CN113106073B - 一种协同选择性催化甲苯及类似物羟化的突变体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及催化反应，具体的说是一种协同选择性催化甲苯及类似物羟化的突变体及其利用H2O2实现甲苯及其类似物的苄位sp3 C‑H键和/或邻芳香位sp2 C‑H键高效选择性羟化的应用。突变体为细胞色素P450BM3氧化酶第87位苯丙氨酸处和第268位苏氨酸处的两个位点突变；其中，两个位点的氨基酸可相同或不同的突变为甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸或苯丙氨酸。所述突变体在催化甲苯及其类似物羟化中的应用。本发明显著提高野生酶对甲苯及其类似物的羟化能力，大大提高甲苯及其类似物的附加值。

Description

一种协同选择性催化甲苯及类似物羟化的突变体及其应用
技术领域
本发明涉及催化反应，具体的说是一种协同选择性催化甲苯及类似物羟化的突变体及其利用H2O2实现甲苯及其类似物的苄位sp3 C-H键和/或邻芳香位sp2 C-H键高效选择性羟化的应用。
背景技术
在有机合成中，利用丰富的工业原料来生产有高附加值的产品一直是意义非凡的事情。一个典型的实例就是石油衍生产品-甲苯及其衍生物不同位置的直接C(sp3)-H或C(sp2)-H选择性羟化，其不同的选择性羟化产物均是合成医药、农药、香精、塑料等高附加值产品的前体。如，苄位C(sp3)-H羟化产物可以用来合成抗癌药物1，3-二芳基丙烷，其邻位芳香羟化产物邻甲酚可合成神经系统药物托莫西汀等。因此实现甲苯及其衍生物不同区域的选择性羟化具有非常重要的经济和社会价值。
传统的芳香化合物羟化主要通过三步的Hock反应过程，虽然其过程生成的副产物全是丙酮，但其转化率却极低只有5％，而且选择性不易控制。利用一步化学催化直接进行甲苯选择性氧化的研究也一直在进行，主要通过仿生催化的HAT氢转移反应、一电子转移反应和过渡金属催化等，一个典型实例是Fe(ClO4)2在乙腈和水的双向体系中通过调节浓度可以实现芳香和苄位的选择性氧化，但其催化效率不高，氧化程度和芳香羟化的精确位点依然不受控制。自然界中存在一些天然的氧化酶能催化甲苯及其衍生物的羟化，如flavo-单加氧酶、双加氧酶、甲苯-4-单加氧酶、过加氧酶、细胞色素P450酶等，其中甲苯-4-单加氧酶羟化甲苯主要生成对甲酚产物，而且Ayelet Fishman等利用定向进化虽实现了其对邻位、间位、对位所有芳香位点的选择性羟化，但该酶的羟化效率也不甚理想，而且酶组分复杂也并未实现苄位的选择性羟化。Rene′Ullrich等发现来源于Agrocybe aegerita的过加氧酶可催化甲苯及其衍生物的各位点的选择性羟化，但其区域选择性不高。Rainer Russ等利用氯过氧化物酶CPO催化甲苯及其衍生物少有的高选择性的实现了苄位的羟化，但其过氧化现象严重。
天然能催化甲苯及其衍生物羟化的P450酶不多，主要来源于人源或动物源，如人源的CYP2E1羟化甲苯主要生成苄醇，但也有相当量的芳香羟化产物。细菌来源的细胞色素P450CYP116家族虽可以催化甲苯的苄位羟化，但其活性却非常低。鉴于细菌来源的细胞色素P450酶对惰性C-H键优异的催化能力及良好的选择性等突出特点，研究者们也尝试利用蛋白质工程手段和底物误识别策略等来赋予和提高其甲苯及其衍生物的选择性羟化能力。如2010年Christopher J.C.Whitehouse等通过对P450BM3关键位点的定点突变实现了对甲苯的高效选择性羟化，其中突变体R3/I401P的初始反应速率PFR高达1824，其邻位芳香羟化产物的选择性为100％，2013年Alexander Denni等利用P450BM3及其突变体M2(R47S/Y51W/I401M)对单取代苯的选择性羟化进行了系统的研究，结果显示单取代苯的羟化都具有非常高的活性和区域选择性，其主产物邻位芳香羟化的选择性几乎均在95％以上。2017年Samuel D.Munday等通过对P450BM3的突变筛选高效率地实现了甲苯及其衍生物的选择性羟化，但其选择性并不理想。除了利用蛋白质工程手段外，2017年Osami Shoji等利用底物误识别策略，利用小分子S-Ibu-L-Phe的诱导P450BM3高效地催化甲苯选择性羟化，其产物生成速率可达641±22min–1P450–1，其主产物也是邻位芳香羟化产物，选择性在96％以上。
总结以上可以看出，目前通过蛋白质工程手段和底物误识别策略虽然已经实现了甲苯及其衍生物较好的催化效率，但不论是定向进化还是理性设计，不论是对底物通道上的氨基酸位点还是活性中心周围的位点及与轴向配位相关的位点突变都仅对活性有影响，只是不同的突变体或通过对底物口袋进行重塑或通过对P450酶氧化还原电势的微调来提高了活性，其区域选择性却一直集中在邻位的C(sp2)-H键羟化，并未实现苄位C(sp3)-H的选择性羟化。过加氧酶CPO虽少有的实现了苄位C(sp3)-H的高选择性羟化，但其过氧化生成醛现象严重，苄醇的选择性仅为55％。此外目前绝大多数P450酶的催化过程亦是高度依赖提供电子的还原辅酶NAD(P)H，以及负责电子传递的还原伴侣蛋白。还原辅酶价格昂贵且其原位再生技术也不成熟，而包括还原伴侣蛋白的融合蛋白分子量较大，既给酶的表达制备带来困难也不利于通过蛋白质工程技术对其进行分子改造，同时也增加了酶的不稳定性，这些因素也都大大限制了目前P450酶在甲苯及其类似物的选择性羟化中的实际应用。
综上所述，不管是化学催化还是生物催化，都依然存在着技术瓶颈，这都制约了甲苯及其类似物的高附加值利用。因此有必要开发一种新的催化策略，既能在温和条件下具有高效的催化效率，又能实现甲苯及其类似物不同位点的高区域选择，还能避免昂贵辅因子的依赖，降低成本。
发明内容
鉴于现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种协同选择性催化甲苯及类似物羟化的突变体及其利用H2O2实现甲苯及其类似物的苄位sp3 C-H键和/或邻芳香位sp2 C-H键高效选择性羟化的应用。
为实现上述目的，本发明采用技术方案为：
一种协同选择性催化甲苯及类似物羟化的突变体，突变体为细胞色素P450BM3氧化酶第87位苯丙氨酸处和第268位苏氨酸处的两个位点突变；其中，两个位点的氨基酸可相同或不同的突变为甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸或苯丙氨酸。
所述第87位苯丙氨酸处突变为甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、缬氨酸或异亮氨酸；所述第268位苏氨酸处的缬氨酸或异亮氨酸。
