CN1784494A - 提高植物对应激的抗性的方法和组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了提高植物应激耐受性的方法和组合物。拟南芥MYB8转录因子(也称为HOS10)参与调节植物对寒冷、干旱、渗透性应激、植物激素脱落酸和盐度的应激应答。

Description

提高植物对应激的抗性的方法和组合物
背景技术
环境因素例如干旱、土壤盐度和不利的温度导致植物应激并造成植物产量的减少。非生物性应激所造成的如水稻、小麦和玉米这样的主要农作物的农作物产量损失代表了一个重要的经济及政治因素，并引起了许多国家的粮食短缺。需要开发应激耐受性植物以克服这些限制并增加植物产量。尝试选择提高应激抗性的基因的传统育种策略只取得了有限的成功，因为应激耐受性性状有着复杂的遗传特性，这使得通过植物育种方案所获得的进展缓慢而不可预测。
绝大多数植物有进化策略以保护它们自身对抗例如干旱和不利的温度这样的不利环境条件。例如，当植物被暴露于不利的高生长温度时，正常蛋白的合成被减少并开始了热休克蛋白的快速合成。同样地，植物的低温适应与用作抗冻剂的亲水蛋白的合成有关。许多植物通过蓄积高水平的被认为是保护植物组织免受渗透性应激的蛋白质以应答干旱和盐度应激。但是，如果这些应激条件的严重程度和持续时间是强或持续较长的时间，对植物的发育、生长和绝大多数农作物植物的产量的有害影响是显著的。持续暴露于干旱和高盐分引起植物代谢的较大变化。这些代谢干扰最终导致了细胞死亡并及随后的产量损失。
信号感知启动了一般的应激信号传导途径，随后生成了第二信使(例如，磷酸肌醇和活性氧)。第二信使可以调控细胞内Ca2+水平，细胞内Ca2+水平常常触发蛋白质磷酸化级联反应，该反应靶向于直接参与细胞保护的蛋白或控制特异性的各组应激调节基因的转录因子的。这些基因的产物可以参与如植物激素这样的调节分子的生成，所述植物激素有例如脱落酸(ABA)、乙烯和水杨酸。这些调节分子反过来可以传递第二轮的信号应答。
植物激素脱落酸(ABA)介导了多种生理过程，包含对干旱和盐应激的应答。ABA是在缺水条件下生成的，这引起气孔的关闭和对干旱及盐应激的耐受性。
变更某些转录因子的表达可以极大地影响植物的应激耐受性。例如，转录因子C-BOX结合因子1(CBF1)的过量表达使得植物对寒冷应激的耐受性被增强。转录因子脱水反应元件结合因子1A(DREB1A)的诱导表达也造成了对一些应激条件包含干旱、盐和寒冷的耐受性被提高。
应激信号转导需要所有相关的信号分子的适当的空间和时间的协调。MYB(最初被鉴定为禽成髓细胞瘤病毒的转化决定子)基因包含真核细胞中的一个大家族的转录调节基因并涉及多种生物功能。MYB蛋白的一个共同特点是具有在动物、植物和酵母菌中保守的功能性DNA结合结构域(MYB结构域)。典型地，MYB结构域由1-3个被称为R1、R2和R3的不完全(不相同)重复构成。每个重复约50个氨基酸长并含有三个螺旋，第二个和第三个螺旋形成了螺旋-转角-螺旋(HTH)的DNA结合结构。MYB蛋白在MYB结构域外表现出很小的序列相似性，因此基于结构域内的重复的数目被分类为亚家族。
在植物中，一些MYB基因被表征，在拟南芥中已经鉴定出了超过100个成员。与动物不同，绝大多数植物MYB基因属于R2R3-MYB亚家族。已经表明植物MYB基因参与了植物的发育、激素信号传导和代谢的许多方面的调节。与c-Myb(细胞增生)有关的“经典的”MYB因子可能参与了动物、植物和其它更高等的真核细胞中细胞周期的调控。植物的MYB蛋白的功能包含次级代谢的调节、细胞形态发生的调控，以及分裂组织形成和细胞周期的调节。
发明概述
参与植物应激耐受途径的基因特别是转录因子的调节物对于通过遗传工程授予植物耐受性是有益的，因为单个基因可以激活导致耐受性表型的基因的整个级联反应。
一种用于提高植物对应激的应答的方法，该各个包含以下步骤：
(a)将一种DNA分子转入植物中，所述DNA分子的核苷酸序列编码与SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列有至少90％相同性的多肽；以及
(b)在该植物中表达所述DNA分子。
所述DNA分子包含SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列，它被稳定地整合于植物基因组中或被瞬时表达。其它也提高植物对应激的应答的其它DNA分子也可以被转入以进一步增强应答。
所述应激可以是寒冷、渗透性、干旱或脱落酸。
