CN116286952A - 大豆GmSAMMT基因在调控植物蛋白含量和/或产量中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及基因工程技术领域，特别是涉及大豆GmSAMMT基因在调控植物蛋白含量和/或产量中的应用。本发明通过实验证明GmSAMMT基因在敲除株系中的表达量比对照显著降低，敲除株系的蛋白含量和粒重较对照显著提高；过表达GmSAMMT基因也得到两个株系，该基因在两个过表达株系中的转录水平得到了显著提高，但蛋白含量与对照相比则显著降低，粒重虽然也降低但不显著。粒重和蛋白含量在GmSAMMT敲除转基因大豆材料中的变化结果表明，该基因负调控大豆的粒重和蛋白含量，敲除该基因可同时改善大豆的产量和品质性状，可以用于大豆的营养品质改良。

Description

大豆GmSAMMT基因在调控植物蛋白含量和/或产量中的应用
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，特别是涉及大豆GmSAMMT基因在调控植物蛋白含量和/或产量中的应用。
背景技术
从农作物(如大豆，玉米和小麦)中提取的蛋白质(被称为植物蛋白)通常作为食用油，淀粉或其他食品加工产品的副产品。与动物来源的蛋白质相比，植物蛋白质的生产消耗较少的自然资源因此被认为对环境更有利。大豆[Glycine max(L.)Merr.]是植物蛋白的主要来源，在我们的日常生活中起着不可替代的作用。随着人们生活水平的提高，食品的健康和营养问题逐渐被人们所关注。大豆种子富含蛋白质，含有35％～42％的蛋白质。种子蛋白质含量和产量是大豆的重要性状，阐明这两个性状的遗传和分子机制，对大豆种子产量和品质改良具有重要意义。
S-腺苷-L-甲硫氨酸甲基转移酶(S-adenosyl-L-methioninemethyltransferase)在动物和大肠杆菌中研究的比较多，在植物中很少被报道。在拟南芥中的研究表明，甲硫氨酸是植物细胞中的基本代谢物，S-腺苷甲硫氨酸(SAM)是甲硫氨酸的第一个代谢物，可以调节乙烯、多胺和生物素等多种代谢物的水平。SAM是生物体内主要的生物甲基供体，这一过程由S-腺苷-L-甲硫氨酸甲基转移酶来催化完成。在大豆中还没有该类酶基因功能的报道。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了大豆GmSAMMT基因在调控植物蛋白含量和/或产量中的应用。本发明所述大豆GmSAMMT基因可以调控植物蛋白含量和/或产量，敲除GmSAMMT基因可显著提高大豆的蛋白质含量，同时粒重也显著增加。
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
本发明提供了大豆GmSAMMT基因在以下一种或多种方面中的应用，包括：
1)调控植物蛋白含量；2)调控植物粒重；3)调控植物粒长；4)调控植物粒宽；5)调控植物粒厚；所述GmSAMMT基因编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
优选的，所述调控植物蛋白含量包括：通过负调控GmSAMMT基因的表达来提高植物蛋白含量，或通过正调控GmSAMMT基因的表达来降低植物蛋白含量。
优选的，所述植物蛋白包括植物种子中的蛋白。
优选的，所述调控植物粒重包括通过负调控GmSAMMT基因的表达来提高植物粒重；
所述调控植物粒长包括通过负调控GmSAMMT基因的表达来提高植物粒长；
所述调控植物粒宽包括通过负调控GmSAMMT基因的表达来提高植物粒宽；
所述调控植物粒厚包括通过负调控GmSAMMT基因的表达来提高植物粒厚。
优选的，所述植物包括豆科植物。
优选的，所述豆科植物包括大豆。
本发明还提供了大豆GmSAMMT基因在培育高蛋白和/或高产的转基因植物中的应用，所述GmSAMMT基因编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
优选的，所述植物包括豆科植物。
优选的，所述豆科植物包括大豆。
本发明还提供了一种敲除GmSAMMT基因的sgRNA，包括敲除靶点的扩增引物；所述扩增引物为核苷酸序列如SEQ ID No.11～18所示的引物。
有益效果：
本发明提供了大豆GmSAMMT基因在以下一种或多种方面中的应用，包括：1)调控植物蛋白含量；2)调控植物粒重；3)调控植物粒长；4)调控植物粒宽；5)调控植物粒厚；所述GmSAMMT基因编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示。本发明利用CRISPR-Cas9技术定点编辑大豆GmSAMMT基因后，得到两个GmSAMMT基因被编辑的株系，qRT-PCR结果表明GmSAMMT基因在敲除株系中的表达量比对照显著降低，敲除株系的蛋白含量和粒重较对照显著提高；过表达GmSAMMT基因也得到两个株系，该基因在两个过表达株系中的转录水平得到了显著提高，但蛋白含量与对照相比则显著降低，粒重虽然也降低但不显著。亚细胞定位结果表明GmSAMMT定位在细胞核中。粒重和蛋白含量在GmSAMMT敲除转基因大豆材料中的变化结果表明，该基因负调控大豆的粒重和蛋白含量，敲除该基因可同时改善大豆的产量和品质性状，可以用于大豆的营养品质改良。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为GmSAMMT的PCR扩增结果；
图2为GmSAMMT组织表达水平分析；
图3为GmSAMMT基因亚细胞定位结果；
图4为GmSAMMT过表达载体示意图；
图5为GmSAMMT转基因材料PCR检测结果；
