CN112760331A

CN112760331A - 大豆GmHOS1a基因和GmHOS1b基因及其应用

Info

Publication number: CN112760331A
Application number: CN202011268382.8A
Authority: CN
Inventors: 李宏宇; 王昕�; 刘军; 赵涛; 刘斌
Original assignee: Institute of Crop Sciences of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Crop Sciences of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2020-11-13
Filing date: 2020-11-13
Publication date: 2021-05-07

Abstract

本发明公开了大豆GmHOS1a基因和GmHOS1b基因及其在调控植物开花时间和/或耐寒性中的应用。

Description

大豆GmHOS1a基因和GmHOS1b基因及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及大豆GmHOS1a基因和 GmHOS1b基因及其应用。

背景技术

我国的大豆种质资源丰富，有许多高产、高油、高蛋白和抗逆性强的优质品种。但由于大豆是较严格的短日植物，只有在达到特定的光周期条件才能开花；不同纬度地区会因区域间光周期的差异而显著影响大豆的产量，这也是制约大豆品种推广和利用主要因素之一。因此探究大豆光形态建成和开花调控机制具有重要的理论和生产意义。东北地区是中国最大的大豆生产加工地区，寒地大豆的种植越来越受到重视。低温、冷害是影响东北大豆高产稳产的主要原因之一。一些优良高产的大豆品种也因东北特殊环境而不能成功引种。因此怎样提高大豆的耐寒性，根据大豆种植地的有效积温以及生育期来科学选择品种，在早霜到来之前育成成熟的大豆，有效利用自然资源同时保证大豆的品质，是当前亟待解决的问题。

拟南芥中的研究表明，高表达的渗透反应基因1(High Expression ofOsmoticallly Responsive Genes 1，HOS1)基因作为信号整合因子联系着植物发育与胁迫反应过程，在调控低温反应、光形态建成和开花时间中发挥至关重要的作用，是很有潜力的作物分子育种目标基因。

温度是植物生长发育的必要因素之一，当环境温度降低至植物不能承受的程度时，植物就会停止生长、受伤或死亡。为适应这种非冻低温条件，植物在进化过程中会通过调节体内的生理生化反应来扩大温度承受范围，提高耐寒性，这叫做冷驯化过程(BOND etal.,2011)。近年来，随着越来越多的响应冷驯化机制的基因在植物上被发现和鉴定，人们的焦点逐渐转移到了响应冷驯化分子机制上(ZHU et al., 2008)。

作为植物抗寒重要调控因子，HOS1基因是从拟南芥hos1突变体中鉴定出来(ISHITANI et al.,1998)^1152-1153。由荧光素酶连接冷反应基因(Responsive ToDesiccation 29A，RD29A)转入拟南芥材料中，利用荧光素酶成像所鉴定的突变体可以导致冷反应基因的超诱导，例如RD29A、冷调节47(Cold-Regulated 47，COR47)、COR15A、激酶1(Kinase 1，KIN1)和乙醇脱氢酶1(Alcohol Dehydrogenase 1， ADH1)等，可增强植株抗冻性(LEE et al.,2011；PARK et al.,2018)。虽然这些基因除了由低温诱导也可以由脱落酸、高盐或聚乙二醇诱导，但hos1-1突变体只在低温下增强它们的表达(MILLAR et al.,1992； ISHITANI et al.,1997)。此外长日照条件下与野生型相比，hos1-1的开花时间更早，而且出现了基本春化。综上所述，HOS1基因是植物细胞中参与冷信号转导的一个重要的负调节因子，它在控制寒冷胁迫、耐寒和开花时间的基因表达方面起着关键作用。

拟南芥中，HOS1编码的蛋白质靠近氨基酸黏性末端为环指结构，在所有植物组织中都能表达。在正常的生长温度范围内，HOS1蛋白定位于细胞质，而在低温条件下则在细胞核内积累(LEE et al.,2001)。 HOS1也是一种E3泛素连接酶，为高尔基体膜上的跨膜蛋白，参与蛋白质泛素化降解过程。

前人研究结果表明，在植物经历冷驯化的过程中，除了植物体内发生的一些生理生化改变外，植物中的许多基因表达水平也会出现不同程度的变化，这些基因被称为冷响应基因。这些冷诱导基因表达的产物可以分为两类：一类是与植物抗寒性的提高直接相关的功能性蛋白；另一类是调控性蛋白，调控寒冷信号传导、抗寒基因表达和抗寒蛋白活性。包括各种转录因子和蛋白激酶，如DREB转录因子、Ca²⁺依赖性蛋白激酶等。这类转录因子能诱导多种冷诱导基因和逆境胁迫诱导基因的表达，从而极大地增强了植物抗寒性。

拟南芥CBF表达诱导因子1(Inducer Of CBF Expression 1，ICE1) 基因在低温下可被激活，这个C端重复结合因子(C-Repeat Binding Factor，CBF)基因的主要转录激活因子，可以通过直接绑定到CBF 基因启动子上来诱导其基因转录(CHINNUSAMY et al.,2003；ZHU et al.,2004；DONG et al.,2006；ZHOU et al.,2011；XU et al.,2014)。而 CBF转录因子也可以直接绑定到基因启动子中的CRT/DRE元件来诱导冷响应基因的表达，提高植株耐寒性(GILMOUR et al.,1998； THOMASHOW,2010；NOVILLO et al.,2012；DONG et al.,2013)。

hos1突变体低温处理3h后CBF2和CBF3被超诱导表达，延长低温处理时间CBF2和CBF3的诱导表达更加明显。表明HOS1可以调控CBFs基因的表达而响应冷胁迫(LEE et al.,2001)。而冷驯化中HOS1作为一种E3泛素连接酶，能促进ICE1蛋白的泛素化降解，而失活的ICE1降低了CBF诱导的很多冷胁迫应答基因的活性，从而防止低温反应的过度活化，使植物表现低温敏感型(CHINNUSAMY et al.,2006；LOURENCO et al.,2013；DING et al.,2015；KIM et al.,2015)。此外，生物钟也可以直接或间接地(通过影响HOS1活性)调控CBF3 基因的表达。因此在冷驯化中HOS1扮演的是负调控冷胁迫应答基因角色(VISWANATHAN et al.,2002)。

hos1突变体的耐寒表型与低温驯化的耐寒植物表型是难以区分的。此外尽管冷响应基因在突变体中高度表达，但非驯化突变株耐寒性降低，这表明HOS1调控ICE1蛋白稳定并不适用于hos1突变体中观察到的所有的冷反应表型。此外即使非低温下，HOS1突变也诱导冷响应基因，而且HOS1 E3泛素酶在30℃仍然有活性，这表明HOS1 的功能并不局限于冷反应。

经过人们对植物开花调控的多年研究，目前模式植物拟南芥的开花调控网络研究得最为清楚。研究结果表明，植物开花主要受到六个截然不同的信号途径调控，即光周期途径(Photoperiod Pathway)、春化途径(Vernalization Pathway)、赤霉素途径(Gibberellin Pathway)、自主途径(Autonomous Pathway)、温度途径(AmbientTemperature) 和年龄途径(Age Pathway)(LIU et al.,2015)。光周期开花途径、春化途径和温度途径是植物对光照长短及温度变化的反应，而年龄途径、自主途径与赤霉素途径是植物内在因素的调控途径。六个途径通过植物体内相对应的信号响应因子，对不同的环境信号作出响应，并传递给开花信号整合因子，共同调控下游基因的表达，进而调节开花。

拟南芥光周期调控开花机制中，叶片中的光受体感受不同波长的光信号，随后将光信号整合到生物钟系统，通过核心振荡器将信号传递给下游节律调节基因，最后传递到开花基因，调控拟南芥开花。

拟南芥中至少存在13种光受体，分为吸收红光和远红光的光敏色素(Phytochrome)PHYA、PHYB、PHYC、PHYD、PHYE，吸收蓝光的隐花色素(Crytochrome)CRY1、CRY2和3个LOV/F-box/Kelch 结构域ZTLs家族蛋白(Flavin-Binding Kelch Repeat F-Box1，FKF1)、泽特鲁普(Zeitlupe，ZTL)、洛夫凯尔奇蛋白2(Lov Kelch Protein 2， LKP2)，吸收紫外光的UV-B受体UVR8，对蓝光依赖的向光素 (Phototropin)Phot1和Phot2。

光受体将光信号整合进入生物钟系统过程涉及一系列的基因，包括光敏色素相互作用因子(Phytochrome Interacting Factor 3，PIF3)、早花基因3(Early Flowering 3，ELF3)、ELF4、组成性光形态1 (Constitutively Photomorphogenic 1，COP1)等基因。光敏色素PHYB 是红光的主要受体，在红光条件下，PHYB从非活性状态(Pr)转变为活性状态(Pfr)，并与PIFs蛋白相互作用，降解PIF3/4蛋白，进而在白天抑制细胞伸长。与此同时，PHYB亦可与ELF3相互作用，共同抑制PIF4功能，进而调控下胚轴伸长和拟南芥开花。ELF3-COP1 复合物可以与GIGANTEA(GI)蛋白相互作用，并降解生物钟蛋白 GI。另一个蓝光受体CRY则通过ELF3-COP1复合物降解GI蛋白这条途径将光信号整合进入植物生物钟调控网络中(YU et al.,2008)。

生物钟在高等植物体内主要由三部分构成，分别为根据环境信号控制振荡器的输入途径(Input Pathway)；控制并产生近似24小时的昼夜节律信号的核心振荡器(CentralOscillator)；产生与昼夜节律一致的振荡器输出途径(Output Pathway)。生物钟三个系统在功能上存在部分重叠，其互相联系，互相影响，连接外部环境信号，识别日照长短，调控开花(MCWATTERS et al.,2011)。位于生物钟输出途径的重要基因主要有康斯坦基因(Constans，CO)、GI和开花基因T(Flowering Locus T，FLC)。CO为B-box锌指结构的转录因子，具有生物钟周期性节律，受到FKF1和GI的转录调控，可直接结合 FT启动子区域，激活其表达，在长日照条件下可促进拟南芥开花 (PUTTERILL et al.,1995；KOBAYASHI et al.,1999；YAMAGUCHI et al.,2005)。

CO活性在转录和转录后水平上受到了严格调控。CO转录是由生物钟控制的，使CO转录水平在长日条件下保持白天低水平，夜间高水平。同时CO蛋白的丰度被几个泛素化事件协调调控。在早晨， PHYB介导的红光信号会导致CO降解。值得注意的是，尽管夜间的 CO转录水平很高，但由于黑暗激活的COP1，CO蛋白水平非常低 (JANG et al.,2008；HUANG etal.,2014)。而傍晚时蓝光和远红光信号通过抑制COP1活性来稳定CO蛋白水平(VALVERDEet al.,2004； LAUBINGER et al.,2006；LIU et al.,2008；ZUO et al.,2011；JUNG etal.,2014)。

HOS1也能调节拟南芥开花时间。不同光照和温度下HOS1通过调节CO蛋白稳定性来调节光周期开花。长日照条件下HOS1泛素化降解CO，因此hos1突变体中CO蛋白的丰度提高了。一致的是FT 转录水平也提高了，特别是在日光期的初期阶段。此外，当CO也突变时hos1突变体的早花表型受到抑制，进一步支持了光周期开花中 HOS1介导CO降解。另外PHYB可以介导红光诱导CO蛋白降解来调控开花时间，所以在phyb缺失突变体中也观察到CO蛋白的高水平积累，研究发现PHYB可以和HOS1，CO产生互作，这三个蛋白在拟南芥中可能以复合体形式协调光周期反应(SONG et al.,2013； LAZARO et al.,2015)。

常温下hos1突变体呈现早花，因为HOS1突变诱导了FT基因表达(CHENG et al.,2020)；当植物处于低温时，HOS1促进CO降解，进而抑制了FT基因表达(JUNG et al.,2012；LAZARO et al.,2012； LEE et al.,2012；SEO et al.,2013；LIU et al.,2016)。拟南芥植株一旦暴露于低温下，CO蛋白迅速降解。低温对CO的影响在phyb突变体中仍然存在，表明低温条件下HOS1对CO蛋白的降解作用是独立于 PHYB的(Endo et al.,2013)。在红光信号和低温促进HOS1降解CO 的基础上，我们提出HOS1整合了光和温度信号通过调节CO的丰度去调节与温度有关的光周期开花。然而目前不清楚光和温度信号是怎样调节HOS1的E3泛素连接酶的活性的。

HOS1也是染色质组织的调节因子，独立于其E3酶活性。短时间低温条件时，HOS1影响开花抑制子FLC的染色质状态，以调节低温条件下的开花时间(JUNG et al.,2013a；JUNGet al.,2013b)。

低温调节开花时间的不同取决于植物处于低温的持续时间。FLC 能调节长期低温影响的春化开花途径。长时间处在低温但不冻结的温度(春化)可以抑制FLC基因表达而促进开花(SEO et al.,2009；HE, 2012)。研究表明长期低温促进开花与HOS1无关。FLC也可以在短期冷胁迫下延迟开花。冷胁迫对开花时间的影响是通过间歇低温处理进行研究的，即在黎明后的几个小时内植物处在低温环境下直至开花。尽管间歇性的低温条件不会影响植物的发育，但它会诱导FLC而显著晚花。所以间歇性低温对flc突变体的开花没有抑制作用。有趣的是，春化开花途径很大程度上与HOS1介导FLC无关。而hos1突变体中短期低温对FLC表达和开花时间的影响大大减少，就像flc突变体中一样，表明HOS1调控低温条件下FLC的激活。

具体机制如下：正常温度下，组蛋白脱乙酰酶6(Fve-Histone Deacetylase 6，HDA6)复合体沉默FLC(JEON et al.,2011；TO et al., 2011)；低温条件下，HOS1首先结合到FLC上，与FVE和HDA6 互作，迫使HDA6与FLC分开，从而激活FLC延迟开花。

有趣的是，两个HOS1互作蛋白FVE和HDA6并不是HOS1 E3 泛素酶的底物，这表明HOS1在低温胁迫时诱导FLC转录中所起的作用是由调节机制调节的而非泛素事件。在这个调控模式中HOS1作为FLC染色质的调节子，将低温信号整合到开花途径中。

已经证明HOS1在调节昼夜节律周期中还调控生物钟基因mRNA 的核-质转运(MACGREGOR et al.,2013)，进一步扩展了HOS1在植物发育和环境适应途径中的分子和生物化学机制。

在广泛的光照和温度环境中，HOS1可以维持昼夜周期性 (HARMER,2009)。hos1缺失突变体表现出了更长的昼夜节律。考虑到HOS1使ICE1和CO不稳定，提出了HOS1靶定的生物钟成分的积累是突变体有着更长周期昼夜节律的原因。然而hos1突变体中生物钟基因的突变对生物钟周期几乎没有影响(SONG et al.,2010)，这表明HOS1不会影响生物钟成分的蛋白质丰度。类似地，缺失生物钟组分和HOS1基因的多种突变体表现出下胚轴伸长，与hos1缺失突变体类似(MACGREGOR et al.,2013)。因此在昼夜节律调节中的 HOS1功能中至少有一部分是独立于它的E3泛素酶活性的。

HOS1可以与核膜上的核孔复合体(Nuclear Pore Complex，NPC) (TAMURA etal.,2010；PARRY,2014)互作，NPCs可以调控核质之间mRNA的转运来调节基因表达。NPC-HOS1复合体促进生物钟基因的mRNA出核，研究表明hos1突变体的细胞核中多聚腺苷酸mRNA积累(MACGREGOR et al.,2015)。目前还不知道NPC-HOS1复合体是否调节细胞质中合成的生物钟基因转运到核中。很多缺失E3泛素连接酶的植物表型是由目标蛋白高水平累积引起的。尽管最近的研究表明HOS1促进生物钟基因的mRNA输出，但是HOS1仍有可能作为一个E3泛素连接酶来调节生物钟组分的蛋白质稳定性。

