CN103184221A - 核开关aac及其在制备抗生素中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术领域，涉及一种新型抗生素药物筛选靶点。更具体地，本发明涉及aac核开关的序列和制备方法，以及其作为新型抗生素筛选靶点的应用。本发明提供了一种核开关，其DNA序列如SEQ IN NO 1所示；其中，N是A、T、G或者C中的任意一种；或者，该核开关的DNA序列如SEQ IN NO 2所示。利用该核开关的RNA序列容易结合抗生素、进而引起抗性基因表达的特性，将该核开关作为筛选新型抗生素或者降低微生物抗药性的药物的药靶。本发明为诱导性耐药的研究提供了新的思路。

Description

核开关aac及其在制备抗生素中的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种抗生素及耐药相关的核开关。更具体地，本发明涉及核开关“aac”的体外转录，与抗生素相互作用后结构变化，以及其作为抗生素作用靶点的应用。

背景技术

抗生素的发现给人类有效治疗各种细菌感染病带来福音。但是，抗生素的广泛使用乃至于滥用所致的抗生素耐药性日益巨增，造成大量抗生素失去作用，据统计目前每年全世界死于多种细菌感染病的人数比十年前高8倍。因此，发现新型抗生素十分重要，而其关键点是找到抗生素新靶点。

核糖体是细菌用来合成蛋白质的场所，已知现有的许多抗生素的作用位点是细菌核糖体，抗生素与核糖体的结合使细菌的蛋白质合成无法进行，从而达到杀死细菌的效果。近几年来，利用X-光衍射结晶的方法，细菌核糖体的结构已逐渐被解析清楚[Structure of the 30Sribosomal subunit.Wimberly，B.，Brodersen，D.，Clemons，W.J.，Morgan-Warren，R.，Carter，A.，Vonrhein，C.，Hartsch，T.& Ramakrishnan，V.，Nature.2000.407(6802)：327-39.Crystal structure of the ribosome at 5.5A resolution.Science.Yusupov，M.，Yusupova，G.，Baucom，A.，Lieberman，K.，Earnest，T.，Cate，J.& Noller，H.，2001.292(5518)：p.883-96.A detailed view of a ribosomal active site：the structure ofthe L11-RNA complex.Wimberly，B.T.，Guymon，R.，McCutcheon，J.P.，White，S.W.，andRamakrishnan，V.，Cell.，1999.97(4)：p.491-502.Structure of the S15，S6，S18-rRNAcomplex：assembly of the 30S ribosome central domain.Agalarov，S.C.，Sridhar Prasad，G.，Funke，P.M.，Stout，C.D.，and Williamson，J.R.，Science，2000.288(5463)：p.107-13.]，使得以结构为基础的新抗生素的发现成为可能，因此当前针对细菌核糖体结构进行抗生素靶点的研究受到了广泛的关注[The structural basis for the action of theantibiotics tetracycline，pactamycin，and hygromycin B on the 30S ribosomal subunit.Brodersen，D.E.，Clemons，W.M.J.，Carter，A.P.，Morgan-Warren，R.J.，Wimberly，B.T.，and Ramakri shnan，V.，Cell，2000.103(7)：p.1143-54.The structural basis of ribosomeactivity in peptide bond synthesis.Nissen，P.，Hansen，J.B.，N.，Moore，P.，andSteitz，T.，Science，2000.289(5481)：p.920-30.]。

细菌体内能够进化出修饰抗生素靶点的系统，是其对抗抗生素并产生耐药性的一个重要原因。而其中，细菌核糖体RNA上特定位点的甲基化是目前观察到的一个普遍现象。例如，某些从临床上分离的抗红霉素的的金黄色葡萄球菌，基因组中编码一类红霉素耐药型RNA甲基转移酶(Erythromycin resistance RNA methyltransferase C，ERM C)，ERM蛋白能够甲基化23S RNA上2058位的腺嘌呤A，甲基化后的A2058位会影响核糖体RNA局部的构象，使红霉素无法再结合这一区域，从而造成细菌的耐药性[The structural basis of ribosome activity inpeptide bond synthesis.Nissen，P.，Hansen，J.B.，N.，Moore，P.，and Steitz，T.，Science，2000.289(5481)：p.920-30.The bacterial  ribosome，a promising focus forstructure-based drug design.Knowles D，Foloppe N，Matassova N，Murchie A I H.Current Opinion in Pharmacology，2002.2(5)：p.501-6.]。