所述多肽是如SEQ ID NO：1所示的拟南芥的HOS10转录因子。所述植物是单子叶或双子叶植物。
本发明的转基因植物包含一种编码HOS10多肽(SEQ ID NO：1)的重组核酸，该蛋白在植物内的表达的增加使得植物的抗寒性增加。所述植物可以是单子叶或双子叶植物。
植物种子包含一种编码具有与SEQ ID NO：1有至少90％相同性的氨基酸序列的多肽的核酸分子。
本发明的表达盒包含一种在植物细胞中有功能的启动子，其被可操纵地连接到编码HOS10多肽(SEQ ID NO：2)的分离的核酸序列上，这导致多肽在植物细胞中的表达增强并使得植物抗寒性增加。
所述启动子可以是应激诱导的，例如ABA-诱导型启动子、细胞膨胀-诱导型启动子和乙烯反应性启动子。
所述启动子可以是病毒外壳蛋白启动子、植物组织特异性启动子、单子叶植物启动子、遍在蛋白质(ubiquitin)启动子、CaMV 35S启动子、CaMV 19S启动子、nos启动子、Adh启动子、蔗糖合酶启动子、微管蛋白启动子、napin启动子、肌动蛋白启动子、cab启动子、PEP Case启动子、7S-α’-伴大豆球蛋白启动子(7S-alpha’-conglycinin promoter)、R基因复合启动子、西红柿E8启动子、patatin启动子、甘露氨酸合酶启动子、大豆种子蛋白大豆球蛋白启动子、大豆营养贮藏蛋白启动子、噬菌体SP6启动子、噬菌体T3启动子、噬菌体T7启动子、Ptac启动子和根细胞启动子。
本发明的植物载体包含编码HOS10多肽(SEQ ID NO：1)的重组核酸，其中所述多肽在植物中的表达使得植物的抗寒性增加。
本发明的宿主植物细胞包含编码HOS10多肽(SEQ ID NO：1)的重组核酸。所述蛋白质在植物细胞中的表达使得植物的抗寒性增加。
本发明的植物载体包含编码HOS10多肽(SEQ ID NO：1)的重组核酸。其中所述多肽在植物中的表达使得植物对抗盐性增加。
本发明的宿主植物细胞包含编码HOS10多肽(SEQ ID NO：1)的重组核酸。所述多肽在植物细胞中的表达使得植物的抗盐性增加。
在应激耐受性的研究中所用的模型植物是拟南芥。包含嵌合的RD29A∷LUC转基因的遗传学筛选和低光度视频成像技术被用于分离一些拟南芥的应激反应性突变体。RD29A启动子是寒冷、渗透性应激和ABA应答性的。表达RD29A∷LUC转基因的生物发光性拟南芥植物被用于鉴定一些拟南芥突变体，这些突变体中高盐分、寒冷和ABA对应激反应性基因的诱导被改变了。这些突变体表现出在应答各种非生物性应激或ABA处理时，RD29A∷LUC基因在结构型(cos)、高(hos)或低(los)水平的表达被改变。
定义
“启动子”指的是位于转录起始点的上游和/或下游，并参与RNA聚合酶及其它蛋白的识别和结合以启动转录的核酸分子区域或序列。“植物启动子”是能启动植物细胞内的转录的启动子。这样的启动子可以来源于植物基因或来源于其它有机体，例如能感染植物细胞的病毒。应激诱导型启动子指的是在应答外源性应激反应时能从可操纵地连接的异源序列启动转录，所述应激例如是盐度、干旱和寒冷。对于实现功能，启动子不必是全长的。
“可操纵地连接”指的是启动子和另一种核酸分子之间的功能性连接，其中所述启动子序列启动了另一序列的RNA的转录。
“核酸序列”指的是形成单链或双链分子的有序的脱氧核糖核酸或核糖核酸碱基组。
“植物”包含整个植物、枝条营养器官/结构(例如，叶、茎和块茎)、根、花和花器官/结构(例如，苞片、萼片、花瓣、雄蕊、心皮、花药和胚珠)、种子(包含胚芽、胚乳和种皮)以及果实(成熟子房)、植物组织(例如维管组织、基本组织等等)、细胞(例如保卫细胞、卵细胞、香毛簇等等)、和相同的子代。可用于本发明的方法中的植物种类通常其范围广泛到能进行转化技术的高等或低等植物，包含被子植物(单子叶植物和双子叶植物)、裸子植物、蕨类和多细胞藻类。它包含多种倍体水平的植物，包含非整倍体、多倍体、双倍体、单倍体和半合子。
“重组”指的是人工操纵的多核苷酸或人工操纵的多核苷酸的拷贝或互补链。例如，作为人工操纵的结果，包含可操纵地连接到另一个核苷酸上的启动子的重组表达盒可以包含一个异源于另一多核苷酸的启动子。
“基因”指的是染色体DNA、质粒DNA、cDNA、合成DNA、或其它编码肽、多肽、蛋白或RNA分子的DNA、以及参与表达的调节的编码序列的侧翼区域。
涉及两个核酸或多肽序列的“序列相同性”或“相同性”指的是当在特定的比较窗中进行比对达到最大符合度时，两个序列中的相同的残基。当序列相同性百分比用于蛋白质时，得到公认的是不一致的残基位点间的差异通常是由保守氨基酸的不同取代引起的，其中氨基酸残基被具有相似化学特性(例如电荷或疏水性)的其它氨基酸残基所取代，因此不改变该分子的功能特性。具有不同的保守取代的序列被称为具有“序列相似性”或“相似性”。
