CN113151517B - 一种氨基糖苷类抗生素抗性基因检测引物及试剂盒 - Google Patents
一种氨基糖苷类抗生素抗性基因检测引物及试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于试剂盒技术领域，提供一种环境中氨基糖苷类抗生素抗性基因的高通量定量检测引物及试剂盒，包括引物、qPCR反应试剂、smartchip芯片以及wafergen耗材，所述引物由35对氨基糖苷类抗生素抗性基因和内参16SrRNA基因的特异性引物组成，所述wafergen耗材包括384深孔板、qPCR膜、芯片暂封膜、芯片滤膜和芯片qPCR膜，本试剂盒一次可检测144个环境样本。采用wafergen平台进行ARGs检测，很好的解决了目前qPCR方法通量低的缺点。自行编写的自动化脚本，实现快速绝对拷贝数的计算。将以上36对引物预喷在芯片上，然后组装成试剂盒，方便后续环境测检点的快速检测。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种环境中氨基糖苷类抗生素抗性基因的高通量定量检测引物及试剂盒。
背景技术
抗生素自被发现以来在临床医学、畜牧养殖以及农业病虫害防治等领域的广泛应用已导致耐药病原菌和抗性基因的传播，其危害受到世界范围的重视。2014年世界卫生组织(World Health Organization，WHO)的报告提出抗生素抗性为21世纪面临的最严峻的人类健康挑战，需要加强全球抗药性的监管。早已有研究提出将抗性基因作为一种新的环境污染物。
氨基糖苷类抗生素是光谱、高效抗生素，具有许多适用于临床治疗感染的特征，尤其适合用于治疗由革兰氏阴性菌引起的严重感染，再医疗、农业、养殖业等领域有广泛应用。中国40％的抗生素用于畜牧业上，2008年全国重点城市抗生素市场排序资料显示，氨基糖苷类位列第五，仍是临床上使用量最多的五大抗生素之一。中国是氨基糖苷类抗生素的主要生产国，至2010年，中国链霉素产能已超过2800t，其中出口占总产量的58％，庆大霉素产能突破2500t，其他卡那霉素、奈替米星等也合计1000t。氨基糖苷类抗生素脂溶性差，因此人体和畜禽的肠胃道几乎不吸收，肌肉注射后大部分以原药经肾排泄，同时粪肥和抗生素又被用在农业上，并可能转移至土壤及周围人体中，最终进入食物链，对动物和人体健康以及生态系统构成潜在威胁。
细菌对氨基糖苷类抗生素逐渐产生了抗性，耐药菌残留在动物及农作物中，继而危害人类健康。另一方面，抗生素在禽畜养殖中的滥用以及环境中残留诱导微生物产生耐药基因，因此环境中氨基糖苷类抗生素及抗性基因的调查和控制至关重要。有研究认为氨基糖苷类抗性基因(aac(3)、aac(6’)、ant(2”)、aph(2”))是在污水、废水和动物粪便中最频繁检出的一类抗性基因，在天然水体中也有检出。但是目前检测抗性基因最常用的方法是qPCR和宏基因组的方法。其中宏基因组的方法，能检测样本中目前已注释的所有ARG的信息，但是价格昂贵，不适合大范围多样本的检测；传统的qPCR虽然便宜，能进行绝对定量，但是通量小，一次最多只能进行384个qPCR反应；目前用qPCR方法做ARGs检测时，做绝对定量的方法是仅绘制16S rRNA一条标准曲线，然后用相对定量的比值乘以对应的16S rRNA绝对拷贝数，具体公式如下：
相对拷贝数计算公式：
Gene copy number＝10(31-CT)/(10/3)
绝对拷贝数计算公式：
目的基因绝对拷贝数＝16s rRNA绝对拷贝数*(目的基因的相对拷贝数/16srRNA的相对拷贝数)
但是以上公式计算出来的绝对拷贝数其实并不准确。最为准确的方法是每种ARG都构建一个标准品，然后各绘制一个标准曲线。分别计算各自的绝对拷贝数。但是由此会增加另外一个难点，就是随着ARGs的引物数增加时，出现假阳性的概率越来越大，同时计算绝对拷贝数的工作量会越来越大。
发明内容
针对现有技术中qPCR方法通量小、假阳性高、计算绝对拷贝数工作量大等问题，本发明提供了一种环境中氨基糖苷类抗生素抗性基因的高通量定量检测引物及试剂盒。
一种环境中氨基糖苷类抗生素抗性基因的高通量定量检测引物，包括35对引物对和内参16S rRNA基因序列，其中35对引物对如下：
(1)扩增aac氨基糖苷类抗生素抗性基因的高通量定量检测引物对其核苷酸序列如SEQ ID NO:1～2所示；
(2)扩增aac(6')I1氨基糖苷类抗生素抗性基因的高通量定量检测引物对其核苷酸序列如SEQ ID NO:3～4所示；
(3)扩增aac(6')-Ib(akaaacA4)-01氨基糖苷类抗生素抗性基因的高通量定量检测引物对其核苷酸序列如SEQ ID NO:5～6所示；
(4)扩增aac(6')-Ib(akaaacA4)-02氨基糖苷类抗生素抗性基因的高通量定量检测引物对其核苷酸序列如SEQ ID NO:7～8所示；
(5)扩增aac(6')-Ib(akaaacA4)-03氨基糖苷类抗生素抗性基因的高通量定量检测引物对其核苷酸序列如SEQ ID NO:9～10所示；
(6)扩增aac(6')-II氨基糖苷类抗生素抗性基因的高通量定量检测引物对其核苷酸序列如SEQ ID NO:11～12所示；
(7)扩增aac(6')-Iy氨基糖苷类抗生素抗性基因的高通量定量检测引物对其核苷酸序列如SEQ ID NO:13～14所示；
(8)扩增aacA/aphD氨基糖苷类抗生素抗性基因的高通量定量检测引物对其核苷酸序列如SEQ ID NO:15～16所示；
(9)扩增aacC氨基糖苷类抗生素抗性基因的高通量定量检测引物对其核苷酸序列如SEQ ID NO:17～18所示；
(10)扩增aacC1氨基糖苷类抗生素抗性基因的高通量定量检测引物对其核苷酸序列如SEQ ID NO:19～20所示；
(11)扩增aacC2氨基糖苷类抗生素抗性基因的高通量定量检测引物对其核苷酸序列如SEQ ID NO:21～22所示；
(12)扩增aacC4氨基糖苷类抗生素抗性基因的高通量定量检测引物对其核苷酸序列如SEQ ID NO:23～24所示；
(13)扩增aadA-01氨基糖苷类抗生素抗性基因的高通量定量检测引物对其核苷酸序列如SEQ ID NO:25～26所示；
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(27)扩增aph氨基糖苷类抗生素抗性基因的高通量定量检测引物对其核苷酸序列如SEQ ID NO:53～54所示；
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(29)扩增aph(2')-Id-02氨基糖苷类抗生素抗性基因的高通量定量检测引物对其核苷酸序列如SEQ ID NO:57～58所示；
(30)扩增aph6ia氨基糖苷类抗生素抗性基因的高通量定量检测引物对其核苷酸序列如SEQ ID NO:59～60所示；