耐药菌的耐药性是指，当长期应用或接受抗生素或其他生化药剂时，本来敏感的细菌多数被杀灭，而少数菌株可因基因突变、耐药质粒的产生等而生存，并大量繁殖，从而对某种或某类抗生素产生部分或完全的耐药性，也称之为获得性耐药性。而一些细菌对某些抗生素药物天然不敏感，即天然耐药性，也称固有耐药性。目前认为获得性耐药是微生物产生耐药性的主要原因，这是人类长期使用抗生素和不合理使用抗生素药物的直接后果。在获得性耐药的产生机制方面目前还不是很清楚，但是诱导耐药基因表达最核心的是耐药基因5’端非翻译区域序列，如ermC的前导序列。

2002年，Breaker实验室发现了一类新的调控RNA[The bacterial ribosome，apromising focus for structure-based drug design.Knowles D，Foloppe N，MatassovaN，Murchie A I H.Current Opinion in Pharmacology，2002.2(5)：p.501-6]，它们依赖细胞内的代谢状态，选择性的结构形成来调控转录的延伸和翻译的起始。这类RNA的特性是不需要中间感应分子(如蛋白分子或tRNA)参与去控制衰减过程而行使这些感应分子的功能。这些自然界存在的RNA适体，也叫核开关，调控细菌甚至一些高等生物体的大范围内代谢基因的表达。核开关位于大量代谢途径相关基因的前导序列，在转录和翻译水平上能抑制或者激活它们同源基因。

发明内容

本发明要解决的问题是提供了一种新的核开关，将其作为抗生素筛选的新药靶。

1944年以来，氨基糖苷类抗生素临床应用走过了漫长的道路，细菌也产生了更强的耐药性。氨基糖苷类抗生素耐药机制包括：抗生素乙酰化，腺苷化或磷酸化；细菌外膜通透性改变，使胞内抗生素浓度降低，减少内膜运输，主动外排，药物诱捕；30S核糖体亚基作用位点突变；抗生素结合位点甲基化等。而诱导抗性基因的表达成为当前抗生素耐药的主要问题。

AAC(6’)-IIb位于荧光假单胞菌的染色体上，该基因表达使细菌对庆大霉素、妥布霉素、奈替米星、地贝卡星和西索米星产生抗性。此氨基糖苷类抗生素抗性基因的5’端非翻译区，序列来源于基因aac(6’)-IIb[10.Isolation，Characterization，and DNA-sequenceAnalysis of an AAC(6’)-II Gene from Pseudomonas-aeruginosa.Shaw KJ，Cramer CA，RizzoM，Mierzwa R，Gewain K，Miller GH，Hare RS.Antimicrobial Agents and Chemotherapy，1989，33p：2052-62.Correlation between Aminoglycoside Resistance Profiles and DNAHybridization of Clinical Isolates.Antimicrobial Agents and Chemotherapy，1991，35p：2253-61.A Spontaneous Point Mutation in the AAC(6’)-IB’Gene Results in AlteredSubstrate-specificity of Aminoglycoside 6’-N-Acetyltransferase of aPseudomonas-fluorescens Strains.Lambert T，Ploy MC，Courval in P.Fems MicrobiologyLetters，1994，115p：297-303.Aminoglycoside resistance in Pseudomonas aeruginosa.Antimicrobial Agents and Chemotherapy.Poole K.2005，49p：479-87.Aminoglycoside-resistance mechanisms for cystic fibrosis Pseudomonas aeruginosaisolates are unchanged by long-term，intermittent，inhaled tobramycin treatment.MacLeod DL，Nelson LE，Shawar RM，Lin BB，Lockwood LG，Dirks JE，Miller GH，et al.Journal of Infectious Diseases，2000，181p：1180-4.]，氨基糖苷乙酰转移酶前导序列，GeneBank编号：L06163.1。