生物钟可以调节生长素信号反应而影响下胚轴生长 (COVINGTON et al.,2007；NUSINOW et al.,2011)。最近的一项研究表明，HOS1也可以通过调节生长素的生物合成控制下胚轴伸长。 hos1突变体表现出伸长的下胚轴，也是因为生长素生物合成相关基因的表达量增加了(DOWSON-DAY et al.,1999)。HOS1通过调节生长素信号的未知成分的蛋白量负向调控生长素合成基因(LEE et al., 2015b)。植物内源生长素在光照条件下可以使下胚轴伸长，黑暗中则抑制伸长(NOZUE et al.,2011)。至于具体HOS1如何调节生长素介导的下胚轴伸长当时还很模糊。

2017年研究提供了分子和生化证据证实了HOS1与下胚轴长度紧密相关(KIM etal.,2017a)。HOS1会抑制光敏色素相互作用因子4 (Phytochrome Interacting Factor 4，PIF4)的转录激活活性，从而抑制下胚轴伸长(WIGGE,2013)。HOS1对PIF4活性的抑制作用依赖于PHYB介导的光信号(KAMI et al.,2010)。同时也观察到PHYB 抑制下胚轴需要HOS1。然后有研究发现建立了一种不同的HOS1调节的PHYB信号通路来控制下胚轴生长，并解决了PHYB-PIF4如何调节拟南芥的发育过程的不确定性(HUQ et al.,2002；GARCIA et al.,2014；PARK et al.,2018)。光照条件下PHYB激活HOS1并促进其与 PIF4互作，抑制了PIF4的转录激活活性，从而抑制下游生长素合成基因的表达，促进光形态建成(HUANG et al.,2016b；KIM et al.,2017b； HUAI et al.,2018)。

在植物发育过程中HOS1参与调控低温反应，开花时间，下胚轴伸长和保持昼夜节律，表明HOS1作为信号整合因子联系着植物发育与胁迫反应，在调控低温反应、光形态建成和开花时间中发挥至关重要的作用，是很有潜力的作物工程育种目标。

进化分析表明HOS1蛋白存在于大多数陆生植物中(KOLLMAR, 2003；JUNG et al.,2014)。拟南芥和水稻中的HOS1基因只有一个，大豆中有两个拷贝，它们的HOS1蛋白结构域也是高度保守的。目前拟南芥中HOS1基因的研究较为全面，而大豆HOS1基因尚未见报道。鉴于两物种蛋白结构的相似性，我们猜测大豆HOS1有很多与AtHOS1 类似的功能，但大豆HOS1的调控机理是否与拟南芥有不同之处，是我们想要探究的问题。研究大豆中HOS1的功能也许会为揭示拟南芥大豆间，长日短日植物间的光形态建成及开花调控机制上的不同提供理论依据。生产上大豆作为重要的粮饲作物，目前国产大豆面临着诸多问题，亩产量低下，主要依赖于进口；大豆是典型的短日照植物，光照和温度是制约大豆推广和应用的重要因素之一，某一优质品种仅限于在特定的区域(纬度)内种植，严重制约了大豆品种推广和利用。

因此结合研究大豆光周期调控开花和响应温度胁迫，对选育适当生育期的耐低温优良品种向大豆主种植地东北地区推广具有重要的生产意义。

发明内容

本发明的第一方面，提供了一种分离的基因，其具有如下的核苷酸序列：

(1)SEQ ID NO.:1或3所示的序列或其互补序列；

(2)在严格杂交条件下与SEQ ID NO.:1或3杂交的序列；

(3)与SEQ ID NO.:1或3具有至少85％、90％、95％或99％同一性的序列；或

(4)由SEQ ID NO.:1或3所示的序列通过其中一个或多个核苷酸的缺失、置换、插入或添加而衍生所得到的序列。

本发明的第二方面，提供了一种分离的DNA分子，其包含所述的基因，该DNA分子具有GmHOS1a基因或GmHOS1b基因的生物学功能。

在一个优选例中，所述基因或所述的DNA分子，其中所述基因对应的CDS序列如SEQID NO.:5或6所示。

在一个优选例中，其中所述基因或所述的DNA分子包含选自下组的一种或多种突变体：Gmhos1a-ab1-1、Gmhos1a-ab1-2、 Gmhos1a-ab2-4、Gmhos1b-3-1、Gmhos1b-3-2、Gmhos1b-3-3、 Gmhos1b-3-4、Gmhos1b-3-5、Gmhos1a/b-1-1、Gmhos1a/b-1-2、 Gmhos1a/b-1-3、Gmhos1a/b-2-1，优选包含选自下组的一种或多种突变体：Gmhos1a-ab1-1、Gmhos1b-3-1、Gmhos1a/b-1-1。

本发明的第三方面，提供了一种重组载体，其包含所述基因或所述的DNA分子。

本发明的第四方面，提供了一种分离的蛋白质，其具有如下的氨基酸序列：

(1)SEQ ID NO.:2或4所示的氨基酸序列；

(2)由第一方面所述的基因编码的序列；或

(3)包含一个或几个氨基酸残基的置换和/或缺失和/或添加的 SEQ ID NO.:2或4所示的氨基酸序列。

本发明的第五方面，提供了一种宿主细胞，其包含第一方面所述的基因、第二方面所述的DNA分子、第三方面所述的重组载体或第四方面所述的蛋白质。

本发明的第六方面，提供了一种转基因植物，其包含第一方面所述的基因、第二方面所述的DNA分子、第三方面所述的重组载体或第四方面所述的蛋白质。

在一个优选例中，其中所述植物为单子叶植物或双子叶植物，优选为拟南芥或大豆。

本发明的第七方面，提供了第一方面所述的基因、第二方面所述的DNA分子、第三方面所述的重组载体或第四方面所述的蛋白质在调控植物开花时间和/或耐寒性中的应用。

本发明的第八方面，提供了一种培育转基因植物的方法，包括将第一方面所述的基因引入目的植物以获得转基因植物，从而调控所述转基因植物的开花时间和/或耐寒性。

在一个优选例中，进一步包括获得所述转基因植物的种子。

在一个优选例中，其中所述转基因植物中GmHOS1a基因和/或GmHOS1b基因发生突变；优选地，所述转基因植物中GmHOS1a基因和GmHOS1b基因均发生突变。

本发明的第九方面，提供了一种调控植物开花时间的方法，包括将第一方面所述的基因、第二方面所述的DNA分子、或第三方面所述的重组载体引入植物中以使其在植物中表达。

在一个优选例中，其中所述植物中GmHOS1a基因和/或GmHOS1b 基因发生突变，以提前所述植物的开花时间；优选地，所述植物中 GmHOS1a基因和GmHOS1b基因均发生突变，以提前所述植物的开花时间。

本发明的第十方面，提供了一种调控植物耐寒性的方法，包括将第一方面所述的基因、第二方面所述的DNA分子、或第三方面所述的重组载体引入所述植物中以使其在植物中表达。

在一个优选例中，其中所述植物中GmHOS1a基因和/或GmHOS1b 基因发生突变，以增加所述植物的耐寒性；优选地，所述植物中 GmHOS1a基因和GmHOS1b基因均发生突变，以增加所述植物的耐寒性。

本发明的第十一方面，提供了一种生产转基因植物的方法，所述转基因植物包含引入的第一方面所述的基因、第二方面所述的DNA 分子、第三方面所述的重组载体或者其重组表达第四方面所述的蛋白质，包括获得所述转基因植物的种子，并种植所述种子以获得所述转基因植物。

附图说明

图1显示了HOS1进化树分析和蛋白结构域分析。A.HOS1进化树分析。B.HOS1氨基酸序列比对。C.HOS1蛋白结构示意图，灰色矩形代表环指结构域，蓝色矩形代表ELYS结构域。

图2显示了GmHOS1s表达的组织特异性分析。A-B.GmHOS1a 和GmHOS1b在大豆不同组织中的表达情况。

图3显示了GmHOS1s表达模式分析。A-B.GmHOS1a和 GmHOS1b在中日照条件下的表达模式。

图4显示了GmHOS1a与GmHOS1b亚细胞定位分析。GmHOS1s 蛋白亚细胞定位，RFP为核定位标记，标尺为2μm。

图5显示了农杆菌介导大豆发状根验证载体工作效率。A.GmHOS1a-1、2位点测序峰图。B.GmHOS1b-1、3位点测序峰图。 C.GmHOS1a/b-1、3位点测序峰图。

图6显示了已获得Gmhos1a和Gmhos1b纯合突变体。 A-B.Gmhos1a和Gmhos1b纯合突变体。

图7显示了已获得Gmhos1a/b纯合突变体和非纯合突变体。 A.Gmhos1a/b纯合突变体。B.Gmhos1a/b非纯合突变体编辑情况。

图8显示了短日照条件下Gmhos1a和Gmhos1b突变体无开花表型。A.短日照条件下，WT，Gmhos1a和Gmhos1b突变体的表型。B.WT， Gmhos1a和Gmhos1b突变体的开花时间统计，采用Student’s t-test 方法检验开花表型差异性。

图9显示了长日照条件下Gmhos1a和Gmhos1b突变体早花。A.长日照条件下，WT，Gmhos1a和Gmhos1b突变体的表型。B.WT， Gmhos1a和Gmhos1b突变体的开花时间统计，采用Student’s t-test 方法检验开花表型差异性(**P<0.01)。

图10显示了短日照条件下，Gmhos1a/b突变体早花。A.短日照条件下，WT和Gmhos1a/b突变体的表型。B.WT和Gmhos1a/b突变体的开花时间统计，采用Student’s t-test方法检验开花表型差异性 (**P<0.01)。

图11显示了长日照条件下，Gmhos1a/b突变体早花。A.长日照条件下，WT和Gmhos1a/b突变体的表型。B.WT和Gmhos1a/b突变体的开花时间统计，采用Student’s t-test方法检验开花表型差异性 (**P<0.01)。

图12显示了短日照条件下，GmHOS1s过表达晚花。A.WT和 GmHOS1s过表达株系中GmHOS1s表达量的检测。B.短日照条件下， WT和GmHOS1s过表达株系的表型。C.WT和GmHOS1s过表达株系的开花时间统计，采用Student’s t-test方法检验开花表型差异性(** P<0.01)。

图13显示了长日照条件下，GmHOS1s过表达晚花。A.长日照条件下，WT和GmHOS1s过表达株系的表型。B.WT和GmHOS1s 过表达株系的开花时间统计，采用Student’s t-test方法检验开花表型差异性(**P<0.01)。

图14显示了GmHOS1s可以与GmCOs相互作用。-表示缺陷；L：亮氨酸；W：色氨酸；H：组氨酸；A：腺嘌呤。

图15显示了GmHOS1s不与GmELF3s和GmCOP1s发生互作。

图16显示了Gmhos1s突变体影响开花基因的表达。A-F.Gmhos1s 和WT中GmCCA1a、J、E1、GmFT4、GmFT2a和GmFT5a的表达情况。

图17显示了GmHOS1s过表达中开花基因的表达模式。 A-D.GmHOS1s过表达和WT中GmE1、GmFT4、GmFT2a和GmFT5a 的表达情况。

图18显示了Gmhos1s突变体的下胚轴表型。A.长日照条件下， WT和Gmhos1s突变体的下胚轴表型。B.WT和Gmhos1s突变体的下胚轴长度统计，采用Student’s t-test方法检验差异性(*P<0.05， **P<0.01)。

图19显示了低温处理前(A)后(B)Gmhos1s的相对电导率变化。A.低温处理前Gmhos1s和WT的相对电导率变化。B.低温处理后Gmhos1s和WT的相对电导率变化。

图20显示低温处理Gmhos1s突变体耐冷基因的变化。A-D.比较低温前后Gmhos1s突变体和WT中低温相关基因的转录表达量，采用Student’s t-test方法检验差异性(*P<0.05，**P<0.01)。

具体实施方式

下列定义和方法被提供来更好地定义本发明和在本发明的实施中指导本领域技术人员。除非另外指出，否则将根据相关领域技术人员常规使用的含义来理解术语。

如本文中所用，术语“DNA”、“DNA分子”、“核酸分子”是指基因组或合成来源的双链DNA分子，即脱氧核糖核苷酸碱基的聚合物或核苷酸分子，从5'端(上游)至3'端(下游)阅读。

如本文中所用，术语“DNA序列”、“核苷酸序列”和“多核苷酸序列”是指通常从5’'(上游)末端至3’'(下游)末端显示的 DNA分子的核苷酸的序列。

分离的基因

GmHOS1a基因或GmHOS1b基因

本发明的第一方面提供了一种分离的基因，其具有如下的核苷酸序列：(1)SEQ IDNO.:1或3所示的序列或其互补序列；(2)在严格杂交条件下与SEQ ID NO.:1或3杂交的序列；(3)与SEQ ID NO.:1 或3具有至少85％、90％、95％或99％同一性的序列；或(4)由SEQID NO.:1或3所示的序列通过其中一个或多个核苷酸的缺失、置换、插入或添加而衍生所得到的序列。

本发明的第二方面还提供了一种分离的DNA分子，其包含所述的基因，该DNA分子具有GmHOS1a基因或GmHOS1b基因的生物学功能。

在一个具体实施方式中，所述基因或所述的DNA分子，其中所述基因对应的CDS序列如SEQ ID NO.:5或6所示。

在一个具体实施方式中，其中所述基因或所述的DNA分子包含选自下组的一种或多种突变体：Gmhos1a-ab1-1、Gmhos1a-ab1-2、 Gmhos1a-ab2-4、Gmhos1b-3-1、Gmhos1b-3-2、Gmhos1b-3-3、 Gmhos1b-3-4、Gmhos1b-3-5、Gmhos1a/b-1-1、Gmhos1a/b-1-2、 Gmhos1a/b-1-3、Gmhos1a/b-2-1，优选包含选自下组的一种或多种突变体：Gmhos1a-ab1-1、Gmhos1b-3-1、Gmhos1a/b-1-1。

本发明的基因GmHOS1a和GmHOS1b，是拟南芥HOS1在大豆中的同源基因，在大豆Williams 82中的核酸序列分别对应于 Glyma.01G207400和Glyma.11G035800(参考https://phytozome.jgi.doe.gov)，其氨基酸序列分别对应于I1J9T6和I1LGS7(UniProtKB)。GmHOS1a位于1号染色体，其基因组序列共6429个核苷酸，CDS序列共2886个核苷酸；GmHOS1b位于11 号染色体，其基因组序列共6521个核苷酸，CDS序列共3093个核苷酸。GmHOS1a与GmHOS1b具有高度相似性。