所述突变体于至少一个下述氨基酸位点中突变；所述下述氨基酸位点为第75位亮氨酸处、第78位缬氨酸处、第81位苯丙氨酸处、第82位丙氨酸处、第88位苏氨酸处、第168位天门冬氨酸处、第181位亮氨酸处、第184位丙氨酸处、第260位苏氨酸处、第263位异亮氨酸处、第264位丙氨酸处、第267位谷氨酸处、第328位丙氨酸处、第330位丙氨酸处或第437位亮氨酸处。
所述下述氨基酸位点的氨基酸可相同或不同的突变为丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、天门冬酰胺、谷氨酸或天门冬氨酸。
进一步的说，对甲苯及其类似物的苄位sp3 C-H键进行羟化；其中，突变体为含所述第87位和第268位进行突变的二、三或四的突变体，所述第87位苯丙氨酸突变为甘氨酸或丙氨酸，第268位苏氨酸变为缬氨酸或异亮氨酸；
对甲苯及其类似物的邻芳香位sp2 C-H键进行羟化；其中，突变体为含所述第87位和第268位进行突变的二、三或四的突变体，所述第87位苯丙氨酸变为缬氨酸或亮氨酸，第268位苏氨酸变为缬氨酸或异亮氨酸。
再进一步的说，具体的突变体为：
将SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第87位的苯丙氨酸替换为甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸或亮氨酸，所得突变体命名为F87G、F87A、F87V、F87I、F87L。
将SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第268位的苯丙氨酸替换为缬氨酸或异亮氨酸，所得突变体命名为T268V、T268I。
将SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第87位的苯丙氨酸替换为甘氨酸，第268位的苯丙氨酸替换为缬氨酸，命名为F87G-T268V。
或，将SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第87位的苯丙氨酸替换为丙氨酸，第268位的苯丙氨酸替换为缬氨酸，命名为F87A-T268V。
或，将SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第87位的苯丙氨酸替换为缬氨酸，第268位的苯丙氨酸替换为缬氨酸，命名为F87V-T268V。
将SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第87位的苯丙氨酸替换为甘氨酸，第268位的苯丙氨酸替换为缬氨酸，第75位亮氨酸替换为甲硫氨酸，命名为F87G-T268V-L75M。
将SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第87位的苯丙氨酸替换为缬氨酸，第268位的苯丙氨酸替换为缬氨酸，第78位缬氨酸替换为半胱氨酸，命名为F87V-T268V-V78C。
将SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第87位的苯丙氨酸替换为缬氨酸，第268位的苯丙氨酸替换为缬氨酸，第82位丙氨酸替换为苏氨酸，命名为F87V-T268V-A82T。
将SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第87位的苯丙氨酸替换为甘氨酸，第268位的苯丙氨酸替换为缬氨酸，第184位丙氨酸替换为缬氨酸，命名为F87G-T268V-A184V。
将SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第87位的苯丙氨酸替换为甘氨酸，第268位的苯丙氨酸替换为缬氨酸，第328位丙氨酸替换为缬氨酸，命名为F87G-T268V-A328V。将SEQ IDNO.1所示氨基酸序列的第87位的苯丙氨酸替换为甘氨酸，第268位的苯丙氨酸替换为缬氨酸，第184位丙氨酸替换为缬氨酸，第328位丙氨酸替换为缬氨酸，命名为F87G-T268V-A184V-A328V。
将SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第87位的苯丙氨酸替换为缬氨酸，第268位的苯丙氨酸替换为缬氨酸，第82位丙氨酸替换为苏氨酸，第184位丙氨酸替换为缬氨酸，命名为F87V-T268V-A82T-A184V。
将SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第87位的苯丙氨酸替换为缬氨酸，第268位的苯丙氨酸替换为缬氨酸，第82位丙氨酸替换为苏氨酸，第184位丙氨酸替换为缬氨酸，第437为亮氨酸替换为甲硫氨酸，命名为F87V-T268V-A82T-A184V-L437M。
一种表达载体，其特征在于：表达载体含所述任意一项突变体。
一种基因工程菌，基因工程菌含有所述的表达载体。
一种突变体的应用，所述突变体在催化甲苯及其类似物羟化中的应用。
所述催化体系为双功能小分子化合物、所述突变体、H2O2和底物；其中，双功能小分子化合物为N-(ω-咪唑基，脂肪酰基)-L-苯丙氨酸衍生物。
一种协同选择性催化甲苯及类似物羟化的方法，利用N-(ω-咪唑基，脂肪酰基)-L-苯丙氨酸衍生物双功能小分子化合物诱导所述P450酶的氧化结构域突变体实现利用H2O2对甲苯及其类似物的苄位和/或邻芳香位的选择性羟化调控。
进一步的说，利用双功能小分子化合物Im-C6-Phe诱导所述P450酶的氧化结构域突变体实现利用H2O2对甲苯及其类似物的苄位sp3 C-H键进行羟化；其中，突变体为含所述第87位和第268位进行突变的二、三或四的突变体，所述第87位苯丙氨酸突变为甘氨酸或丙氨酸，第268位苏氨酸变为缬氨酸或异亮氨酸；
利用双功能小分子化合物Im-C5-Phe诱导所述P450酶的氧化结构域突变体实现利用H2O2对甲苯及其类似物的邻芳香位sp2 C-H键进行羟化；其中，突变体为含所述第87位和第268位进行突变的二、三或四的突变体，所述第87位苯丙氨酸变为缬氨酸或亮氨酸，第268位苏氨酸变为缬氨酸或异亮氨酸。
所述羟化体系为将0.01μM-1mM所述突变体与0.1μM-300mM底物加入至pH5.0-9.0的缓冲溶液中，再添加1μM-300mM的所述双功能小分子化合物和1μM-600mM H2O2在0℃-45℃反应1min-24h来实现底物的催化氧化。
上述底物为甲苯及其类似物，包括甲苯、乙苯、丙苯等，或脂肪链取代苯、苯并脂肪环取代化合物；具体为香邻位、对位、间位取代甲苯、取代乙苯等，取代基可以是卤素、硝基、腈基、三氟甲基等，其中优选甲苯、乙苯及对位取代的甲苯。
本发明通过蛋白质工程技术与双功能小分子诱导策略相结合，既能实现酶催化甲苯及其类似物羟化高的催化效率及高区域选择性的调控，又能解除昂贵辅因子的依赖，大大降低应用成本。