(31)扩增aphA1(akakanR)氨基糖苷类抗生素抗性基因的高通量定量检测引物对其核苷酸序列如SEQ ID NO:61～62所示；
(32)扩增spcN氨基糖苷类抗生素抗性基因的高通量定量检测引物对其核苷酸序列如SEQ ID NO:63～64所示；
(33)扩增str氨基糖苷类抗生素抗性基因的高通量定量检测引物对其核苷酸序列如SEQ ID NO:65～66所示；
(34)扩增strA氨基糖苷类抗生素抗性基因的高通量定量检测引物对其核苷酸序列如SEQ ID NO:67～68所示；
(35)扩增strB氨基糖苷类抗生素抗性基因的高通量定量检测引物对其核苷酸序列如SEQ ID NO:69～70所示；
以上35对引物对在一次检测中共同使用；
所述16S rRNA基因序列如下：
GCCCGTGACCTCGTCGTATTGACTGCATCGCGTGTCGCCCTTGATCCTAAACATAACCACTAACTGCAATATCTTATTATCATCATGTTCCACAGCTCCTCAGGCTTTATTCATGTCCATTCTTCATCAAATTCGTCATTTTTCACCAAAATGCATTGTGATAAACGATTATCACTTAAGATAATCGATTGTCTTAGTGAAATTTAACCAGAAACATCATGCAGGATGTGATAATTGAATATCAACCCAGATAATCAATTATTCCTAAAACCATTTTCAAAACCTACATGCAACTAATCAAAGGGCGACACGCGATTGCAGCGAGCCTCAGACACTGGCCGTCGTTTTACACAATCAAGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGCTCACTGGCTCACCTTCACGGGTGGGCCTTTCTTCGGTAGAAAATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTTCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAA。
一种环境中氨基糖苷类抗生素抗性基因的高通量定量检测引物的高通量定量检测试剂盒，包括：qPCR反应试剂、smartchip芯片以及wafergen耗材，所述wafergen耗材包括384深孔板、qPCR膜、芯片暂封膜、芯片滤膜和芯片qPCR膜。
其中，所述smartchip芯片内预喷有所述35对引物对和16S rRNA基因序列；
其中，所述smartchip芯片为一张72*72孔位的芯片，一次最多可进行5184个qPCR反应；
一种环境中氨基糖苷类抗生素抗性基因的高通量定量检测试剂盒检测方法，包括如下步骤：
第一步：标准曲线绘制，用双蒸水将36个阳性质粒进行10倍梯度稀释，做5个梯度，以10倍系列稀释的阳性质粒溶液作为模板，应用35个所述特异性引物对和16S rRNA基因序列分别进行qPCR扩增，绘制标准曲线；
第二步：提取环境样本DNA，测定浓度，质检，样本均一化；
第三步：待测DNA样本检测，所述反应体系与反应程序第一步绘制标准曲线的反应体系及反应程序相同；
第四步：数据处理，删除没有扩增的数据，将保留的数据通过标准曲线计算绝对拷贝数。
其中，所述通过标准曲线计算绝对拷贝数：
①计算相对拷贝数，采用2-ΔΔCt法
内参基因均一化样本差异
Ct目的基因-Ct内参基因＝ΔCt
处理和对照样本比较
ΔCt处理样本-ΔCt对照样本＝ΔΔCt
使用公式计算倍数差异(Fc)
Fc＝2-ΔΔCt
②标准曲线计算绝对拷贝数：
标准品绝对拷贝数(N)＝con.(ng/ul)*6.022*10^(23)*10^(-9)/660*basesnumber
标准曲线绘制
将各基因的标准品分别进行梯度稀释；
每个基因根据上述找出的起始浓度，进行1/10梯度稀释，得到每个基因的起始浓度与各Ct值的对应关系；其中绝对拷贝数(N)的导数与Ct值存在线性关系；
将各基因的Ct值代入各自的标准曲线方程，计算出各自的绝对拷贝数。
其中先根据标准品的浓度确定各浓度下的N，然后根据标准品各浓度下的Ct值，根据Ct＝klgN+b进行线性拟合，要求相关系数R2＞0.99。
其中，所述的样本均一化，是将样本浓度统一稀释到5ng/μl-10ng/μl。
有益效果：
1、本发明提供的35对ARGs引物覆盖了目前已注释的所有氨基糖苷类抗生素抗性基因，同时，解决了其他引物假阳性高的问题，在数量众多的引物下，本发明不仅无假阳性的现象发生，而且16S rRNA的加入不仅为后续做相对丰度提供数据支持，同时也可作为内参基因，佐证下机数据的可靠性，保证了试剂盒检测数据的准确性。
2、本发明采用wafergen平台进行ARGs检测氨基糖苷类抗生素抗性基因，很好的解决了目前qPCR方法通量低的缺点，其检测通量大，检测速度快。
3、本发明的计算方法可以实现快速绝对拷贝数的计算，用计算机运行后，能迅速计算得到绝对拷贝数。
4、本发明首次将36对引物预喷在芯片上，然后组装成试剂盒，实现了环境测检点的快速检测。
附图说明
图1：16S rRNA阳性样本筛选时PCR产物琼脂糖电泳图；
图2：16S rRNA阳性对照品绘制标准曲线时qPCR反应的溶解曲线；
图3：16S rRNA阳性对照品绘制标准曲线时qPCR反应的扩增曲线；
图4：16S rRNA标准曲线。
具体实施方式
为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体，进一步阐明本发明。
本发明中所有的原料，对其来源没有特别限定，在市场上购买的或按照本领域技术人员熟知的常规方法制备的即可。本发明中所有的原料，对其纯度没有特别限定，本发明优选采用分析纯或复合材料领域使用的常规纯度。
实施例1
本实施例提供氨基糖苷类抗生素抗性基因的高通量定量检测引物，所述氨基糖苷类抗生素抗性基因的高通量定量检测引物对由人工合成，由35个氨基糖苷类抗生素抗性基因引物对和16S rRNA基因标准品序列组成，分别如下：
所述16S rRNA基因标准品序列如下：
GCCCGTGACCTCGTCGTATTGACTGCATCGCGTGTCGCCCTTGATCCTAAACATAACCACTAACTGCAATATCTTATTATCATCATGTTCCACAGCTCCTCAGGCTTTATTCATGTCCATTCTTCATCAAATTCGTCATTTTTCACCAAAATGCATTGTGATAAACGATTATCACTTAAGATAATCGATTGTCTTAGTGAAATTTAACCAGAAACATCATGCAGGATGTGATAATTGAATATCAACCCAGATAATCAATTATTCCTAAAACCATTTTCAAAACCTACATGCAACTAATCAAAGGGCGACACGCGATTGCAGCGAGCCTCAGACACTGGCCGTCGTTTTACACAATCAAGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGCTCACTGGCTCACCTTCACGGGTGGGCCTTTCTTCGGTAGAAAATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTTCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAA。
