疫性。该研究方案获得了两家医院的医药伦理委员会的许可。利用从手术切除的样本中所分离的DNA的HPV16和HPV18特异性引物，检测个体的HPV状态(Class et al.1989)。用于HLA限制性分析的外周血单核细胞(PBMC)获自知情同意的HLA型匿名健康血液供体。

1.2抗原

T细胞刺激分析中采用了一套涵盖HPV16和HPV18E6及E7蛋白的重叠肽。HPV16和HPV18E6和E7由重叠12个残基的22-mers组成。按照之前的描述合成并溶解肽(van derBurg et al.2001,Welters et al.2006)。按照之前的描述在重组E.coli中制备重组HPVE6和E7蛋白(van der Burg et al.2001)。此外，制备一套HPV16E6和E7两者的10-mer重叠(9个氨基酸重叠)，以便正确定位HPV16特异性T细胞所识别的肽表位。

1.3抗原呈递细胞

将患者的EB病毒(Epstein-Barr virus)转化的B细胞系(B-LCL)维持于含有10％FCS的IMDM中。按照之前所述(de Jong et al.2002)，从外周血淋巴细胞中制备单核细胞。

1.4T细胞的分离和培养

在子宫根治性切除术后获得宫颈瘤活检，活检后从CIN III患者获得宫颈瘤组织。将新鲜的宫颈组织切成约1mm³的片并在添加了10％人AB血清(Sigma,St.Louis MO,USA)、10％T细胞生长因子(TCGF,Zeptometrix,Buffalo NY,US)和5ng/ml IL-15(Peprotech,Rocky Hill NJ,USA)的IMDM中培养(Bio Whittaker,Verviers,Belgium)。第一天，往培养物中添加5ng/ml IL-7(Peprotech)，以确保T细胞的生长。在2-3周后，检测T细胞(TIL,CIL)培养物的特异性，并利用经照射的自体B-LCL及5ng/ml同源肽(cognate peptide)的混合物扩增阳性培养物。

从骨盆区域中获得淋巴结，该淋巴结含有肿瘤细胞，这是转移性癌的标志。将淋巴结切成片并在存在胶原酶(200IU/ml,Sigma)和DNAse(50μg/ml,Sigma)的情况下37℃孵育1小时，之后使所述淋巴结单核细胞通过细胞滤网(BD,Erebodemgem,Belgium)以获得单细胞悬浮液。用HPV16或18E6或E7肽库刺激单独的LMNC培养物，并培养2-3周。

根据对Evans et al改进后的试验方案，利用有限稀释(limiting dilution)分离T细胞克隆，所述改进系用10％的TCGF和5ng/ml替换IL-2并添加0.5μg/ml植物血凝素(PHA,Murex Diagnostics,Dartford,UK)以激发T细胞受体。有限稀释后，检测T细胞的特异性并将其维持于含有10％小牛血清(FCS,PAA laboratories,Pasching,Austria)、10％TCGF和5ng/mlIL-15的IMDM中。利用培养基、来自3位不同供体的经照射的PBMCT、B-LCL和0.5μg/mlPHA的混合物扩增T细胞克隆。

1.5T细胞特异性分析

在3天的增殖分析中，在经脉冲的自体单核细胞或经照射的自体BVs上，一式三份检测T细胞培养物(25,000-50,000个细胞/孔)对HPV16和18E6及E7肽(5μg/ml)和蛋白(10μg/ml)的识别。48小时后收获上清液并在-20℃下储存，用于细胞因子分析。在培养的最后16个小时期间，添加0.5μCi/孔的[³H]胸苷，以便测量增殖(van der Burg et al.2001)。按照之前描述(van der Burg et al.1999)，用ELISA测量抗原特异性IFNγ的产生。

按照之前的报道(van der Burg et al.1999)，利用抗HLA-DR(B8.11.2)、HLA-DQ(SPV.L3)和HLA-DP(B7-72)的鼠单克隆抗体，实施II型MHC封闭实验。在加入T细胞之前，将肽脉冲的APC与II型抗MHC抗体一起孵育2小时。

按照之前所述(de Jonge et al.2005)，列举利用细胞内细胞因子染色所测量的IFNγ产生T细胞。简而言之，用同源肽或重组蛋白负载APC，并与T细胞培养物一起孵育。孵育1小时后，添加10μg/ml布雷非德菌素A(brefeldin A,Sigma)，并孵育过夜。此后，用4％的多聚甲醛(Sigma)固定该细胞并用0.1％的皂角苷(Saponin)渗透。该样品随后用CD4-APC、CD8-perCP和IFNγ-PE染色并通过流式细胞仪分析。

