CN113150098A

CN113150098A - GmEID1蛋白在调控大豆开花和主茎节数中的应用

Info

Publication number: CN113150098A
Application number: CN202110555960.4A
Authority: CN
Inventors: 刘军; 秦超; 赵涛; 李宏宇; 刘斌
Original assignee: Institute of Crop Sciences of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Longping Biotechnology Hainan Co ltd
Priority date: 2021-05-21
Filing date: 2021-05-21
Publication date: 2021-07-23
Anticipated expiration: 2041-05-21
Also published as: CN113150098B

Abstract

本发明公开了GmEID1蛋白在调控大豆开花和主茎节数中的应用。本发明所保护的一个技术方案是蛋白质或调控所述蛋白质活性或含量的物质在调控或延迟植物花期、调控或增加植物主茎节数、调控或增加植物株高以及植物育种和改良中的应用。所述蛋白为序列表中序列1所示的GmEID1蛋白或突变失活后的GmEID1蛋白。实验证明，降低大豆中GmEID1蛋白的表达量和/或活性后得到转基因大豆，与大豆品种TL1相比，可延迟大豆花期且使大豆主茎节数增加。因此，GmEID1蛋白可以延迟大豆花期，增加株高、分枝数、主茎节数、单株荚数和单株产量，可应用于大豆育种。

Description

GmEID1蛋白在调控大豆开花和主茎节数中的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及GmEID1蛋白在调控大豆开花和主茎节数中的应用。

背景技术

大豆起源于中国，是重要的植物蛋白质和食用油脂来源。由于大豆对光周期非常敏感，只能在特定的光周期条件下开花、结实，因此某一优质品种仅限于在特定的区域(纬度)内种植，在相差1.5个纬度的地区就会产生区域间的光周期差异，从而显著制约了大豆品种推广和利用。此外，大豆果荚生长附着在茎节上，因此有效茎节数是决定大豆产量的关键性状之一，在保证主茎直立前提下增加有效茎节数是选育理想株型高产大豆新品种的重要目标。由于直接控制大豆主茎节数的基因和作用机制还很不清楚，限制了大豆理想株型的分子选育。所以寻找一个调控大豆开花和主茎节数的基因对提高大豆产量具有重要的理论和生产意义。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何调控大豆的花期和/或主茎节数和/或如何调控大豆株高和/或如何调控大豆分枝数和/或如何调控大豆单株荚数和/或如何增加大豆单株产量。

为了解决上述技术问题，本发明首先提供了蛋白质或调控所述蛋白质编码基因表达的物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质的应用。

所述应用可为下述任一种：

P1、所述蛋白质或调控所述蛋白质编码基因表达的物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质在调控植物花期或延迟植物花期中的应用；

P2、所述蛋白质或调控所述蛋白质编码基因表达的物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质在调控植物主茎节数或增加植物主茎节数中的应用；

P3、所述蛋白质或调控所述蛋白质编码基因表达的物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质在调控植物株高或增加植物株高中的应用；

P4、所述蛋白质或调控所述蛋白质编码基因表达的物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质在调控植物分枝数或增加植物分枝数中的应用；

P5、所述蛋白质或调控所述蛋白质编码基因表达的物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质在调控植物荚数或增加植物荚数中的应用；

P6、所述蛋白质或调控所述蛋白质编码基因表达的物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质在调控植物单株产量数或增加植物单株产量中的应用；

P7、所述蛋白质或调控所述蛋白质编码基因表达的物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质在植物育种或品质改良中的应用。

所述蛋白质可为如下A1)、A2)、A3)、A4)或A5)的蛋白质：

A1)氨基酸序列是序列表中序列1的蛋白质；

A2)氨基酸序列是序列表中序列4的蛋白质；

A3)氨基酸序列是序列表中序列6的蛋白质；

A4)将A1)、A2)或A3)所示的氨基酸序列经过一个以上氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的且具有相同功能的由A1)、A2)或A3)衍生的或与A1)、A2)或A3)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有相同功能的蛋白质；

A5)在A1)、A2)、A3)或A4)的N末端或/和C末端连接蛋白标签得到的融合蛋白质。

上文所述蛋白质可来源于大豆。

上文所述一个以上氨基酸残基具体可为十个以内的氨基酸残基。

上述应用中，调控所述蛋白质活性或含量的物质可为敲除所述蛋白质的编码基因的物质和/或调控所述蛋白质的编码基因表达的物质。

上述应用中，所述调控基因表达的物质可为进行如下6种调控中至少一种调控的物质：1)在所述基因转录水平上进行的调控；2)在所述基因转录后进行的调控(也就是对所述基因的初级转录物的剪接或加工进行的调控)；3)对所述基因的RNA转运进行的调控(也就是对所述基因的mRNA由细胞核向细胞质转运进行的调控)；4)对所述基因的翻译进行的调控；5)对所述基因的mRNA降解进行的调控；6)对所述基因的翻译后的调控(也就是对所述基因翻译的蛋白质的活性进行调控)。

上述应用中，所述调控基因表达可为抑制或降低所述基因表达，所述抑制或降低所述基因表达可通过基因敲除实现或通过基因沉默实现。

所述基因敲除(geneknockout)是指通过同源重组使特定靶基因失活的现象。基因敲除是通过DNA序列的改变使特定靶基因失活。

所述基因沉默是指在不损伤原有DNA的情况下使基因不表达或低表达的现象。基因沉默以不改变DNA序列为前提，使基因不表达或低表达。基因沉默可发生在两种水平上，一种是由于DNA甲基化、异染色质化以及位置效应等引起的转录水平的基因沉默,另一种是转录后基因沉默，即在基因转录后的水平上通过对靶标RNA进行特异性抑制而使基因失活,包括反义RNA、共抑制(co-suppression)、基因压抑(quelling)、RNA干扰(RNAi)和微小RNA(miRNA)介导的翻译抑制等。