图6为GmSAMMT敲除转基因材料的获得示意图和测序结果；
图7为转基因大豆株系中GmSAMMT转录水平检测结果；
图8为GmSAMMT转基因材料大豆籽粒中的蛋白含量结果；
图9为GmSAMMT转基因材料大豆的种子表型、百粒重、粒长、粒宽和粒厚测定结果。
具体实施方式
大豆GmSAMMT基因在以下一种或多种方面中的应用，包括：
1)调控植物蛋白含量；2)调控植物粒重；3)调控植物粒长；4)调控植物粒宽；5)调控植物粒厚；所述GmSAMMT基因编码的蛋白(记为GmSAMMT蛋白)的氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示，具体如下：
MAKLFLKQAKQYADARPSYPPQLFQFIASKTPSHNLAWDVGTGSGQAAKSLAAIYKNVIATDASDKQLEFAAKLPNVRYQHTPSTMSTAELEQMVASKGTIDLVTIAQALHWFDRPTFYEQVKWVLKKPHGIIAAWCYYLPRVSDAFDTVFDQFYSTNVSPYWDPARKWVDDNYRSIDFPFEPVDGADHTGPFEFVTETMMDLDDFLTYIRSWSAYQTAKEKGVELLAEDVVEKFKLAWGEDAKKVVKFPIYLRIGRTGDS。
在本发明中，所述GmSAMMT基因的核苷酸序列优选如SEQ ID NO.2所示，具体如下：5’-ttcaggacgcaacgggggtgatggcatcatggttattacagaataaatgattgaagagtgatggaaggttcttgcttttgtttgtatatatacatactattattgctaggaaattgaagacctaagatacaatagagatggcaaagcta tttttgaaacaggcaaagcaatacgcagatgcaagaccaagctatcctccacaactcttccaattcattgcttcca agactccctctcacaacctcgcttgggacgtcggcactgggagcggccaagctgccaaatctttagctgcaatata caagaatgtgatagccacagatgctagtgacaaacaacttgaatttgcagccaagctcccaaatgtgagataccaa cacaccccttcaaccatgtcgacggccgagcttgaacaaatggtggcatctaagggaaccatagaccttgtgacca tagcacaagccctgcattggtttgaccgcccaaccttctacgaacaagtgaagtgggttctcaagaaacctcatgg aatcattgctgcttggtgttactatttgccaagagttagtgatgcatttgacactgtctttgaccaattctattcc actaatgtaagcccttattgggacccagctcgtaaatgggttgatgacaattatagaagcattgattttccatttg agcccgtggatggagctgatcacacaggaccctttgagtttgtgacggaaacaatgatggatttggatgatttctt gacctacataagatcatggtcagcatatcagacggctaaggagaaaggagtggagcttctcgcggaggatgtggtt gaaaaattcaagcttgcttggggtgaagatgctaaaaaagttgtcaagtttccaatttatttgagaattggaagaa caggggattcctaaagacatatgcaaatggttgcttttactgtgtgggagatgtgacgagtaccaacttttatgagtttatccattgattgaataatgtaattttattgaattgcgttcatgttaagtcaaaagcttttaaattcgaagggtacaattcctacttatctggaaagagttgagccttagtttgctatgttaattttgtaatttggtattgataaattttgttgtgtgtgtcaaccaaattttgatagaaaagtacttgtagtaaatacttgataatttattttaatgatgttaaattaaggtatttgc-3’；其中下划线的序列为编码区序列。
在本发明中，所述调控植物蛋白含量优选包括：通过负调控GmSAMMT基因的表达来提高植物蛋白含量，或通过正调控GmSAMMT基因的表达来降低植物蛋白含量；所述植物蛋白优选包括植物种子中的蛋白。
在本发明中，所述调控植物粒重优选包括通过负调控GmSAMMT基因的表达来提高植物粒重；
所述调控植物粒长优选包括通过负调控GmSAMMT基因的表达来提高植物粒长；
所述调控植物粒宽优选包括通过负调控GmSAMMT基因的表达来提高植物粒宽；
所述调控植物粒厚优选包括通过负调控GmSAMMT基因的表达来提高植物粒厚。
在本发明中，所述植物优选包括豆科植物；所述豆科植物优选包括大豆。
本发明以Jack为受体材料，构建GmSAMMT基因的过表达和CRISPR/Cas9载体转化大豆，获得过表达和敲除该基因的T0代大豆植株。qRT-PCR结果表明GmSAMMT基因在敲除株系中的表达量比对照显著降低，敲除株系的蛋白含量和粒重较对照显著提高；GmSAMMT基因在两个过表达株系中的转录水平得到了显著提高，但蛋白含量与对照相比则显著降低，粒重虽然也降低但不显著。亚细胞定位结果表明GmSAMMT定位在细胞核中。粒重和蛋白含量在GmSAMMT敲除转基因大豆材料中的变化结果表明，该基因负调控大豆的粒重和蛋白含量，敲除该基因可同时改善大豆的产量和品质性状，可以用于大豆的营养品质改良。