Hos10-1(和myb8-1)在本文中指的是由T-DNA插入所形成的突变DNA分子。Hos10(myb8)指的是相应的基因。HOS10(MYB8)指的是hos10(atmyb)基因所编码的多肽。HOS10同义于AtMYB8或简单地表示为MYB8。
附图说明
图1表示的是对低温或植物激素脱落酸(ABA)或渗透性应激进行应答时，多肽HOS10负控制RD29A∷LUC的表达。野生型位于垂直分隔的左半边，HOS10-1位于右边。突变型HOS10-1植物细胞表达更多的荧光。(A)显示了相对荧光；(B)定量的荧光。
图2表示hos10-1突变体对冷冻处理是敏感的：(A)表示相对的植物生长；(B)相对成活率的统计学分析；(C)电解质渗漏的测定。
图3hos10-1突变体的种子发芽对ABA抑制是超敏的(左图)，hos10-1突变体植物在缺水条件下失水更多(右图)。误差条表示标准差(左图n＝5，右图n＝8)。
图4显示(A)和(B)hos10-1突变体植物对NaCl，(C)LiCl超敏；以及(D)该突变体的幼苗蓄积了更多的Na+；(E)显示出在K蓄积上只有很小的差异。
图5(A-E)表示hos10-1植物的发育缺陷。每张照片的右侧是突变体，左侧是野生型植物。
图6表示(A)T-DNA在hos10-1位点上的插入位置；(B)hos10-1突变体表型与野生型hos10基因的互补作用；和(C)在不同的植物物种中比较HOS10(AtMYB8)的序列比对。HOS10编码R2R3型MYB转录因子。箭头代表R2和R3结构域的分界。
图7显示了AtMYB8转录因子(HOS10)的氨基酸序列(SEQ IDNO：1)(A)和核苷酸序列(SEQ ID NO：2)(B)。
发明详述
尽管在附图及本申请说明书中详细地图解和描述了本发明，但是这种图解和描述应被视为用于举例说明而非对本发明的限制，应当理解说明书只对例证性实施方式进行了说明和描述，所有不偏离本发明所公开的内容的变化和修饰形式都落入本发明的范围内。
HOS10表现为是包含RD29的应激反应性基因包含A的负调节物。选择突变体hos10-1进行表征，在应答低温、ABA或NaCl时，该突变体显示出对RD29A:LUC基因的诱导的增加(图1)。用TAIL-PCR鉴定出引起该突变的遗传位点；hos10编码R2R3型MYB转录因子，对应于AtMYB8(GenBank登录号：AF207991；基因标识符At5g35515)。构成地表达或应答应激反应，例如干旱(例如位于ABA诱导型启动子下)时表达hos10的转基因植物比不表达hos10或以低水平表达hos10的植物表现出对外来应激的抗性或耐受性更强。
图1表示应答低温、ABA和NaCl时，RD29A∷LUC在hos10-1中的表达明显高于在野生型幼苗中。甚至在室温下，RD29A∷LUC在hos10-1中的表达也高于在野生型幼苗中的表达。应答寒冷、ABA或渗透性应激时，hos10-1突变增强了RD29A∷LUC的表达。(A)用荧光强度(读数/植物)定量测定RD29A∷LUC的表达。显示的是野生型和hos10-1幼苗以及它们在室温、或0℃处理24小时后、或用100M ABA处理3小时后，或用300mM NaCl处理5小时后的荧光图象。右侧的比例标尺表示从暗色(最小)到白色(最高)的荧光强度。(B)对如(A)中所示的荧光图像的定量。数值代表的是20株单幼苗的荧光强度的平均值。误差条表示标准差。
因为hos10-1突变体植物表现出对寒冷、盐度和ABA处理的敏感性的增强，所以HOS10(MYB8)的表达使得对这些应激反应的抗性或耐受性增强。例如，与用空载体转化的hos10-1突变体植物相比，HOS10多肽在hos10-1突变体植物中的异位表达造成对冷处理的抗性增加(实施例1)。
在耐冻性试验中，hos10-1突变体植物显著地显示出对冷冻的更大的敏感性(图2)。hos10-1突变体植物在冷适应性上有缺陷(图2)，这产生了冷冻敏感性表型。(A)在冷冻处理(-8℃处理4小时)之前，将生长在生长箱中的四周龄野生型和hos10-1植物在4℃以及光照条件下(16小时光照，8小时黑暗)冷适应8天。冷冻处理后7天照相。(B)对如(A)所示的冷冻处理7天之后的植物存活率的统计学分析，误差条表示标准差(n＝60)。(C)电解质渗漏测定。通过将植物在4℃下暴露8天获得冷诱导的适应性。hos10-1(A)、冷适应的hos10-1、野生型(A)、冷适应性的野生型。误差条表示标准差(n＝8)。