上述应用中，所述调控基因表达的物质可为抑制或降低所述基因表达的试剂。所述抑制或降低所述基因表达的试剂可为敲除所述基因的试剂，如通过同源重组敲除所述基因的试剂，或通过CRISPR-Cas9敲除所述基因的试剂。所述抑制或降低所述基因表达的试剂可以包含靶向所述基因的多核苷酸，例如siRNA、shRNA、sgRNA、miRNA或反义RNA。

上述应用中，所述80％以上的同一性可为至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、98％或99％的同一性。

为了解决上述技术问题，本发明还提供了与上文所述蛋白质相关的生物材料的下述任一种应用：

Q1、所述生物材料在调控植物花期或延迟植物花期中的应用；

Q2、所述生物材料在调控植物主茎节数或增加植物主茎节数中的应用；

Q3、所述生物材料在调控植物株高或增加植物株高中的应用；

Q4、所述生物材料在调控植物分枝数或增加植物分枝数中的应用；

Q5、所述生物材料在调控植物荚数或增加植物荚数中的应用；

Q6、所述生物材料在调控植物单株产量数或增加植物单株产量中的应用；

Q7、所述生物材料在植物育种或品质改良中的应用。

所述生物材料可为下述B1)至B9)中的任一种：

B1)编码上文所述蛋白质的核酸分子；

B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；

B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体；

B4)含有B1)所述核酸分子的重组微生物、或含有B2)所述表达盒的重组微生物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物；

B5)含有B1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有B2)所述表达盒的转基因植物细胞系；

B6)含有B1)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有B2)所述表达盒的转基因植物组织；

B7)含有B1)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有B2)所述表达盒的转基因植物器官；

B8)抑制或降低上文所述蛋白质的编码基因表达或上文所述蛋白质活性的核酸分子；

B9)含有B8)所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因植物细胞系。

上文所述核酸分子可为如下b1)或b2)或b3)或b4)所示的DNA分子：

b1)编码序列是序列表中序列2所示的DNA分子；

b2)核苷酸序列是序列表中序列2所示的DNA分子；

b3)编码序列是序列表中序列5所示的DNA分子；

b4)编码序列是序列表中序列7所示的DNA分子；

b5)与b1)、b2)、b3)或b4)限定的核苷酸序列具有90％或90％以上同一性，且编码上文所述蛋白质的DNA分子；

b6)在严格条件下与b1)、b2)、b3)或b4)限定的核苷酸序列杂交，且编码上文所述蛋白质的DNA分子。

上文B8)所述核酸分子可为表达靶向上文A1)所述蛋白编码基因的gRNA的DNA分子或靶向上文A1)所述蛋白编码基因的gRNA。

所述靶向上文A1)蛋白编码基因的gRNA的靶序列可如序列表序列2的第94-113位所示和序列表序列2的第212-231位所示。

术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。所述具有90％或90％以上同一性可为至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％的同一性。

上述生物材料中，B2)所述的含有核酸分子的表达盒，是指能够在宿主细胞中表达上述应用中所述蛋白质的DNA，该DNA不但可包括启动蛋白编码基因转录的启动子，还可包括终止蛋白编码基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。可用于本发明的启动子包括但不限于：组成型启动子，组织、器官和发育特异的启动子，和诱导型启动子。

可用现有的植物表达载体构建含有所述蛋白编码基因表达盒的重组表达载体。

上述生物材料中，所述重组微生物具体可为酵母，细菌，藻和真菌。

上文所述植物可为下述任一种：

D1)双子叶植物，

D2)豆目植物，

D3)豆科植物，

D4)大豆属植物，

D5)大豆。

为了解决上述技术问题，本发明还提供了一种延迟植物花期和/或增加植物主茎节数和/或增加植物株高和/或增加植物分枝数和/或增加植物单株荚数和/或增加单株产量的方法。所述方法包括通过抑制或降低植物中上文所述的蛋白质的编码基因的表达量或上文所述的蛋白质的活性来延迟植物花期和/或增加植物主茎节数和/或增加植物株高和/或增加植物分枝数和/或增加植物单株荚数和/或增加单株产量。

上述降低或抑制植物中上文所述蛋白编码基因的表达量可采用现有技术中的任何方式实现，以使基因产生缺失突变、插入突变或碱基变换突变，进而实现基因功能降低或丧失，具体可为化学诱变、物理诱变、RNAi、基因组定点编辑或同源重组等。

上述基因组定点编辑方法中，可采用锌指核酸酶(Zinc finger nuclease,ZFN)技术、类转录激活因子效应物核酸酶(Transcription activator-like effector nuclease,TALEN)技术或成簇的规律间隔的短回文重复序列及其相关系统(Clustered regularlyinterspaced short palindromic repeats/CRISPR associated,CRISPR/Cas9 system)技术，以及其它能实现基因组定点编辑的技术。无论采取哪种方法，既可对上文所述蛋白的整个编码基因作为靶标，又可将调控上文所述蛋白编码基因表达的各个元件作为靶标，只要能实现基因功能丧失或降低即可。如可以将上文所述蛋白的编码基因的外显子或5’UTR等作为靶标。

上文所述方法还可包括向所述植物中导入降低或抑制上文所述蛋白质编码基因表达的物质；所述降低或抑制上文所述蛋白质编码基因表达的物质可为如下c1)-c4)任一种物质：

c1)抑制或降低上文所述蛋白编码基因表达的核酸分子；

c2)含有c1)所述核酸分子的表达盒；

c3)含有c1)所述核酸分子的重组载体、或含有c2)所述表达盒的重组载体；

c4)含有c1)所述核酸分子的重组微生物、或含有c2)所述表达盒的重组微生物、或含有c3)所述重组载体的重组微生物。

上文所述方法中的蛋白具体可为上文A1)中所述的蛋白质。上文c1)所述的核酸分子可为表达靶向上文所述A1)蛋白编码基因的gRNA的DNA分子或靶向上文所述A1)蛋白编码基因的gRNA；