GmHOS1a(Glyma.01G207400)的核酸序列如SEQ ID NO.:1所示：

CCATTCTGTAAGGAGTTTTCCCCTCTACGAGACAGAGTCGT TCCAAGCAGGGACGCGTCCCTTCACTGAGTACAAATAAATCTGA ACCGTTTGAAAATCTCGCACCTAATTTCTCAGTGTTTGAGAAAA TCTCTCTCAGTTCTCCGTTTGGTTATTATCTCTGAGAAATGGATA AGAGGCTCAATGGACCCACCGTTTCGTCCAGCTCTAACGGCGGC TCCGCCGTGGGACGATCTTCTCCTACGCTTCAACCAAACTACAG TAGCCGATTAGTTCAGGTACACTCACTCATCCTCTCAATTTTAA GTTCCGCACTTGCTGAGCTACTTCATAAACCCTAGCTGCCTGTC ACTAACGCAGTGTTTGGTTGAAACTTTTATATTTAAATGGTTTG CTGCTTGCGTCATGTTTGCTTCAATATGTGCATTGTGTGTTTGAGTCTAATTCTTATCACTAGTTTGGGTTTTTTCATTGTAATCGTGGG TTTTGTGGCGTGGGAATTTGTTAAGCGAGATAATGATCTGTGAA TTAACCTCATAAAGTGAGTGTTTGTCATGTGCTGGACTTACTCA TAATTTTGGTTTTATGAATCATGCATCCTAGTTATGTCAATTTCT TTGCTAGTTTGTTTGGTTGGCATTTCAGTCTATGCAAAATTGAATTTATGCTGGACTGGTAAGTTTAAAAATGAATTATTTGTTGTGGG TTTGTGGTGTGGGAACTTGTTATGGTGAGATAATGACCTGTGAG TTAATCTGATAAAGTGAATGCTCGGCATTTGCTGTTCTGATTCA TAATTTTGATTTTATGAATCATGCATCCTAGTTATTTATGTCAAA GGCTTCATTTGGTTGGTATTTCAGTCTGATGCTGGAAAATTAAA AGATTGAATTTGTTCTCTAAATGAGTTAATTTTCATGTTACTGAT GCAGGCTAGAAGTTAGCATTTCATATTTGTGAAATTTATAACTA CTGTATTGCTAAAATAATAGGAAAGAAATGGTTTGTGACATTTG ATTTCAGGAAGCATTGGAACACTTGGCATCCATTGATCTGATTG AGTTGTGCAAAGAAGCCAAAGTTGAGCGCTGCCGAGCAACTCG AGACTTGAGAAGCTGTGGTCGCTATGTCCACCATGTCTTGAATT CATGCGGACATGCCTCTTTATGTGAAGAATGTAGCCAACGGTGT GATATCTGCCCAATTTGTAGAATCCCAATTTCAAAAAGTGGTGC TAAAGTGCATCTTCGACTTTATTATGAATGCATAGAAGCAGGCC TTATTTCGAAAAGGTGTGATGAGAGGTTTCAAGAAATAGAAGA TGGGGACAAACAACTAACTGCTGACGTACAGCGCCTTTATTCTC TGTTTGACGTTGCACTTGAGAATAACTTGGTTTCTTTAATTTGCC ACTGTATCCTTTTCTACATCAGTCATTTTCTTGGCATATTTTATTT TATTATTAATTTACTTATTAAAATTTTAAATATAAATACTTGTCA ATTGGTAAGTAAAGTTATATGATAAGGCTTTGTCTCAGTAATGT TATCACCTGAGAAAATTAAGTTGGTTTTTCTTCTTTATCCTCCCA TTTTTCTTATTTGTCCTATTGCCCCCTTGTCTCCACTTTTGCATTT TCTTGACCTGAAATTTTACAGACATCACAGATGTATGTATGGAT GAAACTGCTGTTTCCAGTGATCCTGTCATTGCATTTTTGTTGGAT GAAGTGGTAGTGAAGGATTGGTGCAAGAGGACATTCAAAAACA TCATTGCTGAACTGCAGGGAATTTGTATCCTTAAACCTTGTTTTT TTGTTGATATCTAAAGCTAATTATTAGTATGACCTTTTTCCATAA TTATATTTGTTCTCCCTAACAATTTTCACTAGATAATATGGACAT TTTAGGCTTGAAAGAGAGATTGAGTTTACTTCTGAAATTTTCAT TATACTTGAAGGGCATATCAAATGTGCTAGACATTTTGGAGTCA TCTTTTAAGGGTACTCTTTCAGCACAACTTCACGATTTGCAGAA TCTCCAAGAGAGCATCATGAAGACAAAGCAGGTTTGGTTTTGCA AGAATTCATGTTCAATGGAGTCATTGCTTAACCGTTATGATTTTT GCATTAATATTTGATTTTTGACACATTTCTTGCTTGGCTGATGTG CTGCCAAGTGTCAAGTCATCACAATAAATTCGTACATATTATCT ATTTTTTAAATGATTCTGTGTGATTTTTGTTGGAAGGGGCTTTAT ACCTAATCTTCAAAAGTGTTGATGACAATGGGTAACCTTTGTTG TTGTAGTTCACTATGATGAAGTATATAAGAGGGACGTTTGTAGA AATGACTGTTATTTGGCCTTGCACTTTAATTAATATTGCTTATAA AGAGTGGTTTGCTGGATTTAGTCTTCCTCTATCTGTCTGTATGTA GCTCCAAAATTAGAGTAGCTCATTGCAATCTTCATCCTGGTGTT TAATTTTTGTTGTTTTACCCAGCATATGGATGTTATTATTTGGTG TACGAGACATCAATTTTTGGAAGATGTGAGATCACGTTTTACTG ATAGTTCGTCATGGTCATCAGTTGTTCGGACAAGGAAATCAGAA GCAATTAGACGTGCTTGGCCTGATCCAATAAATCAATCTGTGGA GTCATCAGGACATGATGGGTCTCTATTTATTGAAGATGCAATGA ATAATCTTGATCTGGAGGAGGGGTTTAGGAATGAAATTGTAGAGGGATTGGAAATTGCATCCTTGCAGAAGGACAGTGAATCATTTT TGGGGTCAAATACTGATCAGATTCTGGGTTACTATCCCTTCAAA AATCTTCGTTCTGCTGTTGACTTGCTCTTTTTACGTGGAGGCTCT GATATGGTGATTGCAAAACAGGCCATTGTATCCTTTTACTCCTA 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AAAAGAATTTCAATAAAACAGCATCTGGGAATACTTCTGAGAA GCAAAAAGGTCAATGTAATAAGTGGGTGGAGTGGATGGAGGTC CTGGTGACTGAGATTTGTTGCCTCTGTATTAGGAGGAACTTGGT GGATCGAATGCTAGAATTGCCATGGAATTCTGAGGAAGAGAAG TATATACATAAATGTCTTTTGGATTATGCTATTGAAGACCCTTTA AGGACAACAGGAAATCTACTTGTTGTGTATTATTTTCAGGTACT TAATTTCAATAGCTGGTTCCATGTCTGACATTGATTCTCATGTTT TATTGATCTTGTTAGTCAATTAGTCTTACAGTCTTTTCAGTTTAT ACTTTGGAATCTTGTAAATATGTTAATTTGCTACCCAAAGTTGA ATTCTGTTCCATATAATGCATATGATACACCACCATCACCTATTT TACTTAGCTTATCTTTGATAGCAAACAATTCCTCCTTCATCTATC TTAACATCTACCATCTTCATATCTTGGCTTGCATACTGATGTGAT ATTTTGTTTCCAAAGCTTAGTAGATACTAGATCCTAATATCAAT GTGAATATATATACATACCTCACTTTCCTATTCGGTTACCATTTC CGTTGTAAATTGATATGAACTTTATTTTGCTTCTTAAAATGTGTC ACGGTAATTTAGCATATCCTTGATGATAGTATTTCATTTTGAGG AAAATGTGAAAAAATTTCTGGCTAATATATTTATCTGGGTTTCA GCGCCACAGATACTCTGAAGCATATCAAGTTCATATTAAACTTG AAAAGGCGGAGCAAGATTGCATTTCAAAAGGTTCCGTAAGTCA ACAAAATCTGCCAGTATTAGAGAAGGCTATTCACTTCAGAGCCA ATTTGATTGTAAGTGATTTAAAATCTTTAATTTTGAAGCAAATGTTTTGTTCCACAAACATTTTATCCTTGGATCATGACAGGCATTA GTTACTTTTATGATGTCTAGCAGTTGCAAAGTTTCCAATGCTAA TTTTTTAAAATAAATTAAATGGACTCTTATTTATTATTTAACATG TTTGGAGAACACTGTTGGTCTTAGACTGAATTTGTGGACGATTT ATGTTTGAATAAAACAGAATAGATGCTTGGAATTGTTGCCAGAA GTTGAGCAGCAGCAACTGAGGAGCGGAAACTTGACTGAAGGTG TTGTTACTTCTTGTGAAGAAGTTGAAATTCCTGACAAATTTGAC GTTCCTCAGATTCAGGATTTCTTGTCAACCAGTTTATTGATTCCT TCATCTGTAAATTCTTCCTTGATGTTGCATAAAGATCATCCAACT GGCTTGTTGAGTTCATTGACTTTAGGAACATCAGCCAAAATAGG CATGTCTTTCCCTACTACTGGCACTGAGCTAGGTAATTTTGGTTC CTTATCATACCATCATGATGGGTTATTTACAAATAATGAGAGGG TTCCAAGTCATCAACGTAAAATTGGTAAAAATCTAAGAAATGAT AACTCTCCAACTCCTAGGAATCATAGGATCCGTTTCATGAATGG TTCACCCCTGAAGGGATTTACCAGGACATCACCAAGCAATTCCC AGGAGAATAGGCCGGACAAAATCTCGCCTGGAGTTGAACAAAA TAATCAAACTACCAGTCCTATGGAATCCTGGAAGGCTACAGTTA ACCCTGTTACTAGATCCACACTTAGCTATCCTAAAGAATTTGCA AATGATCTCTCAAATGTATCTAGTAAGAATGTCCAATCACATAA AGATGAAAGAAGTTGGAACATGGGGTCCACTAATGATCCAATG GATGTTTCTCGGAGGTAAGAATCTAATAACCCATTTCTTTCGCT CATTGCTTTTGTTCATATTACCTGTTTTGTATAATTTTCGTGTAT AAGAATATCCATGTGCCTTGATTTAATGCTTCTTAATGTTCACC AAAAAGGGTATAATATTTTTGTAAACTGAATCCTTTTGTGTACT TCATTTCTTTATAGCCTTGTAGATAATAAATTAAATACTGAAGA AAACATCAAGGGTGCACCTAGATGGAGATCTGATGATGCGAGT GATGAGGAAGATGATCGGGATGTGGGAAGAGCAATGGATATAG CTTATTATTCAACTCCTCCAACTCAGATGACAAGACGAAGCAGA GTTTCCAGGAGATGAAAACTCAACTTTTTGGTGAAAGGTTTCTG GAAATTTATGTGAAGAAACAAGAAAATACGTATGTTAAAGGGT TGTTTTTGAAATGAGAGCTTCGCTTTTTTGAAACTCGGGAGTTTT AACGCCGGTGTCTGTTGTGCAGCTAATATTCAATGAAGAAAATT TTAATGTTAAAGGTGCATTTTTGTATCCTTTTCCTTCAATGAATC AATGTTAGTCCAAAGTTTTTAATATTTTCTAGTTTTGGAGAATG ATTCATTTAAAATGATTTTTTTGAGCAAATTCAAAGGTTGTTTCA TTTGGCAGTATCTTTCAATTTCGTCCTAGTAAATGATCTATCTGG GAGGTCGAGTTCACAT(SEQ ID NO.:1)

GmHOS1a的CDS序列如SEQ ID NO.:5所示:

ATGGATAAGAGGCTCAATGGACCCACCGTTTCGTCCAGCTC TAACGGCGGCTCCGCCGTGGGACGATCTTCTCCTACGCTTCAAC CAAACTACAGTAGCCGATTAGTTCAGGAAGCATTGGAACACTT GGCATCCATTGATCTGATTGAGTTGTGCAAAGAAGCCAAAGTTG AGCGCTGCCGAGCAACTCGAGACTTGAGAAGCTGTGGTCGCTATGTCCACCATGTCTTGAATTCATGCGGACATGCCTCTTTATGTG AAGAATGTAGCCAACGGTGTGATATCTGCCCAATTTGTAGAATC CCAATTTCAAAAAGTGGTGCTAAAGTGCATCTTCGACTTTATTA TGAATGCATAGAAGCAGGCCTTATTTCGAAAAGGTGTGATGAG AGGTTTCAAGAAATAGAAGATGGGGACAAACAACTAACTGCTG ACGTACAGCGCCTTTATTCTCTGTTTGACGTTGCACTTGAGAAT AACTTGGTTTCTTTAATTTGCCACTACATCACAGATGTATGTATG GATGAAACTGCTGTTTCCAGTGATCCTGTCATTGCATTTTTGTTG GATGAAGTGGTAGTGAAGGATTGGTGCAAGAGGACATTCAAAA ACATCATTGCTGAACTGCAGGGAATTTATAATATGGACATTTTA GGCTTGAAAGAGAGATTGAGTTTACTTCTGAAATTTTCATTATA CTTGAAGGGCATATCAAATGTGCTAGACATTTTGGAGTCATCTT TTAAGGGTACTCTTTCAGCACAACTTCACGATTTGCAGAATCTC CAAGAGAGCATCATGAAGACAAAGCAGCATATGGATGTTATTA TTTGGTGTACGAGACATCAATTTTTGGAAGATGTGAGATCACGT TTTACTGATAGTTCGTCATGGTCATCAGTTGTTCGGACAAGGAA ATCAGAAGCAATTAGACGTGCTTGGCCTGATCCAATAAATCAAT CTGTGGAGTCATCAGGACATGATGGGTCTCTATTTATTGAAGAT GCAATGAATAATCTTGATCTGGAGGAGGGGTTTAGGAATGAAA TTGTAGAGGGATTGGAAATTGCATCCTTGCAGAAGGACAGTGA ATCATTTTTGGGGTCAAATACTGATCAGATTCTGGGTTACTATC CCTTCAAAAATCTTCGTTCTGCTGTTGACTTGCTCTTTTTACGTG GAGGCTCTGATATGGTGATTGCAAAACAGGCCATTTTTCTGTAT TATTTATATGATCGCCACTGGACAATTCCTGA AGAAGAATGGAGATACATACTTGAGGACTTTGCTGCTACATTTAGTATTAGCAGGC ACTCATTACTTGAATCTTTGACTTTTTACCTTCTGGATGATCACA CAGAGGAGGCTTTACAGGAAGCTTGTCGCCTTCTTCCTGAAATA ACTGGCTCAACATCACATCCTAAAATTGCTGAAGTACTATTAGA AAGGGGTAGCCCTGATACAGCTCTCATGGTTTTGAGGTGGGCTG GGCGGGATGGTGGACCTCACGTGACTTCACTCAGAGATGCTGTC ACTGCAGTGCGGGTGAGGGTTGAGTGTGGGCTTCTGACTGAAG CATTTATGCATCAGAGAATGCTCTGCACCAAAGTGAAGGAAAA GAATTTCAATAAAACAGCATCTGGGAATACTTCTGAGAAGCAA AAAGGTCAATGTAATAAGTGGGTGGAGTGGATGGAGGTCCTGG TGACTGAGATTTGTTGCCTCTGTATTAGGAGGAACTTGGTGGAT CGAATGCTAGAATTGCCATGGAATTCTGAGGAAGAGAAGTATA TACATAAATGTCTTTTGGATTATGCTATTGAAGACCCTTTAAGG ACAACAGGAAATCTACTTGTTGTGTATTATTTTCAGCGCCACAG ATACTCTGAAGCATATCAAGTTCATATTAAACTTGAAAAGGCGG AGCAAGATTGCATTTCAAAAGGTTCCGTAAGTCAACAAAATCTG CCAGTATTAGAGAAGGCTATTCACTTCAGAGCCAATTTGATTAA TAGATGCTTGGAATTGTTGCCAGAAGTTGAGCAGCAGCAACTG AGGAGCGGAAACTTGACTGAAGGTGTTGTTACTTCTTGTGAAGA AGTTGAAATTCCTGACAAATTTGACGTTCCTCAGATTCAGGATT TCTTGTCAACCAGTTTATTGATTCCTTCATCTGTAAATTCTTCCT TGATGTTGCATAAAGATCATCCAACTGGCTTGTTGAGTTCATTG ACTTTAGGAACATCAGCCAAAATAGGCATGTCTTTCCCTACTAC TGGCACTGAGCTAGGTAATTTTGGTTCCTTATCATACCATCATG ATGGGTTATTTACAAATAATGAGAGGGTTCCAAGTCATCAACGT AAAATTGGTAAAAATCTAAGAAATGATAACTCTCCAACTCCTAG GAATCATAGGATCCGTTTCATGAATGGTTCACCCCTGAAGGGAT TTACCAGGACATCACCAAGCAATTCCCAGGAGAATAGGCCGGA CAAAATCTCGCCTGGAGTTGAACAAAATAATCAAACTACCAGT CCTATGGAATCCTGGAAGGCTACAGTTAACCCTGTTACTAGATC CACACTTAGCTATCCTAAAGAATTTGCAAATGATCTCTCAAATG TATCTAGTAAGAATGTCCAATCACATAAAGATGAAAGAAGTTGGAACATGGGGTCCACTAATGATCCAATGGATGTTTCTCGGAGCC TTGTAGATAATAAATTAAATACTGAAGAAAACATCAAGGGTGC ACCTAGATGGAGATCTGATGATGCGAGTGATGAGGAAGATGAT CGGGATGTGGGAAGAGCAATGGATATAGCTTATTATTCAACTCC TCCAACTCAGATGACAAGACGAAGCAGAGTTTCCAGGAGATGA (SEQ IDNO.:5)。