用IFNγELISPOT分析CD8T细胞所识别的最小肽(van der Burg et al.2001,Welters et al.2006,de Jong et al.2002)。以2×10⁴的密度，将CD8T细胞系一式三份接种于包被有IFNγ捕获抗体(catch antibody,Mabtech.Nacha,Sweden)的Multyscreen 96孔板(Millipore,Etten-Leur,The Netherlands)的孔中。利用5μg/ml 10-mer肽刺激微培养物，并孵育过夜。利用5μg/ml 10-mer肽脉冲的PBMC或用与等量T细胞共培养的B-LCL，分析CD8T细胞的HLA限制性。根据制造商的说明(Mabtech)对IFNγ特异斑点进行染色。在全自动计算机辅助视屏成像系统(BIOSYS)中分析斑点的数量。

2.结果

2.1HPV特异性T细胞存在于宫颈瘤侵润性淋巴细胞中

在本研究中，我们分析宫颈瘤病变中HPV16和HPV18特异性T细胞的存在、类型和特异性，所述宫颈瘤病变是HPV特异性T细胞遭遇其同源抗原并应发挥其效应功能的位点。总计分析了74例患者。从61例患有宫颈癌的患者以及9例患有CINIII的其他患者中获得宫颈组织。将切碎的组织片在含有IL-15的细胞因子和TCGF的混合物存在的情况培养2-3周。为了防止肿瘤特异性T细胞生长过程中的潜在偏差，没有给这些培养物提供外源性HPV抗原。在培养14-21天内，收获细胞因子扩增的T细胞并用FACS进行分析。这些培养物中CD3⁺T细胞的平均百分比从2周时的41％增加到3周时的68％。通常，如2周时CD3⁺、CD4⁺T细胞(34％±22％)和CD3⁺CD8⁺T细胞(52％±22％)的百分比，或者3周时(分别为38％±21％；48％±24％)的百分百所示，该培养方法并不有利于某一类型T细胞的选择性生长。个别培养物偶尔显示出更显著的CD4⁺或CD8⁺T细胞扩增(未示出)。为了分析HPV特异性T细胞的存在，用经重叠肽的不同库以及各自重组蛋白脉冲的自体单核细胞刺激该培养物，所述重叠肽跨越HPV16和HPV18的E6和E7蛋白。在51例HPV16阳性或HPV18阳性患者中的19例中，我们能通过增殖检测HPV特异性T细胞(表1，图1a)。这些培养物都对负载肽和蛋白的单核细胞作出应答，表明T细胞识别天然加工的抗原。在8份培养物中，检测到E6特异性T细胞，在10份培养物中T细胞对E7作出应答，且在一份T细胞培养物中检测到对E6和E7都作出应答。重要的是，在HPV16和18份阴性宫颈癌组织(n＝19)中未检测到HPV16或HPV18特异性T细胞应答，这表明体外没有诱导出所观察到的HPV16和18特异性应答(表1)。

2.2HPV特异性CD4和CD8T细胞都侵润肿瘤组织

对HPV特异性反应性评价后，通过用同源肽、细胞因子混合物以及饲养细胞刺激，扩增19份相应的T细胞系。对这些HPV特异性培养物中的15份进行充分扩增，用于进一步分析。在利用单一肽在短期刺激分析中，测定HPV特异性T细胞的良好特异性。5份培养物识别2种或多种不同肽，而其他10份培养物识别单一肽(图1b，表1)。为了评价对抗原刺激作出应答的T细胞的类型，用它们的同源肽和蛋白抗原对T细胞培养物进行刺激，并用细胞内IFNγ染色分析应答(图2)。大多数TIL培养物都含有HPV特异的CD4⁺侵润性T淋巴细胞(n＝13例患者，识别的13种不同肽)，而在6份培养物中发现了HPV特异性CD8⁺T细胞侵润性淋巴细胞。在9份HPV特异性T细胞系中，仅检测到CD4⁺T细胞应答，在4份T细胞系中，CD4⁺T细胞和CD8⁺T细胞都反应，在2份T细胞系中仅检测到CD8T细胞应答(表1，图2)。