本发明还提供了上述大豆GmSAMMT基因在培育高蛋白和/或高产的转基因植物中的应用。
在本发明中，所述植物优选包括豆科植物；所述豆科植物优选包括大豆。
在本发明中，所述应用优选包括通过基因编辑的手段敲除大豆GmSAMMT基因或干扰大豆GmSAMMT基因的表达。
本发明还提供了用于敲除GmSAMMT基因的sgRNA，包括敲除靶点的扩增引物；所述扩增引物为核苷酸序列如SEQ ID No.11～18所示的引物。
本发明提供的sgRNA，同时靶向GmSAMMT基因的两个外显子区域，从而可以有效敲除GmSAMMT基因，降低其表达。
为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的大豆GmSAMMT蛋白在调控植物蛋白含量和/或调控植物产量中的应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
1)大豆S-腺苷-L-甲硫氨酸甲基转移酶GmSAMMT编码基因的克隆
从NCBI数据库和Phytozome v12大豆数据库，找到GmSAMMT所对应的基因(Glyma.03G129300，Gene ID:100784891)，根据数据库提供的核苷酸序列设计特异引物用于扩增GmSAMMT基因的编码序列，引物序列见SEQ ID NO.3(5’-GGATCTTCCAGAGATGTAGTCATGGTAGTCTGCACCA-3’)和SEQ ID NO.4(5’-CTGCCGTTCGACGATACTCGTCACATCTCCCACAC-3’)，以大豆品种Jack为取材对象，取其叶，用液氮研碎，将粉末装于1.5ml EP管中，加入1ml裂解液，涡旋震荡使其混合均匀，然后按照试剂盒进行提取(Total RNA Kit，天根，北京，中国)。用甲醛变性胶电泳鉴定总RNA质量，分光光度计测定RNA含量。以获得的总RNA为模板，按照诺唯赞Vazyme公司提供的反转录试剂盒(Vazyme HiScript 1st Strand cDNA SynthesisKit，南京)的说明书进行反转录，得到cDNA第一链后，进行PCR扩增，PCR反应体系如下：模板2μl，上下游引物各2μl，dNTP Mix 1μl，2×Phanta Max Buffer 25μl，Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase 1μl，最后加ddH2O定容至50μl。PCR程序如下：95℃预变性3分钟；95℃变性15秒，58℃退火15秒，72℃延伸60秒，共35个循环；最后72℃彻底延伸5分钟，随后4℃恒温半小时。
PCR扩增结果见图1，其中M为Marker(DL2000)，最亮的条带为750bp；1～5为GmSAMMT的目的条带，6为阴性对照；切胶随后进行PCR产物纯化、连接及转化工作，挑取阳性单克隆测序，测序后获得具有完整编码区的长度为786bp的大豆GmSAMMMT基因的CDS序列(SEQ ID NO.2所示的下划线的序列)。
2)GmSAMMT基因组织表达分析
为了鉴定GmSAMMT在不同组织中的表达水平，取Jack材料不同发育阶段的根、茎、叶、花、荚和种子：根、茎和叶为V4期；花为R2期；种子为15(15DAF seed)和45天(45DAFseed)的种子；荚为开花后15(15DAF pod)和45天(45DAF pod)的荚，每种材料进行3次平行重复实验。样品于液氮速冻后-80℃保存。总RNA的提取同步骤1)。以上述各组织取样获得的总RN A为模板，按照反转录HiScript III 1st Strand cDNA Synthesis Kit(+gDNA wiper(Vazyme,China)试剂操作说明反转为cDNA。参照
Figure BDA0004115511140000061
qP CR Master Mix(Vozyme,China)试剂说明书进行实时荧光定量qRT-PCR检测。qRT-PCR反应体系如下：2×ChamQ SYBRqPCR Master Mix 10μl，Primer 1(10μM)0.4μl，Primer 2(10μM)0.4μl，50×ROX Reference Dye 10.4μl，Template DNA/cDNA 5μl，最后ddH2O定容至20.0μl。qRT-PCR反应程序如下：95℃预变性30秒；95℃变性10秒，60℃延伸30秒，共40个循环。溶解曲线95℃，15秒；60℃，1分钟；95℃，15秒。GmSAMMT荧光定量引物序列见SEQ ID NO.5(5’-GAATTTGCAGCCAAGCTCCC-3’)和SEQ ID NO.6(5’-CAGGGCTTGTGCTATGGTCA-3’)。
GmSAMMT组织表达水平分析结果见图2，组织表达水平检测结果显示Gm SAMMT是一个组成型表达的基因，在大豆多个组织中均表达，在发育45天种子中表达量最高，在根、茎和发育15天种子中则最低。
3)GmSAMMT基因亚细胞定位
设计包含GmSAMMT基因完整CDS的引物(不包含终止密码子)，引物序列见SEQ IDNO.7(5’-TACAAATCTATCTCTCTCGAGATGGCAAAGCTATTTT TGAA-3’)和SEQ ID NO.8(5’-TGCTCACCATGGATCCCCGGGGGAATCCCC TGTTCTTCCAA-3’)，具体的PCR过程与步骤1)相同。利用诺唯赞高保真聚合酶(
Figure BDA0004115511140000062