GmHOS1a氨基酸序列如SEQ ID NO.:2所示:

MDKRLNGPTVSSSSNGGSAVGRSSPTLQPNYSSRLVQEALEHL ASIDLIELCKEAKVERCRATRDLRSCGRYVHHVLNSCGHASLCEEC SQRCDICPICRIPISKSGAKVHLRLYYECIEAGLISKRCDERFQEIED GDKQLTADVQRLYSLFDVALENNLVSLICHYITDVCMDETAVSSD PVIAFLLDEVVVKDWCKRTFKNIIAELQGIYNMDILGLKERLSLLL KFSLYLKGISNVLDILESSFKGTLSAQLHDLQNLQESIMKTKQHMD VIIWCTRHQFLEDVRSRFTDSSSWSSVVRTRKSEAIRRAWPDPINQS VESSGHDGSLFIEDAMNNLDLEEGFRNEIVEGLEIASLQKDSESFLG SNTDQILGYYPFKNLRSAVDLLFLRGGSDMVIAKQAIFLYYLYDRH WTIPEEEWRYILEDFAATFSISRHSLLESLTFYLLDDHTEEALQEAC RLLPEITGSTSHPKIAEVLLERGSPDTALMVLRWAGRDGGPHVTSL RDAVTAVRVRVECGLLTEAFMHQRMLCTKVKEKNFNKTASGNTS EKQKGQCNKWVEWMEVLVTEICCLCIRRNLVDRMLELPWNSEEE KYIHKCLLDYAIEDPLRTTGNLLVVYYFQRHRYSEAYQVHIKLEK AEQDCISKGSVSQQNLPVLEKAIHFRANLINRCLELLPEVEQQQLRS GNLTEGVVTSCEEVEIPDKFDVPQIQDFLSTSLLIPSSVNSSLMLHK DHPTGLLSSLTLGTSAKIGMSFPTTGTELGNFGSLSYHHDGLFTNN ERVPSHQRKIGKNLRNDNSPTPRNHRIRFMNGSPLKGFTRTSPSNS QENRPDKISPGVEQNNQTTSPMESWKATVNPVTRSTLSYPKEFAN DLSNVSSKNVQSHKDERSWNMGSTNDPMDVSRSLVDNKLNTEEN IKGAPRWRSDDASDEEDDRDVGRAMDIAYYSTPPTQMTRRSRVSRR(SEQ ID NO.:2)。

GmHOS1b(Glyma.11G035800)序列如SEQ ID NO.:3所示:

ATGAAGAAAAAGAAAAACAAAAAAGCGTTTCAAAAACCCT CCAATTCCAATCTGTATGGAGTTTTTCCCTCTACGAGACACAGA GTTGTTCCGAGTACAAATAAATCTGCACCGTTTAATAATCTCGC ACCTCATTTCTCAGTGCTTGATCAAATCTGTCTCAGTTCTCCGTT TGGTTATTATTTCTCAGTAATGGATAGGAGGCTCAACGGACCCACCGTTTCGTCCAGCTCCAACGGCGGCCCCGCCGTCGGACGATCT TCTCCTACGCTTCAACCAAACTACAGTAGCCGATTAGTTCAGGT ACTCATTCTTGTGTCAATTTTAAGTTCCGCCACTTGCTGAGCTAC TTCATAAACCCTAGCTGCATGTAACTGACGTAGTGTTTGGTTGA AATTTTTATATTTGAATGCTGTGCTGCTTGAGTTATGTTTGCTTC AACATGTGAATTGTGTGTTTGAGTTTAATTCGCCTTACTAGTTTG GATCTTTTTCGTTGTAATAGTGTGTTTTTGTGGTGTGGTAATTTG TTAAGTGACATAATGATCTGTGAATTAACCTCATAAAGTGAGTG TTTGGCTTGTGCTGGACTTACTCATAATTTTGTTTTTGTGAATCA TGCATCCTAGTTATGTCAATGTCTTTGTTAGTTTGTTTGGTTGGCATTTCAGTCTGAATTCTTATTGTGCCTGTTCTGATTCTGGAAAGC CCACAATTGAATTTATGCAGGAAAATTTTAAAAATGAATTATTA GTTGTGGGTTTGTGGTGTGGGAGCTTGTTATAGTGACTGATAAA GTGAACGCTTGGCATCTGCTGTTCTGATTCATAATTTTGATTTTA TGAATCATGCTTCCTAGTTATTTATATCAAAGGCTTCATTTGGTTGGCATTTCTGTTTCATTCTGAATACTTATTGTGCCTTGTTTGATG CTGGAAAATTAAAAGATTGAATTTGTTCTTGGGTTAATTTGCAT GTTACTGATGCAGGATAGAAGTAGGATAGAAGTTAGCATTTGA TATTTGTGAAATTTATAACTACTGTATTGATTAAATAATAGGAA AGAAAGATGTTTGATTTCAGGAAGCATTGGAACACTTGGCATCC ATTGATCTGATTGAGTTGTGCAAAGAAGCCAAAGTTGAGCGCTG TCGAGCAACTCGAGACTTGAGAAGCTGTGGTCGCTATGTCCACC ATGTCTTGAATTCCTGCAGACATGCCTCTTTATGCGAAGAATGT AGTCAACGGTGTGATATCTGCCCAATTTGTAGAATCCCAATTTC AAAAAGTGGTGCTAAAGTGCATCTCCGACTTTATTATGAGTGCA TAGAAGCAGGCCTTATTTCCAAAAGGTGTGATGAGAGATTTCAA GAAAGAGAAGATGGGGAGAAAGACCTAACTGCTGATGTACAGC GCCTTTATTCTCTGTTTGATGTTACACTTGAGAATAACTTGGTTT CTTTAATTTGCCACTGTATCCTTTTCTACATCAGTCCTTTTATTG GCATATTTTATTTTATTATTAATTTACTTATTAAAATTTTAAATA TAAATACCTGTCAATTGGTAAGTAAAATTATATGATAAGGTTTT GTCTCATTAATGTTATCACCTGAGAAACTTAGGTTTTTTTTTCTT CTTTATCCTCCCAATTTTCTTATTGGTCATATTGTTCTGTCTGTCA CTTGTCTCCGCTTTCGCATTTTCTTGACCAGAAATTTTACAGACA TCACTGATGTATGTATGGATGAAACTGCTGTTTCCAGTGATCCT GTCATAGCATTTTTGTTGGATGAAGTGGTAGTGAAGGATTGGTG CAAGAGGACATTCAAAAACATCATTGCTGAACTGCAGGGAATT TGTATCCTTAAACCTTGTTTTATTGTTGATATCTAAAGCTAATTA TTAGTATGACGTTTTTTCCATAATTATGTTTGCACTCCATGACAA TTTTCACTAGATGATATGGACATTTTAGGCTTGAAAGAGAGATT GAGTTTACTTCTGAAATTTTCATTATACTTGAAGGGCATATCGA ATGTGCTAGACATTTTGGAGTCATCTTTTAAGGGTACTCTTTCA GCACAACTGCACGATTTGCAGAATCTCCAAGAGAGCATCATGA AGACAAAACAGGTTTGGTTTTGCTAGAATTCATGTTCAATGGAG TTATTGCATAACTGTTATGATTTTTGCATTAATATTTGATTTTTG ACCCATTTCTTGCTTGGCTGATGTGCTGTCAAGTCATCATGATA AATTTGTACATATTATCTATTCTTTTAATGGTATTGCTATTGTTT TTGTGCATTGTGTTCTTCAAATGATTCGGTGTGATTTTTGTTGGA AGGGGCTTTATACCCAATCTTCAAAAGTGTGGATGAGTATGGGT AACCTTTGTTGTTGTTCGCTATGATGAAGTGTGTAAGAGGGATG CTTGTAGAAATGACTGATAGTTGGCCTTGCACTTTAATTAATTG CTTATAAAGAGTGATTGGCTGGATTTAGTCTTCCTCTATCTGTCT GTCTGTAATAGAGTTTGATAAACTCTGATTTCTCATTGATCAAG AAAAAGAAAGACTAACTATCAGTCATCTCTATATATAGCGAGA CTAACTGTTAACTAACCCAATCTGTTAGTAACTAAATACTTACT CTAATATAGCTCCAAAAATTAGAGTAGCTCATTGCAATCTTCAT CCTGGTGTTTAATTTTTGTTTTTGTTCTACCCAGCATATGGATGTTATTATTTGGTGTACAAGACATCAATTTTTGGAAGGTGTGAGGT CACGTTTTACTGATGGTTCATCATGGTCATCAGTTGTTCGGATA CGAAAATCAGAAGCAATTAGACGAGCATGGCCTGATGCAATAA ATCAATCTGTGGAGTCACAAGGACATGATGGGTCTCTATTTATT GAAGATGCATTGAATAATCTTGATCTGGAGGAGGGGTTTAGGA ATGAAATTGTAGAGGGATTAGAAATTGCATCCTTGCAGAAGGA TAGTGCATCATTTTTGGGGTCAAATACTGATCAGATGCTGGGTT ACTATCCCTTCAAAAATCTTCGTTCTGCTGTTGACTTGCTCTTTT TACATGGAGGCTCTGATATGGTGGTTGCAAAACAGGCCATTGTA TCCTTTTACCCCCAAATTTTATTGTGGGTGTAGAACTGTGTTTGT TTCTGTTAATAATAGTTATTAAGTTGAAGCAATACTTATTTCATT CCTTAACATCTGTAGTTTCTGTATTATTTATATGATCGCCACTGG ACAATTCCTGAAGAGGAATGGAGATACATACTGGAGGACTTTG CAGCTACATTTAGTGTTAACAGGCACTCATTACTTGAGTCTTTG ACTTTTTACCTTCTGGATGATCACACAGAGGAGGCTTTACAGGT AACGCCAACAAAATATTATGCCCAATGAGTCTTGAGGAGCTCGT ATATCCTGGTCTTAATATTTTTTTAATCTATTTGTGTCAAGGTTG CTTTACTGGTATTCCTTTTACTTCTGACTAATGATAATCATTATA TTCAACTAGGAAAAAATATCAGGACCATTTGGTAATAGTTATAT TGGGATCTTATATGTGACCCTGAAAATAAAGCAGTAAAGATGT AATTAGGCTTTAGTTTTAGGTGTTATTTGGGTCTTTCTTTCATCT CTTCGTTATCTTGTTTTCACTGAAAGTAAAAAGTGGCATTTAAT AATAACACCAAGAGTCTCCTCTTCCCCATATAAGGCATGTGATC TTGTTTTTGTGGCAACTTAGTATTTGATGTTACTTAATGCAAACC TGTTCCTTTTAGAGTAATATTATTGATTTATTTATTATCCTGTTA GGAAGCTTGCCGCCTTCTTCCTGAAATAACTGGCTCAACATCAC ATCCTAAAATTGCTGAAGTACTATTAGAAAGGGGTATCCCTGAT ACAGCTCTCATGGTCTTGAGGTGGGCTGGGCGTGATGGTGGACC TCACTTGACTTCACTCAGAGATGGTGTCACTGCAGTGCGGGTGA GGGTTGAGTGTGGGCTTCTGACTGAAGCATTTATGCATCAGAGA GTGCTCTGCACCAGAGTGAAGGAAAAGAATTTCAATAAAACAG CATCTGGGAATACTTCTGAGAAGCAAAAAGGCCAATTTAGTAA TTGGGTGGAGTGGGTGGAGGTCCTGGTGACTGAGATTTGTTGCC TCTGTATTAGGAGGAACTTGGTGGATCGAATGCTAGAGTTGCCT TGGAATTCCGAGGAAGAGAAGTATATACATAAATGCCTTTTGG ATTATGCTATTGAAGACCCTCTAAGGACATCAGGAAATCTACTT GTTGTGTATTATTTTCAGGTACTTAAGTTCAATAGCTGGTTCCAC GTCCAACATTGATTCTCCTGGTTTATTAATCATGTTAGTCAATTT GTCTTACAGTCTTTTCAGTATATACTTTGGAGTCTTGTAAATGTT ATTTATTACCCAATGTTGAGTTCTGTTCCATATCATGCATATGAT ACACCACGATTACCTATTTTACTTAGCTTATCTTTGATAACAAA ATAATTCCTCCTTCATCTATCTTGGCATCTACCATCTTCATATCT TTGCTTGCATACTGATGTGATATTTTGTTTCCAAAACCTAGTAG ATACTAGATCATAGTATCAGTGTGAAATTTATACATACCTCACT TTCCTATTCGGTTACCATTTTCTGTTATAAATTAATATGAACTTT ATTTTGCTTCTTAAAATGTGAAAGTATTTTAGCATATCCTTGATA ATAATATTTTAGTTTGAGGAAATTGTGAAATAATTTCTGGCTTA TATATTTATCTGGGTTTCAGCGCCACAGATACTCTGAAGCATAT CAAGTTCATATTAAACTTGAAAAGGTGGAGCAAGATTGCATTTC AAAAGGTTCCATAAGTCAAGAAAATCTGCCCATATTAGAAAAG GCTATTCACATTAGAGGCAATTTGATTGTAAGTGATTTAAAATC TTTAATTTTGAAGCAAATGTTTTCTTCTACGAACATTTTATCCTT GGATCATGACCGGCATTAGTTACTTTTATTATGTCTAGCAGTTG TTAAGTTTCTAATGCTCATTTTTTTTTAATTTTTTTTTTAAGTGGA CTCTTATTTATTATTTAACATGTTTGGAGAACACTGTCTCTCTTA GACTGAATTTGTGGACAATTTATGTTTGAATAAAACAGAATAGA TGCTTGGAATTGTTGCCAGAAGTTGAGCAGCAACAACTGAGGA GCGGAAACTTGACTGAAGGTGTTGTTACTTGTTGTGCAGAAGTT GAAATTCCTGACAAATTTGATGTTCCCCAGATTCAGGATTTCTT GTCGACCAGTTTGTTGATTCCTTCATCTGCAAATTCTTCCCTGAC ATTGCATAAAGATCATCCGACTGGCTTGTTGAGTTCGTCGACTT TAGGAAGATCAGCCAAAATAGGCATGTCTTTCCCTACTACTGGC ACTGAGCTTGGTAATTTTGGTTCCTTTTCATATCATCATGATGGG TTATTTACAAATAACGAGAGGGTTCCAAGTCATCTAAGTAAAAT TGGCAAAAATCTAAGAAATGATAACACTCCAACTCCAAGGAAT CATAGGATCCGTTTCATGAATGGTTCACCCCTGAAGGGATTTAA TAGGACATCACCAAGCAATTCCCAGGAAAATAGGCCAGACAAA ATCTTGCCTGAAGTTGAACAAAATCTACATTTTGGCCATAATCA AACTACCAGTCCTATGTACTCCTGGAAGGCTACAGTCAACCCTG TTACTAGATCCACACTTAGCTATCCTAAAGAATTTGCAAATGAT CTCTCAAATATATCTAGTAGGAATGTCCAATCACATAAAGATGA TAGAAGTTGGAACATGGGGTCCACTAATGATCCAATGGATGTTT CTCAGAGGTACGATTCTAGTTACTCATTTCTTTCGCTCATTGCTT TTGTTCATATTACCTGTTTTGTATAATTTTGGTGTGTAAGAATCT CCATGTTCACCAAAAAGTGTATAATATTTTTGTAAACTGAATCC TTTTATGTACTTCATTTCTTTAGCCTTGTTGAGAAGAAATTAAAT ACCGAAGTAAACATCAATGGTGGACCTAGATGGAGATCTGATG ATGCAAGTGATGAGGAAGATGATCTGGATCTGGGAAGAGCTAT GGATATAGCTTATTATGCAAGTCCTCCAATTCGGACGACAAGAC GAAGCAGAGTTTCCAGGAGATGAAAACTCAACTTTTTGGTGAA AGGTTTCTGGAAATTTATGGGAAGAAACAAGAAAATACGTATG TTAAAAGAGTTGTTTTTGAAATGAGAGCTTCGCTTTTTTGGAAC TCGGGAGATTTTACTTGTAGTTTTACGCTTGTCGCTGTTGTGCAG CTAATATTCAATGAAGAAAATTTTAGTGTTAAAGGTGCATTTTT GTATCCTTTTCCTTCAATGAATCAATGTTAACCCGATGTTTTTAA TATTTTTAATTTTCTATATTTAAAGA(SEQ ID NO.:3)