实施例2
基于实施例1得到的引物对，本实施例提供一种试剂盒，包括如下内容：
一种环境中氨基糖苷类抗生素抗性基因的高通量定量检测试剂盒，包括35对氨基糖苷类抗生素抗性基因和内参16S rRNA基因的特异性引物、qPCR反应试剂、smartchip芯片以及wafergen耗材。
其中，所述wafergen耗材包括384深孔板、qPCR膜、芯片暂封膜、芯片滤膜和芯片qPCR膜。
所述qPCR反应试剂包括2×LightCycler 480SYBR Green IMaster、ROX、Oligo(F+R)、5个不同梯度稀释的DNA标准质粒和NF H20。
实施例3
一种环境中氨基糖苷类抗生素抗性基因的高通量定量检测方法，具体包括如下步骤：
1：标准曲线绘制
16S rRNA阳性对照品构建
第一步：用16S rRNA特异性引物大量筛选环境样本，所筛选是通过qPCR的方法扩增环境样本，所述环境样本类型为核酸样本；
第二步：观察qPCR的扩增曲线跟溶解曲线，溶解曲线单峰，扩增曲线的CT值小于25，判定此反应的样本为对应特异性引物的候选样本；
第三步：用16S rRNA特异性引物PCR扩增对应的候选样本；
第四步：PCR产物进行琼脂糖电泳、切胶回收、并采用一代测序，测序结果在NCBI数据库中进行比对，确定为特异性引物对应的基因，则此候选样本为阳性样本；一代测序结果如下：
GCCCGTGACCTCGTCGTATTGACTGCATCGCGTGTCGCCCTTGATCCTAAACATAACCACTAACTGCAATATCTTATTATCATCATGTTCCACAGCTCCTCAGGCTTTATTCATGTCCATTCTTCATCAAATTCGTCATTTTTCACCAAAATGCATTGTGATAAACGATTATCACTTAAGATAATCGATTGTCTTAGTGAAATTTAACCAGAAACATCATGCAGGATGTGATAATTGAATATCAACCCAGATAATCAATTATTCCTAAAACCATTTTCAAAACCTACATGCAACTAATCAAAGGGCGACACGCGATTGCAGCGAGCCTCAGACACTGGCCGTCGTTTTACACAATCAAGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGCTCACTGGCTCACCTTCACGGGTGGGCCTTTCTTCGGTAGAAAATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTTCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAA；
第五步：用特异性引物PCR扩增对应的阳性样本；
第六步：PCR产物进行琼脂糖电泳、切胶回收、并将回收的PCR片段与质粒进行构建，构建的质粒即为阳性对照。
标准曲线绘制：用双蒸水将上述16S rRNA阳性质粒进行10倍梯度稀释，做5个梯度，以10倍系列稀释的阳性质粒溶液作为模板；
qPCR体系如下：
反应程序：
预变性95℃，10min；{95℃，30s；60℃，30s}40cycles+溶解曲线下机后检查溶解曲线图2和扩增曲线图3，溶解曲线单峰，扩增CT值小于30且平滑，然后直线拟合(Ct＝-k*LgN+A)时R2＞0.99(图)，：LgN中，N为copy number，并绘制标准曲线图4.根据标准曲线得知16SrRNA的标准曲线方程为Ct＝-3.3236LgN+43.441；R2＝0.9929.
其余35对抗生素抗性基因如上步骤，绘制35个标准曲线。标准质粒信息如下：
35个碱基对和质粒结合后形成的碱基片段序列如下：
实施例4
一种环境中氨基糖苷类抗生素抗性基因的高通量定量检测试剂盒的使用方法，具体包括如下步骤：
第一步：提取不同流域的沉积物样本及水样各72个，合计144个样本。水样通过0.22-0.28μm滤膜过滤1L水样，然后用FastDNATM SPIN Kit for Soil试剂盒提取滤膜样本和沉积物样本。
第二步：提取的核酸用qbuit测定浓度，然后对将核酸的浓度进行均一化至10ng/μl；
第三步：根据wafergen平台的MSND操作规程，模式选择144sample*36assay，进行核酸样本排版及试剂配制，然后在MSND上将试剂和样本喷入到预喷36对特异性引物的芯片上；
第四步：上机检测，将喷入样本的预喷芯片用滤膜吸附，观查有没有喷偏的情况，用芯片qPCR膜覆盖压紧，离心后上机。
第无步：上机检测及下机数据处理，将下机数据导出，然后删除没有扩增及CT值超过31的删除，运行相对拷贝数及绝对拷贝数的计算。
其中，相对拷贝数及绝对拷贝数的计算方法如下：
1.相对拷贝数2-ΔΔCt法
内参基因均一化样本差异
Ct目的基因-Ct内参基因＝ΔCt
处理和对照样本比较
ΔCt处理样本-ΔCt对照样本＝ΔΔCt
使用公式计算倍数差异(Fc)
Fc＝2-ΔΔCt
2.绝对拷贝数(标准曲线法)
标准品制备,在NCBI数据库或CARD数据库中找到需要构建标准品基因的序列，然后根据对于基因的引物信息将PCR扩增片段提取出来，通过人工合成的方法将目的片段进行合成。并将人工合成的片段与质粒进行构建，重组后的质粒即为对应引物的标准品。
标准品绝对拷贝数(N)＝con.(ng/ul)*6.022*10^(23)*10^(-9)/660*basesnumber标准曲线绘制
将各基因的标准品分别进行梯度稀释，找到合适的起始浓度，起始浓度Ct值在10-18左右比较合适；
每个基因根据上述找出的起始浓度，进行1/10梯度稀释，得到每个基因的起始浓度与各Ct值的对应关系。其中绝对拷贝数(N)的导数与Ct值存在线性关系(如下)，根据标准品的浓度确定各浓度下的N，然后根据标准品各浓度下的Ct值，根据下面公式进行线性拟合，要求相关系数R2＞0.99，标准曲线才能用于后续计算；
Ct＝klgN+b
35个标准曲线对应的参数具体如下表：
| 基因名称 | k | b | R2 |
| aac | -3.8822 | 39.154 | 0.9981 |
| aac(6')I1 | -3.4478 | 34.953 | 0.996 |
| aac(6')-Ib(akaaacA4)-01 | -3.5703 | 35.549 | 0.9983 |
| aac(6')-Ib(akaaacA4)-02 | -3.6866 | 37.296 | 0.9992 |
| aac(6')-Ib(akaaacA4)-03 | -3.6274 | 36.362 | 0.9958 |