以组织特异性方式表达的Myb8(hos10)的也在本申请公开的范围内。例如，根特异性启动子下的myb8(hos10)的表达造成了myb8(hos10)在植物根中的选择性表达，并给根细胞提供了对高盐度或冷冻的保护作用。根特异性启动子包含，例如来自碗豆的金属硫蛋白样基因PsMTA的启动子(Fordam-Skelton，et al.1997)。可以在http：//rarge.gsc.riken.go.jp/cdna/promoter/和Higo et al.(1999)中找到植物启动子的顺式作用的植物调节序列的其它实例。
myb8(hos10)在花或任何其它的花器官中的组织特异性表达使得对冷冻的耐受性增加。例如，位于花瓣或萼片特异性启动子控制下的表达导致了在不利温度期间的耐冻性。来自矮牵牛的查耳酮合酶(CHS)启动子是花瓣特异性启动子的一个实例。
myb8(hos10)在果实、叶、茎、叶柄或任何其它植物部分的组织特异性表达都使得对冷冻的耐受性增加。
在hos10-1突变体植物中所观察到的对RD29A的更高的诱导可能是由于超敏所造成的反馈性应答。因为突变体对应激处理是高度敏感的，应激反应性基因，例如RD29A更容易被激活以弥补该突变体被降低的应激耐受性。HOS10很可能对于应激耐受性和应激基因的表达都很重要。
Hos10-1突变显示出影响了ABA敏感性和失水(图3)。Hos10-1突变体的种子发芽对ABA抑制是超敏的(左图)，hos10-1突变体植物在缺水条件下失水更多(右图)。误差条表示标准差(左图n＝5；右图n＝8)。
Hos10-1突变显示出影响了突变体植物的盐敏感性(图3)。如(A)生长于MS培养基或添加有80mM NaCl的MS培养基中的hos10-1和野生型幼苗所示，hos10-1植物对NaCl和LiCl是超敏的；(B)hos10-1和野生型幼苗对NaCl的剂量效应。所显示的数据是相对的根的生长(在0mM NaCl中的生长被认为是100％)；(C)hos10-1和野生型幼苗对LiCl的剂量效应；(B)和(C)中的误差条表示标准差(n＝16)。(D)在hos10-1和野生型幼苗中的Na+的蓄积；误差条表示标准误(n＝8)；(E)在hos10-1和野生型幼苗中的K+的蓄积。误差条表示标准误(n＝8)。
通过TAIL-PCR鉴定出hos-10的位点，其编码R2R3型MYB转录因子。野生型atmyb8基因能与hos10-1突变体互补(图5)。
Atmyb8(hos10)在hos10-1/myb8-1突变体植物中的表达恢复了对冷冻的耐受性(图6)。hos10基因的结构和T-DNA插入相对于突变形式的翻译起始密码子的位置。填充盒表示外显子；线条表示内含子。显示了在hos10-1/myb8-1突变体中所插入的T-DNA；(B)显示了含有与hos1-1/myb8-1突变体互补的假定hos10基因的基因组片段。在冷冻处理(-8℃，3小时)8天后照像。myb8-1+载体，由用于互补作用的空载体转化的myb8-1；myb8-1+MYB8，用野生型atmyb基因转化的myb8-1；(C)比较hos10(atmyb8)与来自其它物种的序列的序列比对。
根据在染色体中的整合位点以及所整合的拷贝数，转基因植物可以或构成型地或在应答刺激时表达转基因到不同的水平。因为转基因的整合是随机的，转基因植物可以具有不同水平的表达。可以用标准RT-PCR或任何其它的定量技术获得稳定转化的转基因植物以选择所期望的表达水平。
来自多个位点的基因可以调节干旱和低生长温度的应激。例如，在RD29A基因的启动子区所鉴定到的顺式作用元件对干旱和低温两者都具有反应性。这一脱水-反应性元件(DRE)对于调节脱水反应性基因的表达是必需的。CBF基因编码转录激活子，所述激活子控制多种在其启动子中含有C-重复/DRE序列的基因的表达。其它的转录调节物，例如MYC和MYB蛋白，是脱水和脱落酸(ABA)诱导的rd22基因表达的激活子。Rd22基因的启动子含有一67bp的片段，其具有两个紧邻的碱性螺旋-环螺旋蛋白MYC的识别位点。在rd22基因的启动子中也有一个假定的MYB的识别位点。所有的三个识别位点都作为rd22的脱水诱导表达中的顺式作用元件。因此，设想在植物中表达多种基因，它们的表达是受多种信号途径所调节或触发的。