GmHOS1b的CDS序列如SEQ ID NO.:6所示:

ATGAAGAAAAAGAAAAACAAAAAAGCGTTTCAAAAACCCT CCAATTCCAATCTGTATGGAGTTTTTCCCTCTACGAGACACAGA GTTGTTCCGAGTACAAATAAATCTGCACCGTTTAATAATCTCGC ACCTCATTTCTCAGTGCTTGATCAAATCTGTCTCAGTTCTCCGTT TGGTTATTATTTCTCAGTAATGGATAGGAGGCTCAACGGACCCACCGTTTCGTCCAGCTCCAACGGCGGCCCCGCCGTCGGACGATCT TCTCCTACGCTTCAACCAAACTACAGTAGCCGATTAGTTCAGGA AGCATTGGAACACTTGGCATCCATTGATCTGATTGAGTTGTGCA AAGAAGCCAAAGTTGAGCGCTGTCGAGCAACTCGAGACTTGAG AAGCTGTGGTCGCTATGTCCACCATGTCTTGAATTCCTGCAGAC ATGCCTCTTTATGCGAAGAATGTAGTCAACGGTGTGATATCTGC CCAATTTGTAGAATCCCAATTTCAAAAAGTGGTGCTAAAGTGCA TCTCCGACTTTATTATGAGTGCATAGAAGCAGGCCTTATTTCCA AAAGGTGTGATGAGAGATTTCAAGAAAGAGAAGATGGGGAGA AAGACCTAACTGCTGATGTACAGCGCCTTTATTCTCTGTTTGAT GTTACACTTGAGAATAACTTGGTTTCTTTAATTTGCCACTACATC ACTGATGTATGTATGGATGAAACTGCTGTTTCCAGTGATCCTGT CATAGCATTTTTGTTGGATGAAGTGGTAGTGAAGGATTGGTGCA AGAGGACATTCAAAAACATCATTGCTGAACTGCAGGGAATTTA TGATATGGACATTTTAGGCTTGAAAGAGAGATTGAGTTTACTTC TGAAATTTTCATTATACTTGAAGGGCATATCGAATGTGCTAGAC ATTTTGGAGTCATCTTTTAAGGGTACTCTTTCAGCACAACTGCACGATTTGCAGAATCTCCAAGAGAGCATCATGAAGACAAAACAG CATATGGATGTTATTATTTGGTGTACAAGACATCAATTTTTGGA AGGTGTGAGGTCACGTTTTACTGATGGTTCATCATGGTCATCAG TTGTTCGGATACGAAAATCAGAAGCAATTAGACGAGCATGGCC TGATGCAATAAATCAATCTGTGGAGTCACAAGGACATGATGGG TCTCTATTTATTGAAGATGCATTGAATAATCTTGATCTGGAGGA GGGGTTTAGGAATGAAATTGTAGAGGGATTAGAAATTGCATCC TTGCAGAAGGATAGTGCATCATTTTTGGGGTCAAATACTGATCA GATGCTGGGTTACTATCCCTTCAAAAATCTTCGTTCTGCTGTTGA CTTGCTCTTTTTACATGGAGGCTCTGATATGGTGGTTGCAAAAC AGGCCATTTTTCTGTATTATTTATATGATCGCCACTGGACAATTC CTGAAGAGGAATGGAGATACATACTGGAGGACTTTGCAGCTAC ATTTAGTGTTAACAGGCACTCATTACTTGAGTCTTTGACTTTTTA CCTTCTGGATGATCACACAGAGGAGGCTTTACAGGAAGCTTGCC GCCTTCTTCCTGAAATAACTGGCTCAACATCACATCCTAAAATT GCTGAAGTACTATTAGAAAGGGGTATCCCTGATACAGCTCTCAT GGTCTTGAGGTGGGCTGGGCGTGATGGTGGACCTCACTTGACTT CACTCAGAGATGGTGTCACTGCAGTGCGGGTGAGGGTTGAGTG TGGGCTTCTGACTGAAGCATTTATGCATCAGAGAGTGCTCTGCA CCAGAGTGAAGGAAAAGAATTTCAATAAAACAGCATCTGGGAA TACTTCTGAGAAGCAAAAAGGCCAATTTAGTAATTGGGTGGAG TGGGTGGAGGTCCTGGTGACTGAGATTTGTTGCCTCTGTATTAG GAGGAACTTGGTGGATCGAATGCTAGAGTTGCCTTGGAATTCCG AGGAAGAGAAGTATATACATAAATGCCTTTTGGATTATGCTATT GAAGACCCTCTAAGGACATCAGGAAATCTACTTGTTGTGTATTA TTTTCAGCGCCACAGATACTCTGAAGCATATCAAGTTCATATTA AACTTGAAAAGGTGGAGCAAGATTGCATTTCAAAAGGTTCCAT AAGTCAAGAAAATCTGCCCATATTAGAAAAGGCTATTCACATTA GAGGCAATTTGATTAATAGATGCTTGGAATTGTTGCCAGAAGTT GAGCAGCAACAACTGAGGAGCGGAAACTTGACTGAAGGTGTTG TTACTTGTTGTGCAGAAGTTGAAATTCCTGACAAATTTGATGTT CCCCAGATTCAGGATTTCTTGTCGACCAGTTTGTTGATTCCTTCA TCTGCAAATTCTTCCCTGACATTGCATAAAGATCATCCGACTGG CTTGTTGAGTTCGTCGACTTTAGGAAGATCAGCCAAAATAGGCA TGTCTTTCCCTACTACTGGCACTGAGCTTGGTAATTTTGGTTCCT TTTCATATCATCATGATGGGTTATTTACAAATAACGAGAGGGTT CCAAGTCATCTAAGTAAAATTGGCAAAAATCTAAGAAATGATA ACACTCCAACTCCAAGGAATCATAGGATCCGTTTCATGAATGGT TCACCCCTGAAGGGATTTAATAGGACATCACCAAGCAATTCCCAGGAAAATAGGCCAGACAAAATCTTGCCTGAAGTTGAACAAAAT CTACATTTTGGCCATAATCAAACTACCAGTCCTATGTACTCCTG GAAGGCTACAGTCAACCCTGTTACTAGATCCACACTTAGCTATC CTAAAGAATTTGCAAATGATCTCTCAAATATATCTAGTAGGAAT GTCCAATCACATAAAGATGATAGAAGTTGGAACATGGGGTCCA CTAATGATCCAATGGATGTTTCTCAGAGCCTTGTTGAGAAGAAA TTAAATACCGAAGTAAACATCAATGGTGGACCTAGATGGAGAT CTGATGATGCAAGTGATGAGGAAGATGATCTGGATCTGGGAAG AGCTATGGATATAGCTTATTATGCAAGTCCTCCAATTCGGACGA CAAGACGAAGCAGAGTTTCCAGGAGATGA(SEQ ID NO.:6)。

GmHOS1b氨基酸序列如SEQ ID NO.:4所示:

MKKKKNKKAFQKPSNSNLYGVFPSTRHRVVPSTNKSAPFNNL APHFSVLDQICLSSPFGYYFSVMDRRLNGPTVSSSSNGGPAVGRSS PTLQPNYSSRLVQEALEHLASIDLIELCKEAKVERCRATRDLRSCG RYVHHVLNSCRHASLCEECSQRCDICPICRIPISKSGAKVHLRLYYE CIEAGLISKRCDERFQEREDGEKDLTADVQRLYSLFDVTLENNLVS LICHYITDVCMDETAVSSDPVIAFLLDEVVVKDWCKRTFKNIIAEL QGIYDMDILGLKERLSLLLKFSLYLKGISNVLDILESSFKGTLSAQL HDLQNLQESIMKTKQHMDVIIWCTRHQFLEGVRSRFTDGSSWSSVVRIRKSEAIRRAWPDAINQSVESQGHDGSLFIEDALNNLDLEEGFR NEIVEGLEIASLQKDSASFLGSNTDQMLGYYPFKNLRSAVDLLFLH GGSDMVVAKQAIFLYYLYDRHWTIPEEEWRYILEDFAATFSVNRH SLLESLTFYLLDDHTEEALQEACRLLPEITGSTSHPKIAEVLLERGIP DTALMVLRWAGRDGGPHLTSLRDGVTAVRVRVECGLLTEAFMH QRVLCTRVKEKNFNKTASGNTSEKQKGQFSNWVEWVEVLVTEIC CLCIRRNLVDRMLELPWNSEEEKYIHKCLLDYAIEDPLRTSGNLLV VYYFQRHRYSEAYQVHIKLEKVEQDCISKGSISQENLPILEKAIHIR GNLINRCLELLPEVEQQQLRSGNLTEGVVTCCAEVEIPDKFDVPQI QDFLSTSLLIPSSANSSLTLHKDHPTGLLSSSTLGRSAKIGMSFPTTG TELGNFGSFSYHHDGLFTNNERVPSHLSKIGKNLRNDNTPTPRNHR IRFMNGSPLKGFNRTSPSNSQENRPDKILPEVEQNLHFGHNQTTSP MYSWKATVNPVTRSTLSYPKEFANDLSNISSRNVQSHKDDRSWNMGSTNDPMDVSQSLVEKKLNTEVNINGGPRWRSDDASDEEDDLD LGRAMDIAYYASPPIRTTRRSRVSRR(SEQID NO.:4)。

在本发明的一个方面，本发明的基因具有SEQ ID NO.:1或SEQ ID NO.:3所示的核酸序列。在本发明的另一个方面，本发明的基因与 SEQ ID NO.:1或SEQ ID NO.:3所示的核酸序列共有80％、81％、82％、 83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。在本发明的进一步的方面中，本发明的基因与SEQ ID NO.:1或SEQ ID NO.: 3所示的核酸序列共有95％、96％、97％、98％、99％和100％的序列同一性。

本发明的基因还包括GmHOS1s基因通过其中的一个或多个核苷酸发生缺失、置换、插入或添加的突变而衍生得到的变体序列。基因突变是指基因组DNA分子发生的突然的、可遗传的变异现象。从分子水平上看，基因突变是指基因在结构上发生碱基对组成或排列顺序的改变。基因突变的产生可以是自发的也可以是诱发的，人工诱变的方式包括物理诱变(如γ射线、x射线、紫外线和中子流等)、化学诱变(如烷化剂、碱基类似物和抗生素等)及生物诱变(如某些病毒和细菌等)。而且，可以利用重组DNA技术使DNA分子在指定位置上发生特定的变化，从而实现定向诱变。本领域技术人员可以使用这些公知的诱变方法中的任一种来获得包括一个或多个核苷酸发生缺失、置换、插入或添加的突变的GmHOS1s基因的变体序列。

重组载体

本发明的第三方面提供了一种重组载体，其包含第一方面所述的基因或第二方面所述的DNA分子。

本发明还提供了一种构建体，其包含编码设计为靶向GmHOS1a 基因或GmHOS1b基因的单个向导RNA的序列，其中所述构建体在植物中的表达与Cas相关基因的表达一起导致GmHOS1a基因或 GmHOS1b基因表达抑制。

分离的蛋白

本发明的第四方面还提供了一种分离的蛋白质，其具有如下的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO.:2或4所示的氨基酸序列；(2)由第一方面所述的基因编码的序列；或(3)包含一个或几个氨基酸残基的置换和/或缺失和/或添加的SEQ ID NO.:2或4所示的氨基酸序列。

如本文中所用，术语“重组”是指通常未在自然界中发现的并且因而通过人干预产生的DNA和/或蛋白质和/或生物体形式。这样的人干预可产生重组DNA分子和/或重组植物。如本文中所用，“重组 DNA分子”为包含不能一起天然存在的DNA分子的组合并且为人干预的结果的DNA分子，例如由至少两个彼此异源的DNA分子的组合组成的DNA分子，和/或为人工合成的并且包含从通常存在于自然界中的多核苷酸序列衍生的多核苷酸序列的DNA分子，和/或包含人工地整合入宿主细胞的基因组DNA的转基因和相连的宿主细胞的基因组的侧翼DNA的DNA分子。重组DNA分子的实例为本文中描述的因转基因至拟南芥、玉米或水稻基因组内的插入而产生的DNA分子，其可最终导致重组DNA和/或蛋白质分子在该生物体中表达。

如本文中所用，术语“分离的”是指至少部分地将分子与通常在其自体或天然状态中与其联接的其它分子分离。在一个实施方案中，术语“分离的基因”或“分离的DNA分子”是指这样的DNA分子，其至少部分地与在自体或天然状态中通常侧翼连接所述DNA分子的核酸分离。因此，例如作为重组技术的结果融合于它们通常不与其联接的调控或编码序列的DNA分子在本文中被认为是分离的。此类分子即使当整合入宿主细胞的染色体或与其它DNA分子一起存在于核酸溶液中时亦被认为是分离的。

如本文所述，术语“严格条件”，通常是指由Sambrook等人， 1989和由Haymes等人在：Nucleic acid hybridization，A practical approach，IRO Press，Washington，DC(1985)中所描述的条件。DNA 杂交的合适的严格条件(例如大约45℃的6.0x氯化钠/柠檬酸钠 (SSC)，接着50℃的2.0x SSC洗涤)是本领域的技术人员已知的，或可以在CurrentProtocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons, N.Y.,1989,6.3.1-6.3.6中找到。例如，洗涤步骤中的盐浓度可以从50℃的大约2.0x SSC的低严格条件到50℃的大约0.2xSSC的高严格条件。另外，洗涤步骤中的温度可以从室温(大约22℃)的低严格条件增加到大约65℃的高严格条件。温度和盐都可以变化，或者温度或盐浓度中的一种可以保持恒定，而另一个变量发生变化。例如，中等严格条件可以为大约2.0x SSC的盐浓度和大约65℃的温度，高严格条件可以为大约0.2x SSC的盐浓度和大约65℃的温度。

转基因植物

本发明的第五方面提供了一种宿主细胞，其包含第一方面所述的基因、第二方面所述的DNA分子、第三方面所述的重组载体或第四方面所述的蛋白质。

本发明的第六方面还提供了一种转基因植物，其包含第一方面所述的基因、第二方面所述的DNA分子、第三方面所述的重组载体或第四方面所述的蛋白质。

在一个具体实施方式中，其中所述植物为单子叶植物或双子叶植物，优选为拟南芥或大豆。

如本文中所用，术语“转基因”是指人工地整合入宿主细胞的基因组的多核苷酸分子。这样的转基因对于宿主细胞可以是异源的。术语“转基因植物”是指包含这样的转基因的植物。

拟南芥(A.thaliana)，又名鼠耳芥、阿拉伯芥、阿拉伯草。这种小小的有花植物是在植物科学，包括遗传学和植物发育研究中的模式生物之一。其在植物学中所扮演的角色正仿佛小白鼠在医学中和果蝇在遗传学中的一样。拟南芥的优点是植株小(1个茶杯可种植好几棵)、每代时间短(从发芽到开花不超过6周)、结子多(每棵植物可产很多粒种子)、生活力强(用普通培养基就可作人工培养)。拟南芥的基因组是目前已知植物基因组中最小的。每个单倍染色体组 (n＝5)的总长只有7000万个碱基对，即只有小麦染色体组长的1/80，这就使克隆它的有关基因相对说来比较容易。其整个基因组已于2000 年由国际拟南芥菜基因组合作联盟联合完成，也是第一个测序分析的植物基因组。拟南芥是自花受粉植物，基因高度纯合，用理化因素处理突变率很高，容易获得各种代谢功能的缺陷型。例如用含杀草剂的培养基来筛选，一般获得抗杀草剂的突变率是1/100000。由于有上述这些优点，所以拟南芥是进行遗传学研究的好材料。