| aac(6')-II | -3.3979 | 36.06 | 0.9912 |
| aac(6')-Iy | -3.6102 | 37.204 | 0.9987 |
| aacA/aphD | -2.6661 | 31.376 | 0.9955 |
| aacC | -3.1486 | 34.498 | 0.9958 |
| aacC1 | -3.8845 | 38.003 | 0.9993 |
| aacC2 | -3.3604 | 34.99 | 0.9988 |
| aacC4 | -3.1615 | 35.749 | 0.9979 |
| aadA-01 | -3.3763 | 37.152 | 0.997 |
| aadA-02 | -3.8126 | 39.456 | 0.9992 |
| aadA1 | -3.4933 | 36.437 | 0.9976 |
| aadA-1-01 | -3.5156 | 36.603 | 0.9999 |
| aadA-1-02 | -3.5416 | 37.067 | 0.9994 |
| aadA2-01 | -3.0518 | 32.665 | 0.999 |
| aadA2-02 | -3.5195 | 37.952 | 0.9916 |
| aadA2-03 | -2.1351 | 26.41 | 0.9983 |
| aadA5-01 | -5.2946 | 51.42 | 0.9976 |
| aadA5-02 | -2.6571 | 31.759 | 0.9993 |
| aadA9-01 | -4.4942 | 43.878 | 0.997 |
| aadA9-02 | -3.9714 | 39.804 | 0.9975 |
| aadD | -3.4732 | 36.01 | 0.999 |
| aadE | -4.132 | 41.725 | 0.9992 |
| aph | -4.3943 | 42.221 | 0.9992 |
| aph(2')-Id-01 | -4.3925 | 43.356 | 0.9996 |
| aph(2')-Id-02 | -3.5248 | 38.108 | 0.9944 |
| aph6ia | -4.7433 | 45.424 | 0.9989 |
| aphA1(akakanR) | -4.4459 | 44.275 | 0.9979 |
| spcN | -3.1496 | 34.08 | 0.9939 |
| str | -4.6414 | 44.927 | 0.9992 |
| strA | -4.3741 | 44.231 | 0.9976 |
| strB | -4.5236 | 44.052 | 0.9968 |
实际实验时将各基因的Ct值代入各自的标准曲线方程，计算出各自的绝对拷贝数N。
序列表
<110> 安徽师范大学
<120> 一种氨基糖苷类抗生素抗性基因检测引物及试剂盒
<160> 70
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列 (Synthetic sequence)
<400> 1
ccctgcgttg tggctatgt 19
<210> 2
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列 (Synthetic sequence)
<400> 2
ttggccacgc caatcc 16
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列 (Synthetic sequence)
<400> 3
gaccggatta aggccgatg 19
<210> 4
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列 (Synthetic sequence)
<400> 4
cttgccttga tattcagttt ttataacca 29
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列 (Synthetic sequence)
<400> 5
gtttgagagg caaggtaccg taa 23
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列 (Synthetic sequence)
<400> 6
gaatgcctgg cgtgtttga 19
<210> 7
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列 (Synthetic sequence)
<400> 7
cgtcgccgag caacttg 17
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列 (Synthetic sequence)
<400> 8
cggtaccttg cctctcaaac c 21
<210> 9
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列 (Synthetic sequence)
<400> 9
agaagcacgc ccgacactt 19
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列 (Synthetic sequence)
<400> 10
gctctccatt cagcattgca 20
<210> 11
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列 (Synthetic sequence)
<400> 11
cgacccgact ccgaacaa 18
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列 (Synthetic sequence)
<400> 12
gcacgaatcc tgccttctca 20
<210> 13
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列 (Synthetic sequence)
<400> 13
gctttgcgga tgcctcaat 19
<210> 14
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列 (Synthetic sequence)
<400> 14
ggagaacaaa aataccttca aggaaa 26
<210> 15
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列 (Synthetic sequence)