适合的启动子是以下的任何一种，或任何能在植物中发挥作用使得hos10基因能够表达的启动子。病毒外壳蛋白启动子、组织特异性启动子、单子叶植物启动子、遍在蛋白质启动子、CaMV 35S启动子、CaMV 19S启动子、nos启动子、Adh启动子、蔗糖合酶启动子、微管蛋白启动子、napin启动子、肌动蛋白启动子、cab启动子、PEP Case启动子、7S-α’-伴大豆球蛋白启动子、R基因复合启动子、番茄E8启动子、patatin启动子、甘露氨酸合酶启动子、大豆种子蛋白大豆球蛋白启动子、大豆营养贮藏蛋白启动子、噬菌体SP6启动子、噬菌体T3启动子、噬菌体T7启动子、PM启动子、根细胞启动子、ABA诱导型启动子或组织膨胀诱导型启动子、和任何其它的应激诱导型启动子。应激诱导型启动子是特别有帮助的。在美国专利No.6,414,221中描述了作为范例的瞬时激活的应激诱导型植物启动子。
植物载体包含编码HOS10(AtMYB8)蛋白的分离的核酸。蛋白在植物细胞中的表达赋予了植物细胞的抗寒性、抗旱性和抗盐性的增加。植物载体还可以进一步包含在植物细胞中有功能的启动子。
转基因植物包含编码HOS10蛋白的分离核酸(SEQ ID NO：2)。该蛋白在植物细胞内超过其背景水平的被增加的表达使得植物细胞的抗寒性、抗旱性和抗盐性增加。本申请所公开的转基因植物可以是双子叶或单子叶植物。单子叶植物的例子有玉米、水稻、黑麦、谷子、小麦、大麦、高梁、燕麦、香蕉和兰花。双子叶植物的例子有拟南芥、甘蓝、马铃薯、番茄、烟草、橙子和其它柑桔类水果、南瓜、棉花、茶、大豆和所有的其它的豆类果实、阿月浑子、苹果、桃、草莓。
信号传导途径在单子叶和双子叶植物中都是保守的。一些关键的信号传导途径在双子叶和单子叶植物中都是保守的。例如，在应激应答中的有丝分裂剂激活的蛋白激酶(MAPK)级联反应在单子叶和双子叶植物中都是保守的。另外，来自拟南芥、番茄、烟草和水稻的MYB8(HOS10)显示出显著的结构相似性(图6C)。植物激素例如脱落酸(ABA)和乙烯所介导的信号传导机制在植物物种中也是保守的。来自双子叶植物例如拟南芥的一些基因已经被功能性地表达在单子叶植物例如水稻中。MYB8(HOS10)以构成型的形式或位于诱导型或组织特异性启动子下形式的转基因表达使得单子叶和双子叶植物对应激耐受性的抗性都增加。
种子包含编码HOS10多肽的分离的核酸。该多肽在植物细胞中的表达使得植物细胞抗寒性、抗旱性和抗盐性增加(SEQ ID NO：1)。
实施例
实施例1：HOS10在hos10-1突变体植物中的表达与对应激的敏感性的互补
采用标准的转化技术，用含有位于CaMV 35S启动子控制下的野生型hos10基因的表达载体转化hos10-1/myb8-1突变体植物。图6(B)表示与hos10-1/myb8-1突变体互补的含有假定的hos10基因的基因组片段。在冷冻处理(-8℃下3小时)8天后照相。处理样本为myb8-1+载体，用空载体(用于互补作用)转化的myb8-1；myb8-1+myb8，用野生型hos10基因转化的myb8-1。用位于CaMV 35S启动子控制下的野生型hos10基因所转化的hos10-1突变体对冷冻条件是不敏感的。
实施例2：HOS10的过表达提高了植物的低温耐受性
将仅含有35S启动子的载体所转化的植物(6)、未转化的植物(7)和位于35S启动子激动下的hos10基因所转化的植物(1-5)进行冷(4℃)适应1周。随后将植物暴露于冷冻温度0℃-16℃，24小时。记录下所有植物都存活的最低温度并假定为每以转基因品系的耐寒性。通过HOS10编码序列cDNA的RT-PCR估算出HOS10基因相对于对照(仅用载体转化)的表达。
表1：HOS10的过表达增加了植物对低温的耐受性。
  构建体   转基因品系编号  HOS10的表达   耐寒性表型(存活的最低温度℃)
  35S启动子：HOS10   1  ++++   -14
  35S启动子：HOS10   2  +++   -11
  35S启动子：HOS10   3  +++   -12
  35S启动子：HOS10   4  +++   -12
  35S启动子：HOS10   5  ++++   -13
  仅有35S启动子   6  +   -9
  未转化   7  +   -9
RT-PCR实验的结果(表1)表明当与未转化的植物比较时，表达位于35S启动子下的HOS10的植物的相对吸光率单位。例如，未转化植物(品系编号：7，表1)的吸光度单位被用作为基础值(+)来计算HOS10在HOS10过表达植物中的相对表达。
材料和方法
转化