该酶首先在荧光假单胞菌中发现，对gentamycin，tobramycin，netilmycin，dibekacin和sisomicin耐药。氨基糖苷类乙酰转移酶选择性催化氨基糖苷类抗生素四个氨基任一氨基酸的乙酰化，降低这些抗生素与tRNA 30S核糖体的亲和力。乙酰辅酶A和抗生素氨基基团随机结合后，氨基糖苷的氨基通过直接亲核攻击硫酯而发生乙酰化[New integron-associated genecassette encoding a 3-N-aminoglycoside acetyltransferase.Levings RS，Partridge SR，Lightfoot D，Hall RM，Djordjevic SP.Antimicrobial Agents and Chemotherapy，2005，49p：1238-41]。

本发明通过长期探索，发现aac作为核开关调控氨基糖苷类抗性基因表达，同时也是筛选新抗生素的作用靶点。参考ermC前导序列和核开关命名方法，将AAC(6’)-Iib的5’-UTR非翻译区序列为aac。

本发明提供了一种新的核开关，其DNA序列如SEQ IN NO 1所示；其中，N是A、T、G或者C中的任意一种。SEQ ID NO 1：CNNNNNNNCNCANCNGNGNAGTCG。

本发明的一个实施例中，提供了一种具体的核开关的DNA序列：GGAGCAGCAACGATGTTACGCAGCAGGGCAGTCGCCCTAAAACAAAGTTAGGCAGCACGGAGACACTTCAGCATG(SEQID NO 2)。

本发明还提供了含有上述核开关的DNA序列的载体。

所述的载体是在多克隆位点处插入SEQ ID NO 1或者2所述的核开关的DNA序列。

本发明的核开关aac，可以按照SEQ IN NO 2的序列人工合成。也可以从荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)中获得。

本发明的核开关aac，可以用于筛选降低抗生素耐药性的物质。

本发明的核开关aac，可以作为筛选抗生素的靶标。例如用于筛选氨基糖苷类抗生素。

具体而言，可以将本发明的核开关aac核开关的DNA序列以及验证基因装入表达载体，转入宿主表达，加入候选物质，能够使验证基因表达变化的候选物质即为目标化合物。

加入候选物质的同时可以加入抗生素，能够使宿主产生抗生素耐性的候选物质即为耐药化合物。

本发明还提供了一种筛选抗生素的试剂盒，该试剂盒中含有上述核开关。

所述的试剂盒还含有分子量标记试剂。此外，还可以含有缓冲液，小分子量的蛋白或者核酸标记，内参试剂或者说明书，等。

本发明的一个实施例中提供了一种核开关，它包括序列表SEQ ID NO 2中所示的75个碱基，而碱基1-46是整合子1的保守序列。利用该序列RNA容易结合抗生素的进而引起抗性基因表达的特性，将该核开关作为筛选新型抗生素或者降低微生物抗药性的药物的药靶。

本发明的aac可翻译成短肽，具有ermC、fexA一样的性质。vienna RNA结构在线分析显示，aac在不同温度下呈现不同结构，说明其不同结构可能会影响AAC(6’)-IIb的表达。

体内试验中，构建了含有本发明的aac的载体，例如pGEX-aac-lacZα报告基因表达载体。还构建了含有kanamycin基因的载体pGEX-RmtB-aac-lacZα。

为了证明ggc具有核开关功能，能与抗生素相互作用，本发明选用具有代表性的氨基糖苷类结构模型kanamycin B作为一个实例。

lacZ酶活试验显示，加入kanamycin B组酶活升高，证实其能诱导lacZα的表达。而荧光定量PCR发现lacZα转录水平上，加抗生素组比对照组有稍微上调。不同浓度kanamycinB不引起lacZα转录产物的较大变化，推测kanamycin B组与对照组aac-lacZα实际上没有转录产物表达变化，只有aac转录产物二级结构的变化。