<400> 15
agagccttgg gaagatgaag ttt 23
<210> 16
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列 (Synthetic sequence)
<400> 16
ttgatccata ccatagacta tctcatca 28
<210> 17
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列 (Synthetic sequence)
<400> 17
cgtcacttat tcgatgccct tac 23
<210> 18
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列 (Synthetic sequence)
<400> 18
gtcgggcgcg gcata 15
<210> 19
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列 (Synthetic sequence)
<400> 19
ggtcgtgagt tcggagacgt a 21
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列 (Synthetic sequence)
<400> 20
gcaagttccc gaggtaatcg 20
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列 (Synthetic sequence)
<400> 21
acggcattct cgattgcttt 20
<210> 22
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列 (Synthetic sequence)
<400> 22
ccgagcttca cgtaagcatt t 21
<210> 23
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列 (Synthetic sequence)
<400> 23
cggcgtggga cacgat 16
<210> 24
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列 (Synthetic sequence)
<400> 24
agggaacctt tgccatcaac t 21
<210> 25
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列 (Synthetic sequence)
<400> 25
gttgtgcacg acgacatcat t 21
<210> 26
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列 (Synthetic sequence)
<400> 26
ggctcgaaga tacctgcaag aa 22
<210> 27
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列 (Synthetic sequence)
<400> 27
cgagattctc cgcgctgta 19
<210> 28
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列 (Synthetic sequence)
<400> 28
gctgccattc tccaaattgc 20
<210> 29
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列 (Synthetic sequence)
<400> 29
agctaagcgc gaactgcaat 20
<210> 30
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列 (Synthetic sequence)
<400> 30
tggctcgaag atacctgcaa 20
<210> 31
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列 (Synthetic sequence)
<400> 31
aaaagcccga agaggaactt g 21
<210> 32
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列 (Synthetic sequence)
<400> 32
catctttcac aaagatgttg ctgtct 26
<210> 33
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列 (Synthetic sequence)
<400> 33
cggaattgaa aaaactgatc gaa 23
<210> 34
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列 (Synthetic sequence)
<400> 34
ataccggctg tccgtcattt 20
<210> 35
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列 (Synthetic sequence)
<400> 35
acggctccgc agtggat 17
<210> 36
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列 (Synthetic sequence)
<400> 36
ggccacagta accaacaaat ca 22
<210> 37
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列 (Synthetic sequence)
<400> 37
cttgtcgtgc atgacgacat c 21
<210> 38
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列 (Synthetic sequence)
<400> 38
tcgaagatac ccgcaagaat g 21
<210> 39
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列 (Synthetic sequence)
<400> 39
caatgacatt cttgcgggta tc 22
<210> 40
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列 (Synthetic sequence)