所述靶向上文所述A1)蛋白编码基因的gRNA的靶序列可如序列表中序列2的第94-113位所示和序列表中序列2的第212-231位核苷酸所示。

上文所述方法具体可为通过CRISPR/Cas9方法对上文所述A1)蛋白编码基因进行定点编辑，使植物中的上文所述A1)蛋白编码基因的表达量降低或被抑制，例如将表达Cas9蛋白和gRNA的重组质粒载体通过农杆菌的侵染实现外源基因向植物细胞的转移和整合。

上文所述抑制或降低植物中上文所述的A1)蛋白质的编码基因的表达可为将植物基因组中的序列2所示的所述A1)蛋白编码基因进行下述至少一种突变：

1)缺失了植物序列表中序列2的第98和99位的2个核苷酸AC且缺失了大豆基因组中序列表中序列2的第215-219位的5个核苷酸ACCCC；

2)缺失了序列表中序列2的第98-102位的5个核苷酸ACCCC且在序列表中序列2的第215位核苷酸后插入一个核苷酸A。

上文所述方法中所述的蛋白质可为上文所述A1)中的蛋白质。

上述方法为改造后得到的植物可以是所有染色单体均被定点编辑的植物。

上文所述植物可为大豆。

上文所述的蛋白质和/或上文所述的生物材料也属于本发明的保护范围。

实验证明，采用含有重组质粒GmEID1-gRNA1-gRNA2的农杆菌转化大豆品种TL1，能够对GmEID1基因进行编辑，GmEID1基因通过CRESPR/Cas9核酸内切酶编辑之后，可造成GmEID1基因突变，当两条同源染色体的GmEID1基因同时突变可以导致GmEID1蛋白活性丧失，得到GmEID1蛋白活性丧失的转基因大豆。在长日照条件下(8小时光照/16小时黑暗)与大豆品种TL1(天隆1号)相比，转基因大豆的花期延迟10-15天，且主茎增加3-5节,株高增加5-20cm，节数增加3-4节，单株荚数增加10-60g单株产量10-20g，由此可见，GmEID1可以调控植物花期和主茎节数。本发明具有重要的应用价值。

附图说明

图1为重组质粒GmEID1-gRNA1-gRNA2的部分结构示意图。GmU6代表U6启动子。

图2为Gmeid1突变类型的分子鉴定结果。上图为GmEID1基因结构示意图，下图为具体编辑方式，TL1为大豆品种TL1。

图3为大豆品种TL1、Gmeid1-cr1、Gmeid1-cr2表型统计图。a为TL1、Gmeid1-cr1、Gmeid1-cr2田间表型图，b为花期统计结果，c为株高统计结果，d为主茎节数统计结果，e为分枝数统计结果，f为单株荚数统计结果，g为单株产量统计结果。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

本发明中Phanta Super-Fidelity DNA Polymerase为Vazyme公司的产品。

表1 GmEID1-gRNA1-gRNA2载体构建引物列表

实施例一、GmEID1基因在调控大豆开花和主茎节数中的应用

大豆威廉82(Williams 82，该品种为本实验室从国家种质库中获取)的GmEID1蛋白的氨基酸序列如序列表中序列1所示，其cDNA的CDS编码序列为序列表中序列2所示的核苷酸。

一、CRISPR-Cas9重组质粒GmEID1-gRNA1-gRNA2的构建

1.1、gRNA片段的获得

单向导RNA(single guide RNA)靶点序列的设计是根据大豆蛋白GmEID1的基因组序列，设计2个靶向GmEID1的sgRNA，其名称分别为sgRNA1和sgRNA2，同时将设计好的gRNA靶点序列进行大豆基因组序列比对，以排除非特异性靶位点。

sgRNA1靶点的核苷酸序列为5’-GCTAAGCGAGCCCAGTGGCG-3’，靶向于GmEID1基因的序列表中序列2的第94-113位；sgRNA2靶点的核苷酸序列为5’-GAGGGAGAGAGGGGGGTCGG-3’，靶向于GmEID1基因的序列表中序列2的第212-231。

(1)制备反应体系1。反应体系1为50μL，由

25μL 2×Phanta Max Buffer、1μL dNTP Mix、2μL引物EID1-F1或EID1-F2(序列见表1)水溶液(浓度为10μM)、2μL引物gRNA-R(序列见表1)(浓度为10μM)、1μL Phanta MaxSuper-Fidelity DNA Polymerase、1μL载体pU3-gRNA载体、18μL ddH₂O组成。

反应体系1中的载体pU3-gRNA来源于高彩霞实验室，参考文献：Shan,Q.,Y.Wang,J.Li,Y.Zhang,K.Chen,Z.Liang,K.Zhang,J.Liu,J.J.Xi,J.L.Qiu and C.Gao(2013).Targeted genome modification of crop plants using a CRISPR-Cas system.NatBiotechnol 31(8):686-688.

反应体系1中的EID1-F1和gRNA-R引物扩增产物为sgRNA1的编码DNA。反应体系1中的EID1-F2和gRNA-R引物扩增产物为sgRNA2的编码DNA。

反应程序为：95℃3min；95℃15s，57℃15s，72℃10s，35个循环；72℃5min；4℃保存。

(2)完成步骤(1)后，取所述反应体系1，进行PCR扩增，用琼脂糖凝胶回收试剂盒(Axygen公司)回收分别获得约141bp的sgRNA1的编码DNA(序列表中序列3的第305-444位,前19位与U6启动子重叠片段)和142bp的sgRNA2的编码DNA(序列表中序列3的第730-871)对应的双链DNA片段。

1.2、U6启动子片段的获得

(1)制备反应体系2。反应体系2为50μL，

25μL 2×Phanta Max Buffer、1μL dNTP Mix、2μL引物U6-F(序列见表1)水溶液(浓度为10μM)、2μL引物U6-R(序列见表1)水溶液(浓度为10μM)、1μL Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase、1μL威廉82(大豆)的基因组DNA、18μL ddH₂O组成。

(2)完成步骤(1)后，取所述反应体系2，进行PCR扩增，用琼脂糖凝胶回收试剂盒(Axygen公司)回收约305bp的U6启动子片段(序列表中序列3的第1-323位核苷酸)。