平板诱导实验从另一个角度、更直观的证明了aac RNA能与氨基糖苷类抗生素结合。根据lacZα的表达情况，除spectinomycin外所用13种氨基糖苷类抗生素均能诱导报告基因表达。

SPR实验进一步验证了aac RNA能够与抗生素结合，并获得结合常数。SPR实验需要aacRNA 3’末端标记生物素。经验证，标记过程RNA无明显降解，标记效率高，产量多。体外SPR实验证明，aac RNA能与除spectinomycin外氨基糖苷类抗生素结合，而结合常数与抗生素结构中氨基位置和结构有关。RNA与小分子结合调控相关基因表达为“核开关”的定义。

构建pGEX-RmtB-aac-lacZα报告载体，16S rRNA甲基化，平板诱导实验显示除spectinomycin外氨基糖苷类抗生素仍能诱导lacZα的翻译，证明aac与氨基糖苷类抗生素直接结合，aac是以氨基糖苷类抗生素为配体的核开关。

SHAPE实验证实，aac作为核开关，其与氨基糖苷类抗生素结合前后应有结构改变。氨基糖苷类抗生素与aac RNA结合后使翻译起始SD-2及AUG-2结构打开，而spectinomycin不与之结合。

非变性胶比较试验显示，单碱基突变的aac在加药前后位移发生明显变化，进一步证明其余氨基糖苷类药物结合。

根据以上方法，可以设计一些药物分子抑制aac的功能，使抗生素无法与aac结合，或者设计一些和ggc配对的RNA分子，进而阻断其二级结构的变化，使抗生素失去诱导效应。

发明有如下创新：

1.aac核开关具有很强的代表性，部分序列是整合子1的保守序列，分析其5’UTR序列和很多氨基糖苷类抗性基因5’UTR相关联。

2.构建了新的报告基因载体，该载体优于报导的一些载体，具有通用性和高灵敏性，可以筛选原核生物中具有诱导或抑制功能的前导序列。

3.发现aac为核开关，受氨基糖苷类抗生素调控的核开关，这也是首次报导抗生素小分子作为配体，可直接结合RNA，调控基因表达。

4.预测了aac在有无抗生素存在情况下的结构，SHAPE技术可以发现结合位点及结构变化，同时从非变性胶得到结构变化的改变。

5.aac核开关的发现为基于核开关的新型抗菌药物提供了坚实的基础，为抗菌药物研发提供了一个全新的思路。

本发明发现一个新核开关aac，配体为氨基糖苷类抗生素，这也是首次报导抗生素为配体诱导抗性基因表达的核开关，为诱导耐药机制研究提供了新的模型，为新抗生素的研发开辟了一个新的领域。

附图说明

图1是aac与16S rRNA氨酰基位点编码区域的修饰位点比对。

图2-4是载体构建示意图。

图5-6显示了不同浓度kanamycin B对报告基因β-半乳糖苷酶的诱导作用。

图7-11是平板诱导实验(pGEX-aac-lacZα)的结果。

图12是aac RNA 3’末端生物素标记的结果。

图13-14是Kanamycin B与aac作用的动力学曲线和亲和力拟合曲线。

图15-16是spectinomycin与aac作用的动力学曲线和亲和力拟合曲线。

图17-21是平板诱导实验(pGEX-RmtB-aac-lacZα)的结果。

图22显示10μM kanamycin B与aac RNA作用后SHAPE荧光强度变化。

图23-24显示10μM kanamycin B与aac-linkers RNA作用前后的凝胶位移。

具体实施方式

本发明经过深入而广泛的研究，在荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)中获得了与红霉素甲基转移酶基因前导序列类似功能序列，而该序列部分是整合子1的必需组成序列，本发明命名为aac。在成功合成该序列、体外转录出RNA后，本发明的研究显示，这种序列具有核开关功能，且是抗生素药物的作用靶点。