具体是以来源于巨大芽孢杆菌的细胞色素P450-BM3单加氧酶氧化酶部分为模板，利用含有87突变位点的突变引物进行PCR突变，测序获得F87单突变体；然后以单突变体基因为模板，以同样的方法PCR扩增出F87-T268组合双突变体，以此双突变P450BM3-H2O2系统对甲苯及其类似物的羟化能力大幅提升，同时通过对F87-T268位点的氨基酸组合及与不同双功能小分子的有机结合可以实现甲苯及其类似物苄位sp3 C-H键和邻芳香位sp2 C-H键高效选择性羟化调控。同时再进一步的通过组合突变、迭代饱和突变等其他突变方式获得含有87突变位点和268突变位点，及其周围的其他一个位点或多个位点相结合的多突变体，将其引入至羟化体系，大大提高了利用此体系进行甲苯及其类似物的高附加值利用；
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明利用特定的双功能小分子诱导的P450-H2O2系统羟化解除了P450酶对辅因子和电子传递链的依赖，并且显著提高野生酶对甲苯及其类似物的羟化能力，使工业应用成本大大降低；而且F87-T268的双突变体组合与双功能小分子的有机结合不仅使得甲苯及其类似物羟化催化效率大幅提高，而且还可以首次实现利用同一个酶进行甲苯及其类似物苄位sp3 C-H键和邻芳香位sp2 C-H键高选择性羟化调控，来分别高效高纯度的获得苄醇和邻甲酚。而进一步的组合突变还可使得羟化能力得到进一步的提升。这都大大提高了利用此体系进行甲苯及其类似物的高附加值利用，具有很强的工业应用潜力。
附图说明
图1为本发明实施例7提供的四突变体F87G T268V A184V A328V利用
Figure BDA0002375664720000061
催化甲苯苄位羟化选择性生成苄醇的示意图。
图2为本发明实施例10提供的四突变体F87V T268V A82T A184V利用
Figure BDA0002375664720000062
催化甲苯邻位芳香羟化选择性生成邻甲酚的示意图。
图3为本发明实施例12提供的三突变体F87V T268V A82T利用
Figure BDA0002375664720000063
催化氯苯羟化选择性生成邻氯苯酚的示意图。
图4为本发明实施例14提供的双突变体F87G T268V利用
Figure BDA0002375664720000064
催化对硝基甲苯羟化选择性生成对硝基苄醇的示意图。
具体实施方式
以下对本发明的原理和特征做进一步的描述，所列举实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的保护范围。另外，下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为本领域的常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
本发明首先以两端分别带催化基团和锚定基团的双功能小分子化合物诱导建立P450BM3-H2O2系统，然后应用此策略系统创新性地解除了P450BM3中T268位保守氨基酸地限制，并且T268位和F87位的组合是实现甲苯及其类似物高效羟化的关键位点。进而以细胞色素P450-BM3单加氧酶的结构为基础，在P450-BM3的活性中心周围的16个残基处，进行半理性设计的氨基酸突变，通过分析获得的每个位置的突变指纹图谱，进而获得显著增强甲苯及其类似物羟化活性和区域选择性的体系。
同时下述实施例的小分子化合物可根据现有技术合成获得。
下述实施例中涉及的工程菌构建、酶的诱导表达与纯化、催化活性测定均采用下列方法，具体如下：
1.野生型P450BM3氧化酶部分(BMP)基因的构建设计P450BM3氧化酶部分的上下游引物，以野生型P450BM3(SEQ ID NO.1，其其NCBI登录号为NZ_CP009920.1)为模板用PCR技术来扩增获得目的基因。
上游引物BMP-F：CATGCCATGGGCATGACAATTAAAGAAATGCC
下游引物BMP-R:
CCGGAATTCTTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGAAGCGGAATTTTTTTCGATTTTGCTTTTACC
PCR反应体系如下。
Figure BDA0002375664720000071
反应条件：94℃ 15s→(94℃ 15s→60℃ 5s→72℃ 80s)×2→(94℃ 15s→58℃5s→72℃ 80s)×2→(94℃ 15s→55℃ 5s→72℃ 80s)×26→72℃10min→16℃∞
PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测后，在紫外条件下，切下目的条带按照胶回收试剂盒的操作说明回收目的片段。
建立双酶切体系
用限制性内切酶Nco I、EcoR I分别对载体pET-28a(+)质粒和BMP目的片段进行双酶切。质粒和BMP目的片段酶切体系分别如下。
Figure BDA0002375664720000072
37℃酶切2h后通过琼脂糖凝胶电泳确认酶切产物大小，电泳完后在紫外条件下，分别切下目的条带，然后按照胶回收试剂盒的操作说明回收目的片段。
建立连接体系
将用相同限制性内切酶处理过的BMP、pET-28a(+)质粒进行连接反应，构建重组质粒pET-28a(+)-BMP。连接体系如下。
Figure BDA0002375664720000081
16℃过夜连接。
采用热激法将连接产物转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，测序正确的单菌落，即为构建成功的pET-28a(+)-BMP。
2、突变体的构建
利用PCR诱变技术对野生型细胞色素P450-BM3单加氧酶的基因(基因序列如SEQID NO.1所示)进行定点诱变。
以连接有P450BM3氧化酶部分(BMP)基因的重组质粒pET-28a(+)-BMP为模板，设计一对包含突变位点的正反向引物，进行PCR，得到重组基因。
其中，PCR的反应体系为：
Figure BDA0002375664720000082
PCR程序：
94℃ 5min→(94℃ 15s→63℃ 15s→72℃ 4min)×1→(94℃ 15s→61℃15s→72℃ 4min)×1→(94℃ 15s→59℃ 15s→72℃ 4min)×1→(94℃ 15s→57℃ 15s→72℃4min)×2→(94℃ 15s→55℃ 15s→72℃ 4min)×23→72℃ 10min→16℃∞
PCR后进行琼脂糖凝胶电泳鉴定大小，电泳完后在紫外条件下分别切下目的条带然后利用胶回收试剂盒回收目的片段。
将PCR扩增后的不同突变体的序列末端进行磷酸化处理，磷酸化体系如下。