2.3侵润淋巴细胞的肿瘤的HLA限制性

利用封闭性抗体和分离自健康供体的与HLA部分匹配的APC，对参与HPV肽呈递至CD8⁺T细胞以及CD4⁺T细胞的I型和II型HLA基因座进行研究。发现广泛多种的II型HLA分子都参与了抗原HPV16和18的E6和E7呈递(表2)。使用抗HLA-DR、HLA-DQ和HLA-DP的封闭性抗体表明，所检测到的应答中的3个受HLA-DR限制，3个受HLA-DQ限制，以及3个受HLA-DP限制(图3a，表2)。为测定参与HPV抗原呈递的确切的HLA限制性元件，使用了健康捐供体的仅与一种HLA等位基因相匹配的APC(图3)。在6例病例中，我们未能准确确定限制性元件。

在C265患者的情况下，HPV特异性CD4⁺和CD8⁺T细胞都对相同的肽作出应答(图2)。为区分这两种T细胞应答，通过有限稀释建立T细胞克隆。不幸的是，仅仅获得了CD4⁺T细胞克隆，因而只可以建立II型HLA限制性元件。因此，只可能对其他5份不同的HPV特异性CD8T细胞培养物中的最小肽和限制性进行测定(表2)。作为实例，图3显示测定从自患者C334获得的TIL培养物的CD8T细胞应答的最小肽表位和限制性(图3C)。由于该CD8T细胞培养物仅对HLA-B27匹配的肽负载APC作出应答而不对来自其他供体的其它与I型HLA部分匹配的APC的刺激作出应答，因而该应答受HLA-B27限制(图3C)。一例患者(C265)展示了针对2个不同表位的CD8⁺T细胞应答，而两例患者(C176和C334)则对相同的HLA-B27限制性CTL表位作出应答(表2)。

2.4肿瘤引流淋巴节中的HPV特异性T细胞

肿瘤引流淋巴结是HPV特异性T细胞受到激发和激活的位点，因此，也在来自6例不同宫颈癌患者的肿瘤引流淋巴结中对HPV特异性T细胞应答进行了研究。淋巴结单核细胞(lymph node mononuclear cells,LNMC)的单细胞悬浮液分离自在其淋巴结中展示转移的宫颈癌患者。我们不能在新分离的LNMC中离体直接检测HPV特异性应答(数据未示出)。因此，首先用HPV16或18E6和E7肽库进行一轮体外刺激，扩增LNMC。在4个病例中，LNMC对HPV16作出应答，而在1例患者中，通过增殖和IFNγ产生检测到HPV18应答(表1，图4A)。与TIL培养物类似，HPV16阳性肿瘤患者仅与HPV16反应，而被诊断为HPV18阳性宫颈癌的患者则仅与HPV18反应。尽管事实上用HPV16和HPV18肽对LNMC进行了体外刺激，但在来自HPV16/18阴性患者的LMNC中则既没有检测到对HPV16的应答也没有检测到对HPV18的应答(表1)。针对它们的良好特异性和HLA限制性元件，对分离自这些LNMC培养物的T细胞克隆进行了表征。发现CD4⁺T细胞对10种不同肽的反应性，其中7种未在TIL培养物中检测到。这些表位中的3个受HLA-DQ限制，而其它4个则受HLA-DP限制。另外，鉴定出一个HLA-A*0201限制性和一个HLA-B14限制性CD8⁺T细胞表位(表2)。图4显示了对LNMC培养物进行分析的实例。在一轮刺激后，该LNMC培养物对负载了PV16E6肽的库或重组蛋白的APC作出特异性应答(图4A)。对单一肽反应性的分析显示识别大量全部肽(a repertoire of peptides)(图4B)，而分离自该培养物的CD4⁺和CD8⁺T细胞克隆则识别重组蛋白经天然处理而得到的它们的同源抗原(图4C)。利用II型HLA封闭性抗体和部分匹配供体的APC对限制性作了进一步分析(图4D)。

总之，对TIL和肿瘤引流淋巴结细胞的分析都显示，在54例不同HPV16或HPV18阳性患者的23例中，能够检测到对总共25种不同E6或E7衍生肽的特异性T细胞应答。需要指出的是，13种CD4⁺T细胞肽表位受HLA-DQ或HLA-DP限制，3种受HLA-DR限制，而在6个病例中，我们未能区分HLA-DQ/DP和HLA-DR(表2)。对于所发现的CD8⁺T细胞应答，2种受HLA-A限制，4种受HLA-B限制，而2种则未得到确定(表2)。