Max Super-Fidelity DNA Polymerase)进行PCR扩增，所得产物进行胶回收后用限制性内切酶SmaⅠ和XhoⅠ对产物及载体进行双酶切，酶切体系：SmaⅠ和XhoⅠ酶各1μl，模板100μg，加ddH2O定容至10.0μl，37℃酶切过夜。酶切产物通过T4 DNA连接酶进行连接，连接体系如下：载体片段4μl，目的基因片段8μl，10×T4 DNAligase Buffer2μl，T4 DNA ligase 1μl(400u/μl)，加ddH2O至20μl，通过PCR仪22℃反应1h。然后转化、涂板，测序正确的菌液提质粒并命名为pAN58-GmSAMMT。通过冻融法将该质粒与空载质粒分别转入EHA105感受态细胞中，然后利用PEG法瞬时转化拟南芥原生质体。转化后的原生质体在28℃黑暗条件下培养48小时，然后利用激光共聚焦显微镜(ZEI SS，LSM780)观察原生质体的发光情况。结果见图3，其中，第一行为空载质粒转化后的结果，从左到右分别为荧光通道、叶绿体荧光通道、明场、叠加图；第二行为pAN58-GmSAMMT载体转化后的结果，从左到右分别为目标蛋白荧光通道、Marker荧光通道、叶绿体荧光通道、明场、叠加图；结果表明GmSAMMT蛋白定位在细胞核上。
实施例2基因GmSAMMT的基因工程应用
1)大豆S-腺苷-L-甲硫氨酸甲基转移酶基因GmSAMMT包含酶切位点序列的克隆
以大豆品种Jack种子总RNA为模板，经反转录合成cDNA第一链后，进行PCR扩增，引物序列见SEQ ID NO.9(5’-GGGCCCAGGCCTACGCGTATG GCAAAGCTATTTTTGAA-3’)和SEQ IDNO.10(5’-TCGGGGAAATTCGAGC TCTTAGGAATCCCCTGTTCTTC-3’)，扩增体系如下：模板2μl，上下游引物各2μl，dNTP Mix 1μl，2×Phanta Max Buffer 25μl，Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase 1μl，最后加ddH2O定容至50μl。PCR程序如下：95℃预变性3分钟；95℃变性15秒，58℃退火15秒，72℃延伸60秒，共35个循环；最后72℃彻底延伸5分钟，随后4℃恒温，测序后获得具有完整编码区的大豆GmSAMMT基因的CDS序列(SEQ ID NO.2所示的下划线的序列)，长度为786bp；
2)植物过表达载体的构建
利用同源重组的方法构建过表达载体，将步骤1)中利用SEQ ID NO.9和SEQ IDNO.10引物扩增出来的带有酶切接头的目的基因片段与pBA002载体利用Vazyme公司的
Figure BDA0004115511140000071
Entry One Step Cloning Kit(C115)进行重组反应，反应体系如下：载体1μl，目的片段2μl，2×CloneExpressMix 5μl，加ddH2O定容至10μl。反应程序：50℃，5分钟进行重组反应。将重组产物转化、涂板、挑单克隆并进行菌液PCR测序验证。测序引物序列见SEQ ID NO.21(5’-ATGACGCACAATCCCA-3’)和SEQ ID NO.10。最终获得pBA002-GmSAMMT植物过量表达表达质粒，并于-20℃冰箱保存备用，GmSAMMT过表达载体示意图见图4，限制性内切酶Miu I和Sac I之间为目的基因GmSAMM的CDS序列。
3)植物敲除载体的构建
大豆GmSAMMT基因序列从phytozome(https://phytozome.jgi.doe.gov/)下载。sgRNA靶标序列包含靶点的扩增引物为SEQ ID NO.11(5’-CATGCCATGGTAGAGGAGCTGTTCTGCTTC-3’)和SEQ ID NO.12(5’-TCTGATATGCTGACCATGATTGACCAGACATGTCACGCTT-3’)、SEQ ID NO.13(5’-ATCATGG TCAGCATATCAGAGTTTTAGAGCTAGAAATAGC-3’)和SEQ ID NO.14(5’-GTCAGTCGAC CATGAATAGGTCTATGACC-3’)、SEQ IDNO.15(5’-GTCA GTCGACGGAATTGTGAGCGGATAAC-3’)和SEQ ID NO.16(5’-TGCATTGG TTTGACCGCCCAAATCCATATGTTTTCCTGGG-3’)、SEQ ID NO.17(5’-TG GGCGGTCAAACCAATGCAGTTTTAGAGCTAGAAATAGC-3’)和SEQ ID NO.18(5’-CTAGTCTAGACCATGAATAGGTCTATGACC-3’)。
以pGmU3质粒为模板，利用扩增引物SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12进行PCR扩增，得到扩增产物1；
以pGmU3质粒为模板，利用扩增引物SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14进行PCR扩增，得到扩增产物2；
以pGmU6质粒为模板，利用扩增引物SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16进行PCR扩增，得到扩增产物3；
以pGmU6质粒为模板，利用扩增引物SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.18进行PCR扩增，得到扩增产物4；