Figure BDA0002375664720000091
37℃孵育1h。
将磷酸化后的突变体的序列进行连接，连接体系如下。
Figure BDA0002375664720000092
16℃过夜连接。
采用热激法将纯化产物转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，测序正确的单菌落，即为构建成功的突变子。
3、突变体的诱导表达及纯化
挑取突变成功的单菌落，随机挑取单菌落至含Kana的10mL LB培养基中，活化一段时间后，转接500μL菌液于50mL的LB液体培养基(Kana)，活化一段时间后，转接10mL菌液于1L的LB液体培养基(Kana)，待OD值为0.6-0.8时，加入0.5mM的FeCl3，5’-ALA，30℃，200rpm培养20min后，加入1mM的IPTG，30℃，200rpm过夜诱导。
将表达好的菌液于4200rpm，4℃的条件下离心15min，弃去上清，菌体用Bindingbuffer(100mM K2HPO4-KH2PO4，500mM NaCl，pH 7.4)重悬洗涤两次，得静息细胞。将静息细胞用30mL的Binding buffer重悬，并加入1mM的PMSF(蛋白酶抑制剂)，混匀后经超声波破碎，将破碎后的产物于13000rpm，4℃的条件下离心30min去除细胞碎片，得突变体的粗酶液。
粗酶液的纯化采用Ni柱亲和层析。将粗酶液经0.22μm滤膜过滤。采用
Figure BDA0002375664720000093
KTApurifier 10进行蛋白纯化，Ni柱首先用缓冲液(100mM K2HPO4-KH2PO4，500mM NaCl，5mM咪唑，pH 7.4)进行平衡，平衡后开始上样，上样流速为4mL/min，上样后用上样缓冲液(100mMK2HPO4-KH2PO4，500mM NaCl，20mM咪唑，pH 7.4)进行平衡，然后开始洗脱，采用阶梯式洗脱的方法，首先是用含25mM咪唑的缓冲液洗去杂蛋白，然后用洗脱液(100mM K2HPO4-KH2PO4，500mM NaCl，500mM咪唑，pH 7.4)进行线性洗脱10min，根据418nm吸收值的变化收集蛋白峰相对应的蛋白。收集的目的蛋白经SDS-PAGE检测大小及纯度，然后用透析液(100mM K2HPO4-KH2PO4，100mM NaCl)进行透析脱盐，最后用超滤管将目的蛋白浓缩，添加50％的甘油储存于-20℃冰箱中备用。
4、甲苯及其类似物苄位或邻芳香位催化活性的测定
甲苯及其类似物的苄位或邻芳香位催化反应体系如下：
将10mM甲苯及其类似物(2％DMSO助溶)，0.5μM酶，0.5mM的双功能小分子(对照体系中不添加小分子)，60mM H2O2加入到终体积为1mL的pH8.0的PBS(100mM)中，25℃水浴反应30min后，用1mL的乙酸乙酯对反应体系进行涡旋萃取2min，取有机相过0.22μm膜，用Na2S2O4干燥，添加1mM内标，跑GC测定。
所有反应的对照体系不添加双功能小分子，其余与上述反应体系相同。
GC条件：
甲苯体系：DB-5柱；进样口温度280℃；FID检测器温度280℃；程序升温条件为60℃保留3min，10℃/min升至140℃保留5min，60℃/min升至280℃保留2min；总分析时间为20.33min，内标为二苯甲酮。
甲苯类似物体系：DB-5柱；进样口温度280℃；FID检测器温度300℃；程序升温条件为80℃保留1min，10℃/min升至140℃保留5min，60℃/min升至280℃保留5min；总分析时间为20.33min，内标为二苯甲酮。
实施例1
F87单突变体制备
以连接有P450BM3氧化酶部分(BMP)基因的重组质粒pET-28a(+)-BMP为模板，设计一对包含突变位点的正反向引物(见表)，进行PCR，得到F87单突变体F87A、F87G、F87V、F87I、F87L的重组基因。
Figure BDA0002375664720000101
实施例2
F87-T268双突变的制备
以连接有P450BMP-F87单突变的重组质粒pET-28a(+)-F87A为模板，设计一对包含突变位点的正反向引物(见表)，进行PCR，得到不同F87-T268双突变体的重组基因。
Figure BDA0002375664720000102
Figure BDA0002375664720000111
实施例3
按前述的制备方法获得F87-T268双突变的不同组合，对甲苯的催化活性及选择性进行测定，反应条件如通用方法4中所述，所有突变体不添加小分子作为反应对照；具体活性见下表：
1)
在
Figure BDA0002375664720000112
下，F87-T268双突变体羟化甲苯生成苄醇、邻甲酚和对甲酚的活性及区域选择性测定，典型结果见下表：
Figure BDA0002375664720000113
Figure BDA0002375664720000121
由上述表格可知，所有的F87-T268双突变体在不添加Im-C6-Phe协同下均无明显活性，而在Im-C6-Phe下，F87-T268不同双突变的组合对甲苯羟化的区域选择性具有明显影响，在上表的数据中可发现F87G-T68V双突变体在Im-C6-Phe
Figure BDA0002375664720000122
协同下羟化甲苯的苄位sp3C-H键的选择性为100％,而且仅有极少数的醇会过氧化为醛(<5％)，其产物苄醇的30min总转化数TON可接近1000。
2)
在
Figure BDA0002375664720000123
下，F87-T268双突变体羟化甲苯生成苄醇、邻甲酚和对甲酚的活性和区域选择性测定，结果见下表：
Figure BDA0002375664720000124
Figure BDA0002375664720000131
由上述表中可见，所有的F87-T268双突变体在不添加Im-C5-Phe协同下均无明显活性，而在Im-C5-Phe下，F87-T268不同双突变的组合对甲苯羟化的区域选择性同样具有明显影响。而且在上表的数据中获得了邻位芳香sp2 C-H键的最优双突变组合，F87V-T68V双突变体在Im-C5-Phe
Figure BDA0002375664720000141
协同下羟化甲苯的邻芳香位的选择性>96％，其产物邻甲酚的30min总转化数TON可达1200以上。
实施例4
根据实施例3记载确定活性较好的突变体后，选取活性口袋周围的氨基酸位点进行较系统的研究：L75,V78,F81,A82,T88,D168,L181,A184,T260,I263,A264,E267,A328,A330,L437。
1)将氨基酸突变为更大的疏水氨基酸或某些带极性基团的氨基酸，缩小活性中心的底物口袋以更好的结合甲苯及其类似物底物；