3.讨论

在动物模型中，HPV16编码的癌蛋白E6和E7能够担任肿瘤排斥抗原(Zwaveling etal.2002,Peng et al.2005)，表明它们在宫颈癌中也可以担任肿瘤侵润性淋巴细胞的靶抗原，但这从未在大群体患者中进行过系统分析。我们能够建立大量对HPV16和HPV18具反应性的TIL和CIN侵润性淋巴细胞(CIL)培养物，其中所述HPV16和HPV18是与宫颈癌最显著相关的HPV类型(Bosch et al.1995,Munoz et al.2003)。所使用的细胞因子混合物确保了CD4和CD8T细胞两者的生长而没有对任一类型的T细胞扩增的明显的偏爱。在我们的研究中，从被诊断为HPV型阳性而不是HPV16或HPV18阳性的肿瘤患者中建立19份TIL培养物。这些培养物都不与HPV16或HPV18E6和E7抗原刺激反应。值得一提地，来自HPV16阳性患者的TIL和CIL不对HPV18的E6和E7作出应答，反之亦然(表1)。因此，在HPV16或HPV18阳性患者TIL和CIL中所观察到的HPV特异性的T细胞应答不是体外诱导T细胞应答的结果而是体内抗肿瘤应答的反映。近来，我们证明该实验方案也成功扩增来自小队列患有卵巢癌患者的TIL培养物(Lambeck et al.2007)。

类似数量的TIL培养物对E6和E7作出应答(表1)。对同源肽表位以及HPV特异性免疫应答的HLA限制性元件进行鉴定表明，HPV特异性免疫并不限于特定免疫优势区(immunodominant region)而是针对E6或E7癌蛋白的所有结构域(表2)，这表明HPV E6和E7特异性T细胞两者都有助于抗肿瘤应答。我们的分析醒目地表明，绝大多数HPV特异性CD4⁺T细胞应答受HLA-DQ或DP(13/16)限制但不受HLA-DR限制(表2)。这是令人意外的，因为在APC细胞表面(Schwatz et al.1988)以及发生II型HLA重新表达的宫颈癌细胞(Hilders etal.1994)中，HLA-DR是最丰富的II型HLA分子。此外，在其它肿瘤抗原中，所鉴定的大多数CD4⁺T细胞表位在HLA-DR中呈递(80/93；参见http://www.cancerimmunity.org中的数据库)。然而，在宫颈癌中，HLA-DQ和HLA-DP限制性T细胞似乎有更突出的作用，这提示为鉴定功能性T细胞对HPV的应答而采用的结合计算机数学运算的策略不应当仅仅集中于HLA-DR(Warrino et al.2004,Facchinetti et al.2005)。

在7例患者中检测到CD8⁺T细胞应答。除了鉴定出3个新的HLA-B7、HLA-B14和HLA-B27限制性CD8T细胞表位外，我们证实即使观察到对肽序列11-19的更强反应性，存在识别HPV16E7.11-20表位的HLA-A*0201限制性肿瘤侵润性CD8⁺T细胞(Evans et al.1997,Oerkeet al.2005)。此外，检测到对HLA-B57限制性表位HPV16E6.52-61具有反应性的CD8⁺T细胞。基于对健康个体外周血中HLA-B57限制性HPV16E6.52-61特异性CD8⁺T细胞的检测，已经表明，该CTL表位可以在清除HPV16感染中发挥重要作用(Nakagawa et al.2004,Nkagawa etal.2007)。然而，在癌症患者中所检测到的对该表位作出应答的CTL使该作用的可能性较小。

我们的研究显示，在54例不同的HPV16或HPV18阳性患者中的至少23例中，可以检测到对E6和/或E7的特异性T细胞应答(表1)。这将有利于旨在诱导针对这些抗原的T细胞应答的接种策略，以恢复之前已存在免疫应答的患者的有效抗肿瘤应答。重要的是，本研究中T细胞所识别的T细胞表位，在针对HPV 16和HPV 18阳性肿瘤的应答中，构成了生理靶标。由此它们对不同疾病阶段中HPV特异性T细胞亚型的数量和功能性的综合分析以及监控免疫疗法来说是有价值的。在宫颈癌患者中常存在的HPV特异性T细胞也可以构成用于采用的T细胞转移治疗的肿瘤特异性T细胞的有价值来源。