得到扩增产物1、2、3和4的PCR反应体系均为：2×Phanta Max Buffer25μl，PhantaMax Super-Fidelity DNA Polymerase 1μl，dNTP 1μl,pGmU3/pGmU6质粒1μl，左右引物各1μl，最后加ddH2O定容至50μl。
得到扩增产物1、2、3和4的PCR反应程序均为：95℃预变性5分钟；95℃变性15秒，57℃退火20秒，72℃延伸18秒，共35个循环；72℃彻底延伸5分钟。
通过搭桥方法将所述扩增产物1和2进行PCR反应，反应产物为A；扩增产物3和4进行搭桥PCR反应，反应产物为B。搭桥PCR反应程序体系均为：产物1/3500ng，产物2/4300ng，dNTP Mix 1μl，2×Phanta Max Buffer 25μl，Phanta Max Super-Fidelity DNAPolymerase 1μl，最后加ddH2O定容至50μl。PCR程序如下：95℃预变性5分钟；95℃变性15秒，57℃退火20秒，72℃延伸21秒，共15个循环；72℃彻底延伸5分钟。
以产物A为模板，利用扩增引物SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.14进行PCR扩增，得到扩增产物U3-sgRNA1；
以产物B为模板，利用扩增引物SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.18进行PCR扩增，得到扩增产物U6-sgRNA2；
得到产物U3-sgRNA1和U6-sgRNA2的反应程序体系均为：产物A/B 10μl，dNTP Mix1μl，2×Phanta Max Buffer 25μl，Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase 1μl，左右引物各2μl，最后加ddH2O定容至50μl。PCR程序如下：95℃预变性5分钟；95℃变性15秒，57℃退火20秒，72℃延伸21秒，,36个循环；72℃彻底延伸5分钟。
将PCR产物U3-sgRNA1和U6-sgRNA2以及pSC-M载体进行酶切，U3-sg RNA1和U6-sgRNA2酶切体系：Buffer 5μl，U3-sgRNA1/U6-sgRNA215μl，Nc oⅠ2.5μl，SalⅠ2.5μl，ddH2O定容至50μl；pSC-M载体酶切体系：Buffer 5μl，pSC-M 6μl，NcoⅠ2.5μl，SalⅠ2.5μl，ddH2O定容至50μl；酶切程序均为：37℃，45分钟。
以酶切产物为模板，利用T4连接酶进行连接反应。连接体系为：Buffer 2μl，pSC-M质粒酶切产物150ng，U3-sgRNA1酶切产物60ng，U6-sgRNA2酶切产物60ng，T4连接酶2μl，加ddH2O定容至20μl。连接程序：22℃，2小时。连接产物转化大肠杆菌TOP10，过夜培养后挑取单克隆并进行菌检，选择阳性菌液进行测序检验。测序引物为SEQ ID NO.19(5’-AGCATTGTCTCTGCCTC TTAAC-3’)和SEQ ID NO.20(5’-CGTCACATCTCCCACACAGTA-3’)。测序正确的菌液利用质粒提取试剂盒提取质粒并保存。至此，GmSAMMT基因的敲除载体构建完毕。
pGmU3(反向)为U3-sgRNA1骨架保存载体、pGmU6(正向)为U6-sgR NA2骨架保存载体、pSC-M(S代表sgRNA，C代表Cas9，M代表multiply-tar get)为CRISPR/Cas9多重敲除载体，以上载体由本实验室改造，参见文献【Du,H.,Zeng,X.,Zhao,M.,Cui,X.,Wang,Q.,Yang,H.,Cheng,H.,&Yu,D.(2016).Efficient targeted mutagenesis in soybean by TALENsand CRISPR/Cas9.Journal of biotechnology,217,90–97.https://doi.org/10.1016/j.jbiotec.2015.11.005】。
4)农杆菌介导的大豆子叶节的转化
将步骤2)和3)得到的质粒通过冻融法分别转化农杆菌EHA105，菌液分别命名为pBA002-GmSAMMT和pSC-M-GmSAMMT，具体实验操作流程如下：
1.菌液准备：取pBA002-GmSAMMT和pSC-M-GmSAMMT菌液分别在含有壮观霉素(50μg/mL)和卡那霉素(50μg/mL)的YEB平板(1L配方：0.5g蛋白胨，0.5g酵母提取物，0.5g蔗糖，0.05g MgSO4.·7H2O，1.5g琼脂粉，加入100ml纯水，然后121℃灭菌20分钟)上划线，28℃摇床倒置，待其长出单克隆后，挑取单克隆至含有相应抗生素的YEB液体培养基(1L配方：0.5g蛋白胨，0.5g酵母提取物，0.5g蔗糖，0.05g MgSO4·7H2O，加入100ml纯水，然后121℃灭菌20分钟)中。28℃摇床培养过夜，然后转移到150ml的锥形瓶中，锥形瓶中装有120ml含有相应抗生素的YEB液体培养基。28℃，100rpm过夜，测其OD600为0.85～0.9之间即可。