<400> 40
gacctaccaa ggcaacgcta tg 22
<210> 41
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列 (Synthetic sequence)
<400> 41
atcacgatct tgcgattttg ct 22
<210> 42
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列 (Synthetic sequence)
<400> 42
ctgcggatgg gcctagaag 19
<210> 43
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列 (Synthetic sequence)
<400> 43
gttcttgctc ttgctcgcat t 21
<210> 44
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列 (Synthetic sequence)
<400> 44
gatgctcggc aggcaaac 18
<210> 45
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列 (Synthetic sequence)
<400> 45
cgcggcaagc ctatcttg 18
<210> 46
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列 (Synthetic sequence)
<400> 46
caaatcagcg accgcagact 20
<210> 47
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列 (Synthetic sequence)
<400> 47
ggatgcacgc ttggatgaa 19
<210> 48
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列 (Synthetic sequence)
<400> 48
cctctagcgg ccggagtatt 20
<210> 49
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列 (Synthetic sequence)
<400> 49
ccgacaacat ttctaccatc ctt 23
<210> 50
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列 (Synthetic sequence)
<400> 50
accgaagcgc tcgtcgtata 20
<210> 51
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列 (Synthetic sequence)
<400> 51
taccttattg cccttggaag agtta 25
<210> 52
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列 (Synthetic sequence)
<400> 52
ggaactatgt cccttttaat tctacaatct 30
<210> 53
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列 (Synthetic sequence)
<400> 53
tttcagcaag tggatcatgt taaaat 26
<210> 54
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列 (Synthetic sequence)
<400> 54
ccaagctgtt tccactgttt ttc 23
<210> 55
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列 (Synthetic sequence)
<400> 55
tgagcagtat cataagttga gtgaaaag 28
<210> 56
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列 (Synthetic sequence)
<400> 56
gacagaacaa tcaatctcta tggaatg 27
<210> 57
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列 (Synthetic sequence)
<400> 57
taaggatata ccgacagttt tggaaa 26
<210> 58
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列 (Synthetic sequence)
<400> 58
tttaatccct cttcatacca atccata 27
<210> 59
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列 (Synthetic sequence)
<400> 59
cccatcccat gtgtaaggaa a 21
<210> 60
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列 (Synthetic sequence)
<400> 60
gccaccgctt ctgctgtac 19
<210> 61
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列 (Synthetic sequence)
<400> 61
tgaacaagtc tggaaagaaa tgca 24
<210> 62
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列 (Synthetic sequence)
<400> 62
cctattaatt tcccctcgtc aaaaa 25
<210> 63
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列 (Synthetic sequence)
<400> 63
aaaagttcga tgaaacacgc ctat 24
<210> 64
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列 (Synthetic sequence)