2)合理地引入带极性基团的氨基酸，增加H2O2的结合和利用效率或改变底物在活性中心的构象。
根据实验结果选取活性和选择性较好的F87G-T268V，F87V-T268V，以连接有上述突变体的重组质粒为模板，分别设计一对包含突变位点的正反向引物(见表)，进行PCR，得到重组基因。
将连接有F87G-T268V，F87V-T268V双突变的重组质粒pET-28a(+)-F87G-T268V和pET-28a(+)-F87V-T268V为模板，设计一对包含突变位点的正反向引物(见表)，进行PCR，得到重组基因。
Figure BDA0002375664720000142
Figure BDA0002375664720000151
每个位点取一对引物为例，突变成其他氨基酸时只需将下划线处密码子替换成对应氨基酸的密码子即可。
进而可以获得不同的突变体，举例如下：
将SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第87位的苯丙氨酸替换为缬氨酸，第268位的苯丙氨酸替换为缬氨酸，第82位丙氨酸替换为苏氨酸，命名为F87V-T268V-A82T。
将SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第87位的苯丙氨酸替换为甘氨酸，第268位的苯丙氨酸替换为缬氨酸，第184位丙氨酸替换为缬氨酸，命名为F87G-T268V-A184V。
将SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第87位的苯丙氨酸替换为甘氨酸，第268位的苯丙氨酸替换为缬氨酸，第328位丙氨酸替换为缬氨酸，命名为F87G-T268V-A328V。
将SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第87位的苯丙氨酸替换为缬氨酸，第268位的苯丙氨酸替换为缬氨酸，第328位丙氨酸替换为缬氨酸，命名为F87G-T268V-A328V。
四突变的获得是上述构建好的三突变体的重组质粒为模板，然后再利用选择突变位点的正反向引物(见表)，进行PCR，得到重组基因。
将连接有F87G-T268V-A184V为例，将重组质粒pET-28a(+)-F87G-T268V-A184V为模板，选择一对包含突变位点的正反向引物(见表)，进行PCR，得到重组基因。例如：
将SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第87位的苯丙氨酸替换为甘氨酸，第268位的苯丙氨酸替换为缬氨酸，第184位丙氨酸替换为缬氨酸，第328位丙氨酸替换为缬氨酸，命名为F87G-T268V-A184V-A328V。
实施例5
以上述获得的突变体中的F87G-T268V-A328V利用
Figure BDA0002375664720000152
催化甲苯的羟化反应
将10mM甲苯(2％DMSO助溶)，0.5μM F87G-T268V-A328V，0.5mM的小分子
Figure BDA0002375664720000161
(对照体系中不添加小分子)，60mM H2O2加入到终体积为1mL的pH8.0的PBS(100mM)中，25℃水浴反应30min后，用1mL的乙酸乙酯对反应体系进行涡旋萃取2min，取有机相过0.22μm膜，用Na2S2O4干燥，添加1mM二苯甲酮，跑GC测定(参见下表)。
Figure BDA0002375664720000162
三突变F87G-T268V-A328V在Im-C6-Phe诱导分子作用下利用H2O2羟化甲苯的活性相较双突变得到进一步提升，而且完全进行苄位的选择性羟化生成产物苄醇。
实施例6
以上述获得的突变体中的F87G-T268V-A184V利用
Figure BDA0002375664720000163
催化甲苯的羟化反应
将10mM甲苯(2％DMSO助溶)，0.5μM F87G-T268V-A184V，0.5mM的小分子
Figure BDA0002375664720000164
(对照体系中不添加小分子)，60mM H2O2加入到终体积为1mL的pH8.0的PBS(100mM)中，25℃水浴反应30min后，用1mL的乙酸乙酯对反应体系进行涡旋萃取2min，取有机相过0.22μm膜，用Na2S2O4干燥，添加1mM二苯甲酮，跑GC测定(参见下表)。
Figure BDA0002375664720000165
三突变F87G-T268V-A184V在Im-C6-Phe诱导分子作用下利用H2O2羟化的活性相较双突变得到进一步提升，而且完全进行苄位的选择性羟化生成产物苄醇。
实施例7
以上述获得的突变体中的F87G-T268V-A184V-A328V利用
Figure BDA0002375664720000166
催化甲苯的羟化反应
将10mM甲苯(2％DMSO助溶)，0.5μM F87G-T268V-A184V-A328V，0.5mM的小分子
Figure BDA0002375664720000171
(对照体系中不添加小分子)，60mM H2O2加入到终体积为1mL的pH8.0的PBS(100mM)中，25℃水浴反应30min后，用1mL的乙酸乙酯对反应体系进行涡旋萃取2min，取有机相过0.22μm膜，用Na2S2O4干燥，添加1mM二苯甲酮，跑GC测定(参见下表和图1)。
Figure BDA0002375664720000172
四突变F87G-T268V-A328V-A184V在Im-C6-Phe诱导分子作用下利用H2O2羟化甲苯的活性相较三突变得到进一步提升，而且完全进行苄位的选择性羟化生成产物苄醇。
实施例8
以上述获得突变体F87V-T268V-A82T利用
Figure BDA0002375664720000175
催化甲苯的羟化反应
将10mM甲苯(2％DMSO助溶)，0.5μM F87V-T268V-A82T，0.5mM的小分子cccc(对照体系中不添加小分子)，60mM H2O2加入到终体积为1mL的pH8.0的PBS(100mM)中，25℃水浴反应30min后，用1mL的乙酸乙酯对反应体系进行涡旋萃取2min，取有机相过0.22μm膜，用Na2S2O4干燥，添加1mM二苯甲酮，跑GC测定(参见下表)。
Figure BDA0002375664720000173
在双突变基础上引入A82T突变体后，活性相较双突变进一步提高至2倍左右，而且保持其选择性基本不变，邻甲酚的选择性在96％左右。
实施例9
以上述获得突变体F87V-T268V-A184V利用
Figure BDA0002375664720000174
催化甲苯的羟化反应
将10mM甲苯(2％DMSO助溶)，0.5μM F87V-T268V-A184V，0.5mM的小分子