实施例1：报告基因载体构建

根据氨基糖苷类抗生素易作用于16S rRNA的A位点，在欧洲生物学中心网站上进行clustwal比对，结果显示aac与A位点存在很多相同碱基，如图1所示。

体内验证试验，通过在质粒pGEX4T-3(4968bp)于BspMI与Tth111I处酶切，插入tac启动子(Ptac)，lac操纵子(Olac)，aac序列，lacZα序列，色氨酸终止子Ttrp序列，质粒命名为pGEX-aac-lacZα。

抗性基因RmtB插入到kasI/NarI与BspMI之间，质粒命名为pGEX-RmtB-aac-lacZα。如图2-4所示。

实施例2：lacZ酶活测定

5ml过夜培养的JM109含转化质粒pGEX-aac-lacZα，1∶100转接入新鲜LB液体培养基中，加入100μg/ml氨苄，0.5mM IPTG，37℃培养1.5～2h；分接到无菌玻璃管，加入不同浓度的氨基糖苷类抗生素，培养24h；测定并记录Abs600的吸光度；吸取20μl菌液加入80μl使细胞壁通透的溶液1(100mM Na₂HPO₄.20mM KCl，2mM MgSO₄.0.8mg/mL CTAB，0.4mg/mL sodiumdeoxycholate，5.4μL/mL beta-mercaptoethanol)至1.5ml EP管；30℃孵育20-30min，相同条件孵育含底物ONPG的溶液2(60mM Na₂HPO₄.40mM NaH₂PO₄.1mg/mL ONPG，2.7μL/mLβ-巯基乙醇)；加入600μl溶液2到每个EP管，孵育2h；加入700μl终止液(1M Na₂CO₃)，混匀；12,000转离心5～10min，上清Abs420测定并记录。计算酶活公式：1000×Abs420的值除以Abs600×0.02×120的值为最终酶活。

图5-6中显示卡那霉素B能诱导lacZ表达，而在RNA转录上无明显变化。这说明，卡那霉素B能与aac相互作用，从而启动lacZ表达。

实施例3：荧光定量PCR

1.菌液培养

如lacZ酶活测定，加入不同浓度抗生素培养24h后离心收集细胞。

2.提取RNA

样品加入1ml TRIzol后，室温放置5min，使样品充分裂解；如不进行下一步操作，样品可放入-70℃长期保存；加入200μl氯仿，剧烈振荡混匀后室温放置3-5min使其自然分相；4℃12,000rpm离心10-15min。把水相(通常可吸取550μl)转移到新管中；在上清中加入等体积冰冷的异丙醇，室温放置10-20min；4℃12,000rpm离心10min，弃上清，RNA沉淀于管底；RNA沉淀中加入1ml 75％乙醇(用RNase-free水配制)，温和振荡离心管，悬浮沉淀；4℃12,000rpm离心10min，弃上清；短暂快速离心，用移液器小心吸弃上清；室温放置10min晾干沉淀；沉淀中加入50-100μl RNase-free水，轻弹管壁，以充分溶解RNA，-70℃保存。

3.纯化RNA

本实验的目的为除去RNA中的基因组DNA，利用TaKaRa公司提供的DNaseI(RNase Free)Kit纯化。在1.5mL离心管中配制下列反应，体系如下：总RNA约20-50μg，10×DNaseI Buffer5μL，DNaseI(RNase-free，5U/μL)2μL，RNase Inhibitor(40U/μL)0.5μL，加DEPC H₂O至50μL，37℃反应20-30分钟。反应完后处理步骤为：加入350μl的RNase-free水；加入400μl(等量)的苯酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)，充分混匀；12,000rpm离心10min，取上层(水层)移至另一1.5ml离心管中；加入400μl(等量)的氯仿/异戊醇(24∶1)充分混匀；12,000rpm离心10min，取上层(水层)移至另一1.5ml离心管中；加入40μl(1/10体积)3M的醋酸钠(pH5.2)；加入1ml(2.5倍体积)的冷无水乙醇，-80℃放置1h；4℃下12,000rpm离心10min，尽量弃上清；加入300μl预冷的70％乙醇，4℃下12,000rpm离心10min，尽量弃上清；加入300μl预冷的无水乙醇，4℃下12,000rpm离心10min，尽量弃上清；室温晾干5-10min；RNase-free水溶解，进行琼脂糖凝胶电泳确认是否除去基因组DNA。