<400> 64
tccagtggta gtccccgaat c 21
<210> 65
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列 (Synthetic sequence)
<400> 65
aatgagtttt ggagtgtctc aacgta 26
<210> 66
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列 (Synthetic sequence)
<400> 66
aatcaaaacc cctattaaag ccaat 25
<210> 67
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列 (Synthetic sequence)
<400> 67
ccggtggcat ttgagaaaaa 20
<210> 68
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列 (Synthetic sequence)
<400> 68
gtggctcaac ctgcgaaaag 20
<210> 69
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列 (Synthetic sequence)
<400> 69
gctcggtcgt gagaacaatc t 21
<210> 70
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列 (Synthetic sequence)
<400> 70
caatttcggt cgcctggtag t 21
Claims (5)
1.一种环境中氨基糖苷类抗生素抗性基因的高通量定量检测引物组合，其特征在于：包括35对引物对和内参16S rRNA基因序列，其中35对引物对如下：
（1）扩增aac氨基糖苷类抗生素抗性基因的高通量定量检测引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1~2所示；
（2）扩增aac6'I1氨基糖苷类抗生素抗性基因的高通量定量检测引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3~4所示；
（3）扩增aac 6' -Ib akaaacA4 -01氨基糖苷类抗生素抗性基因的高通量定量检测引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5~6所示；
（4）扩增aac 6' -Ib akaaacA4-02氨基糖苷类抗生素抗性基因的高通量定量检测引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.7~8所示；
（5）扩增aac6'-Ib akaaacA4-03氨基糖苷类抗生素抗性基因的高通量定量检测引物对,其核苷酸序列如SEQ ID NO.9~10所示；
（6）扩增aac6'-II氨基糖苷类抗生素抗性基因的高通量定量检测引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.11~12所示；
（7）扩增aac6'-Iy氨基糖苷类抗生素抗性基因的高通量定量检测引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.13~14所示；
（8）扩增aacA/aphD氨基糖苷类抗生素抗性基因的高通量定量检测引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.15~16所示；
（9）扩增aacC氨基糖苷类抗生素抗性基因的高通量定量检测引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.17~18所示；
（10）扩增aacC1氨基糖苷类抗生素抗性基因的高通量定量检测引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.19~20所示；
（11）扩增aacC2氨基糖苷类抗生素抗性基因的高通量定量检测引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.21~22所示；
（12）扩增aacC4氨基糖苷类抗生素抗性基因的高通量定量检测引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.23~24所示；
（13）扩增aadA-01氨基糖苷类抗生素抗性基因的高通量定量检测引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.25~26所示；
（14）扩增aadA-02氨基糖苷类抗生素抗性基因的高通量定量检测引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.27~28所示；
（15）扩增aadA1氨基糖苷类抗生素抗性基因的高通量定量检测引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.29~30所示；
（16）扩增aadA-1-01氨基糖苷类抗生素抗性基因的高通量定量检测引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.31~32所示；
（17）扩增aadA-1-02氨基糖苷类抗生素抗性基因的高通量定量检测引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.33~34所示；
（18）扩增aadA2-01氨基糖苷类抗生素抗性基因的高通量定量检测引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.35~36所示；
（19）扩增aadA2-02氨基糖苷类抗生素抗性基因的高通量定量检测引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.37~38所示；
（20）扩增aadA2-03氨基糖苷类抗生素抗性基因的高通量定量检测引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.39~40所示；
（21）扩增aadA5-01氨基糖苷类抗生素抗性基因的高通量定量检测引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.41~42所示；
（22）扩增aadA5-02氨基糖苷类抗生素抗性基因的高通量定量检测引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.43~44所示；