Figure BDA0002375664720000181
(对照体系中不添加小分子)，60mM H2O2加入到终体积为1mL的pH8.0的PBS(100mM)中，25℃水浴反应30min后，用1mL的乙酸乙酯对反应体系进行涡旋萃取2min，取有机相过0.22μm膜，用Na2S2O4干燥，添加1mM二苯甲酮，跑GC测定(参见下表)。
Figure BDA0002375664720000182
在双突变基础上引入A184V突变体后，活性得到进一步提升，邻位芳香羟化的选择性保持在96％以上。
实施例10
以上述获得突变体F87V-T268V-A82T-A184V利用
Figure BDA0002375664720000183
催化甲苯的羟化反应
将10mM甲苯(2％DMSO助溶)，0.5μM F87V-T268V-A82T-A184V，0.5mM的小分子
Figure BDA0002375664720000184
(对照体系中不添加小分子)，60mM H2O2加入到终体积为1mL的pH8.0的PBS(100mM)中，25℃水浴反应30min后，用1mL的乙酸乙酯对反应体系进行涡旋萃取2min，取有机相过0.22μm膜，用Na2S2O4干燥，添加1mM二苯甲酮，跑GC测定(参见下表和图2)。
Figure BDA0002375664720000185
四突变F87V-T268V-A82T-A184V在Im-C5-Phe诱导分子作用下利用H2O2羟化甲苯的活性得到进一步提升，而且生成邻甲酚的选择性依然保持在96％左右。
实施例11
以上述获得突变体F87V-T268V-A82T-A184V利用
Figure BDA0002375664720000191
催化甲苯的羟化反应
将10mM甲苯(2％DMSO助溶)，0.5μM F87V-T268V-A82T，0.5mM的小分子
Figure BDA0002375664720000192
(对照体系中不添加小分子)，60mM H2O2加入到终体积为1mL的pH8.0的PBS(100mM)中，25℃水浴反应30min后，用1mL的乙酸乙酯对反应体系进行涡旋萃取2min，取有机相过0.22μm膜，用Na2S2O4干燥，添加1mM二苯甲酮，跑GC测定(参见下表)。
Figure BDA0002375664720000193
四突变F87V-T268V-A82T-A184V在Im-C5-Ile诱导分子作用下利用H2O2羟化甲苯的活性可达1000以上，而且生成邻甲酚的选择性得到提升可达97.5％左右。
实施例12
以上述获得突变体F87V-T268V-A82M利用
Figure BDA0002375664720000194
催化氯苯的羟化反应
将10mM氯苯(2％DMSO助溶)，0.5μM F87V-T268V-A82M，0.5mM的小分子
Figure BDA0002375664720000195
(对照体系中不添加小分子)，60mM H2O2加入到终体积为1mL的pH8.0的PBS(100mM)中，25℃水浴反应30min后，用1mL的乙酸乙酯对反应体系进行涡旋萃取2min，取有机相过0.22μm膜，用Na2S2O4干燥，添加1mM二苯甲酮，跑GC测定(参见下表和图3)。
Figure BDA0002375664720000196
F87V-T268V-A82M在Im-C5-Phe诱导分子作用下利用H2O2羟化氯苯生成邻氯苯酚的选择性为100％。
实施例13
以上述获得的突变体中的F87A-T268V利用
Figure BDA0002375664720000201
催化对溴甲苯的羟化反应
将10mM对溴甲苯(2％DMSO助溶)，0.5μM F87A-T268V，0.5mM的小分子
Figure BDA0002375664720000202
(对照体系中不添加小分子)，60mM H2O2加入到终体积为1mL的pH8.0的PBS(100mM)中，25℃水浴反应30min后，用1mL的乙酸乙酯对反应体系进行涡旋萃取2min，取有机相过0.22μm膜，用Na2S2O4干燥，添加1mM二苯甲酮，跑GC测定(参见下表)。
Figure BDA0002375664720000203
三突变F87A-T268V在Im-C6-Phe诱导分子作用下利用H2O2羟化对溴甲苯的活性可达2000以上，而且完全选择苄位羟化。
实施例14
以上述获得的突变体中的F87G-T268V利用
Figure BDA0002375664720000204
催化对硝基甲苯的羟化反应
将10mM对硝基甲苯(2％DMSO助溶)，0.5μM F87G-T268V，0.5mM的小分子
Figure BDA0002375664720000205
(对照体系中不添加小分子)，60mM H2O2加入到终体积为1mL的pH8.0的PBS(100mM)中，25℃水浴反应30min后，用1mL的乙酸乙酯对反应体系进行涡旋萃取2min，取有机相过0.22μm膜，用Na2S2O4干燥，添加1mM二苯甲酮，跑GC测定(参见下表和图4)。
Figure BDA0002375664720000206
三突变F87G-T268V在Im-C6-Phe诱导分子作用下利用H2O2羟化对硝基甲苯完全选择苄位羟化。
对比例1
以上述获得的突变体中的BMP利用
Figure BDA0002375664720000207
催化甲苯的羟化反应
将10mM甲苯(2％DMSO助溶)，0.5μM BMP，0.5mM的小分子
Figure BDA0002375664720000211
(对照体系中不添加小分子)，60mM H2O2加入到终体积为1mL的pH8.0的PBS(100mM)中，25℃水浴反应30min后，用1mL的乙酸乙酯对反应体系进行涡旋萃取2min，取有机相过0.22μm膜，用Na2S2O4干燥，添加1mM二苯甲酮，跑GC测定。
Figure BDA0002375664720000212
野生型BMP催化甲苯不管是否存在诱导小分子，均无明显活性。
对比例2
以上述获得的突变体中的F87G利用
Figure BDA0002375664720000213
催化甲苯的羟化反应
将10mM甲苯(2％DMSO助溶)，0.5μM F87G，0.5mM的小分子
Figure BDA0002375664720000214
(对照体系中不添加小分子)，60mM H2O2加入到终体积为1mL的pH8.0的PBS(100mM)中，25℃水浴反应30min后，用1mL的乙酸乙酯对反应体系进行涡旋萃取2min，取有机相过0.22μm膜，用Na2S2O4干燥，添加1mM二苯甲酮，跑GC测定。
Figure BDA0002375664720000215
单突变F87G催化甲苯不管是否存在诱导小分子，均无明显活性。
对比例3
以上述获得的突变体中的F87V利用
Figure BDA0002375664720000216