2.菌液收集：将锥形瓶中的菌液分装到两个50ml的离心管中，5000rpm离心10min，弃上清。底部沉淀用45ml CCM-liquid(1L配方：0.5ml 100×Fe盐(Na2-EDTA 7.46mg/L，FeSO4·7H205.56 mg/L)，5ml 20×B5大量(KNO350g/L，NaH2PO4·2H2O 3g/L,MgSO4·7H205g/L，(NH4)2SO42.68g/L，CaCl2·2H2O 3g/L)，0.5ml 200×B5微量(H3BO30.6g/L，MnSO4·H2O2g/L，ZnSO4·7H2O 0.4g/L，KI 0.15g/L，Na2MoO4·2H2O 0.05g/L，CuSO4·5H2O 0.05g/L，CoC l2·6H2O 0.05g/L)和10ml 100×B5有机(烟酸0.1g/L，VB11g/L，VB60.1g/L，肌酸10g/L)，30g蔗糖(青岛生工)和3.9g MES(青岛生工))进行悬浮，悬浮液倒进收集罐里，然后利用45ml CCM-liquid重复悬浮一次，测得收集罐中的菌液OD600为0.5～0.6即可冰箱放置备用。
3.子叶节遗传转化：挑选色泽均匀、籽粒饱满无裂痕的大豆种子，进行灭菌。利用化学反应HCl(浓)+NaClO→Cl2↑+NaOH(浓盐酸与次氯酸钠体积比为1:10)产生的氯气来进行消毒，该步骤在通风橱中进行，消毒时间6.5小时。灭菌完成后，将种子置于超净台上使残留的氯气充分吹散，然后用镊子将种子插入SG4固体培养基(青岛生工)中过夜。用手术刀首先将吸胀的种子沿着子叶中间一分为二，去除真叶，然后在子叶节部分用刀顺着下胚轴的方向轻轻划出几道伤口。将处理好的外植体和第2)步中悬浮好的菌液一起倒入灭过菌的罐子中，于28℃，120rpm共培养40min。最后将外植体取出，子叶节一面朝下，置于铺有一层滤纸的CCM固体培养基(在CCM-liquid配方的基础上，每升加入5g琼脂糖)上，每个培养皿内放14个外植体，25℃黑暗培养5天。将共培养5天后的外植体用灭菌水和Wash-Liquid除菌后，切掉过长的下胚轴，留5～10mm，生长点向上45度斜插入到SIM固体培养基(1L配方：5ml 100×Fe盐(Na2-EDTA7.46mg/L，FeSO4·7H205.56 mg/L)，50ml 20×B5大量(KNO350g/L，NaH2PO4·2H2O 3g/L,MgSO4·7H2O 5g/L，(NH4)2SO42.68g/L，CaCl2·2H2O 3g/L)，5ml 200×B5微量(H3BO30.6g/L，MnSO4·H2O 2g/L，ZnSO4·7H2O 0.4g/L，KI0.15g/L，Na2MoO4·2H2O0.05g/L，CuSO4·5H2O 0.05g/L，CoCl2·6H2O 0.05g/L)，10ml 100×B5有机(烟酸0.1g/L，VB11g/L，VB60.1g/L，肌酸10g/L)，30g蔗糖(青岛生工)，0.58g MES(青岛生工)和3.5g植物凝胶)中，此时不进行抗除草剂的筛选，每皿8个，26℃光照培养15天后切除大芽和部分下胚轴，将长出丛生芽的外植体更换到加入6mg/L草丁膦的SIM固体培养基中进行筛选，继续培养半个月后将未完全枯死的外植体的子叶、枯叶和部分下胚轴切除，更换到加入4mg/L草丁膦的SEM固体培养基(1L配方：4.74g MS粉末(青岛生工)，5ml 100×Fe盐(Na2-EDTA7.46mg/L，FeSO4·7H205.56 mg/L)，10ml 100×B5有机(烟酸0.1g/L，VB11g/L，VB60.1g/L，肌酸10g/L)，30g蔗糖(青岛生工)，0.58g MES(青岛生工)和3.5g植物凝胶)中培养。半个月一个周期进行SEM培养基的更换直至有芽伸长。当外植体的芽伸长到6cm时，切掉底部，在茎底部切一个十字型伤口，转入RM生根培养基(1L配方：4.74g MS粉末(青岛生工)，2.5ml 100×Fe盐(Na2-EDTA 7.46mg/L，FeSO4·7H205.56 mg/L)，5ml 100×B5有机(烟酸0.1g/L，VB11g/L，VB60.1g/L，肌酸10g/L)，20g蔗糖(青岛生工)，0.58g MES(青岛生工)和3.5g植物凝胶)中培养，10天后可见诱导出的根。当根的长度达到五厘米以上时，将组培苗从培养基中分离，移入灭菌后的土中，置于人工培养箱中生长(16h光照/8h黑暗，25℃)。
5)转基因植株阳性鉴定
1.移栽到土里的过表达或敲除组培苗首先进行bar基因的检测，结果见图5中的a；其中，1～3为KO_#1敲除株系；4～6为KO_#2敲除株系；7～8，过表达株系，记为OE_#1和OE_#4，用于后续实验；
2.检测以后再取过表达组培苗叶片提DNA。利用诺唯赞聚合酶(2×Rapid TaqMaster Mix)进行PCR鉴定，PCR体系如下：2×Rapid Taq Master Mix
10μl，Primer 1(10μM)2μl，Primer2(10μM)2μl，Template DNA/cDNA2μl，最后ddH2O定容至20.0μl。反应程序如下：95℃预变性3分钟；95℃变性15秒，60℃复性15秒，72℃延伸5秒，共35个循环；72℃彻底延伸5分钟。此时用到的左引物位于载体35启动子区域，右引物位于基因编码区下游(左引物SEQ ID NO.21和右引物SEQ ID NO.10)。PCR鉴定条带大小符合且测序完全正确的即为过表达阳性苗，结果见图5中的b；其中M：DL2000，泳道1～3为过表达株系OE_#1，泳道4和5为过表达株系OE_#4
3.敲除阳性苗利用诺唯赞高保真酶(
Figure BDA0004115511140000121
Max Super-Fidelity DNAPolymerase)进行检测，PCR体系如下：模板2μl，上下游引物各2μl，dNTPMix1μl，2×PhantaMax Buffer25μl，PhantaMax Super-Fidelity DNAPolymerase 1μl，最后加ddH2O定容至50μl。PCR程序如下：95℃预变性3分钟；95℃变性15秒，58℃退火15秒，72℃延伸15秒，共35个循环；最后72℃彻底延伸5分钟。所用引物为SEQ ID NO.19和SEQ ID NO.20，测序结果与对照材料Jack进行比较，纯合以及编辑类型如图6所示，其中(a)GmSAMMT基因结构图以及靶点所在位置；sgRNA-1和sgRNA-2为两个靶点；黑色为CDS序列，灰色为UTR区，黑色直线为内含子区域；(b)GmSAMMT敲除转基因材料的编辑类型；斜体标注的为NGG序列，下划线标注的为20bp的靶序列，虚线为缺失的碱基序列。