（23）扩增aadA9-01氨基糖苷类抗生素抗性基因的高通量定量检测引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.45~46所示；
（24）扩增aadA9-02氨基糖苷类抗生素抗性基因的高通量定量检测引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.47~48所示；
（25）扩增aadD氨基糖苷类抗生素抗性基因的高通量定量检测引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.49~50所示；
（26）扩增aadE氨基糖苷类抗生素抗性基因的高通量定量检测引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.51~52所示；
（27）扩增aph氨基糖苷类抗生素抗性基因的高通量定量检测引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.53~54所示；
（28）扩增aph2'-Id-01氨基糖苷类抗生素抗性基因的高通量定量检测引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.55~56所示；
（29）扩增aph2'-Id-02氨基糖苷类抗生素抗性基因的高通量定量检测引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.57~58所示；
（30）扩增aph6ia氨基糖苷类抗生素抗性基因的高通量定量检测引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.59~60所示；
（31）扩增aphA1 akakanR氨基糖苷类抗生素抗性基因的高通量定量检测引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.61~62所示；
（32）扩增spcN氨基糖苷类抗生素抗性基因的高通量定量检测引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.63~64所示；
（33）扩增str氨基糖苷类抗生素抗性基因的高通量定量检测引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.65~66所示；
（34）扩增strA氨基糖苷类抗生素抗性基因的高通量定量检测引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.67~68所示；
（35）扩增strB氨基糖苷类抗生素抗性基因的高通量定量检测引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.69~70所示；
以上35对引物对在一次检测中共同使用；
所述16S rRNA基因序列如下：
GCCCGTGACCTCGTCGTATTGACTGCATCGCGTGTCGCCCTTGATCCTAAACATAACCACTAACTGCAATATCTTATTATCATCATGTTCCACAGCTCCTCAGGCTTTATTCATGTCCATTCTTCATCAAATTCGTCATTTTTCACCAAAATGCATTGTGATAAACGATTATCACTTAAGATAATCGATTGTCTTAGTGAAATTTAACCAGAAACATCATGCAGGATGTGATAATTGAATATCAACCCAGATAATCAATTATTCCTAAAACCATTTTCAAAACCTACATGCAACTAATCAAAGGGCGACACGCGATTGCAGCGAGCCTCAGACACTGGCCGTCGTTTTACACAATCAAGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGCTCACTGGCTCACCTTCACGGGTGGGCCTTTCTTCGGTAGAAAATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTTCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAA。
2.一种根据权利要求1所述的环境中氨基糖苷类抗生素抗性基因的高通量定量检测引物组合的高通量定量检测试剂盒，其特征在于：所述高通量定量检测试剂盒包括：qPCR反应试剂、smart chip芯片以及wafergen耗材，所述wafergen耗材包括384深孔板、qPCR膜、芯片暂封膜、芯片滤膜和芯片qPCR膜；
其中，所述smart chip芯片内预喷有所述35对引物对和16S rRNA基因序列。
3.根据权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于：所述smartchip芯片为一张72*72孔位的芯片，一次最多能够进行5184个qPCR反应。
4.一种权利要求2所述检测试剂盒的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
第一步：标准曲线绘制，用双蒸水将36个阳性质粒进行10倍梯度稀释，做5个梯度，以10倍系列稀释的阳性质粒溶液作为模板，应用所述35对引物对和16S rRNA基因序列分别进行qPCR扩增，绘制标准曲线；
第二步：提取环境样本DNA，测定浓度，质检，样本均一化；
第三步：待测DNA样本检测，反应体系与反应程序和第一步绘制标准曲线的反应体系及反应程序相同；
第四步：数据处理，删除没有扩增的数据，将保留的数据通过标准曲线计算绝对拷贝数；
其中，所述通过标准曲线计算绝对拷贝数包括：
①计算相对拷贝数，采用2-ΔΔCt法
内参基因均一化样本差异
Ct目的基因-Ct内参基因=ΔCt
处理和对照样本比较
ΔCt处理样本-ΔCt对照样本=ΔΔCt
使用公式计算倍数差异Fc
Fc=2-ΔΔCt
②标准曲线计算绝对拷贝数：
标准品绝对拷贝数N=con.(ng/ul)*6.022*10^(23)*10^(-9)/660*bases number
标准曲线绘制
将各基因的标准品分别进行梯度稀释；得到每个基因的起始浓度与各Ct值的对应关系；其中绝对拷贝数N的导数与Ct值存在线性关系；
将各基因的Ct值代入各自的标准曲线方程，计算出各自的绝对拷贝数；
先根据标准品的浓度确定各浓度下的N，然后根据标准品各浓度下的Ct值，根据Ct=klgN+b进行线性拟合，要求相关系数R2＞0.99。
5.根据权利要求4所述的检测试剂盒的检测方法，其特征在于：所述的样本均一化，是将样本浓度统一稀释到5ng/μl-10ng/μl。
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