分离出本申请所公开的被鉴定到的DNA片段，并将其与至少一种在植物细胞中有功能的启动子结合以形成重组表达盒。用本领域中的已知技术将包含重组DNA片段的表达盒亚克隆到任何标准的表达载体中。合适的表达载体包含在原核细胞和/或真核细胞中自主复制的质粒。用目前可获得的方法例如原生质体转化、农杆菌介导的转化、电穿孔、微粒轰击、钨丝和脂质体将所述表达载体导入原核或真核细胞中。所述载体被导入原核细胞例如大肠杆菌或农杆菌中。典型地，采用表达载体上所编码的选择性或筛选标记选择转化细胞。在美国专利US 6,281,411中描述了制备转基因单子叶植物的方法，该方法在此通过引用被并入本发明中。
将表达盒或载体引入到包含单子叶和双子叶植物的植物细胞中。被用于转化的植物细胞、或组织、或器官包含花、胼胝、未成熟的胚胎、分生组织、配子组织、或培养的悬浮细胞。也可以导入其它的编码能提高植物转化的蛋白的重组DNA分子。被转化的植物细胞再生为成为植物，测试该植物在应激条件下的生长或发育(thrive)能力，所述应激条件例如有高盐分、可利用的水减少或不利温度。根据植物的种类，基因表达的水平、重组DNA片段所编码的蛋白的活性，将重组DNA导入到植物中都使得植物产生了对应激条件的耐受性或抗性表型。
在被转化植物细胞内表达所导入的重组DNA片段，并将其稳定地传递给(无性地或有性地)随后生成的细胞。载体能在植物细胞内引入、保持和表达重组DNA片段，其中所述重组DNA获自多种来源，包含植物动物、细菌、真菌、酵母或病毒。另外，该载体被导入到多种植物细胞内。
已经利用根瘤农杆菌的肿瘤诱导(Ti)质粒的T-DNA完成了外源基因在双子叶植物例如拟南芥、番茄、马铃薯和苜蓿中的导入和表达。通过重组DNA技术，多种外源DNA可以被插入到农杆菌的T-DNA中。在用含有重组Ti质粒的细菌感染之后，外源DNA被插入到宿主植物染色体中，从而生成遗传工程化的细胞，然后生成遗传工程化的植物。另一种方法是将根诱导(Ri)质粒作为基因载体导人。另外，用Ti质粒作为一种模型系统，给单子叶植物人工构建转化载体可能是有可能的。也可以通过人工的方法例如显微注射、或单子叶的原生质体和含有T区的细菌的原生质球之间的融合将Ti质粒引入到单子叶植物中，然后该Ti质粒可被整合到植物核DNA中。选择性标记和在此所述的异源基因表达盒可被置于被设计用于在植物中进行操作的合适的表达载体中。例如在美国专利US 5,888,789和5,889,189中描述了合适的载体。
也可以通过将重组DNA导入到其它的可以将所插入的DNA转移到植物基因组中的核酸分子中来完成重组DNA片段对植物细胞的转化，所述核酸分子例如有植物病原体例如类CaMV或双生病毒群的DNA病毒、RNA病毒和类病毒；来源于像细胞器(例如叶绿体或线粒体)中的染色体外DNA元件的不稳定的植物基因组成分或核编码的控制元件的DNA分子；来自稳定的植物基因组成分(例如，复制起点或其它容许所导入的DNA整合到细胞器或核基因组中并能正常复制、自主复制、在细胞分裂和植物的有性生殖期间正常分离并可以在植物以后的子代中被遗传的DNA序列)的DNA分子或转座子。
通过带有感染性质粒、感染性病毒的微生物、脂质体的应用、通过机械或激光束方法对完整的染色体或染色体片段进行显微注射、电穿孔和微粒轰击可以将重组DNA直接传送到植物细胞或组织中。例如，使用多种标准技术(例如，电穿孔、农杆菌、原生质体融合或微粒轰击)，用至少包含感兴趣的重组DNA片段、选择标记和合适的启动子的表达盒转化胼胝细胞或来源于所需的植物物种的成员的任何其它的合适的组织。合适的转录调节区(启动子)包含一植物启动子，其转录在应答各种应激反应例如干旱、盐度和高温时被调节。
Hos10-1突变体的分离：利用激活标记载体pSKI015(Zhu et al.，2002)以根瘤农杆菌(GV3101株)介导的T-DNA转化诱变被称为野生型的表达纯合子转基因RD29A∷LUC的拟南芥植物(生态型：C24)(Ishitani et al.1997)。如Ishitani et al.(1997)所述，将来自T2植物的种子被用于用CCD相机的荧光影象来筛选在应答低温、ABA和/或渗透性应激时RD29A∷LUC的表达被改变的突变体。