4.qRT-PCR检测目的基因在转基因材料中转录水平的变化，所用引物为SEQ IDNO.5和SEQ ID NO.6。对照Jack和两个敲除材料中的表达量，分别进行了4次平行重复实验；重新取对照Jack，测定对照Jack和两个过表达材料中的表达量，分别进行了3次平行重复实验。qRT-PCR反应体系如下：2×ChamQ SYBRqPCRMasterMix 10μl，Primer 1(10μM)0.4μl，Primer 2(10μM)
0.4μl，50×ROX Reference Dye 10.4μl，Template DNA/cDNA5μl，最后ddH2O定容至20.0μl。qRT-PCR反应程序如下：95℃预变性30秒；95℃变性10秒，60℃延伸30秒，共40个循环。溶解曲线95℃，15秒；60℃，1分钟；95℃，15秒。结果如图7和表1所示，a为GmSAMMT基因在对照Jack和两个敲除材料中的表达量，N＝4；b为GmSAMMT基因在对照Jack和两个过表达材料中的表达量，N＝3；误差线表示平均值±SD，统计分析采用双尾T检验；*，P<0.05；**，P<0.01；***，P<0.001。
表1转基因大豆株系中GmSAMMT转录水平检测结果
Figure BDA0004115511140000122
Figure BDA0004115511140000131
由如图7和表1可知，与对照材料Jack相比，目的基因在过表达植株中的表达量显著提高(N＝3)(图7中的b)，在敲除材料中的表达量则显著降低(N＝4)(图7中的a)。
6)转基因植株成熟籽粒蛋白含量测定
测定对照Jack、KO_#1、KO_#2、OE_#1和OE_#4植株成熟籽粒中的蛋白含量，每个株系进行3次平行重复实验，大豆蛋白质含量测定的方法是国标方法GB/T 5511-2008中推荐的凯氏定氮法，测定仪器为Kjeltec8400全自动凯氏定氮仪(FOSS)。结果见图8和表2，其中a为Jack和两个GmSAMMT敲除转基因株系的蛋白含量；b为Jack和两个GmSAMMT过表达转基因株系的蛋白质含量。
表2GmSAMMT转基因材料大豆籽粒中的蛋白含量结果(g/100g大豆)
Jack KO_#1 KO_#2 OE_#1 OE_#4
重复1 34.6614 42.9167 38.0003 33.0741 32.7372
重复2 34.6551 43.5086 38.0879 33.2116 32.7659
重复3 34.6868 45.2000 38.1710 32.8557 32.2274
平均值 34.67 43.88 38.09 33.05 32.58
由图8和表2可知，与对照材料相比，两个敲除株系种子中的蛋白含量均显著增加(N＝3)(图8a)。与之相反的是，过表达材料种子中的含蛋白含量出现了明显的降低(N＝3)(图8b)。以上结果表明，GmSAMMT基因负调节大豆的蛋白含量，敲除该基因可显著提高大豆种子中的蛋白含量，进而改善大豆营养品质。
7)转基因材料粒重测定
将收获的转基因大豆种子于37℃烘箱干燥一周，然后测定对照材料Jack和转基因材料的百粒重(N＝3)、粒长(N>15)、粒宽(N>15)和粒厚(N>15)表型。结果见图9和表3～6，其中a为Jack和GmSAMMT转基因株系的种子表型；b为Jack和GmSAMMT编辑转基因株系的粒重、粒长、粒厚和粒宽比较；c为Jack和GmSAMMT过表达转基因株系的粒重、粒长、粒厚和粒宽比较；粒重性状进行了3次平常重复实验(N＝3)；粒长、粒厚和粒宽的重复数为N>15(具体见表)。
表3对照材料Jack和转基因材料的百粒重(g)
Figure BDA0004115511140000132
Figure BDA0004115511140000141
表4对照材料Jack和转基因材料的粒厚(mm)
Jack KO_#1 KO_#2 OE_#1 OE_#4
重复1 5.0100 5.8800 6.8500 5.5100 5.0000
重复2 4.7800 6.3500 5.7700 5.4600 5.5200
重复3 5.3300 6.3000 5.6800 5.5200 5.2300
重复4 5.4400 6.2600 5.8000 5.7600 5.4800
重复5 5.8500 6.2800 5.7900 5.9100 5.1700
重复6 4.9800 6.1400 5.7900 5.5200 5.2900
重复7 5.0300 6.1100 5.9700 5.6400 5.3900
重复8 5.0900 6.4800 5.8100 5.0800 5.2300
重复9 5.9700 6.3800 5.6800 5.6500 5.1400
重复10 4.8000 6.0800 5.8800 5.4400 4.9000
重复11 4.5800 6.3200 5.6900 5.3500 5.3900
重复12 4.7800 6.3200 5.9300 5.5500 4.8300
重复13 5.0500 6.4000 5.8100 5.8700 4.9100
重复14 4.8300 6.2800 5.5900 5.3900 5.4100