4.合成cDNA

在本实验中，采用Takara公司的PrimeScript^TMRT-PCR Kit以检验合格并浓度确定的RNA为模板，经逆转录反应合成cDNA第一链，反应体系如下：dNTP Mixture(10mM each)1μl，Oligo dT Primer(2.5μM)0.5μl，Random 6mers(20μM)0.5μl，Template RNA 8μl，加RNase free dH₂O至10μl。将混合物在PCR仪上于65℃变性5min后置于4℃，离心数秒钟使模板RNA、引物等的混合液聚集于EP管底部，在上述EP管中加入下列反转录反应液：5×PrimeScript^TMBuffer 4μl，RNase Inhibitor(40U/μL)0.5μl，PrimeScript^TMRTase(for 2step)0.5μl，Rnase-Free H₂O至20μl。然后在PCR仪上按下列条件进行反转录反应：30℃for 10min，42℃for 30min，95℃for 5min，4℃保存。

5.Real-time PCR

采用TaKaRa公司提供的SYBR Premix Ex Taq^TMKit于Bio-Rad公司的iQ5multicolorreal-time PCR detector system进行实验操作。其中cDNA模板为不同的待测样品，引物为待测基因，

AmpR-Forward：TGGCTGGTTTATTGCTGAT，(SEQ ID NO 3)；

AmpR-Reverse：TAACTACGATACGGGAGGG，(SEQ ID NO 4)；

lacZα-Forward：CGTCGTGACTGGGAAAAC，(SEQ ID NO 5)；

lacZα-Reverse：GCCTCTTCGCTATTACGC，(SEQ ID NO 6)。

6.Real-Time PCR实验数据的分析：

用Bio-Rad公司的Bio-Rad iQ5软件打开Realtime PCR的数据文件；软件通过2^-ΔΔCt方法自动计算数据，给出Ct值、相对表达量和误差值，并根据相对表达量和误差值绘出柱状图。详细结果见图5-6。

实施例4：报告基因诱导实验

1.感受态制备

感受态大肠杆菌JM109购于上海生工，划无抗生素平板，37℃培养箱培养过夜；挑单个菌落于5ml LB培养基，37℃200rpm培养过夜；转接300ml LB培养基培养1-2h至OD≤0.3；收集JM109至50ml无菌corning管，置于冷库20min；4000rpm，4℃离心10min；弃上清，加入20ml 100mM CaCl₂，轻轻悬起菌液；4000rpm，4℃离心10min；弃上清，加入4ml 100mMCaCl₂与15％甘油混合物，轻轻悬起菌液；100μl分装至500μl EP管，液氮冷冻或-80℃长期保存。

2.转化实验

取感受态JM109两管，置于冰上直至溶解；加入质粒pGEX-aac-lacZα、pGEX-RmtB-aac-lacZα各1μl，静置冰上20-30min；42℃热激45S，迅速放冰上1-2min；加入液体LB 500μl，37℃200rpm培养1h；离心弃上清，剩余菌液涂于含100μg/ml氨苄培养基，37℃培养箱培养过夜。

3.平板实验

分别挑取单菌落，做PCR检测aac、RmtB；对含转入质粒单菌落置于5ml，100μg/ml氨苄液体LB培养基，37℃200rpm培养过夜；1∶100转接至含氨苄100μg/ml，IPTG 0.5mM的液体LB培养基中，37℃200rpm培养2h；菌液50-500μl转入37℃，10ml含0.6％琼脂的LB培养基中，混匀；平铺于含1.5％琼脂，100μg/ml氨苄，IPTG 0.5mM，160μg/ml X-gal的LB培养基平板上；待琼脂凝固，1-10μl不同浓度的氨基糖苷类抗生素置于平板上，锡箔纸包裹后平整放入37℃培养箱培养18-24h；取出平板，置于扫描仪下拍照。