实施例2：肽的皮内给药

材料与方法

研究方案

通过在患有HPV相关宫颈失调的患者以及健康个体的上臂中皮内注射临床级HPV16肽库来实施用于对HPV16E2、E6和E7特异性T细胞应答进行分析的代表性初步研究。由于迟发型超敏反应代表记忆T细胞应答，在分析时不以HPV阳性为先决条件。

个体

一组19名健康个体(HD)在提供知情同意书后参与本研究。健康个体组的平均年龄为31岁(范围，20-51岁)并由80％的女性和20％的男性组成。在皮肤测试给药之前，直接从所有个体获取外周血单核细胞(PBMCs)。健康个体中后来所出现的皮肤测试阳性导致从19例健康志愿者中的11例当中分离第二血样。该方案设计获得Leiden大学医疗中心医疗道德委员会(Medical Ethical Committee of the Leiden University Medical Centre)的许可。

DTH皮肤测试

皮肤测试，其基于迟发型超敏反应(Delayed Type Hypersensitivityreactions,DTH)，可以用作体内测定HPV特异性细胞免疫应答的灵敏且简便方法(Hopfl,2000；Hopfl,1991)。皮试配制品由涵盖整个HPV16E6和E7蛋白和HPV16E2蛋白的最具免疫原性区域的长的临床级合成的肽的8个库组成(de Jong,2004)。这些临床级肽由LUMC的内部GMP-Facility制备。皮肤测试的每个库由两种或三种合成的肽组成，由该肽所覆盖的蛋白区域中的第一和最后一个氨基酸来表示。库1：E2_31-60，E2_46-75，库2：E2_301-330，E2_316-345，库3：E6_1-31，E6_19-50，库4：E6_41-65，E6_55-80，库5：E6_85-109，E6_91-122，库6：E6_109-140，E6_127-158，库7：E7_1-35，E7_22-56，库8：E7_43-77，E7_64-98。库3包含Seq ID 5、22及23。库4包含Seq IDs 7-9。库5包含SeqID 11和12。库6包含Seq ID 13、14、24和25。库7包含Seq ID 15和26。库8包含Seq IDs 16和17。每个肽库中，皮内注射含于溶解于20mM等渗磷酸缓冲液(10μg/肽)的16％DMSO中的0.05ml 0.2mg/ml的肽。肽库及阴性对照(只有溶剂)分别注入个体上臂的皮肤测试位点。在注射肽后的72小时和7天内以及首次报告第一批健康个体之一非常迟的皮试反应后3周时，至少检查3次皮肤测试位点。如果在注射后不少于2天时间里产生直径超过2mm的丘疹，应当认为该反应是阳性的。从阳性皮肤反应位点获得穿孔活检(4mm)，切成小片并在含有10％人AB血清、10％TCGF和5ng/ml IL7及IL15的IMDM中进行培养以使淋巴细胞移出皮肤组织。在培养2-4周后收获所扩增的T细胞并测试其HPV特异性反应性。

用于体外免疫分析的抗原

一套肽，类似于皮肤测试中所用的肽，用于T细胞刺激分析和IFNγ-ELISPOT分析。四种HPV16E2肽由重叠15个残基的30-mer肽组成，HPV16E6由32-mer肽组成，而HPV16E7由35-mer肽组成，这两者都重叠14个残基。按照前述(van der Burg,1999)，合成并溶解该肽。特别是，在IFNγELISPOT分析中，肽库4和5与皮肤测试所用肽稍有差异，库4含有肽E6_37-68、E6_55-86、E6_73-104，而库5则包含肽E6_73-104、E6_91-122。

由破伤风类毒素(0,75Limus flocculentius/ml；National Institute ofPublic Health and Environment,Bilthoven,The Netherlands)、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)声波降解物(sonicate,5μg/ml；由Dr.P Klatser惠赠，Royal Tropical Institute,Amsterdam,The Netherlands)和白色念珠菌(Candidaalbicans)(0.15mg/ml,HAL Allergenen Lab.,Haarlem,The Netherlands)组成的记忆应答混合物(MRM 50×)，用作阳性对照。按照前述(van der Burg,2001)，在重组大肠杆菌(Escherichia coli)中制备HPV 16E2、E6和E7蛋白。