1.3、U6-gRNA片段的获得

(1)制备反应体系3。反应体系3为50μL，

25μL 2×Phanta Max Buffer、1μL dNTP Mix、2μL引物U6-F水溶液(浓度为10μM)、2μL引物gRNA-R水溶液(浓度为10μM)、1μL模板(含有50ng步骤1.1中获得的sgRNA1的编码DNA(或sgRNA2的编码DNA)和50ng步骤1.2获得的U6启动子片段)和18μL ddH₂O组成。

反应程序为：95℃3min；95℃15s，57℃15s，72℃30s，35个循环；72℃5min；4℃保存。

通过反应体系3的PCR扩增分别得到PCR产物U6-sgRNA1或U6-sgRNA2。

1.4、CRISPR-Cas9载体线性化

CRISPR-Cas9载体为本实验室保存，记载于如下文献中:Li,C.et al.Adomestication-associated gene GmPRR3b regulates the circadian clock andflowering time in soybean.Mol Plant 13,745–759(2020).文献中用的pCas9-AtU6-sgRNA为本发明中使用的CRISPR-Cas9载体。

用限制性内切酶StuI和XbaⅠ双酶切CRISPR-Cas9载体，回收约14000bp的线性CRISPR-Cas9载体骨架。

同时使用限制性内切酶StuI和EcoRI双酶切步骤1.3获得的U6-sgRNA1,使用限制性内切酶EcoRI和XbaI双酶切步骤1.3获得的U6-sgRNA2。

1.5、连接产物的获得

(1)将1μL步骤1.4双酶切后获得的U6-gRNA1片段和1μL步骤1.4双酶切后获得的U6-gRNA2片段(各约100ng)、1μL 1.4获得的线性CRISPR-Cas9载体骨架50ng)，1μL T410xbuffer,1μL T4 DNA Ligase和5μL ddH₂O得到连接体系。

(2)取所述连接体系，16℃反应过夜，得到连接产物。

1.6、将1.5得到的连接产物转化大肠杆菌TOP10感受态细胞(TRANS)，得到若干单克隆转化菌。

1.7、分别以1.6获得的各个单克隆转化菌为模板，以引物5’-ACATTTAATACGCGATAGAAAAC-3’和5’-GTGCTCGGCAACGCGTTCTAGA-3’组成的引物对进行PCR扩增。如果PCR扩增产物的核苷酸序列为序列表中序列8所示的DNA片段即含有序列表中序列3所示的sgRNA1和sgRNA2串联DNA分子：U6-sgRNA1-U6-sgRNA2，则对应的单克隆转化菌为阳性单克隆菌。

1.8、将1.7得到的阳性单克隆菌接种至LB液体培养基培养，然后从培养菌液中提取质粒，即得到CRISPR-Cas9重组质粒GmEID1-gRNA1-gRNA2。

重组质粒GmEID1-gRNA1-gRNA2的部分结构示意图见图1。

二、T₀代拟转基因大豆植株的获得

1、将重组质粒GmEID1-gRNA1-gRNA2通过液氮冷冻法转化发根农杆菌EHA105(ZOMANBIO ZC142)的感受态细胞，得到重组农杆菌，命名为EHA105/GmEID1-gRNA1-gRNA2。

2、将EHA105/GmEID1-gRNA1-gRNA2转化大豆品种TL1(Tian-Long1，由中国农业科学院油料作物研究所单志慧研究员赠送，本实验室保存，用以TL1为背景进行转基因，以下简称大豆。参考文献：Xiangguang Lyu et al.,GmCRY1s modulate gibberellinmetabolism to regulate soybean shade avoidance in response to reduced bluelight,Molecular Plant,Volume 14,Issue 2,2021)，经过Kan(卡那霉素)抗生素筛选、分化和生根后，获得11株T₀代拟转基因大豆植株。具体步骤依次如下：

(1)用浓盐酸和次氯酸钠反应出的氯气对大豆灭菌。

(2)将大豆对半切开，去掉一部分胚尖，在分生区部分划伤口，在无菌水中浸泡7-8h；之后弃无菌水，加入OD_600nm为0.5-0.8的重组农杆菌EHA105/GmEID1-gRNA1-gRNA2菌液，28℃、200rpm振荡30min；取出豆瓣在无菌条件下吹10min，然后平铺于共培养培养基，28℃暗培养3天。

(3)用无菌水和加入特美汀、头孢、万古霉素的液体诱导培养基各洗4-5次，目的为将农杆菌洗净。

(4)将长出的胚芽切掉，只保留3-4mm，胚芽朝下，有伤口的一面朝上斜插入固体诱导培养基中，在温室中光照培养。

(5)10天后有的豆瓣开始出芽，有芽的从桩部将芽切掉并转到新的固体诱导培养基中，没长芽的扔掉，继续在温室中光照培养。

(6)10天后，将长芽的继代到新的固体诱导培养基中，没有长芽的豆瓣扔掉，温室培养10天。豆瓣在固体诱导培养基中共培养30天。

(7)将长好的愈伤组织与豆瓣分离，扔掉豆瓣，把愈伤组织上黑色表面刮掉，转到固体伸长培养基中，每20天更换一次新的固体伸长培养基(含筛选抗生素Glufosinate-ammonium)，一般继代3-4次，合计60-80天。愈伤在伸长培养的同时也在筛选，在筛选的过程中会有苗长出来。

(8)当苗长到约4-5cm的时候从愈伤上切下来，移到生根培养基中。

(9)在生根培养基中培养20-30天左右，长得壮实有发达根系的苗子就可以开始放在背光处炼苗了，一般炼苗5天。

(10)将苗移入大田，加入适量水，绿肥和缓释肥，盖上一层薄膜放在光照下，使其适应强光，3天后去膜。

上述筛选后所得小苗为T₀代拟转基因大豆植株小苗。

共培养培养基、加入激素的液体诱导培养基、固体诱导培养基、固体伸长培养基和生根培养基记载于如下文献中：Paz,M.M.,J.C.Martinez,A.B.Kalvig,T.M.Fonger andK.Wang(2006)."Improved cotyledonary node method using an alternative explantderived from mature seed for efficient Agrobacterium-mediated soybeantransformation."Plant Cell Rep 25(3):206-213.

