CN113101316B - 天女木兰提取物在制备抗抑郁产品中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及植物提取物技术领域，尤其涉及天女木兰提取物在制备抗抑郁产品中的应用。本发明天女木兰提取物具有优异的抗抑郁功效，实验结果表明，天女木兰提取物可以有效缩短抑郁小鼠的FST不动时间和TST不动时间；提高小鼠大脑组织中海马区神经元的数量；提高大脑组织中BDNF蛋白的表达量。

Description

天女木兰提取物在制备抗抑郁产品中的应用

技术领域

本发明涉及植物提取物技术领域，尤其涉及天女木兰提取物在制备抗抑郁产品中的应用。

背景技术

据世界卫生组织数据显示,抑郁症仅次于艾滋病、心脏病等重大疾病，在全球十大疾病中位居第5位，严重影响人们的生活质量。对于抑郁症，常见的治疗方法中，药物治疗最为广泛,且相对来说效果更好。然而，目前的抗抑郁药物会对胃造成刺激，而且对人体免疫系统也会产生不良影响,给人带来很多副作用，比如头晕、恶心、高血压、便秘等，过量药物可致急性中毒甚至死亡，因此，目前采用药物治疗抑郁症存在较大的风险。

非药物治疗主要有芳香疗法等，芳香疗法采用的药用成分主要为植物提取物。采用植物提取物的芳香疗法虽然治疗效果不如药物治疗效果快，但优势在于植物提取物纯天然，安全性高，几乎无药物依赖性、撤药反应等副作用。

天女木兰属木兰科，天女木兰提取物具有抑菌、增白、抗皱等功效，常用于日化领域。目前还未发现天女木兰提取物在抗抑郁领域中的应用。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了天女木兰提取物在制备抗抑郁产品中的应用，天女木兰提取物可以有效缩短抑郁小鼠的FST不动时间和TST不动时间，提高大脑组织海马区神经元的数量，提高与抗抑郁相关蛋白的表达量，具有优异的抗抑郁功效。

其具体技术方案如下：

本发明提供了天女木兰提取物在制备抗抑郁产品中的应用。

本发明中，天女木兰提取物为天女木兰醇提取物、天女木兰水提物和天女木兰水蒸气蒸馏提取物中的一种或两种以上。

优选地，所述天女木兰醇提取物、天女木兰水提物和天女木兰水蒸气蒸馏提取物均为天女木兰精油。

精油是从植物的花、叶、茎、根或果实中萃取的挥发性芳香油脂性液体，具有渗透性强和生物活性多样等特点，不同种类的精油有不同的功效。精油因其本身的天然特性和分子小、易进入人体达到特定效果的优点。因此，本发明所述天女木兰提取物优选为天女木兰精油。

本发明中，所述天女木兰提取物的原料取自天女木兰的叶、根、花、果实和茎中的一种或两种以上，优选取自天女木兰叶。因此，本发明所述的天女木兰精油为天女木兰叶精油。

本发明中，天女木兰精油的制备方法优选为：

取天女木兰叶粉碎至10-20目，装在3-5 个串联水蒸气蒸馏反应釜中，分散均匀，加上网罩，通入水蒸气，打开冷凝器，反应1-2h ，收集提取物，分离油和水，得到天女木兰精油。

本发明采用急性利血平诱导抑郁模型实验，利用精油芳香疗法来检测精油对利血平抑郁模型小鼠游泳不动时间和悬尾不动时间的影响。结果显示，本发明提供的天女木兰叶精油可以缩短利血平模型小鼠的游泳不动时间和悬尾不动时间。

进一步地，本发明采用尼氏染色检测实验小鼠神经元的数目。结果显示本发明提供的天女木兰叶精油可以提高小鼠海马体区的正常神经元数量。

BDNF（brain-derived neurotrophic factor）是脑源性神经营养因子主要在神经元中合成并广泛存在于中枢神经系统，参与神经可塑性和对应激性神经损伤的修复，影响5-HT信号转导，增加脑组织中5-HT水平，防止5-HT神经元退化。慢性应激压力过大等促发因素可能导致BDNF神经营养支持下调，降低Bcl-2的抗凋亡调节，从而降低神经源性细胞存活率。这对海马功能有不利影响，并最终导致抑郁症状的发展。因此，检测小鼠大脑组织中BDNF的表达水平可以确定药物对抑郁小鼠的治疗效果。