详细结果见图7-11和图17-21。

平板诱导实验显示，除spectinomycin外氨基糖苷类抗生素仍能诱导lacZα的翻译，证明aac与氨基糖苷类抗生素直接结合，aac是以氨基糖苷类抗生素为配体的核开关。

实施例5：表面等离子共振实验验证抗生素与aac是否有相互作用

1.DNA模板制备

上海生工合成，aac序列前加上T7启动子序列，以及单独T7互补序列，所有片段用PAGE法纯化。合成报告单给出了每OD引物稀释为100μmoL/L(即100pmol/μl)浓度的加水量，加入适量的退火缓冲液PCR 10×buffer(Takara)溶解引物，开启瓶盖溶解之前在3000-4000rpm/min的转速下离心1min，防止开盖时引物散失。将要退火的引物等摩尔数混合，总体积不要超过500μl，加热到95℃2min，然后缓慢冷却至室温(低于30℃)即可。退火的产物可以放在4℃待用。

2.RNA制备

T7RNA polyerase由本实验室纯化保存。其中10×transcription buffer包括：400mMTris-HCl，pH7.9；0.1％(V/V)Triton X-100；200mM MgCl₂；20mM spermidine。体外转录RNA总体积500μl体系条件如下：10×transcription buffer 50μl，1M DTT 5μl，25mM rNTPmixture 112.5μl，DNA template(～700ng/μl)25μl，RNase inhibitor 12.5μl，T7RNApolymerase 25μl，RNase-free H₂O 245μl，42℃反应4-6h。加12.5μl DNase I，37℃反应45min；加512.5μl Formamide，95℃反应5min；置于冰上。

3.胶纯化回收

配置15％的丙烯酰胺凝胶200ml：5×TBE 40ml，Urea 84.08g，40％stocking buffer 75ml，APS(10％)680μl，TEMED 200μl，加RNase-free H₂O至200ml。胶1500V预电泳1h左右直至玻璃胶板大于50℃，上样置于冰上的变性样品，1500V电泳3-5h；拨胶于保鲜膜上，以荧光板为背景，手提紫外暗室照射发光，切下RNA条带；RNA条带置于透析袋内，加入相应1×TBEbuffer，170V透析4h；加入1/10体积3M的醋酸钠(pH5.2)；加入2.5倍体积的冷无水乙醇，-20℃放置3h或过夜，或-80℃放置1h；4℃，12000rpm离心10分钟，弃上清；加入300μl预冷的75％乙醇，4℃下12000rpm离心10分钟，弃上清；加入300μl预冷的无水乙醇，4℃下12000rpm离心10分钟，弃上清；室温晾干。

4.RNA标记

RNA溶于pH5.0，0.1M醋酸钠溶液中，其中醋酸钠溶液含0.1M过碘酸钠。室温暗室孵育90-180min；加入终浓度为0.25M的氯化钾，置于冰上；4℃，10000g离心5min；上清过SephadexG-25除盐；RNA溶于pH4.0，100μl，50mM的醋酸钠溶液；加入pH7.2，30μl，2M含碳原子的长链，37℃反应2h；加入15μl，2M的溶于乙腈的NaCNBH3，室温孵育1h；RNA乙醇沉淀回收；RNA溶于100μl，0.5M NaHCO₃-Na₂CO₃pH8.5～9.0[0.5M Na₂CO₃(5.3％)10ml+0.5M NaHCO₃(4.2％)90ml]；加入300μl溶于DMSO的NHS-biotin，室温孵育2h；乙醇沉淀回收。详细实验结果见图12。

5.RNA固定

RNA溶于pH7.4，1×HBS溶液中；S-A芯片用终浓度1M NaCl溶于50mM NaOH的混合液注射1min，连续三次；手动注射RNA至Fc-2，直至固定过程中显示信号不上升；Prime三次，HBS buffer 10μl/min流动过夜。

6.RNA与抗生素作用检测

配置不同浓度的氨基糖苷类抗生素溶液(包括庆大霉素gentamicin、奇霉素spectinomycin和卡那霉素kanamycin)，做动力学浓度梯度实验。进样时间2min，解离时间4.5min，150mM Na₂SO₄冲洗时间2min。结束后用亲和力和动力学曲线分析结果。