三、T₀代转基因大豆植株的获得和突变类型的分子鉴定

3.1、分别以T₀代拟转基因大豆植株叶片的基因组DNA为模板，采用5’-TCCGCAGCCATTAACGACTT-3’和5’-ACAGATAAAGCCACGCACATT-3’组成的引物对1进行PCR扩增，得到相应的PCR扩增产物1(用于鉴定是否含有Basta抗性基因)；采用5’-CAGCTCGTCCAAACCTAC-3’和5’-CTGTGCCATCCATCTTCT-3’组成的引物对2进行PCR扩增，得到相应的PCR扩增产物2(用于鉴定是否含有Cas9基因,序列表中序列9所示的核苷酸)；采用5’-acatttaatacgcgatagaaaac-3’和5’-GTGCTCGGCAACGCGTTCTAGA-3’组成的引物对3进行PCR扩增，得到相应的PCR扩增产物3(用于鉴定是否含有U6启动子和sgRNA的编码DNA，序列表中序列8)。

如果某T₀代拟转基因大豆植株的PCR扩增产物1中含有989bp的Basta抗性基因的DNA片段、PCR扩增产物2中含有601bp的Cas9基因的DNA片段(序列9)且PCR扩增产物3的核苷酸序列为序列表中序列8所示的DNA片段即含有序列表中序列3所示的sgRNA1和sgRNA2的串联DNA分子：U6-sgRNA1-U6-sgRNA2，，则该T₀代拟转基因大豆植株被鉴定为T₀代转基因大豆植株。

3.2、分别以T₀代转基因大豆植株叶片的基因组DNA为模板，采用5’-AAGAACCTGTTTTCGGAACTAA-3’和5’-ACATCCACGCCCGCTCTTACGC-3’组成的引物对4进行PCR扩增，得到相应的PCR扩增产物4。

3.3、分别将PCR扩增产物4进行Sanger测序。测序结果和GmEID1基因(序列表中序列2所示的核苷酸分子)目标序列进行比对，统计突变类型。

由于大豆是二倍体植株，当Cas9发挥作用开始剪切特定的基因时，同一个细胞内的两条同源染色体上的两个等位基因都有可能被编辑，产生同样类型或不同类型的突变，所以将一个植株中两个等位基因看成是两个基因编辑事件。GmEID1基因纯合突变株指的是该植株的两条同源染色体的GmEID1基因发生了相同的突变。GmEID1基因双等位基因突变株指的是该植株的两条同源染色体的GmDCL2a基因均发生了突变但突变形式不同。

经检测T₀代转基因大豆植株11株中，发生基因编辑的植株为7株。

将T₀代基因编辑的植株分别自交2代，得到T₂代基因编辑的植株。之后按照上述方法检测T₂代基因编辑的植株的突变类型。共获得2个双纯合突变体。将2个双纯合突变体分别命名为Gmeid1-cr1和Gmeid1-cr2。

2个双纯合突变体的检测结果见图2(上图为GmEID1基因结构示意图，下图为具体编辑方式，TL1为大豆品种TL1)。

Gmeid1-cr1在GmEID1基因中发生了“AC”2个核苷酸的缺失(即缺失了序列表中序列2的第98-99位核苷酸)和“ACCCC”5个核苷酸的缺失(即缺失了序列表中序列2的第215-219位核苷酸)，从而引起了移码并提前终止，造成GmEID1蛋白功能缺失。

上述Gmeid1-cr1突变体中突变后的GmEID1-cr1蛋白质的氨基酸序列如序列4所示，其编码序列如序列5所示。

Gmeid1-cr2在GmEID1基因中发生了“ACTGG”5个核苷酸的缺失(即缺失了序列表中序列2的第98-102位核苷酸)和1个核苷酸的插入(即在序列表中序列2的第215位核苷酸后插入了“a”碱基)，从而引起了移码并提前终止，造成GmEID1蛋白功能缺失。

上述Gmeid1-cr2突变体中突变后的GmEID1-cr2蛋白质的氨基酸序列如序列6所示，其编码序列如序列7所示。

收获Gmeid1-cr1和Gmeid1-cr2植株所结的种子，进行步骤四的表型观察。

四、田间进行Gmeid1表型观察

分别将野生型大豆品种TL1、步骤三得到的两个突变体Gmeid1-cr1和Gmeid1-cr2于北京(40°13'28”N，116°33'37”E)的种子各250粒，夏播于大田小区采用随机区组设计，3次重复。处理小区面积为8m²(2.5m×3.5m)，观察并统计花期、株高、主茎节数、分枝数、单株荚数和单株产量。采用SPSS11.5统计软件对数据进行处理，实验结果以平均值±标准偏差表示，采用One-way ANOVA检验，P＜0.05(*)表示与野生型大豆品种TL1相比具有显著性差异，P＜0.01(**)表示与野生型大豆品种TL1相比具有显著性差异。通过大田中表型观察，结果表明TL1在长日照下50天左右开花，而Gmeid1-cr1和Gmeid1-cr2的开花时间在60-65天(图3中b)；成熟后对其株高和主茎节数进行统计，结果表明TL1的株高在80-88cm，主茎有19-22个节；而Gmeid1-cr1株高在95-105cm,主茎24-27个节；而Gmeid1-cr2株高在92-103cm,主茎23-27个节(图3中c和d所示)；TL1在长日照下分枝数为5-8个，而Gmeid1-cr2的分枝数7-10个(图3中e所示)；TL1在长日照下单株荚数为110-170个荚，而Gmeid1-cr1有130-240个荚，Gmeid1-cr2有140-245个荚(图3中f所示)；TL1在长日照下单株种子重为40-70g，而Gmeid1-cr1单株种子重为60-85g，Gmeid1-cr2单株种子重为55-95g(图3中g所示)。大豆TL1品种与Gmeid1-cr1和Gmeid1-cr2在花期、株高、主茎节数、分枝数、单株荚数和单株产量上有明显差异。