本发明采用Western Blot 试验检测小鼠大脑组织中BDNF蛋白的表达情况。结果显示，本发明提供的天女木兰叶精油可以显著提高大脑组织中BDNF蛋白的表达。

本发明还提供了一种抗抑郁产品，包括天女木兰提取物。

本发明中所述天女木兰提取物为天女木兰精油。

本发明中，所述天女木兰提取物在所述抗抑郁产品中的质量含量为0.001%~10%。

本发明中，所述抗抑郁产品的给药方式为嗅吸、涂抹或，优选为嗅吸。

本发明中，所述抗抑郁产品中天女木兰提取物的有效剂量为625μL/kg/天~2500μL/ 天/ kg，优选为625μL/ 天/ kg、1250μL/ 天/ kg或2500μL/ 天/ kg。

从以上技术方案可以看出，本发明具有以下优点：

本发明首次发现天女木兰提取物具有抗抑郁功效。通过实验发现，本发明天女木兰提取物可以有效缩短抑郁小鼠的FST不动时间和TST不动时间；提高小鼠大脑组织中海马区神经元的数量；提高大脑组织中BDNF蛋白的表达量。因此，本发明天女木兰提取物可以缓解抑郁诱发的情绪低落、心境沮丧、兴趣丧失、亲情淡漠、坐立不安、思考能力下降、失眠等症状，改善生活质量。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。

图1为本发明实施例提供的抗抑郁-FST不动时间的柱状图；

图2为本发明实施例提供的抗抑郁-TST不动时间的柱状图；

图3为本发明实施例提供的各组小鼠海马区尼氏染色神经元显微镜图（标尺为50μm）；

图4为本发明实施例提供的各组小鼠海马体中正常神经元数目统计图；

图5为本发明实施例提供的各组小鼠脑组织BDNF蛋白免疫印迹图；

图6为本发明实施例提供的各组小鼠脑组织BDNF蛋白相对表达量的柱状图。

具体实施方式

为使得本发明的发明目的、特征、优点能够更加的明显和易懂，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，下面所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而非全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

本实施例为天女木兰叶精油的制备

本实施例采用专利CN 105708760 A 天女木兰提取液作为抑菌剂的用途中实施例1的制备方法制备天女木兰叶精油，具体制备步骤如下：取天女木兰叶粉碎至20目，装在4个串联水蒸气蒸馏反应釜中，分散均匀，加上网罩，通入水蒸气，打开冷凝器，反应1h，收集提取物，分离油和水，得到天女木兰叶提取精油。

实施例2

本实施例为利血平诱导建立急性抑郁症造模小鼠模型

原理: 利血平通过消耗脑组织中的儿茶酚胺和 5-羟色胺( 5-hydroxytryptamine，5-HT) 贮存来抑制中枢神经系统活动，可引起啮齿类动物体温下降、上眼睑下垂、快感缺失、体质量减轻、运动能力减弱等。

造模：5周龄雄性KM小鼠（30±5g）适应性饲养一周后开始造模。利血平现配现用，配制浓度是0.6 mg/mL，除空白对照组外，其余组按小鼠体重0.1 mL/10 g用量进行腹腔注射，给药剂量为6 mg/kg。小鼠单次给予腹腔注射利血平(6 mg/kg)，此剂量导致抑郁症状在注射后持续72小时。空白组在同一天给予DMSO/生理盐水i.p.注射，第二天进行行为试验，即强迫游泳试验(FST) 尾部悬挂试验（TST）。经过刺激后，与正常和造模前小鼠相比，小鼠悬尾测试实验和强迫游泳实验不动时间百分比应显著延长，体质量显著降低或无明显差异， 血清5-HT浓度显著下降，表明抑郁造模成功。

给药：空白组小鼠未建立利血平抑郁模型，将利血平抑郁小鼠随机分为4组，实验组动物分别嗅闻不同浓度的天女木兰叶精油，低浓度组小鼠吸入体积为625μL/天/kg，中浓度组小鼠吸入体积为1250μL/天/kg，高浓度组小鼠吸入体积为2500μL/天/kg，空白组小鼠吸入含1%Tween80的生理盐水，体积均为2500μL/天/kg，每组中每只小鼠每天嗅闻 30 分钟；阳性对照组小鼠在行为学测试前30 min时注射盐酸氟西汀溶液，使用剂量为20mg/kg。