除了在植物形态建成研究中经典的花发育ABC模型外，近十年来，植物科学家们利用拟南芥模式系统，对植物不同组织和器官的发育开展了类似的研究。通过大量拟南芥突变体的分析，科学家们对植物根、茎、叶、花、胚胎和种子的发育，对植物抗病性和抗逆性机理，以及对各种生命活动有关的激素、光和环境因子引起的信号传导过程等进行了深入的研究，极大丰富了人类对于植物生命活动内在机理的认识。

本发明中的植物包括但不限于单子叶植物和双子叶植物，包括作物植物(如玉米)、芸苔属(例如，甘蓝、白菜、芥菜)，特别是可用作种子油来源的芸苔物种、紫花苜蓿(Medicago sativa)、水稻(Oryza sativa)、裸麦(Secale cereale)、高粱(Sorghumbicolor,Sorghum vulgare)、粟(例如，珍珠稷(Pennisetum glaucum)、黍(Panicummiliaceum)、小米(Setaria italica)、龙爪粟(Eleusine coracana))、向日葵(Helianthusannuus)、红花(Carthamus tinctorius)、小麦(Triticum aestivum)、大豆 (Glycinemax)、烟草(Nicotiana tabacum)、土豆(Solanum tuberosum)、花生(Arachis hypogaea)、棉花(Gossypium barbadense,Gossypium hirsutum)、甘薯(Ipomoea batatus)、木薯(Manihot esculenta)、咖啡 (Coffea spp.)、椰子(Cocos nucifera)、菠萝(Ananascomosus)、柑橘树 (Citrus spp.)、可可(Theobroma cacao)、茶(Camellia sinensis)、香蕉 (Musa spp.)、鳄梨(Persea americana)、无花果(Ficus casica)、番石榴 (Psidiumguajava)、芒果(Mangifera indica)、橄榄(Olea europaea)、番木瓜(Carica papaya)、腰果(Anacardium occidentale)、马卡达姆坚果 (Macadamia integrifolia)、杏(Prunusamygdalus)、甜菜(Beta vulgaris)、甘蔗(Saccharum spp.)、燕麦()、大麦)、蔬菜(如西红柿(Lycopersicon esculentum)、莴苣(例如Lactuca sativa)、青豆(Phaseolusvulgaris)、菜豆(Phaseolus limensis)、豌豆(Lathyrus spp.)和黄瓜属的成员如黄瓜(C.sativus)、甜瓜(C.cantalupensis)和香瓜(C.melo))、观赏植物(如杜鹃花(Rhododendron spp.)、八仙花(Macrophylla hydrangea)、芙蓉(Hibiscusrosasanensis)、玫瑰(Rosa spp.)、郁金香(Tulipa spp.)、水仙花(Narcissus spp.)、牵牛花(Petunia hybrida)、康乃馨(Dianthus caryophyllus)、猩猩木(Euphorbiapulcherrima)和菊花(Dendranthema morifolium)。在特定的实施方式中，本发明的植物是作物植物(例如，玉米、紫花苜蓿、向日葵、芸苔属、大豆、棉花、花生、高粱、小麦、粟、烟草等)。在一些实施方式中，优选是拟南芥或大豆。

GmHOS1a基因、GmHOS1b基因的应用

本发明的第七方面提供了第一方面所述的基因、第二方面所述的 DNA分子、第三方面所述的重组载体或第四方面所述的蛋白质在调控植物开花时间和/或耐寒性中的应用。

本发明的第八方面提供了一种培育转基因植物的方法，包括将第一方面所述的基因引入目的植物以获得转基因植物，从而调控所述转基因植物的开花时间和/或耐寒性。

在一个具体实施方式中，第八方面的方法进一步包括获得所述转基因植物的种子。

在一个具体实施方式中，其中所述转基因植物中GmHOS1a基因和/或GmHOS1b基因发生突变；优选地，所述转基因植物中GmHOS1a 基因和GmHOS1b基因均发生突变。

本发明的第九方面提供了一种调控植物开花时间的方法，包括将第一方面所述的基因、第二方面所述的DNA分子或第三方面所述的重组载体引入植物中以使其在植物中表达。

在一个具体实施方式中，其中所述植物中GmHOS1a基因和/或GmHOS1b基因发生突变，以提前所述植物的开花时间；优选地，所述植物中GmHOS1a基因和GmHOS1b基因均发生突变，以提前所述植物的开花时间。

本发明的第十方面还提供了一种调控植物耐寒性的方法，包括将第一方面所述的基因、第二方面所述的DNA分子或第三方面所述的重组载体引入植物中以使其在植物中表达。

在一个具体实施方式中，其中所述植物中GmHOS1a基因和/或 GmHOS1b基因发生突变，以增加所述植物的耐寒性；优选地，所述植物中GmHOS1a基因和GmHOS1b基因均发生突变，以增加所述植物的耐寒性。

本发明的第十一方面还提供了一种生产转基因植物的方法，所述转基因植物包含引入的第一方面所述的基因、第二方面所述的DNA 分子、第三方面所述的重组载体，或者其重组表达第四方面所述的蛋白质，包括获得所述转基因植物的种子，并种植所述种子以获得所述转基因植物。

实施例1、大豆HOS1家族基因的克隆与表达模式分析

1.1大豆HOS1家族基因的克隆

在拟南芥网站(https://www.Arabidopsis.org/)上下载AtHOS1基因的氨基酸序列，在(https://phytozome.jgi.doe.gov)网站中利用 AtHOS1氨基酸序列进行Blast分析得到大豆中的HOS1同源基因，最终得到两个目标基因，GmHOS1a基因或GmHOS1b基因。

使用Vector NTI 10软件比对基因序列和核苷酸序列。

使用MEGA5软件对拟南芥、大豆、水稻和玉米等物种中的HOS1 蛋白序列进行比对(选择比对方法为ClustalW)，选择Neighbor-joining方法构建HOS1进化树(Bootstrap设置为1000)。

结果：通过生物信息学分析，利用拟南芥HOS1氨基酸序列在大豆网站(https://phytozome.jgi.doe.gov)上进行同源比对，发现HOS1 在进化中十分保守，和拟南芥相同的是，水稻、小麦和番茄等物种中只存在一个HOS1，而苔藓、烟草和大豆物种中存在两个拷贝的HOS1。本实验选取大豆中的两个AtHOS1同源基因：Glyma.01G207400和Glyma.11G035800，使用MEGA5(TAMURA et al.,2011)软件对拟南芥、大豆以及其他物种的HOS1蛋白序列进行比对(比对方法为 ClustalW)，选择Neighbor-joining方法(Bootstrap设置为1000)构建进化树，根据进化关系的远近，将大豆中的两个AtHOS1同源基因分别命名为GmHOS1a和GmHOS1b(图1A)。

使用GENEDOC软件分析拟南芥、大豆和水稻HOS1氨基酸序列，比对结果表明，HOS1蛋白结构域在不同物种中高度保守，都具有N 端的环指结构域和中间区域的与脊椎动物NPC成分Embryonic Lage Molecule Derived Yolk Sac(ELYS)高度相似的保守序列(RASALA et al.,2006；GILLESPIE et al.,2007；BILOKAPIC et al.,2013)。HOS1蛋白环指结构域是E3泛素连接酶发挥功能的必要成分，但其并不存在于所有物种中。ELYS序列是绝对保守的，在所有鉴定的陆生物种中都存在该结构域，这表明HOS1的非蛋白水解作用(如mRNA转运，染色质重塑等)相对更重要。这两个结构域在拟南芥，大豆和水稻中都存在。表明HOS1的泛素化活性和非蛋白水解作用在这三个物种中都发挥着重要作用(图1B-C)。

1.2组织特异性表达分析

1.2.1样品选取

在长日照光照条件(16h光照/8h黑暗)下种植10-20株William 82大豆，生长14天后分别对根、下胚轴、子叶、单叶、三出复叶、节等部位进行取材，待开花后取花部位样品。每份样品取三个重复，置于1.7mL离心管(无RNA酶)，置于液氮中冻存。

1.2.2提取RNA，使用购自全式金公司的反转录试剂盒

ⅡOne-StepgDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix对提取的RNA进行反转录。

1.2.3利用qPCR反应检验GmHOS1a和GmHOS1b组织特异性表达

本申请中设计引物均采用Primer Premier 5软件。克隆目标基因引物、构建CRISPR/Cas9载体引物以及Real-time引物均根据大豆 Williams 82的CDS序列设计，突变体株系检测引物根据GmHOS1s 的全基因序列设计。Real-time引物使用前需在 (https://www.soybase.org/Real-time)网站中确定其特异性。具体地，本实施例中qPCR反应使用的引物信息如下表所示：

引物名称	引物序列(5'-3')
		GmActin-qF	CGGTGGTTCTATCTTGGCATC(SEQ ID NO.:7)
GmActin-qR	GTCTTTCGCTTCAATAACCCTA(SEQ ID NO.:8)
		GmHOS1a-qF	TGATGATGCGAGTGATGA(SEQ ID NO.:9)
GmHOS1a-qR	TCTGAGTTGGAGGAGTTG(SEQ ID NO.:10)
		GmHOS1b-qF	AATCTTCGTTCTGCTGTT(SEQ ID NO.:11)
GmHOS1b-qR	TATGTATCTCCATTCCTCTTC(SEQ ID NO.:12)

反应体系：

反应程序：

根据公式ΔCT＝2-[CT(GmHOS1 average)–CT(GmActin average)]计算ΔCT值，得出结果进行分析比较。

结果：利用qRT-PCR技术测定GmHOS1s在栽培大豆Williams 82 各个植物组织中的表达量，qRT-PCR结果表明GmHOS1a在三出复叶中表达量最高，其次在下胚轴和花中有较高表达；GmHOS1b和 GmHOS1a表达模式相似，均在三出复叶中表达最高，其次是花和单叶；但GmHOS1b的表达量比GmHOS1a要低得多(图2)。

实施例2生物钟昼夜节律分析

为了探究GmHOS1s表达是否具有生物钟昼夜节律，在中日照条件下取生长三周的Willam82大豆第二片刚刚展开的复叶进行 qRT-PCR检测，从开灯点开始每四小时取一次(取完前24个小时后改变光周期条件为持续光照再取48小时)，共取72小时，每一组样品由三个生物重复构成，每一个生物重复由3-5棵单株组成。通过如实施例1中的方法，提取RNA、反转录RNA获取cDNA、qPCR检测GmHOS1a和GmHOS1b的表达情况。

结果：qRT-PCR结果表明GmHOS1a和GmHOS1b都呈现昼夜节律性表达，都是见光表达量升高，黑暗前表达达到峰值，黑暗下表达量下降。值得注意的是，GmHOS1a表达量显著高于GmHOS1b(图3)。以上结果说明GmHOS1s可能是大豆生物钟中的重要组分并受其调控 (图3)。

实施例3亚细胞定位分析

拟南芥AtHOS1蛋白分布在细胞核和细胞质中。为了进一步探究 GmHOS1a与GmHOS1b蛋白亚细胞定位情况是否与拟南芥相同，我们构建了亚细胞定位载体，将YFP荧光蛋白融合在GmHOS1a与 GmHOS1b蛋白的C端；并和RFP核定位标记GmMYB29-RFP(登录号：Glyma.10G180800)共转入大豆原生质体中瞬时表达。通过检测大豆细胞中的荧光分布，以分析GmHOS1a与GmHOS1b蛋白的亚细胞定位。

结果：在黑暗条件下，作为对照的YFP荧光蛋白在细胞核、细胞质和细胞膜都可以表达，融合C端YFP的GmHOS1a与GmHOS1b 蛋白定位在细胞核中。大豆中GmHOS1s的C端融合YFP蛋白载体与拟南芥中HOS1蛋白有着不同的亚细胞定位结果，证明GmHOS1s 与AtHOS1的功能可能存在一定的差别，拟南芥HOS1蛋白在细胞质中发挥的功能在大豆中是否存在或改变也未可知(图4)。

实施例4大豆转基因及突变体材料构建

4.1突变体材料构建

对每个基因选取5-6个靶位点利用CRISPR/Cas9技术将 GmHOS1s基因敲除，一个敲除载体上连接两个靶位点，以提高载体工作效率，最终构建了9个GmHOS1s敲除载体。CRISPR/Cas9载体构建，使用由实验室保存的载体JRH0645-RPS5A(抗性：Kan+)，构建所述GmHOS1s敲除载体的guideRNA靶向序列的引物如下所示：

4.1.1子叶节发根检测技术验证载体的工作效率

由于完整的大豆遗传转化耗时长、阳性率低，而一次发根检测的周期只有18-24天，因此在大豆子叶节转化之前用子叶节发根检测技术验证载体的工作效率。将构建完成的载体电击法转化发根农杆菌 K599菌株，诱导出发状根后取材提取DNA，PCR后进行测序，比较空白对照和转入载体发状根的靶位点之后的工作峰图，确定载体的工作效率，选取高效工作的载体进行大豆遗传转化。

发根检测PCR所需引物，如下表所示：

测序检测的反应体系：

反应程序：

反应后吸取少量产物跑胶检测，若目标大小位置有条带，则剩余 25μL PCR产物送公司测序。

通过发根检测确定了6个工作较好的载体：单独敲除GmHOS1a、GmHOS1b载体各两个，同时敲除GmHOS1a/b的载体两个，并进行大豆转化(图5)。

4.1.2 Gmhos1s突变体的获得

将经过发根检测确定工作效率的敲除载体进行大豆遗传转化后，已获得多个株系的Gmhos1a、Gmhos1b纯合突变体和Gmhos1a/b纯合突变体。

用三对引物(①Bar-F/R、②Cas9-F/R、③35S-nos-F1/RPS5A-R1) PCR电泳检测纯合突变体，电泳结果有条带说明该株为阳性植株，不是阳性苗扔掉。突变体PCR检测，所需引物如下所示

引物名称	引物序列(5'-3')
		Bar-F2	TCCGCAGCCATTAACGACTT(SEQ ID NO.:62)
Bar-R1	ACAGATAAAGCCACGCACATT(SEQ ID NO.:63)
		Cas9-CK-F1	CAGCTCGTCCAAACCTAC(SEQ ID NO.:64)
Cas9-CK-R1	CTGTGCCATCCATCTTCT(SEQ ID NO.:65)
		U6-CX-F2	GCGGTGTCATCTATGTTACTA(SEQ ID NO.:66)
U6-CX-R2	TTCAAGTTGATAACGGACTA(SEQ ID NO.:67)
		35S-nos-F1	CGTTATTTATGAGATGGGTT(SEQ ID NO.:68)
RPS5A-R1	TCTTGCCATACCATTTAG(SEQ ID NO.:69)

2×Mix PCR反应体系：

反应程序：

反应后吸取少量产物跑胶检测，有条带且大小正确的PCR产物进行测序验证。

结果：

如图6所示，突变体Gmhos1a-1、Gmhos1a-2和Gmhos1a-3分别在第一个靶位点处缺失了2bp、6bp和63bp，Gmhos1a-4则在第二个靶位点处缺失了63bp。Gmhos1b在第一个靶位点处分别增加了1bp和缺失 1bp、2bp、3bp和7bp，并命名为Gmhos1b-1、Gmhos1b-2、Gmhos1b-3、Gmhos1b-4和Gmhos1b-5。

Gmhos1a/b获得4种纯合突变体，Gmhos1a/b-1在Gmhos1a和 Gmhos1b基因处各插入1bp，Gmhos1a/b-2在Gmhos1a基因处缺失14bp， Gmhos1b处增加1bp，Gmhos1a/b-3和Gmhos1a/b-4都在Gmhos1a处缺失63bp，Gmhos1b处分别减少5bp和减少8bp，另外还有一个Gmhos1a 和Gmhos1b各缺失4bp和1bp，但未纯合的Gmhos1a/b杂合突变体(图 7)。

Gmhos1a和Gmhos1b突变体长日照下具有早花表型

在短日照(10h光照/14h黑暗)，长日照(16h光照/8h黑暗)条件下分别种植野生型天隆一号和Gmhos1a、Gmhos1b纯合突变体，对上述材料的开花时间进行统计分析，对有表型的株系拍照保存。