由此可见，GmEID1蛋白的功能丧失会导致大豆花期明显延迟、株高增加、分枝数增加、主茎节数增加、单株荚数增加以及单株产量增加。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

序列表

<110> 中国农业科学院作物科学研究所

<120> GmEID1蛋白在调控大豆开花和主茎节数中的应用

<130> GNCSQ211049

<160> 9

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 327

<212> PRT

<213> 大豆（Glycine max）

<400> 1

Met Asp Ser Glu Ile Glu Lys Lys Lys Asn Leu Phe Ser Glu Leu Thr

1 5 10 15

Asp Asp Ile Val Leu Asn Ile Phe Tyr Lys Leu Glu Asp Asp Pro Arg

20 25 30

His Trp Ala Arg Leu Ala Cys Val Cys Thr Lys Phe Ser Ser Leu Val

35 40 45

Arg Asp Phe Cys Trp Lys Thr Lys Cys Ser Leu Thr Ile Pro Gln Asp

50 55 60

Leu Leu Ser Ala Ala Ala Ser Asp Pro Pro Leu Ser Leu His Lys Leu

65 70 75 80

Ser Phe Cys Cys Pro Gly Leu Arg His Ala Gly Leu Leu Phe Asp Thr

85 90 95

Ser Asp Phe Gly Leu Glu Arg Asp Leu Gly Pro Gly Asn Phe Asn Val

100 105 110

Ile Thr Asp Asp Ser Pro Ser Asn Thr Thr Pro Pro Pro Pro Pro Pro

115 120 125

Pro Pro Gln Gln Gln Gln Gln Gln Pro Pro Gln Ser Asp Asp Cys Ser

130 135 140

Ser Ser Cys Trp Ser Leu Tyr Asp Asp Leu Tyr Tyr Asp Thr Leu Tyr

145 150 155 160

Val Pro Thr Glu Ser Glu Ser Pro Arg Leu Thr Glu Ser Val Ser Val

165 170 175

Arg Ala Gly Val Asp Val Ala Ser Ile Ser Ala Cys Ser Lys Lys Arg

180 185 190

Lys Leu Ser Arg Ala Trp Ser Ser His Leu Ala Ser Gly Ser Trp Thr

195 200 205

Leu Ser Arg Glu Gln Gly Ser Lys Leu Leu Ala Arg Lys Phe Arg Tyr

210 215 220

Asp Cys Leu Tyr Val Cys Glu Trp Pro Gly Cys Val His Lys Glu Glu

225 230 235 240

Lys Arg Lys Tyr Cys Leu Phe Arg Gly Val Phe Lys Asn Phe Arg Arg

245 250 255

Thr Met Val Trp Arg Thr Ile Gln Asp Gly Lys Lys Arg Lys Met Asp

260 265 270

Leu Pro Cys Ala Phe Cys Ala Cys Glu Phe Thr Trp Asp Leu His Ser

275 280 285

Ser Phe Cys Leu Arg Pro Gly Phe Gly Phe His Asp Asp Gly Glu Pro

290 295 300

Met Val Arg Ala Tyr Val Cys Glu Asn Gly His Val Ser Gly Ala Trp

305 310 315 320

Thr Asp Leu Pro Ile Tyr Thr

325

<210> 2

<211> 984

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 2

atggatagtg aaattgaaaa gaagaagaac ctgttttcgg aactaaccga cgacatcgtt 60

ctgaacatct tctacaaact cgaagacgat cctcgccact gggctcgctt agcctgtgtc 120

tgcaccaaat tctcttccct cgttagggat ttctgttgga agaccaaatg ctccctcacc 180

atcccccaag acctcctctc cgccgccgcc tccgaccccc ctctctccct ccacaaactc 240

tccttctgct gccccggcct ccgccacgcc ggcctcctgt tcgacacctc cgatttcggc 300

ctcgaacgcg acctcggccc cggcaacttc aacgtcatca ccgatgattc tccttcgaac 360

accactccac caccaccacc accaccacca caacaacaac aacaacaacc tcctcaatcc 420

gatgattgtt cttcctcttg ttggtccctt tacgatgacc tctactacga cacgctctac 480

gtcccaaccg agtccgagtc gccgcgatta acggaatccg ttagcgtaag agcgggcgtg 540

gatgtggctt cgatcagcgc gtgcagcaag aagcgcaagc tctcccgcgc gtggagctca 600

cacctggctt cgggaagctg gacactaagc cgtgaacaag gaagcaagct cctggcgcgt 660

aagttccggt acgattgctt gtacgtgtgc gagtggccag ggtgcgtgca caaggaggag 720

aagcgcaagt actgcctctt cagaggggtt ttcaagaact tcaggcgaac tatggtttgg 780

aggactattc aggatgggaa gaagaggaag atggatctgc cttgcgcctt ctgcgcgtgt 840

gagttcacgt gggatctgca ctcttccttt tgcttgaggc ctggctttgg cttccatgac 900

gatggggagc ctatggttag ggcttatgtt tgtgagaatg gacatgtctc tggtgcctgg 960

accgatcttc ccatctacac ttga 984

<210> 3

<211> 871

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 3

gatcggaagc ttaggcctaa aataaatggt aaaatgtcaa atcaaaacta ggctgcagta 60

tgcagagcag agtcatgatg atactactta ctacaccgat tcttgtgtgc agaaaaatat 120

gttaaaataa ttgaatcttt ctctagccaa atttgacaac aatgtacacc gttcatattg 180

agagacgatg cttcttgttt gctttcggtg gaagctgcat atactcaaca ttactccttc 240

agcgagtttt ccaactgagt cccacattgc ccagacctaa cacggtattc ttgtttataa 300

tgaaatgtgc caccacatgg attgctaagc gagcccagtg gcggttttag agctagaaat 360

agcaagttaa aataaggcta gtccgttatc aacttgaaaa agtggcaccg agtcggtgct 420