用IFNγELISPOT分析抗原特异性Th细胞

按照前述(van der Burg,2001)，用IFNγELISPOT分析抗原特异性Th细胞的出现。简而言之，在存在或不存在所述的HPV 16E2、E6和E7肽库的情况下，在24孔板(Costar,Cambridge,MA)中以2×10⁶个细胞/孔的密度将新鲜PBMC接种于1ml富集了10％人AB血清的IMDM(Bio Whittaker，Verviers，Belgium)中。所使用的肽的浓度为5μg/ml/肽。在37℃下孵育4天后，收获PBMCs，洗涤并在包被有IFNγ捕获抗体(Mabtech AB,Nacha，瑞典)的Multiscreen 96孔板(Millipore,Etten-Leur，荷兰)中以10⁵个细胞/孔的密度接种于100μl富集了10％FCS的IMDM中，一式四份。根据厂商说明书(Mabtech)实施其他抗体的孵育和ELISPOT显影。用全自动计算机辅助视屏成像分析系统(Bio Sys)对斑点计数。通过从实验孔中的斑点平均数减去培养基对照的平均斑点数+2×SD，计算特异性斑点(van der Burg,2001)。

T细胞增殖分析

在3天的增殖分析中，检测皮肤活检T细胞培养物对特异性肽和蛋白的识别(vander Burg,2001)。简而言之，通过37℃下在2h期间粘附到平底96孔板中的X-vivo 15培养基(Cambrex)上，从PBMCs中分离自体单核细胞。该单核细胞被用作APCs，用10μg/ml肽和20μg/ml蛋白负载过夜。以2-5×10⁴个细胞/孔的密度将皮肤测试侵润性淋巴细胞接种于添加了10％AB血清的IMDM中。将培养基单独作为阴性对照，植物血凝素(0.5μg/ml)用作阳性对照。利用[³H]胸苷(0.5μCi/mmol)掺入测量增殖。增殖反应被特定地限定为刺激指数(stimulation index,SI)≥3。孵育48小时后，收获增殖分析的上清液，用于对抗原特异性细胞因子的产生进行分析。

与HPV16特异性增殖应答相关的细胞因子分析

根据厂商说明书利用流式珠阵列(cytometric bead array,Becton Dickinson)同时检测6种不同的Th1和Th2细胞因子：IFNγ、肿瘤坏死因子α、白细胞介素2(IL2)、IL4、IL5和IL10。临界值以不同细胞因子(100pg/ml IFNγ和其它细胞因子20pg/ml)的标准曲线为基础。抗原特异性细胞因子的产生被限定为细胞因子的浓度超过临界值水平并>培养基对照的浓度(de Jong,2004)。

细胞内细胞因子染色(Intracellular Cytokine Staining,ICS)

按照之前的报道(de Jong,2005)，利用ICS对衍生于阳性皮肤反应位点的T细胞培养物的特异性和特征进行检测。简而言之，收获皮肤测试侵润性淋巴细胞、洗涤并悬浮于含10％AB血清的IMDM中，向自体单核细胞中添加2-5×10⁴个细胞，所述自体单核细胞在Xvivo培养基中用50μl肽(10μg/ml)或蛋白(20μg/ml)脉冲过夜。培养基单独作为阴性对照，植物血凝素(0.5ug/ml)用作阳性对照。同时用FITC标记的鼠抗人IFNγ(0.5g/ml,BDPharmigen)、PE标记的鼠抗人IL5(0.2mg/ml,BD Pharmingen)、APC标记的抗CD4(BDBioscience)和PerCP标记的抗CD8(BD Bioscience)对样品进行染色。在4℃孵育后，洗涤细胞，用1％的多聚甲醛固定,并用流式细胞仪(FACSscan,BD Biosciences)分析。

统计分析

在这些组中，利用Fisher精确检验(双尾)对PBMC中IFNγ产生HPV特异性T细胞的检测、皮肤活检中皮肤测试反应的存在或HPV特异性T细胞的存在之间的关系以及患者和健康对照有关皮肤反应的大小或数量进行分析。统计分析采用Graphpad Instat软件(3.0版本)和Graphpad Prism4进行。

结果

皮肤对皮内注射HPV16E2、E6和E7肽的反应

皮内注射HPV16E2、E6和E7肽后，我们研究了健康个体的皮肤反应。阳性皮肤反应看起来是直径为2-20mm的浅红色丘疹，其在注射后的2-25天出现。在152例健康志愿者的皮肤测试中检测到46例阳性皮肤反应。总体上，皮肤测试中每个肽库都引起阳性皮肤反应。在对照组中，最常观测到的反应是针对E2_31-75(19例个体中有10例)、E6_37-104(9/16)及E7_43-98(7/19)的反应。该反应类型与我们之前在PBMC中所观测到的类似(de Jong,2002；Welters,2003)(图5)。这些皮肤反应与这些个体的PBMC中所检测到的肽特异性T细胞应答的出现一致(数据未示出)。