催化甲苯的羟化反应
将10mM甲苯(2％DMSO助溶)，0.5μM F87G，0.5mM的小分子
Figure BDA0002375664720000217
(对照体系中不添加小分子)，60mM H2O2加入到终体积为1mL的pH8.0的PBS(100mM)中，25℃水浴反应30min后，用1mL的乙酸乙酯对反应体系进行涡旋萃取2min，取有机相过0.22μm膜，用Na2S2O4干燥，添加1mM二苯甲酮，跑GC测定。
Figure BDA0002375664720000221
单突变F87G催化甲苯不管是否存在诱导小分子，均无明显活性。
由上述各实施例以及对比例可见，不同F87-T268双突变体及其基础上的叠加突变体与不同诱导小分子的组合对甲苯及其类似物羟化的活性和选择性具有重要影响。通过对F87-T268双突变体的组合调控及与合适双功能小分子的组合可以实现甲苯及其类似物苄位sp3 C-H键和邻芳香位sp2 C-H键的高效选择性羟化调控。如F87G-T268V利用Im-C6-Phe
Figure BDA0002375664720000222
羟化甲苯完全选择苄位sp3C-H键进行羟化，其选择性为100％，进一步引入叠加三突变，四突变后活性得到进一步提升，如突变体F87G-T268V-A184V-A328V羟化甲苯的TON可达1800以上，而且依然保持苄位的选择性为100％；F87V-T268V利用Im-C5-Phe
Figure BDA0002375664720000223
羟化甲苯高效地选择邻芳香位sp2C-H键进行羟化，其选择性可达96％以上，进一步引入叠加三突变，四突变后同样活性得到进一步提升，如突变体F87V-T268V-A82T-A184V羟化甲苯的TON可达2000以上，而且依然保持邻芳香位的选择性在96％左右。
本研究首次实现利用同一个酶进行甲苯及其类似物苄位sp3 C-H键和邻芳香位sp2 C-H键高选择性羟化调控，来分别高效高纯度的获得苄醇和邻甲酚。这大大提高了目前甲苯及其类似物高附加值利用的效率，具有很强的工业应用潜力。
SEQ ID No1
Figure BDA0002375664720000224
Figure BDA0002375664720000231
序列表
<110> 中国科学院青岛生物能源与过程研究所
<120> 一种协同选择性催化甲苯及类似物羟化的突变体及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 3
<211> 3150
<212> DNA
<213> 巨大芽孢杆菌P450BM3(Bacillus megaterium)
<400> 3
atgacaatta aagaaatgcc tcagccaaaa acgtttggag agcttaaaaa tttaccgtta 60
ttaaacacag ataaaccggt tcaagctttg atgaaaattg cggatgaatt aggagaaatc 120
tttaaattcg aggcgcctgg tcgtgtaacg cgctacttat caagtcagcg tctaattaaa 180
gaagcatgcg atgaatcacg ctttgataaa aacttaagtc aagcgcttaa atttgtacgt 240
gattttgcag gagacgggtt atttacaagc tggacgcatg aaaaaaattg gaaaaaagcg 300
cataatatct tacttccaag cttcagtcag caggcaatga aaggctatca tgcgatgatg 360
gtcgatatcg ccgtgcagct tgttcaaaag tgggagcgtc taaatgcaga tgagcatatt 420
gaagtaccgg aagacatgac acgtttaacg cttgatacaa ttggtctttg cggctttaac 480
tatcgcttta acagctttta ccgagatcag cctcatccat ttattacaag tatggtccgt 540
gcactggatg aagcaatgaa caagctgcag cgagcaaatc cagacgaccc agcttatgat 600
gaaaacaagc gccagtttca agaagatatc aaggtgatga acgacctagt agataaaatt 660
attgcagatc gcaaagcaag cggtgaacaa agcgatgatt tattaacgca tatgctaaac 720
ggaaaagatc cagaaacggg tgagccgctt gatgacgaga acattcgcta tcaaattatt 780
acattcttaa ttgcgggaca cgaaacaaca agtggtcttt tatcatttgc gctgtatttc 840
ttagtgaaaa atccacatgt attacaaaaa gcagcagaag aagcagcacg agttctagta 900
gatcctgttc caagctacaa acaagtcaaa cagcttaaat atgtcggcat ggtcttaaac 960
gaagcgctgc gcttatggcc aactgctcct gcgttttccc tatatgcaaa agaagatacg 1020
gtgcttggag gagaatatcc tttagaaaaa ggcgacgaac taatggttct gattcctcag 1080
cttcaccgtg ataaaacaat ttggggagac gatgtggaag agttccgtcc agagcgtttt 1140
gaaaatccaa gtgcgattcc gcagcatgcg tttaaaccgt ttggaaacgg tcagcgtgcg 1200
tgtatcggtc agcagttcgc tcttcatgaa gcaacgctgg tacttggtat gatgctaaaa 1260
cactttgact ttgaagatca tacaaactac gagctggata ttaaagaaac tttaacgtta 1320
aaacctgaag gctttgtggt aaaagcaaaa tcgaaaaaaa ttccgcttgg cggtattcct 1380
tcacctagca ctgaacagtc tgctaaaaaa gtacgcaaaa aggcagaaaa cgctcataat 1440
acgccgctgc ttgtgctata cggttcaaat atgggaacag ctgaaggaac ggcgcgtgat 1500