重复15 4.7900 6.3500 5.6900 5.6700 5.2000
重复16 - 6.3600 5.5400 5.5800 5.2900
重复17 - 6.1400 5.6200 5.4300 5.4100
重复18 - 6.2700 5.8700 5.5300 5.4200
重复19 - 6.2900 5.8100 5.3300 4.9800
重复20 - 6.0300 5.7200 5.4800 5.3600
重复21 - - 5.8000 - -
平均值 5.09 6.25 5.81 5.53 5.23
表5对照材料Jack和转基因材料的粒宽(mm)
Figure BDA0004115511140000142
Figure BDA0004115511140000151
表6对照材料Jack和转基因材料的粒长(mm)
Jack KO_#1 KO_#2 OE_#1 OE_#4
重复1 6.5300 7.5900 7.8100 6.6600 6.6200
重复2 6.4300 7.4200 7.9500 6.4500 6.9200
重复3 6.5600 7.6800 7.9300 6.5300 6.2700
重复4 6.6200 7.5900 7.6500 6.4900 6.8100
重复5 7.7500 7.6900 7.6200 6.6600 6.5800
重复6 6.6100 7.4700 7.6600 7.0300 6.6200
重复7 6.1800 8.0800 7.7800 6.8400 6.7300
重复8 6.6600 8.1200 8.0800 6.7100 6.5700
重复9 7.1900 8.5000 7.5000 6.8400 6.7200
重复10 6.5700 8.7600 7.8100 6.6400 6.7000
重复11 6.2500 8.6300 7.7500 6.5200 6.9100
重复12 6.5200 8.3300 7.3800 6.7600 5.8500
重复13 6.4500 8.0200 7.6200 6.6600 6.3100
重复14 6.1600 8.2100 7.6500 6.5200 6.9400
重复15 6.1500 8.4200 8.1200 6.9000 6.5800
重复16 - 7.8900 7.6500 6.6500 6.7800
重复17 - 7.8800 8.0600 6.8300 6.8700
重复18 - 7.7900 7.7300 7.0200 6.8200
重复19 - 7.7900 7.6400 6.6000 6.5900
重复20 - 8.5500 7.6900 6.8300 6.6700
重复21 - - 7.5700 - -
平均值 6.58 8.02 7.75 6.71 6.64
由图9和表3～6可知，与对照Jack相比，成熟种子在外观上没有明显差异(图9a)，但粒重、粒长、粒宽和粒厚显著增加(图9b)。过表达株系虽然粒重降低，但与对照之间的差异不显著。该结果表明GmSAMMT基因负调节大豆的粒重表型。
综上所述，大豆GmSAMMT基因负调控大豆的粒重和蛋白含量，敲除该基因可同时改善大豆的产量和品质性状，可以用于大豆的营养品质改良。
虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可以做各种改动和修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.大豆GmSAMMT基因在以下一种或多种方面中的应用，包括：
1)调控植物蛋白含量；2)调控植物粒重；3)调控植物粒长；4)调控植物粒宽；5)调控植物粒厚；所述GmSAMMT基因编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述调控植物蛋白含量包括：通过负调控GmSAMMT基因的表达来提高植物蛋白含量，或通过正调控GmSAMMT基因的表达来降低植物蛋白含量。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述植物蛋白包括植物种子中的蛋白。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述调控植物粒重包括通过负调控GmSAMMT基因的表达来提高植物粒重；
所述调控植物粒长包括通过负调控GmSAMMT基因的表达来提高植物粒长；
所述调控植物粒宽包括通过负调控GmSAMMT基因的表达来提高植物粒宽；
所述调控植物粒厚包括通过负调控GmSAMMT基因的表达来提高植物粒厚。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述植物包括豆科植物。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述豆科植物包括大豆。
7.大豆GmSAMMT基因在培育高蛋白和/或高产的转基因植物中的应用，所述GmSAMMT基因编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述植物包括豆科植物。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述豆科植物包括大豆。
10.一种敲除GmSAMMT基因的sgRNA，其特征在于，包括敲除靶点的扩增引物；所述扩增引物为核苷酸序列如SEQ ID No.11～18所示的引物。
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