结果发现在短日照条件下Gmhos1a和Gmhos1b突变体较野生型早开花一天左右，进行T测验分析结果发现与野生型没有显著差异(图8)。说明短日条件下Gmhos1a和Gmhos1b突变体没有开花表型。长日照条件下Gmhos1a-ab1-1与野生型相比早花3天左右，且具有显著性差异(图 9)。Gmhos1b-3-1也具有早花表型，但没有Gmhos1a突变体早花表型明显，统计结果表明较野生型开花早2天左右，显著性测验表明与野生型比较也具有显著性差异。突变体的早花导致了生育周期稍有缩短；但突变体和野生型的株高和节数没有显著差异。缺失63个碱基的 Gmhos1a-ab1-3在长、短日照条件下均无明显表型，开花时间与野生型几乎没有差别，说明这63个碱基缺失可能未影响GmHOS1a的蛋白翻译和空间结构，因此未影响开花时间。

Gmhos1a/b突变体长、短日照下均具有早花表型

为了确定GmHOS1s两基因之间是否存在部分功能冗余，在长短日照条件下观察野生型、Gmhos1a/b纯合突变体表型，对其开花时间进行统计分析。统计结果表明在短日照条件下，Gmhos1a/b突变体开花时间比野生型天隆一号提前约两天(图10)，而长日照条件下，Gmhos1a/b 突变体的早花表型更为明显，统计分析显示比野生型早花3-4天(图11)。无论在长、短日照条件下，Gmhos1a/b突变体开花时间均显著早于野生型，且其开花时间明显早于Gmhos1a和Gmhos1b突变体。说明GmHOS1a 和GmHOS1b在大豆开花调控上存在功能叠加效应。

GmHOS1s过表达具有晚花表型

为了确定GmHOS1s的功能，也将构建好的GmHOS1s过表达载体 (35S::GmHOS1a-FLAG和35S::GmHOS1b-FLAG)进行了大豆遗传转化，并获得了一些GmHOS1a和GmHOS1b的过表达株系。通过Western Blot 技术对所有的过表达株系进行GmHOS1s蛋白含量测定，均没有发现蛋白含量有所积累。于是利用qRT-PCR技术再对过表达株系GmHOS1s表达量进行测定，发现过表达株系GmHOS1a-FLAG-42和 GmHOS1b-FLAG-1中GmHOS1s基因的表达量较高(图12A)。将这两个株系种在短日照和长日照条件下进行表型观察，统计它们的开花时间，分析发现相比于天隆一号均有晚花表型(图12B和C、图13A和B)；短日照下GmHOS1a-FLAG-42过表达比野生型开花晚一天，但显著性测验表明是晚花具有极显著差异，而GmHOS1b-FLAG-1的开花时间也略晚于野生型，但是没有显著性差异的。长日照下GmHOS1a-FLAG-42和GmHOS1b-FLAG-1过表达的晚花表型更为明显，与野生型的开花时间都具有极显著差异。

过表达的表型分析进一步确定了GmHOS1s在调控大豆开花时间的过程中发挥重要功能。

4.2 GmHOS1过表达材料构建

过表达载体使用In-fusion体系构建，载体骨架：JRH0641-FLAG (抗性：Kan+)。扩增引物为0641-HOS1a-flag-F/R、 0641-HOS1b-flag-F/R，模板为PA7-GmHOS1，反应结束后对PCR产物进行凝胶回收测序。构建过表达载体所需引物如下表所示：

使用Bar-F/R.、35S-F/35S-nos-R检测检测过表达植株。

过表达载体中的GmHOS1a片段序列如SEQ ID NO.:76所示： ATGGATAAGAGGCTCAATGGACCCACCGTTTCGTCCAGCTCTAA CGGCGGCTCCGCCGTGGGACGATCTTCTCCTACGCTTCAACCAA ACTACAGTAGCCGATTAGTTCAGGAAGCATTGGAACACTTGGC ATCCATTGATCTGATTGAGTTGTGCAAAGAAGCCAAAGTTGAGC GCTGCCGAGCAACTCGAGACTTGAGAAGCTGTGGTCGCTATGTC CACCATGTCTTGAATTCATGCGGACATGCCTCTTTATGTGAAGA ATGTAGCCAACGGTGTGATATCTGCCCAATTTGTAGAATCCCAA TTTCAAAAAGTGGTGCTAAAGTGCATCTTCGACTTTATTATGAA TGCATAGAAGCAGGCCTTATTTCGAAAAGGTGTGATGAGAGGT TTCAAGAAATAGAAGATGGGGACAAACAACTAACTGCTGACGT ACAGCGCCTTTATTCTCTGTTTGACGTTGCACTTGAGAATAACTT GGTTTCTTTAATTTGCCACTACATCACAGATGTATGTATGGATG AAACTGCTGTTTCCAGTGATCCTGTCATTGCATTTTTGTTGGATG AAGTGGTAGTGAAGGATTGGTGCAAGAGGACATTCAAAAACATCATTGCTGAACTGCAGGGAATTTATAATATGGACATTTTAGGCT TGAAAGAGAGATTGAGTTTACTTCTGAAATTTTCATTATACTTG AAGGGCATATCAAATGTGCTAGACATTTTGGAGTCATCTTTTAA GGGTACTCTTTCAGCACAACTTCACGATTTGCAGAATCTCCAAG AGAGCATCATGAAGACAAAGCAGCATATGGATGTTATTATTTG GTGTACGAGACATCAATTTTTGGAAGATGTGAGATCACGTTTTA CTGATAGTTCGTCATGGTCATCAGTTGTTCGGACAAGGAAATCA GAAGCAATTAGACGTGCTTGGCCTGATCCAATAAATCAATCTGT GGAGTCATCAGGACATGATGGGTCTCTATTTATTGAAGATGCAA TGAATAATCTTGATCTGGAGGAGGGGTTTAGGAATGAAATTGTA GAGGGATTGGAAATTGCATCCTTGCAGAAGGACAGTGAATCAT TTTTGGGGTCAAATACTGATCAGATTCTGGGTTACTATCCCTTC AAAAATCTTCGTTCTGCTGTTGACTTGCTCTTTTTACGTGGAGGC TCTGATATGGTGATTGCAAAACAGGCCATTTTTCTGTATTATTTA TATGATCGCCACTGGACAATTCCTGAAGAAGAATGGAGATACA TACTTGAGGACTTTGCTGCTACATTTAGTATTAGCAGGCACTCA TTACTTGAATCTTTGACTTTTTACCTTCTGGATGATCACACAGAG GAGGCTTTACAGGAAGCTTGTCGCCTTCTTCCTGAAATAACTGG CTCAACATCACATCCTAAAATTGCTGAAGTACTATTAGAAAGGG GTAGCCCTGATACAGCTCTCATGGTTTTGAGGTGGGCTGGGCGG GATGGTGGACCTCACGTGACTTCACTCAGAGATGCTGTCACTGC AGTGCGGGTGAGGGTTGAGTGTGGGCTTCTGACTGAAGCATTTATGCATCAGAGAATGCTCTGCACCAAAGTGAAGGAAAAGAATTT CAATAAAACAGCATCTGGGAATACTTCTGAGAAGCAAAAAGGT CAATGTAATAAGTGGGTGGAGTGGATGGAGGTCCTGGTGACTG AGATTTGTTGCCTCTGTATTAGGAGGAACTTGGTGGATCGAATG CTAGAATTGCCATGGAATTCTGAGGAAGAGAAGTATATACATA AATGTCTTTTGGATTATGCTATTGAAGACCCTTTAAGGACAACA GGAAATCTACTTGTTGTGTATTATTTTCAGCGCCACAGATACTC TGAAGCATATCAAGTTCATATTAAACTTGAAAAGGCGGAGCAA GATTGCATTTCAAAAGGTTCCGTAAGTCAACAAAATCTGCCAGT ATTAGAGAAGGCTATTCACTTCAGAGCCAATTTGATTAATAGAT GCTTGGAATTGTTGCCAGAAGTTGAGCAGCAGCAACTGAGGAG CGGAAACTTGACTGAAGGTGTTGTTACTTCTTGTGAAGAAGTTGAAATTCCTGACAAATTTGACGTTCCTCAGATTCAGGATTTCTTG TCAACCAGTTTATTGATTCCTTCATCTGTAAATTCTTCCTTGATG TTGCATAAAGATCATCCAACTGGCTTGTTGAGTTCATTGACTTT AGGAACATCAGCCAAAATAGGCATGTCTTTCCCTACTACTGGCA CTGAGCTAGGTAATTTTGGTTCCTTATCATACCATCATGATGGG TTATTTACAAATAATGAGAGGGTTCCAAGTCATCAACGTAAAAT TGGTAAAAATCTAAGAAATGATAACTCTCCAACTCCTAGGAATC ATAGGATCCGTTTCATGAATGGTTCACCCCTGAAGGGATTTACC AGGACATCACCAAGCAATTCCCAGGAGAATAGGCCGGACAAAA TCTCGCCTGGAGTTGAACAAAATAATCAAACTACCAGTCCTATG GAATCCTGGAAGGCTACAGTTAACCCTGTTACTAGATCCACACT TAGCTATCCTAAAGAATTTGCAAATGATCTCTCAAATGTATCTA GTAAGAATGTCCAATCACATAAAGATGAAAGAAGTTGGAACAT GGGGTCCACTAATGATCCAATGGATGTTTCTCGGAGCCTTGTAG ATAATAAATTAAATACTGAAGAAAACATCAAGGGTGCACCTAG ATGGAGATCTGATGATGCGAGTGATGAGGAAGATGATCGGGAT GTGGGAAGAGCAATGGATATAGCTTATTATTCAACTCCTCCAACTCAGATGACAAGACGAAGCAGAGTTTCCAGGAGA(SEQ ID NO.:95)

过表达载体中的GmHOS1b片段序列如SEQ ID NO.:77所示： ATGAAGAAAAAGAAAAACAAAAAAGCGTTTCAAAAACCCTCCA ATTCCAATCTGTATGGAGTTTTTCCCTCTACGAGACACAGAGTT GTTCCGAGTACAAATAAATCTGCACCGTTTAATAATCTCGCACC TCATTTCTCAGTGCTTGATCAAATCTGTCTCAGTTCTCCGTTTGG TTATTATTTCTCAGTAATGGATAGGAGGCTCAACGGACCCACCG TTTCGTCCAGCTCCAACGGCGGCCCCGCCGTCGGACGATCTTCT CCTACGCTTCAACCAAACTACAGTAGCCGATTAGTTCAGGAAGC ATTGGAACACTTGGCATCCATTGATCTGATTGAGTTGTGCAAAG AAGCCAAAGTTGAGCGCTGTCGAGCAACTCGAGACTTGAGAAG CTGTGGTCGCTATGTCCACCATGTCTTGAATTCCTGCAGACATG CCTCTTTATGCGAAGAATGTAGTCAACGGTGTGATATCTGCCCA ATTTGTAGAATCCCAATTTCAAAAAGTGGTGCTAAAGTGCATCT CCGACTTTATTATGAGTGCATAGAAGCAGGCCTTATTTCCAAAA GGTGTGATGAGAGATTTCAAGAAAGAGAAGATGGGGAGAAAGACCTAACTGCTGATGTACAGCGCCTTTATTCTCTGTTTGATGTTA CACTTGAGAATAACTTGGTTTCTTTAATTTGCCACTACATCACTG ATGTATGTATGGATGAAACTGCTGTTTCCAGTGATCCTGTCATA GCATTTTTGTTGGATGAAGTGGTAGTGAAGGATTGGTGCAAGAG GACATTCAAAAACATCATTGCTGAACTGCAGGGAATTTATGATA TGGACATTTTAGGCTTGAAAGAGAGATTGAGTTTACTTCTGAAA TTTTCATTATACTTGAAGGGCATATCGAATGTGCTAGACATTTT GGAGTCATCTTTTAAGGGTACTCTTTCAGCACAACTGCACGATT TGCAGAATCTCCAAGAGAGCATCATGAAGACAAAACAGCATAT GGATGTTATTATTTGGTGTACAAGACATCAATTTTTGGAAGGTG TGAGGTCACGTTTTACTGATGGTTCATCATGGTCATCAGTTGTTC GGATACGAAAATCAGAAGCAATTAGACGAGCATGGCCTGATGC AATAAATCAATCTGTGGAGTCACAAGGACATGATGGGTCTCTAT TTATTGAAGATGCATTGAATAATCTTGATCTGGAGGAGGGGTTT AGGAATGAAATTGTAGAGGGATTAGAAATTGCATCCTTGCAGA AGGATAGTGCATCATTTTTGGGGTCAAATACTGATCAGATGCTG GGTTACTATCCCTTCAAAAATCTTCGTTCTGCTGTTGACTTGCTC TTTTTACATGGAGGCTCTGATATGGTGGTTGCAAAACAGGCCAT TTTTCTGTATTATTTATATGATCGCCACTGGACAATTCCTGAAGA GGAATGGAGATACATACTGGAGGACTTTGCAGCTACATTTAGTG TTAACAGGCACTCATTACTTGAGTCTTTGACTTTTTACCTTCTGG ATGATCACACAGAGGAGGCTTTACAGGAAGCTTGCCGCCTTCTT CCTGAAATAACTGGCTCAACATCACATCCTAAAATTGCTGAAGT ACTATTAGAAAGGGGTATCCCTGATACAGCTCTCATGGTCTTGA GGTGGGCTGGGCGTGATGGTGGACCTCACTTGACTTCACTCAGA GATGGTGTCACTGCAGTGCGGGTGAGGGTTGAGTGTGGGCTTCT GACTGAAGCATTTATGCATCAGAGAGTGCTCTGCACCAGAGTGAAGGAAAAGAATTTCAATAAAACAGCATCTGGGAATACTTCTG AGAAGCAAAAAGGCCAATTTAGTAATTGGGTGGAGTGGGTGGA GGTCCTGGTGACTGAGATTTGTTGCCTCTGTATTAGGAGGAACT TGGTGGATCGAATGCTAGAGTTGCCTTGGAATTCCGAGGAAGA GAAGTATATACATAAATGCCTTTTGGATTATGCTATTGAAGACC CTCTAAGGACATCAGGAAATCTACTTGTTGTGTATTATTTTCAG CGCCACAGATACTCTGAAGCATATCAAGTTCATATTAAACTTGA AAAGGTGGAGCAAGATTGCATTTCAAAAGGTTCCATAAGTCAA GAAAATCTGCCCATATTAGAAAAGGCTATTCACATTAGAGGCA ATTTGATTAATAGATGCTTGGAATTGTTGCCAGAAGTTGAGCAG CAACAACTGAGGAGCGGAAACTTGACTGAAGGTGTTGTTACTT GTTGTGCAGAAGTTGAAATTCCTGACAAATTTGATGTTCCCCAGATTCAGGATTTCTTGTCGACCAGTTTGTTGATTCCTTCATCTGCA AATTCTTCCCTGACATTGCATAAAGATCATCCGACTGGCTTGTT GAGTTCGTCGACTTTAGGAAGATCAGCCAAAATAGGCATGTCTT TCCCTACTACTGGCACTGAGCTTGGTAATTTTGGTTCCTTTTCAT ATCATCATGATGGGTTATTTACAAATAACGAGAGGGTTCCAAGT CATCTAAGTAAAATTGGCAAAAATCTAAGAAATGATAACACTC CAACTCCAAGGAATCATAGGATCCGTTTCATGAATGGTTCACCC CTGAAGGGATTTAATAGGACATCACCAAGCAATTCCCAGGAAA ATAGGCCAGACAAAATCTTGCCTGAAGTTGAACAAAATCTACA TTTTGGCCATAATCAAACTACCAGTCCTATGTACTCCTGGAAGG CTACAGTCAACCCTGTTACTAGATCCACACTTAGCTATCCTAAA GAATTTGCAAATGATCTCTCAAATATATCTAGTAGGAATGTCCA ATCACATAAAGATGATAGAAGTTGGAACATGGGGTCCACTAAT GATCCAATGGATGTTTCTCAGAGCCTTGTTGAGAAGAAATTAAA TACCGAAGTAAACATCAATGGTGGACCTAGATGGAGATCTGAT GATGCAAGTGATGAGGAAGATGATCTGGATCTGGGAAGAGCTA TGGATATAGCTTATTATGCAAGTCCTCCAATTCGGACGACAAGACGAAGCAGAGTTTCCAGGAGA(SEQ ID NO.:96)