ttagcagata ttgcaatgag caaaggattt gcaccgcagg tcgcaacgct tgattcacac 1560
gccggaaatc ttccgcgcga aggagctgta ttaattgtaa cggcgtctta taacggtcat 1620
ccgcctgata acgcaaagca atttgtcgac tggttagacc aagcgtctgc tgatgaagta 1680
aaaggcgttc gctactccgt atttggatgc ggcgataaaa actgggctac tacgtatcaa 1740
aaagtgcctg cttttatcga tgaaacgctt gccgctaaag gggcagaaaa catcgctgac 1800
cgcggtgaag cagatgcaag cgacgacttt gaaggcacat atgaagaatg gcgtgaacat 1860
atgtggagtg acgtagcagc ctactttaac ctcgacattg aaaacagtga agataataaa 1920
tctactcttt cacttcaatt tgtcgacagc gccgcggata tgccgcttgc gaaaatgcac 1980
ggtgcgtttt caacgaacgt cgtagcaagc aaagaacttc aacagccagg cagtgcacga 2040
agcacgcgac atcttgaaat tgaacttcca aaagaagctt cttatcaaga aggagatcat 2100
ttaggtgtta ttcctcgcaa ctatgaagga atagtaaacc gtgtaacagc aaggttcggc 2160
ctagatgcat cacagcaaat ccgtctggaa gcagaagaag aaaaattagc tcatttgcca 2220
ctcgctaaaa cagtatccgt agaagagctt ctgcaatacg tggagcttca agatcctgtt 2280
acgcgcacgc agcttcgcgc aatggctgct aaaacggtct gcccgccgca taaagtagag 2340
cttgaagcct tgcttgaaaa gcaagcctac aaagaacaag tgctggcaaa acgtttaaca 2400
atgcttgaac tgcttgaaaa atacccggcg tgtgaaatga aattcagcga atttatcgcc 2460
cttctgccaa gcatacgccc gcgctattac tcgatttctt catcacctcg tgtcgatgaa 2520
aaacaagcaa gcatcacggt cagcgttgtc tcaggagaag cgtggagcgg atatggagaa 2580
tataaaggaa ttgcgtcgaa ctatcttgcc gagctgcaag aaggagatac gattacgtgc 2640
tttatttcca caccgcagtc agaatttacg ctgccaaaag accctgaaac gccgcttatc 2700
atggtcggac cgggaacagg cgtcgcgccg tttagaggct ttgtgcaggc gcgcaaacag 2760
ctaaaagaac aaggacagtc acttggagaa gcacatttat acttcggctg ccgttcacct 2820
catgaagact atctgtatca agaagagctt gaaaacgccc aaagcgaagg catcattacg 2880
cttcataccg ctttttctcg catgccaaat cagccgaaaa catacgttca gcacgtaatg 2940
gaacaagacg gcaagaaatt gattgaactt cttgatcaag gagcgcactt ctatatttgc 3000
ggagacggaa gccaaatggc acctgccgtt gaagcaacgc ttatgaaaag ctatgctgac 3060
gttcaccaag tgagtgaagc agacgctcgc ttatggctgc agcagctaga agaaaaaggc 3120
cgatacgcaa aagacgtgtg ggctgggtaa 3150

Claims (2)

1.一种协同选择性催化甲苯及类似物羟化的突变体的应用，其特征在于：突变体在催化甲苯及其类似物羟化中的应用，所述突变体利用H2O2对甲苯及其类似物的苄位和/或邻芳香位的选择性羟化调控；
所述突变体为细胞色素P450BM3氧化酶第87位苯丙氨酸处和第268位苏氨酸处的两个位点突变；所述突变体为：F87A/T268V、F87A/T268I、F87G/T268I、F87V/T268I、F87I/T268V、F87I/T268I、F87L/T268V、F87L/T268I、F87G-T268V-A328V、F87G-T268V-A184V、F87G-T268V-A184V-A328V、F87V-T268V-A82T、F87V-T268V-A184V、F87V-T268V-A82T-A184V、F87V-T268V-A82M；
所述催化体系为双功能小分子化合物、所述突变体、H2O2和底物；其中，双功能小分子化合物为Im-C6-Phe或Im-C5-Phe；
所述甲苯及其类似物为甲苯、氯苯、对溴甲苯、对硝基甲苯。
2.一种协同选择性催化甲苯及类似物羟化的方法，其特征在于：利用双功能小分子化合物诱导所述P450酶的氧化结构域突变体实现利用H2O2对甲苯及其类似物的苄位和/或邻芳香位的选择性羟化调控；
具体为：利用双功能小分子化合物诱导所述P450酶的氧化结构域突变体实现利用H2O2对甲苯及其类似物的苄位sp3C-H键和/或邻芳香位sp2C-H键进行羟化；所述突变体为：F87A/T268V、F87A/T268I、F87G/T268I、F87V/T268I、F87I/T268V、F87I/T268I、F87L/T268V、F87L/T268I、F87G-T268V-A328V、F87G-T268V-A184V、F87G-T268V-A184V-A328V、F87V-T268V-A82T、F87V-T268V-A184V、F87V-T268V-A82T-A184V、F87V-T268V-A82M；
所述双功能小分子化合物为Im-C6-Phe或Im-C5-Phe；
所述甲苯及其类似物为甲苯、氯苯、对溴甲苯、对硝基甲苯。
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