健康供体的皮肤反应与外周血中较高频率出现的HPV16特异性T细胞相关

为将皮肤测试结果与循环1型HPV16特异性T细胞的出现进行比较，用在进行皮内肽激发前所收集的PBMC’s实施IFNγELIspot分析。在19例健康志愿者的5例中，我们能够利用IFNγ-ELIspot检测到HPV16特异性免疫应答。在健康个体的预激发的血样中每100,000个PBMC中检测到≥5个循环HPV16特异性T细胞，与对相同肽序列的早期(≤13天)阳性皮肤反应相关(p＝0.0003,双尾Fisher精确检验；图6)。在健康供体的预激发的血样中没有检测到针对诱导晚期阳性皮肤反应(late positive skin reacton)(14-25天)的肽的HPV16特异性循环T细胞。这表明循环抗原特异性细胞的出现频率决定皮肤反应出现的延迟时间。

为了评估出现晚期皮肤反应时HPV特异性T细胞的出现频率，收集来自11例健康志愿者的额外血样。在这些个体中，88个皮肤测试中有39个呈阳性。在39个阳性皮肤反应的25个中以及在49个阴性皮肤反应中的10个中每100,000个PBMC检测到≥5个HPV16特异性T细胞。在这一点上，在激发后血样中检测循环的HPV特异性IFNγ产生T细胞和皮肤反应的出现显著相关(p<0.0001，Fisher精确检验；图7)。这显示用HPV16肽皮内激发后，健康志愿者血液中HPV16特异性T细胞的出现频率明显较高，并表明皮内注射肽抗原增加了健康志愿者血液中HPV16特异性T细胞的数量。

阳性皮肤反应位点的活检由Th/Th2CD4⁺和CD8⁺HPV16特异性T细胞两者组成

约25％的健康志愿者的阳性皮肤反应与血液中HPV16特异性IFNγ产生T细胞的检测无关，这提示在皮内注射HPV16肽后，其他非IFNγ产生类型的T细胞可以侵润皮肤。

为了表征阳性皮肤反应位点的细胞，获取穿刺活检。总共从7例健康对照的不同阳性皮肤反应位点中获得8个活检，并与使T细胞在没有抗原刺激的情况下体外生长的细胞因子混合物一起培养。在8个活检的7个中，T细胞在3-4周内从组织中渗出并扩增。在短期增殖分析中，检测该扩增T细胞的特异性。图8表示，在受到肽库(其也在皮肤测试过程中在此位点进行了注射，HD2、HD10、HD15)脉冲的自体单核细胞以及HPV16E6蛋白脉冲的单核细胞刺激后特异性增殖的T细胞培养物的实例(图8AB)。这表明这些T细胞能够在抗原被天然加工和呈递后识别它们的同源HLA-肽复合物。由于HPV16特异性T细胞产生IFNγ、IL-4和IL-5，对这些增殖的T细胞培养物上清液所进行的分析揭示了混合的Th1/Th2细胞因子特性(profile)(图8C)。

在每个活检培养物(8个中有4个)中检测到HPV特异性T细胞的病例中，这与通过ELIspot对激发后血样中循环的HPV16特异性IFNγ产生T细胞所进行的检测结果相符(比较图8A和B)。在其他4例阳性皮肤反应活检中有3例T细胞不对HPV16肽作出应答(图8；HD17)，并且在其中一例中根本没有T细胞渗出组织(HD13)。在这4个病例中，我们在激发后的血样中未能检测到循环的HPV16特异性IFNγ产生T细胞。

利用CD4和CD8细胞表面标记对活检T细胞所进行的共染色显示，在用HPV16肽进行皮内激发后，不但HPV16特异性CD4⁺T细胞而且HPV16特异性CD8⁺T细胞都侵润皮肤位点(图9)。总体上，在HPV16特异性T细胞所侵润的4个活检的3个中，我们能够检测到HPV16特异性CD8⁺T细胞。从HD2活检(库6)中分离的CD8⁺T细胞对皮试注射测试的两种重叠肽都作出应答：HPV16E6_109-140和HPV16E6_127-158(数据未示出)，而个体HD15和HD16两者的CD8⁺T细胞都对HPV16E6_37-68作出应答(参见HD15的实例，图5)。