实施例5 GmHOS1s对开花基因表达的影响分析

在长日照(16h光照/8h黑暗)条件下种植天隆1号、Gmhos1a、 Gmhos1b、Gmhos1a/b各10株，生长约21天时(待第二片三出复叶完全展开)开始取样，取幼嫩的刚刚展开的第二片复叶，每三株混取为一个样品，每个样品取三个生物重复，每4h取一次，共取24h(前 16h为光照，后8h为黑暗条件)。同时在同样条件下种植野生型天隆1号和GmHOS1s过表达材料，同样方法取样分析开花基因表达变化，但黑暗前作为0h。

5.1 Gmhos1a和Gmhos1b突变体长日照下具有早花表型

在短日照(10h光照/14h黑暗)，长日照(16h光照/8h黑暗) 条件下分别种植野生型天隆一号和Gmhos1a、Gmhos1b纯合突变体，对上述材料的开花时间进行统计分析，对有表型的株系拍照保存。

结果：在短日照条件下Gmhos1a和Gmhos1b突变体较野生型早开花一天左右，进行T测验分析结果发现与野生型没有显著差异(图 8)。说明短日条件下Gmhos1a和Gmhos1b突变体没有开花表型。长日照条件下Gmhos1a-ab1-1与野生型相比早花3天左右，且具有显著性差异(图9)。Gmhos1b-3-1也具有早花表型，但没有Gmhos1a突变体早花表型明显，统计结果表明较野生型开花早2天左右，显著性测验表明与野生型比较也具有显著性差异。突变体的早花导致了生育周期稍有缩短；但突变体和野生型的株高和节数没有显著差异。缺失 63个碱基的Gmhos1a-ab1-3在长、短日照条件下均无明显表型，开花时间与野生型几乎没有差别，说明这63个碱基缺失可能未影响 GmHOS1a的蛋白翻译和空间结构，因此未影响开花时间。

5.2 Gmhos1a/b突变体长、短日照下均具有早花表型

为了确定GmHOS1s两基因之间是否存在部分功能冗余，在长短日照条件下观察野生型、Gmhos1a/b纯合突变体表型，对其开花时间进行统计分析。

结果：在短日照条件下，Gmhos1a/b突变体开花时间比野生型天隆一号提前约两天(图10)，而长日照条件下，Gmhos1a/b突变体的早花表型更为明显，统计分析显示比野生型早花3-4天(图11)。无论在长、短日照条件下，Gmhos1a/b突变体开花时间均显著早于野生型，且其开花时间明显早于Gmhos1a和Gmhos1b突变体。说明 GmHOS1a和GmHOS1b在大豆开花调控上存在功能叠加效应。

5.3 GmHOS1s过表达具有晚花表型

为了确定GmHOS1s的功能，也将构建好的GmHOS1s过表达载体(35S::GmHOS1a-FLAG和35S::GmHOS1b-FLAG)进行了大豆遗传转化，并获得了一些GmHOS1a和GmHOS1b的过表达株系。通过 Western Blot技术对所有的过表达株系进行GmHOS1s蛋白含量测定，均没有发现蛋白含量有所积累。于是利用qRT-PCR技术再对过表达株系GmHOS1s表达量进行测定。

结果：过表达株系GmHOS1a-FLAG-42和GmHOS1b-FLAG-1中 GmHOS1s基因的表达量较高(图12A)。将这两个株系种在短日照和长日照条件下进行表型观察，统计它们的开花时间，分析发现相比于天隆一号均有晚花表型(图12B和C、图13A和B)；短日照下 GmHOS1a-FLAG-42过表达比野生型开花晚一天，但显著性测验表明是晚花具有极显著差异，而GmHOS1b-FLAG-1的开花时间也略晚于野生型，但是没有显著性差异的。长日照下GmHOS1a-FLAG-42和 GmHOS1b-FLAG-1过表达的晚花表型更为明显，与野生型的开花时间都具有极显著差异。过表达的表型分析进一步确定了GmHOS1s在调控大豆开花时间的过程中发挥重要功能。

5.4 GmHOS1s与GmCOs互作，GmELF3s、GmCOP1s与GmHOS1s 不互作

在模式植物拟南芥中，AtHOS1长日照条件下可通过泛素化降解 CO来参与调控植株开花。hos1突变体的早花表型受到CO突变的抑制，进一步支持了光周期开花中HOS1介导CO降解。为了探讨 GmHOS1s调控开花的分子机制与拟南芥是否相同，利用拟南芥CO(AT5G15840)氨基酸序列，在大豆参考基因组网站中 (https://phytozome.jgi.doe.gov)Blast分析找到四个CO同源基因，登录号分别为Glyma.13G050300，Glyma.18G278100，Glyma.08G255200 和Glyma.19G039000，并命名为GmCO1、GmCO2、GmCO3和GmCO4。

利用酵母双杂交验证GmHOS1s与GmCOs是否存在相互作用，结果表明GmHOS1a在暗黑条件下均可与GmCO1、GmCO2、GmCO3 和GmCO4蛋白相互作用，但互作强度逐渐减弱(图14)。GmHOS1b 可以与GmCO1、GmCO2互作，与GmCO3、GmCO4几乎不互作，由此说明GmHOS1s可能也通过降解GmCOs来参与大豆开花调控。进行了大豆中GmHOS1s与GmELF3s互作实验，结果发现GmELF3s 并不与GmHOS1s互作(图15A)。由此说明GmELF3s与GmHOS1s 可能在PHYB-PIF4通路中独立发挥作用。利用酵母双杂交检验大豆中GmHOS1s与GmCOP1s是否存在互作，结果发现GmHOS1s不与GmCOP1s互作(图15B)。由此说明两个基因不在一条信号通路发挥作用。

5.5 GmHOS1s可上调E1基因的转录表达来延迟大豆开花

为了研究GmHOS1s是否影响已知开花基因E1、FT2a的转录表达，将野生型、Gmhos1s突变体和GmHOS1s过表达株系分别种植于长日照三周，取样观察不同材料中已知开花基因的动态转录水平。

结果：Gmhos1s各突变体不影响GmCCA1a和J基因的转录水平，但可降低E1和GmFT4的表达量，且Gmhos1a/b非纯合突变体降低E1和GmFT4的表达量的程度高于任何一个Gmhos1s突变体(图16)，这与前期表型结果一致，进一步说明GmHOS1a和GmHOS1b在开花调控上存在功能冗余。同时GmHOS1s过表达株系亦可增加E1和 GmFT4的转录，略微降低GmFT2a和GmFT5a的转录(图17)，综合以上结果说明GmHOS1s可能通过促进E1的转录表达来延迟大豆开花，但GmCCA1a和J的表达量变化没有差异，说明GmHOS1s通过其它途径促进E1基因的转录表达。

实施例6 GmHOS1s突变可增强大豆耐寒性

6.1 GmHOS1s突变可增强大豆耐寒性

当植物体遭遇低温胁迫时，会损伤细胞原生质结构而使细胞透性发生变化，内含物发生渗漏，电导率变大。而电导率越大，表明植株受到伤害越大，耐寒性越弱。鉴于上述原因我们对Gmhos1s突变体材料进行低温处理，通过测量突变体材料和野生型的叶片浸出液的相对电导率来判断Gmhos1s突变体材料是否具有耐寒性。

在长日照条件下25℃左右种植天隆1号、Gmhos1s突变体材料 20株，约生长10-12天后(第一片三出复叶完全展开时)移至4℃长日照培养箱中，除温度其他条件均保证一致；低温处理前和处理4天后，混取三棵植株的单叶为一个样品，每个株系取三个重复。共取三个株系作为三个生物重复。

结果：低温处理前取三出复叶浸入ddH2O中，测3h内的相对电导率变化情况。野生型、Gmhos1a、Gmhos1b和Gmhos1a/b突变体相对电导率的变化趋势几乎相同，最终的相对电导率值也没有显著差异 (图19A)。

4℃处理四天后，再次取复叶测叶片相对电导率，处理数据发现叶片刚浸入ddH₂O(0h)时，野生型、Gmhos1a和Gmhos1b相对电导率几乎相同，但随着浸泡时间的延长，Gmhos1s突变体的相对电导率较野生型增长缓慢，至3h时Gmhos1s突变体的相对电导率明显低于野生型天隆一号，其中Gmhos1a/b突变体增长最为缓慢，其次是 Gmhos1a，Gmhos1b的增长趋势与野生型相近，但略低于野生型，最终相对电导率为WT＞Gmhos1b＞Gmhos1a＞Gmhos1a/b(图19B)， Gmhos1a和Gmhos1b突变体都具有耐寒性，但耐寒程度小于 Gmhos1a/b突变体。综合以上结果可知GmHOS1s可参与大豆冷胁迫响应，且GmHOS1a和GmHOS1b在调控冷胁迫响应上存在功能冗余。

6.2 GmHOS1s突变可上调GmICE1s和GmCBF3s的转录而响应低温胁迫

低温胁迫严重影响着植物生长和作物产量，前人研究表明拟南芥 HOS1是低温信号通路的关键组成部分，低温条件下可通过降解ICE1 而影响CBF3基因转录，从而负调控低温胁迫。而GmHOS1s是否可以影响ICE1和CBF3基因转录表达参与低温胁迫响应，本实验利用AtICE1(AT3G26744)和AtCBF3(AT3G26744)氨基酸序列，在大豆参考基因组网站中(https://phytozome.jgi.doe.gov)Blast分析找两个ICE1和CBF3各两个同源基因，登录号分别为Glyma.04G200500， Glyma.06G165000，Glyma.09G147200和Glyma.16G199000，并命名为GmICE1a、GmICE1b、GmCBF3a和GmCBF3b。

将在长日照25℃生长12天的Gmhos1s突变体低温4℃处理4天取样检测，qRT-PCR分析低温处理前后GmICE1a、GmICE1b、 GmCBF3a和GmCBF3b四个基因表达量变化情况。GmICE1a和 GmICE1b在野生型中低温处理前后表达量无明显变化，但在Gmhos1s 各种突变体中表达量显著上调。GmCBF3a和GmCBF3b受低温诱导表达，但GmCBF3a表达量在各个材料中无明显差异，而GmCBF3b 在Gmhos1s各突变体中基因表达上调程度远高于野生型，尤其是 Gmhos1a/b中。Gmhos1s突变体促进以上基因的转录表达，可激活 GmCBF3s下游低温信号通路，使突变体获得耐寒性。综合以上结果表明GmHOS1s可调控GmICE1a、GmICE1b和GmCBF3b的转录而响应植物低温胁迫。

实施例7 GmHOS1s突变可使大豆下胚轴伸长

光照下拟南芥HOS1可与PIF4互作，抑制PIF4的转录激活活性，间接影响生长素相关基因的表达从而调节下胚轴的伸长(KIM et al., 2017b)。但在人工气候室种植，无论是在长日照还是短日照条件下 Gmhos1s突变体和过表达材料株高均与野生型无差异，说明大豆中 GmHOS1s可能不参与调控植株高度。进一步探究了大豆中GmHOS1s 是否参与调控幼苗下胚轴光形态建成。

在长日照培养箱中观察Gmhos1s突变体材料幼苗的下胚轴， Gmhos1b的下胚轴长度略长于野生型，但Gmhos1a和Gmhos1a/b突变体(非纯合)下胚轴长度明显高于野生型，Gmhos1a与杂合的 Gmhos1a/b幼苗下胚轴长度几乎一致(图18)。说明GmHOS1s参与调控下胚轴生长，其中GmHOS1a起主要作用。此次试验在培养箱中种植Gmhos1s突变体材料可观察到下胚轴表型，分析可能培养箱中光照强度较人工气候室弱，而使突变体下胚轴表型更加明显。

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Claims

1.一种分离的基因，其具有如下的核苷酸序列：

(1)SEQ ID NO.:1或3所示的序列或其互补序列；

(2)在严格杂交条件下与SEQ ID NO.:1或3杂交的序列；

2.一种分离的DNA分子，其包含权利要求1所述的基因，该DNA分子具有GmHOS1a基因或GmHOS1b基因的生物学功能。

3.如权利要求1所述基因或如权利要求2所述的DNA分子，其中所述基因对应的CDS序列如SEQ ID NO.:5或6所示。

4.如权利要求1所述基因或如权利要求2所述的DNA分子，其包含选自下组的一种或多种突变体：Gmhos1a-ab1-1、Gmhos1a-ab1-2、Gmhos1a-ab2-4、Gmhos1b-3-1、Gmhos1b-3-2、Gmhos1b-3-3、Gmhos1b-3-4、Gmhos1b-3-5、Gmhos1a/b-1-1、Gmhos1a/b-1-2、Gmhos1a/b-1-3、Gmhos1a/b-2-1，优选包含选自下组的一种或多种突变体：Gmhos1a-ab1-1、Gmhos1b-3-1、Gmhos1a/b-1-1。

5.一种重组载体，其包含如权利要求1所述的基因或如权利要求2所述的DNA分子。

6.一种分离的蛋白质，其具有如下的氨基酸序列：

(1)SEQ ID NO.:2或4所示的氨基酸序列；

(2)由权利要求1所述的基因编码的序列；或

(3)包含一个或几个氨基酸残基的置换和/或缺失和/或添加的SEQ ID NO.:2或4所示的氨基酸序列。

7.一种宿主细胞，其包含如权利要求1所述基因、如权利要求2所述的DNA分子、如权利要求5所述的重组载体或如权利要求6所述的蛋白质。

8.一种转基因植物，其包含如权利要求1所述基因、如权利要求2所述的DNA分子、如权利要求5所述的重组载体或如权利要求6所述的蛋白质。

9.如权利要求8所述的转基因植物，其中所述植物为单子叶植物或双子叶植物，优选为拟南芥或大豆。

10.如权利要求1所述的基因、如权利要求2所述的DNA分子、如权利要求5所述的重组载体或如权利要求6所述的蛋白质在调控植物开花时间和/或耐寒性中的应用。

11.根据权利要求10所述的应用，其中所述植物为单子叶植物或双子叶植物，优选为拟南芥或大豆。

12.一种培育转基因植物的方法，包括将如权利要求1所述的基因引入目的植物以获得转基因植物，从而调控所述转基因植物的开花时间和/或耐寒性。

13.如权利要求12所述的方法，进一步包括获得所述转基因植物的种子。

14.如权利要求12所述的方法，其中所述植物为单子叶植物或双子叶植物，优选为拟南芥或大豆。

15.如权利要求13所述的方法，其中所述转基因植物中GmHOS1a基因和/或GmHOS1b基因发生突变；优选地，所述转基因植物中GmHOS1a基因和GmHOS1b基因均发生突变。

16.一种调控植物开花时间的方法，包括将如权利要求1所述的基因、如权利要求2所述的DNA分子或如权利要求5所述的载体引入植物中以使其在植物中表达。

17.如权利要求16所述的方法，其中所述植物为单子叶植物或双子叶植物，优选为拟南芥或大豆。

18.如权利要求16所述的方法，其中所述植物中GmHOS1a基因和/或GmHOS1b基因发生突变，以提前所述植物的开花时间；优选地，所述植物中GmHOS1a基因和GmHOS1b基因均发生突变，以提前所述植物的开花时间。

19.一种调控植物耐寒性的方法，包括将如权利要求1所述的基因、如权利要求2所述的DNA分子或如权利要求5所述的载体引入植物中以使其在植物中表达。

20.如权利要求19所述的方法，其中所述植物为单子叶植物或双子叶植物，优选为拟南芥或大豆。

21.如权利要求19所述的方法，其中所述植物中GmHOS1a基因和/或GmHOS1b基因发生突变，以增加所述植物的耐寒性；优选地，所述植物中GmHOS1a基因和GmHOS1b基因均发生突变，以增加所述植物的耐寒性。

22.一种生产转基因植物的方法，所述转基因植物包含引入的如权利要求1所述的基因、如权利要求2所述的DNA分子或如权利要求5所述的重组载体，或者其重组表达如权利要求6所述的蛋白质，包括获得所述转基因植物的种子，并种植所述种子以获得所述转基因植物。