图13-14显示，aac能与kanamycin结合并相互作用，图15-16则显示aac能与spectinomycin结合指数低。

实施例6：引物延伸法分析选择性的2-OH酰基化(Selective 2-hydroxyl acylationanalyzed by primer extension(SHAPE))证实氨基糖苷类抗生素与aaG结合后结构变化：及非变性胶阻滞实验。

由于aac全长为75个碱基，所以毛细管电泳后的前后各10个碱基信号不可靠，在aac两端加入文献报道所用碱基链(linker)。设计序列T7+aac+linker，以及带FAM标记引物，合成8条引物，通过引物延伸法合成全长序列。

表1 设计的8条引物序列

另合成带5’端FAM标记的引物：FAM-GAAACGGAACGAAGCCCG。序列T7+aac+linker插入到pMD18-T载体，测序正确后以质粒为模板，引物编号1，8为引物，PCR产物体外转录制备RNA。加入10μl10pmol RNA；加入50μl 1×TBE；95℃孵育3min，置冰上；加入30μl 1×TBE；25℃孵育1h；加入10μlNMIA；25℃孵育2.5h；乙醇沉淀；沉淀RNA按SuperScriptTM III ReverseTranscriptase试剂盒操作。10pmol RNA溶于0.5×TE，加入FAM标记的引物10μM2μl，2.5mM dNTP4μl，加ddH2O至总体积13μl，而RNA marker则需加入20mM ddNTP 2μl。65℃反应5min，放置冰上1min。另外加上5×first strand buffer 4μl，0.1M DTT，1μl RNaseinhibitor(40U/μl)1μl，Superscript III 1μl，52℃反应1h后加入4M氢氧化钠1μl，95℃孵育5min，乙醇沉淀。DNA沉淀溶于10μl水，ABI3730STR测序。序列按照ABI peak scanner中height数值计算相对比例。详细实验结果见图22。

通过点突变M1，M2，M3，M4及敲出9个碱基的M5可以发现非变性凝胶电泳中RNA含卡那霉素B的电泳系统中存在结构改变，电泳速度加快，详细实验结果见图23-24。

无需进一步详细阐述，相信采用前面所公开的内容，本领域技术人员可最大限度地应用本发明。因此，前面的优选具体实施方案应被理解为仅是举例说明，而非以任何方式限制本发明的范围。

从以上描述，本领域技术人员可容易地明了本发明的本质特征，而且在不偏离其主旨和范围的情况下，可对本发明进行各种变更和改进。

Claims (10)

1.一种核开关，其特征在于，该核开关的DNA序列如SEQ IN NO 1所示；其中，N是A、T、G或者C中的任意一种。

2.如权利要求1所述的核开关，其特征在于，该核开关的DNA序列如SEQ IN NO 2所示。

3.含有权利要求1或者2所述的核开关的DNA序列的载体。

4.如权利要求3所述的载体，其特征在于，所述的载体是在多克隆位点处插入序列1或者2所述的核开关的DNA序列。

5.权利要求2所述的核开关的制备方法，其特征是，按照SEQ IN NO 2的序列人工合成该核开关。

6.权利要求1或者2所述的核开关的应用，其特征是，将该核开关作为筛选抗生素的靶标。

7.如权利要求6所述的应用，其特征是，所述的抗生素是氨基糖苷类抗生素。

8.权利要求1或者2所述的核开关的应用，其特征是，将该核开关用于筛选降低抗生素耐药性的物质。

9.权利要求1或者2所述的核开关的应用方法，其特征是，该方法依次包括下列步骤：

(1)将权利要求1或者2所述的核开关的DNA序列以及验证基因装入表达载体；

(2)将步骤(1)制备的载体转入宿主进行表达；

(3)加入候选物质；

(4)检测验证基因的转录、表达产物的量及活性，能够使验证基因表达变化的候选物质即为目标化合物。

10.一种筛选抗生素的试剂盒，其特征是，该试剂盒中含有权利要求1或者2所述的核开关。

Images