耐冻性：将生长在土壤中的丛生期(rosette stage)的野生型和hos10-1植物用于进行耐冻性测试。对于冷适应性处理，将植物放置在处于长日照光周期(16小时光照、8小时黑暗)的4℃的冷屋中。基本上如Sukumaran和Weiser(1972)以及Ristic和Ashworth(1993)所描述的那样，用完全发育的丛生叶来测定由冷冻所引起的电解质的渗漏。简单地，对于每一处理，将一片离体的叶子放置在含有200μl HPLC级H2O的试管中，并将试管放置在温度设定于0℃的可编程冷却池(RTE-210型；Thermo NesLab，Portsmouth，NH)中。每一温度的处理设有8个重复。池的温度被编程为降低到-10℃，30分钟后降低1℃。当达到所设定的温度时，从池中取出试管，并立即将它们放置到冰水中过夜以使得逐步解冻。然后再加入5mlHPLC级H2O在该试管中并震荡24h，然后用电导表(35型，YSI Co.，Ohio)测定溶液的传导率。然后将带有叶子的试管加热至沸腾40分钟。冷却到室温后，再次测定溶液的传导率。用沸腾前的传导率与沸腾后的传导率的百分比被计为电解质渗漏的百分比。
为了冷适应，首先将三周龄的生长在培育室的土壤中的野生型和hos10-1植物在长日照光周期条件下4℃孵育1周。在冷适应之后，将该植物在-8℃冷冻4h。然后在处理完成之后马上将植物转移到4℃并孵育过夜以使得冻结的土壤逐步解冻。7天之后对植物损伤计分。
HOS10基因的克隆：用TAIL-PCR(Liu et al.，1995；Zhu et al.，2002)分离在hos10-1植物中所插入的T-DAN的左边界的侧翼的DNA片段，并如的(Zhu et al，2002)所述那样将其亚克隆到克隆载体pBluscript SK(+)(Stratagene，La Jolla，CA)中。对完全分离的片段测序。设计以下引物对进行T-DNA诊断PCR(Zhu et al，2002)：
正向5′-ACAAATCGAGTCGGACTGTACC-3′；
反向5′-TCCATCGGCTTACTCTACGTCG-3′。
用逆转录(RT)-PCR扩增HOS10的编码区。用RNeasy Plant Mini Kit(Qiagen)从野生型植物(哥伦比亚生态型)提取出总RNA，并将总RNA中的3μg用于利用thermoscripTM RT-PCR系统(Invitrogen，Carlsbad，CA)的cDNA第一链的合成，HOS10的基因特异性引物如下：
正向，5′-ACTG GAGCTCATGGGAAGATCACCATGTTGTG-3′(SacI位点以下划线标出)
反向，5′-ACGT TCTAGACACACGAGCTAGTAACAAGATC-3′(XbaI位点以下划线标出。
然后，用pGEM-T Easy载体系统(Promega，Madison，WI)将RT-PCR产物亚克隆到pGEM-T Easy载体中，生成cDNA克隆10-133，所插入的序列通过测序进行确认。然后从克隆10-133释放出HOS10并将其克隆到二元载体99-1的SacI和XbaI位点之间，生成位于CaM35S启动子下的HOS10的表达盒。通过根瘤农杆菌介导的(GV3101株)T-DNA转化将该构建体导入hos10-1突变体植物中。对50mg/L潮霉素耐药的初级转化体被转移到土壤中生长至成熟。如上述那样，用CCD相机检测这些转化体的子代的RD29A∷LUC的表达和耐冻性。
离子含量的测定和盐应激测试：对种子进行表面消毒(2％次氯酸钠，15分钟)，并将其播种到含有Murashige和Skoog(MS)基本盐混和物、以1％琼脂糖固化的2％蔗糖(pH 5.7)的培养基中。播种后，种子在4℃下层积(stratified)2到4天。对于突变体的体外表征，MS或不含有添加物或添加有40、80、100、120、150、180、200mM NaCl，或5、10、15、20、25、30mM LiCl。将生长在发芽培养基(0.7％琼脂糖)中的三周龄的幼苗(N＝40-60)转移到含有200ml 1/2浓度的MS盐、2％蔗糖(pH5.7)的500ml烧瓶中。于22℃，在冷荧光灯(16小时光照、8小时黑暗)的条件下，以120rpm下震荡烧瓶。2天后，加入NaCl以到达所需的NaCl的终浓度，让幼苗再生长2天。然后收集幼苗，用过量的去离子水冲洗，在65℃干燥48小时并称重。然后用0.1M硝酸提取基本组织(每种300mg)4小时，并用滤纸过滤。用原子吸收分光仪(SpectrAA-10型，Varian，Springvale，Australia)测定Na+或K+含量。
种子发芽和失水：将表面消毒的hos10-1和野生型种子播散用水或不同浓度的ABA浸泡过的滤纸上的Petri培养皿中。在4℃、黑暗的条件下保留3天之后，将Petri培养皿放置于光照、室温的条件下以打破休眠。当出现根时，认为种子发芽。
将从土壤生长的未处理的或ABA处理(100μM ABA处理3小时)的hos10-1和野生型植物中所分离到的根放置在实验台上3小时以失水。失水被表示为最初的新鲜重量的百分比。
参考文献