ttttttggtc tcgaattcga gaccaaaata aatggtaaaa tgtcaaatca aaactaggct 480

gcagtatgca gagcagagtc atgatgatac tacttactac accgattctt gtgtgcagaa 540

aaatatgtta aaataattga atctttctct agccaaattt gacaacaatg tacaccgttc 600

atattgagag acgatgcttc ttgtttgctt tcggtggaag ctgcatatac tcaacattac 660

tccttcagcg agttttccaa ctgagtccca cattgcccag acctaacacg gtattcttgt 720

ttataatgaa atgtgccacc acatggattg agggagagag gggggtcggg ttttagagct 780

agaaatagca agttaaaata aggctagtcc gttatcaact tgaaaaagtg gcaccgagtc 840

ggtgcttttt tttctagaac gcgttgccga g 871

<210> 4

<211> 47

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 4

Met Asp Ser Glu Ile Glu Lys Lys Lys Asn Leu Phe Ser Glu Leu Thr

1 5 10 15

Asp Asp Ile Val Leu Asn Ile Phe Tyr Lys Leu Glu Asp Asp Pro Arg

20 25 30

His Gly Ser Leu Ser Leu Cys Leu His Gln Ile Leu Phe Pro Arg

35 40 45

<210> 5

<211> 977

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 5

atggatagtg aaattgaaaa gaagaagaac ctgttttcgg aactaaccga cgacatcgtt 60

ctgaacatct tctacaaact cgaagacgat cctcgccacg gctcgcttag cctgtgtctg 120

caccaaattc tcttccctcg ttagggattt ctgttggaag accaaatgct ccctcaccat 180

cccccaagac ctcctctccg ccgccgcctc cgcctctctc cctccacaaa ctctccttct 240

gctgccccgg cctccgccac gccggcctcc tgttcgacac ctccgatttc ggcctcgaac 300

gcgacctcgg ccccggcaac ttcaacgtca tcaccgatga ttctccttcg aacaccactc 360

caccaccacc accaccacca ccacaacaac aacaacaaca acctcctcaa tccgatgatt 420

gttcttcctc ttgttggtcc ctttacgatg acctctacta cgacacgctc tacgtcccaa 480

ccgagtccga gtcgccgcga ttaacggaat ccgttagcgt aagagcgggc gtggatgtgg 540

cttcgatcag cgcgtgcagc aagaagcgca agctctcccg cgcgtggagc tcacacctgg 600

cttcgggaag ctggacacta agccgtgaac aaggaagcaa gctcctggcg cgtaagttcc 660

ggtacgattg cttgtacgtg tgcgagtggc cagggtgcgt gcacaaggag gagaagcgca 720

agtactgcct cttcagaggg gttttcaaga acttcaggcg aactatggtt tggaggacta 780

ttcaggatgg gaagaagagg aagatggatc tgccttgcgc cttctgcgcg tgtgagttca 840

cgtgggatct gcactcttcc ttttgcttga ggcctggctt tggcttccat gacgatgggg 900

agcctatggt tagggcttat gtttgtgaga atggacatgt ctctggtgcc tggaccgatc 960

ttcccatcta cacttga 977

<210> 6

<211> 46

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 6

Met Asp Ser Glu Ile Glu Lys Lys Lys Asn Leu Phe Ser Glu Leu Thr

1 5 10 15

Asp Asp Ile Val Leu Asn Ile Phe Tyr Lys Leu Glu Asp Asp Pro Arg

20 25 30

Gly Ser Leu Ser Leu Cys Leu His Gln Ile Leu Phe Pro Arg

35 40 45

<210> 7

<211> 980

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 7

atggatagtg aaattgaaaa gaagaagaac ctgttttcgg aactaaccga cgacatcgtt 60

ctgaacatct tctacaaact cgaagacgat cctcgcggct cgcttagcct gtgtctgcac 120

caaattctct tccctcgtta gggatttctg ttggaagacc aaatgctccc tcaccatccc 180

ccaagacctc ctctccgccg ccgcctccga acccccctct ctccctccac aaactctcct 240

tctgctgccc cggcctccgc cacgccggcc tcctgttcga cacctccgat ttcggcctcg 300

aacgcgacct cggccccggc aacttcaacg tcatcaccga tgattctcct tcgaacacca 360

ctccaccacc accaccacca ccaccacaac aacaacaaca acaacctcct caatccgatg 420

attgttcttc ctcttgttgg tccctttacg atgacctcta ctacgacacg ctctacgtcc 480

caaccgagtc cgagtcgccg cgattaacgg aatccgttag cgtaagagcg ggcgtggatg 540

tggcttcgat cagcgcgtgc agcaagaagc gcaagctctc ccgcgcgtgg agctcacacc 600

tggcttcggg aagctggaca ctaagccgtg aacaaggaag caagctcctg gcgcgtaagt 660

tccggtacga ttgcttgtac gtgtgcgagt ggccagggtg cgtgcacaag gaggagaagc 720

gcaagtactg cctcttcaga ggggttttca agaacttcag gcgaactatg gtttggagga 780

ctattcagga tgggaagaag aggaagatgg atctgccttg cgccttctgc gcgtgtgagt 840

tcacgtggga tctgcactct tccttttgct tgaggcctgg ctttggcttc catgacgatg 900

gggagcctat ggttagggct tatgtttgtg agaatggaca tgtctctggt gcctggaccg 960

atcttcccat ctacacttga 980

<210> 8

<211> 954

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 8

acatttaata cgcgatagaa aacaaaatat agcgcgcaaa ctaggataaa ttatcgcgcg 60