实施例3

本实施例进行强迫游泳测试（FST）

将小鼠放入直径为25 cm，高30 cm的透明玻璃水缸里，内注有15 cm高的水，水温为21～25 ℃，总记录时间为 360 s，记录的数据为120～360 s时间内，小鼠漂浮不动或轻微肢体活动的时间百分比，用来反映小鼠的无助程度。

图1为本实施例抗抑郁-FST不动时间的柱状图（与模型组比较，*P<0.05， **P<0.01）。由图1可知，相比于模型组，空白组、阳性对照组和天女木兰叶精油高中低浓度给药组的游泳不动时间均显著降低，其中天女木兰叶精油给药组中，高浓度天女木兰叶精油组最显著。

实施例4

本实施例进行悬尾测试（TST）

悬尾实验也是绝望模型中的一种，它的作用机理与强迫游泳类似，也是提供一个避无可避的绝望环境，观察小鼠处于此绝望环境中的状态来判断小鼠是否产生抑郁样症状。固定小鼠尾部使其处于倒悬状态，保持 6 min，并且记录下后 4 min 内小鼠停止挣扎，保持静立不动的时长，测定指标为悬挂时静止不动的时间百分比，以此反映小鼠无助程度。

图2为本实施例抗抑郁-TST不动时间的柱状图（与模型组比较，*P<0.05， **P<0.01）。由图2可知，相比于模型组，阳性对照组和天女木兰叶精油高中低浓度给药组的悬尾不动时间都有了不同程度的缩短，其中天女木兰叶精油给药组中高浓度天女木兰叶精油组效果最显著。

实施例5

本实施例采用尼氏染色检测各组小鼠神经元数量

1、石蜡切片烤片：将恒温干燥箱的温度设置为60℃，烤片15min；

2、二甲苯脱蜡：组织切片依次放入二甲苯I和二甲苯II中，各20min ；

3、梯度酒精至水：按照从高到低的浓度，将切片依次放入100%乙醇I和100%乙醇II，各10min；再放入95%乙醇、90%乙醇、80%乙醇和70%乙醇，各5min；

4、自来水清洗1次（2min/次）；双蒸水清洗2次（2min/次）；

5、甲苯胺蓝染液：10min；

6、染色结束后，进行水洗终止染色：自来水清洗1次（2min/次）；双蒸水清洗2次（2min/次）；

7、酒精脱水：依次放入70%乙醇、95%乙醇和100%乙醇，各5min；

8、二甲苯透明：15min；

9、显微镜镜检，图像采集分析。

图3为本实施例各组小鼠海马区尼氏染色神经元显微镜图；图4为本实施例各组小鼠海马体区正常神经元数目统计图（与模型组比较，*P<0.05， **P<0.01）。由图3~4可知，相比于空白对照组，利血平造模后，模型组小鼠的海马体区中的神经元数目有着较为明显的削减；相比于模型组，阳性对照组和天女木兰叶精油高中低浓度给药组小鼠的海马区中的神经元数目均有所增加，阳性组最显著，天女木兰叶精油组中，高浓度天女木兰叶精油增加较显著。

实施例6

本实施例采用Western Blot检测各组小鼠脑组织BDNF蛋白相对表达量

1、100mg组织总蛋白提取：

组织块用冷PBS洗涤2-3次，去除血污，剪成小块置于匀浆管中。加入1~2个2mm的小磁珠，加入10倍组织体积本试剂（使用前数分钟内加入蛋白酶抑制剂）置于均质匀浆机中，选择程序彻底匀浆，普通组织大约60s，比较柔软的减少时间，比较坚韧的组织增加时间，期间间断降温，一般最多匀浆100s，如果匀浆不彻底或者组织块比较大，需要用剪刀将组织块剪碎。如果需要提高蛋白浓度，可以适量减少该试剂体积。将匀浆完成的样本管取出，冰浴30min，每隔5min震荡一次确保组织完全裂解。12000rpm离心10min，收集上清，即为总蛋白溶液。