按它们涉及本申请中所用的方案的程度，以下参考文献并入本发明作为参考。
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Claims (23)

1.一种用于提高植物对应激的应答的方法，方法包括：
(a)将一种DNA分子加入到植物中，该DNA分子的核苷酸序列编码与SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列有至少90％相同性的多肽；和
(b)在植物中表达该DNA分子。
2.权利要求1的方法，其中所述DNA分子包含如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。
3.权利要求1的方法，其中所述DNA分子被稳定地整合到植物基因组中。
4.权利要求1的方法，其中所述应激选自由寒冷、渗透性应激、干旱和脱落酸所构成的组。
5.权利要求1的方法，其中所述多肽是如SEQ ID NO：1所示的拟南芥HOS10转录因子。
6.权利要求1的方法，其中所述植物是单子叶植物。
7.权利要求1的方法，该方法进一步包括添加至少一种其它的编码除HOS10以外的不同途径中的转录因子的DNA分子。
8.一种包含编码HOS10蛋白(SEQ ID NO：1)的重组核酸的转基因植物，其中所述植物中所述蛋白的表达的增强使得植物的抗寒性增加。
9.权利要求8的转基因植物，其中所述HOS10蛋白具有包含SEQID NO：1的氨基酸序列。
10.权利要求8的转基因植物，其中植物是单子叶植物。
11.一种植物种子，其包含编码含有与SEQ ID NO：1有至少90％相同性的氨基酸序列的多肽的重组核酸分子。
12.一种表达盒，其包含被可操纵地连接到编码HOS10多肽(SEQID NO：2)的分离的核酸序列上的、在植物细胞中有功能的启动子，其中所述多肽在植物细胞内的表达的增强使得植物的抗寒性增加。
13.权利要求12的表达盒，其中所述启动子是应激诱导型启动子。
14.权利要求13的表达盒，其中所述应激诱导型启动子选自由ABA诱导型启动子、细胞膨胀诱导型启动子和乙烯反应性启动子所构成的组。
15.权利要求12的表达盒，其中所述启动子选自由病毒外壳蛋白启动子、植物组织特异性启动子、单子叶植物启动子、遍在蛋白质启动子、CaMV 35S启动子、CaMV 19S启动子、nos启动子、Adh启动子、蔗糖合酶启动子、微管蛋白启动子、napin启动子、肌动蛋白启动子、cab启动子、PEP Case启动子、7S-α’-伴大豆球蛋白启动子、R基因复合启动子、番茄E8启动子、patatin启动子、甘露氨酸合酶启动子、大豆种子蛋白大豆球蛋白启动子、大豆营养贮藏蛋白启动子、噬菌体SP6启动子、噬菌体T3启动子、噬菌体T7启动子、Ptac启动子、根细胞启动子所构成的组。
16.一种包含编码HOS10多肽(SEQ ID NO：1)的重组核酸的植物载体，其中所述多肽在植物中的表达使得植物的抗寒性增加。
17.一种包含编码HOS10多肽(SEQ ID NO：1)的重组核酸的宿主植物细胞，其中所述多肽在植物中的表达使得植物的抗寒性增加。
18.一种包含编码HOS10多肽(SEQ ID NO：1)的重组核酸的植物载体，其中所述多肽在植物中的表达使得植物的抗盐性增加。
19.一种包含编码HOS10多肽(SEQ ID NO：1)的重组核酸的宿主植物细胞，其中所述多肽在植物中的表达使得植物的抗盐性增加。
20.一种用于提高植物对应激的应答的方法，该方法包括：
(a)将第一种DNA分子加入到植物中，该DNA分子的核苷酸序列编码与SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列有至少90％相同性的多肽；
(b)加入至少第二种DNA分子；和
(c)在植物中表达第一种和第二种DNA分子。
21.权利要求20的方法，其中所述第一种和第二种DNA分子的表达由不同的信号传导途径所控制。
22.一种用于提高植物对应激的应答的方法，该方法包括：
(a)将一种DNA分子加入到植物中，该DNA分子的核苷酸序列编码与SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列有至少90％相同性的多肽；和
(b)在组织特异性启动子的控制下在植物中表达该DNA分子。
23.权利要求22的方法，其中所述组织特异性启动子选自由根、花、果实、叶子、茎和叶柄特异性启动子所构成的组。
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