总之，在用HPV16肽进行皮内免激发后迁入皮肤的免疫细胞群包含HPV16特异性CD4⁺Th1、Th2和CD8⁺细胞毒性T细胞。该侵润与血液中循环的HPV16特异性IFNγ产生T细胞并行。

讨论

皮肤测试常被作为体内测量细胞介导的免疫性的简单分析法。通过将结果与利用体外分析对T细胞反应性并行测量的结果进行比较，我们已证实皮肤测试分析在体内测量针对早期抗原E2、E6和E7的HPV16特异性细胞免疫应答中的用途。

在皮内抗原激发后的4-12天，健康志愿者组中出现了早期皮肤反应。在这些个体中，已知其在体外表现出I型HPV16特异性T细胞应答(de Jong,2002；Wlters,2003)，早期皮肤测试反应的出现(13天内)与以每20,000个PBMC中至少1个的出现频率检测到IFNγ产生HPV16特异性T细胞密切相关(图6，p<0.001)。Jeffries等(Jeffries,2006)推荐了ELIspot分析中阳性反应的相同IFNγ临界标准，他利用数学工具限定与Mantoux-tests相关的合适ELISPOT临界值。较少数量的循环记忆T细胞(图6)可以解释为何与典型DTH测试相比皮肤反应的出现有些延迟。在产生足够细胞以引起局部炎症反应即阳性皮肤测试之前，T细胞需要得到强化或再激活并开始分裂。毫无疑问，在出现阳性皮肤反应时，在外周血中可以检测到更高频率的HPV16特异性Th1应答(图7)。

过去推测Th1细胞诱导DTH应答，然而，现在几项研究已经证明，侵润皮肤测试位点的Th2细胞也诱导DTH应答(Wang,1999；Woodfolk,2001)。同样，本研究表明健康志愿者的阳性皮肤测试位点含有Th1和Th2型HPV16特异性T细胞两者(图8和9)。此外，阳性皮肤反应也可以是非特异性T细胞流入的结果，这由于两项用于分析给患有直肠细胞癌或黑色素瘤患者接种后产生特异性免疫应答的阳性皮肤测试位点的深入研究(Bleumer,2007)，而变得明显。本研究还表明，许多来自健康个体的阳性皮肤测试位点被不对所注射的HPV16抗原作出应答的T细胞侵润。迄今为止，特异性阳性皮肤反应的原因仍然未知。出乎意料的是，我们观测到健康个体中大多数皮肤反应出现在皮内注射抗原后的2-3周内。同时，这些晚期阳性皮肤反应与预激发的血液中循环HPV特异性CD4⁺记忆T细胞的检测并不相关(图6)。这些皮肤测试位点的免疫学组成与典型DTH测试的类似(Platt,1983；Poulter,1982)，并由HPV16特异性CD4⁺Th1和Th2细胞以及HPV16特异性CD8⁺T细胞构成(图8和9)。我们假设这些反应可能是T细胞引发的结果。在29％的经受2步结核菌素皮肤测试方案且仅在第二轮测试中呈阳性的患者中也体现出这一点(Akcay,2003)。一般而言，疫苗诱导的T细胞应答在接种后的10-14天内而并不在3周时达到峰值。然而，人们应当记住在此方案中注射了更高剂量的抗原以及较强的佐剂。因此可以合理推测皮内激发所诱导的T细胞应答发展的较为缓慢并在后期才达到峰值。由于在健康志愿者中的皮内肽激发诱导了HPV16特异性CD4⁺和CD8⁺细胞两者，因此应当将其看作为单次低剂量接种。

本初步研究的主要目标是为了证实HPV16特异性皮肤测试在体内检测1型免疫应答中的用途。在健康志愿者中，13天内的阳性皮肤反应确实与体外IFNγELIspot所检测到的循环的IFNγ产生记忆T细胞相关。重要的是，我们也观察到皮肤测试所获得的结果与ELIspot所获得的结果有不一致之处。在许多病例中，在激发后的血样中检测到HPV16特异性、循环IFNγ产生T细胞，而无相伴的皮肤反应，反之亦然(图7)，这可以被认为是假阴性或假阳性结果。为了充分理解其对针对HPV的1型免疫性检测诠释的影响，我们已经开始在印度尼西亚对大规模HPV阳性患者和健康志愿者进行现场试验(field trial)。

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表1在侵润性淋巴细胞中所检测到的HPV16和18特异性应答

*SI＝应答T细胞的刺激指数

表2：由宫颈癌患者所识别的T细胞表位