2、蛋白浓度测定：取未变性的蛋白溶液，用BCA蛋白浓度测定试剂盒测蛋白浓度，具体方法参照试剂盒的说明书。

3、蛋白变性：将蛋白溶液按照4:1的比例加入5*蛋白上样缓冲液，沸水浴变性15min，收入-20℃冰箱保存备用。

4、SDS-PAGE电泳

清洗玻璃板。灌胶与上样。待玻璃板晾干后，将一个毛玻璃板和一个平玻璃板组成一对，玻璃板之间是灌胶的缝隙，放入制胶器，插入楔子将玻璃板固定，检查底部是否对齐以免漏胶。按实验安排配制所需浓度的分离胶（如表1所示），加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。将分离胶灌到适当的的高度，灌胶之前可以用梳子试一下，梳子齿距离分离胶上液面大约5-8mm为宜。然后将纯水缓慢均匀加入到缝隙中直到灌满，过程不要把胶冲散。大约30min左右等分离胶凝固即可倒去胶上层水并用吸水纸将剩余水吸干。

按照上面方法配制5%的浓缩胶（如表2所示），加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中，注意梳子下面不能有气泡。等分离胶凝固好，取下制胶器，小心拔掉梳子，即可准备开始电泳。将制胶器放入电泳槽后加足够的电泳液后上样电泳。将样品加入电泳孔中，电泳。浓缩胶电压75V，分离胶用120V。电泳至溴酚蓝刚跑出即可终止电泳，进行转膜。

5、转膜（使用0.22μm的PVDF膜。）

5.1准备6张7×9cm的滤纸和一张大小适中的 PVDF膜，PVDF膜在使用之前要先用甲醇活化。在加有转移液的盆里放入转膜用的夹子，两块海绵垫，一支玻棒，滤纸和经过活化的PVDF膜。将夹子打开使黑的一面保持水平。在垫子上垫海绵、三层滤纸。小心剥下分离胶放在滤纸上，将PVDF膜盖于胶上，不要有气泡。在膜上盖三张滤纸并除去气泡。最后盖上另一个海绵垫。

5.2转膜条件（湿转）

快转：300mA恒流转膜半小时，或者200mA转膜1小时，时间可以略微调整，电流对应调整。转膜过程中将转膜的槽子放在冰水中降温。

慢转：转膜过夜，25V恒压转膜过夜。

6、免疫反应

将转好的膜于室温下脱色摇床上用5%的脱脂牛奶(0.5%TBST配)，封闭1h。稀释一抗（Anti -BDNF Rabbit pAb，GB11559）（TBST溶解的5%脱脂牛奶，磷酸化蛋白使用TBST溶解的5%BSA），4℃孵育过夜（快转），或者4℃孵育抗体3小时（慢转）。用TBST在室温下脱色摇床上洗三次，每次5min。将二抗（HRP 标记的山羊抗兔IgG，GB23303）用TBST稀释3000倍，室温下孵育30min后，用TBST在室温下脱色摇床上洗三次，每次5min。

7、化学发光

在暗室中将ECLA和ECLB两种试剂在离心管中等体积混合，在曝光匣上贴双层手套或者其他透明薄膜，将PVDF膜的蛋白面朝上放在曝光匣两层薄膜之间，加入混合好的ECL溶液充分反应，1-2min后，去尽残液，盖上上面的一层薄膜开始曝光。曝光后的胶片用显影、定影试剂进行显影和定影。根据不同的发光强度调整曝光条件。

8、凝胶图像分析 将胶片进行扫描存档，PhotoShop整理去色，Alpha软件处理系统分析目标带的光密度值。

图5为本实施例各组小鼠脑组织BDNF蛋白免疫印迹图；图6为本实施例各组小鼠脑组织BDNF蛋白相对表达量的柱状图（与模型组比较，*P<0.05， **P<0.01）；从图5和图6可以看出，相比于空白组，利血平模型组小鼠的BDNF蛋白相对表达量有了较为明显的下降；相对于模型组，阳性对照组和天女木兰叶精油给药组小鼠脑组织中BDNF蛋白的相对表达量均不同程度的增高。其中，天女木兰叶-中浓度和高浓度组均显著，高浓度组最佳。

以上所述，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims (2)

1.天女木兰提取物在制备抗抑郁的产品中的应用；

所述天女木兰提取物在所述抗抑郁产品中的质量含量为0.001%~10%；

所述天女木兰提取物的制备方法为：

取天女木兰叶粉碎至10-20目，装在3-5个串联水蒸气蒸馏反应釜中，分散均匀，加上网罩，通入水蒸气，打开冷凝器，反应1-2h，收集提取物，分离油和水，得到天女木兰提取物。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述天女木兰提取物为天女木兰精油。

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