cggtgtcatc tatgttacta gatcggaagc ttaggcctaa aataaatggt aaaatgtcaa 120

atcaaaacta ggctgcagta tgcagagcag agtcatgatg atactactta ctacaccgat 180

tcttgtgtgc agaaaaatat gttaaaataa ttgaatcttt ctctagccaa atttgacaac 240

aatgtacacc gttcatattg agagacgatg cttcttgttt gctttcggtg gaagctgcat 300

atactcaaca ttactccttc agcgagtttt ccaactgagt cccacattgc ccagacctaa 360

cacggtattc ttgtttataa tgaaatgtgc caccacatgg attgctaagc gagcccagtg 420

gcggttttag agctagaaat agcaagttaa aataaggcta gtccgttatc aacttgaaaa 480

agtggcaccg agtcggtgct ttttttggtc tcgaattcga gaccaaaata aatggtaaaa 540

tgtcaaatca aaactaggct gcagtatgca gagcagagtc atgatgatac tacttactac 600

accgattctt gtgtgcagaa aaatatgtta aaataattga atctttctct agccaaattt 660

gacaacaatg tacaccgttc atattgagag acgatgcttc ttgtttgctt tcggtggaag 720

ctgcatatac tcaacattac tccttcagcg agttttccaa ctgagtccca cattgcccag 780

acctaacacg gtattcttgt ttataatgaa atgtgccacc acatggattg agggagagag 840

gggggtcggg ttttagagct agaaatagca agttaaaata aggctagtcc gttatcaact 900

tgaaaaagtg gcaccgagtc ggtgcttttt tttctagaac gcgttgccga gcac 954

<210> 9

<211> 601

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 9

cagctcgtcc aaacctacaa tcagctcttt gaggaaaacc caattaatgc ttcaggcgtc 60

gacgccaagg cgatcctgtc tgcacgcctt tcaaagtctc gccggcttga gaacttgatc 120

gctcaactcc cgggcgaaaa gaagaacggc ttgttcggga atctcattgc actttcgttg 180

gggctcacac caaacttcaa gagtaatttt gatctcgctg aggacgcaaa gctgcagctt 240

tccaaggaca cttatgacga tgacctggat aaccttttgg cccaaatcgg cgatcagtac 300

gcggacttgt tcctcgccgc gaagaatttg tcggacgcga tcctcctgag tgatattctc 360

cgcgtgaaca ccgagattac aaaggccccg ctctcggcga gtatgatcaa gcgctatgac 420

gagcaccatc aggatctgac ccttttgaag gctttggtcc ggcagcaact cccagagaag 480

tacaaggaaa tcttctttga tcaatccaag aacggctacg ctggttatat tgacggcggg 540

gcatcgcagg aggaattcta caagtttatc aagccaattc tggagaagat ggatggcaca 600

g 601

Claims

1.蛋白质或调控所述蛋白质编码基因表达的物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质的应用，其特征在于：所述应用为下述任一种：

P7、所述蛋白质或调控所述蛋白质编码基因表达的物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质在植物育种或品质改良中的应用；

所述蛋白质是如下A1)、A2)、A3)、A4)或A5)的蛋白质：

A1)氨基酸序列是序列表中序列1的蛋白质；

A2)氨基酸序列是序列表中序列4的蛋白质；

A3)氨基酸序列是序列表中序列6的蛋白质；

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述蛋白质来源于大豆。

3.与权利要求1或2中所述蛋白质相关的生物材料的下述任一种应用：

Q7、所述生物材料在植物育种或品质改良中的应用；

所述生物材料为下述B1)至B9)中的任一种：

B1)编码权利要求1中所述蛋白质的核酸分子；

B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；

B8)抑制或降低权利要求1中所述蛋白质的编码基因的表达或权利要求1中所述蛋白质活性的核酸分子；

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述核酸分子为如下b1)或b2)或b3)或b4)或b5)或b6)所示的DNA分子：

b1)编码序列是序列表中序列2所示的DNA分子；

b2)核苷酸序列是序列表中序列2所示的DNA分子；

b3)编码序列是序列表中序列5所示的DNA分子；

b4)编码序列是序列表中序列7所示的DNA分子；

b5)与b1)、b2)、b3)或b4)限定的核苷酸序列具有90％或90％以上同一性，且编码权利要求1中所述蛋白质的DNA分子；

b6)在严格条件下与b1)、b2)、b3)或b4)限定的核苷酸序列杂交，且编码权利要求1中所述蛋白质的DNA分子；

B8)所述核酸分子为表达靶向上文A1)所述蛋白编码基因的gRNA的DNA分子或靶向上文A1)所述蛋白编码基因的gRNA；

所述靶向上文A1)蛋白编码基因的gRNA的靶序列如序列表序列2的第94-113位所示和序列表序列2的第212-231位核苷酸所示。

5.根据权利要求1-4中任一权利要求所述的应用，其特征在于：所述植物为下述任一种：

D1)双子叶植物，

D2)豆目植物，

D3)豆科植物，

D4)大豆属植物，

D5)大豆。

6.一种延迟植物花期和/或增加植物主茎节数和/或增加植物株高和/或增加植物分枝数和/或增加植物单株荚数和/或增加单株产量的方法，包括通过抑制或降低植物中权利要求1中A1)所述的蛋白质的编码基因的表达量或权利要求1中A1)所述的蛋白质的活性来延迟植物花期和/或增加植物主茎节数和/或增加植物株高和/或增加植物分枝数和/或增加植物单株荚数和/或增加单株产量。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述方法包括向所述植物中导入降低或抑制权利要求1中所述的蛋白编码基因表达的物质；所述降低或抑制权利要求1中所述蛋白编码基因表达的物质为如下c1)-c4)任一种物质：

c1)抑制或降低权利要求1中A1)所述蛋白编码基因表达的核酸分子；

c2)含有c1)所述核酸分子的表达盒；

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：

c1)所述的核酸分子为表达靶向所述权利要求1中A1)所述蛋白编码基因的gRNA的DNA分子或靶向权利要求1中A1)所述蛋白编码基因的gRNA；

所述靶向所述A1)蛋白编码基因的gRNA的靶序列如序列表中序列2的第94-113位所示和序列表中序列2的第212-231位所示。

9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述抑制或降低植物中权利要求1中所述蛋白质的编码基因的表达为将植物中的序列2所示的所述蛋白编码基因进行下述至少一种突变：

2)缺失了植物序列表中序列2的第98-102位的5个核苷酸ACCCC且在序列表中序列2的第215位核苷酸后插入一个核苷酸A；

所述植物为大豆。

10.权利要求1或2中所述的蛋白质和/或权利要求3或4中所述的生物材料。