CN113092758A - 用于检测胰蛋白酶类似物TrypLE的双抗夹心ELISA检测试剂盒及检测方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于免疫学和生物技术领域，为了解决目前针对胰蛋白酶类似物TrypLE没有较好的检测方法，提供了胰蛋白酶类似物TrypLE双抗夹心ELISA检测试剂盒及检测方法与应用。通过构建一种酶联免疫吸附的方法，可以有效，快速，便捷的检测样品中TrypLE的含量。包括：包被有捕获抗体的酶标板制成的固相抗体、酶标抗体、TrypLE标准品、样品稀释液、包被缓冲液、封闭液、ELISA酶标板洗涤液、显色液和终止液。用于定量检测各种生物制品的中间品、半成品和成品中胰蛋白酶的专用试剂盒。本试剂盒操作方便简单，可直接用于样品分析，重现性好，稳定性高。

Description

用于检测胰蛋白酶类似物TrypLE的双抗夹心ELISA检测试剂 盒及检测方法与应用
技术领域
本发明属于免疫学和生物技术领域，具体涉及用于检测胰蛋白酶类似物的TrypLE双抗夹心ELISA检测试剂盒及检测方法与应用。
背景技术
胰蛋白酶Trypsin (Parenzyme) 为蛋白酶的一种，是从牛、羊、猪的胰脏提取的一种丝氨酸蛋白水解酶。在脊椎动物中，作为消化酶而起作用。在胰脏是胰蛋白酶的前体胰蛋白酶原被合成后，作为胰液的成分而分泌，受肠激酶或胰蛋白酶的限制分解成为活化胰蛋白酶，是肽链内切酶，它能把多肽链中赖氨酸和精氨酸残基中的羧基侧切断。它不仅起消化酶的作用，而且还能限制分解糜蛋白酶原、羧肽酶原、磷脂酶原等其它酶的前体，起活化作用。是特异性最强的蛋白酶，在决定蛋白质的氨基酸排列中，它成为不可缺少的工具。
TrypLE是一种胰蛋白酶类似物，是一种通过生物工程制备的非动物源性重组酶，目前主要应用于细胞培养中。在细胞培养中，它可以替代猪和牛的胰蛋白酶来进行对贴壁细胞的解离。TrypLE因其制备方式，一般具有较高纯度，这也导致了其比天然胰蛋白酶配制剂有更强的特异性。此外，TrypLE 作用细胞时更加温和，并且终止消化时不需要 Trypsin酶抑制剂，只需要使用稀释液进行稀释即可停止反应，这样极大程度上减少了外来物质对培养细胞的干扰。TrypLE已经被证明有能力去解离来自有无血清供应培养基的细胞。
胰蛋白酶及其类似物为肽链内切酶，对精氨酸和赖氨酸肽链具有选择性水解作用，可使天然蛋白、变性蛋白、纤维蛋白和黏蛋白等水解为多肽或氨基酸。主要应用是在细胞培养时，使细胞间的蛋白质水解，从而使细胞离散或使贴壁细胞解离下来。
Trypsin作为通过动物体提取的酶类，其不可避免的存在批间差异大与纯度较低的问题，而TrypLE作为通过生物反应器的非动物源产物，其纯度高，批间差异小，这也意味着其特异性更加显著。着通过比较trypsin和TrypLE这两种酶，我们可以发现TrypLE在诸多方面存在着更加优越的性能。Trypsin 必须保存在－20 ℃，在经过多次反复冻融或在 4℃ 长期保存后，稳定性丧失，TrypLE 则可以稳定的保存于室温，节省了冷冻空间，同时提供即时可用的便利。有研究显示，与胰蛋白酶相比，TrypLE将人胚胎干细胞克隆存活和生长状况提高了3倍，这使得其在细胞培养中可以更有利于细胞的生、传代。通过以上比较，可以看出TrypLE是一种极具潜力的胰蛋白酶代替物。
胰蛋白酶现行标准收载于《中华人民共和国药典》（以下简称《中国药典》）2020年版第二部，收录的检测项目未包含残留量检测，滞后于目前药品生产与质量控制中的要求。这不仅在细胞培养过程中带来潜在的风险，会给相关生物制品的临床使用造成安全隐患，也是生物制品生产检定用动物细胞基质制备及质量控制中仍需完善的一环。而TrypLE作为目前较为常用的胰蛋白酶类似物，其残留检测的重要性也愈发显著。
但是，目前针对这种代替物没有好的检测方法，因此，有必要选用一种快速、简便能够定量且灵敏度、准确度和特异性高的方法来进行TrypLE的检测。
发明内容
本发明为了解决目前针对胰蛋白酶类似物TrypLE没有较好的检测方法，提供了用于检测胰蛋白酶类似物TrypLE的双抗夹心ELISA检测试剂盒及检测方法与应用。通过构建一种酶联免疫吸附的方法，可以有效，快速，便捷的检测样品中TrypLE的含量。
本发明由如下技术方案实现的：一种用于检测胰蛋白酶类似物TrypLE的双抗夹心ELISA检测试剂盒，包括：包被有捕获抗体的酶标板制成的固相抗体、酶标抗体、TrypLE标准品、样品稀释液、包被缓冲液、封闭液、ELISA酶标板洗涤液、显色液和终止液。
所述捕获抗体为采用TrypLE抗原免疫小鼠，经融合、克隆、筛选得到的单克隆抗体。
进一步的，所述捕获抗体为抗TrypLE抗原的鼠单克隆抗体；捕获抗体用2ug/ml包板。
所述酶标抗体为HRP-兔多克隆抗体，大小为25kd，其纯度为99%。
所述样品稀释液为 pH=7.4的1×PBST，含PBST 体积0.05%的Tween-20；包被缓冲液为 pH=9.6的0.05M碳酸盐缓冲液；封闭液为 pH =7.4的1×PBST，含PBST 体积3%的BSA；ELISA酶标板洗涤液为 pH=7.4的1×PBST，含0.05%Tween-20；显色液为显色液A和显色液B等体积混合，显色液A为H2O2，显色液B为TMB；终止液为2mol/L浓H2SO4。
所述TrypLE标准品为标准品A-F：将TrypLE标准品使用稀释液稀释至40ng/mL、16ng/mL、6.4ng/mL、2.56ng/mL、1.024ng/mL、0.410ng/mL。
所述用于检测胰蛋白酶类似物TrypLE的双抗夹心ELISA检测试剂盒的制备方法，具体方法为：
（1）制备检测ELISA酶标板：包被缓冲液将抗TrypLE抗原的单克隆抗体稀释成2ug/mL，混匀后按100μl/孔加入空的酶标板，用封板膜封板；4℃包被过夜；PBST洗涤后，封闭液封闭37℃温育120min；封闭结束后PBST洗涤；
（2）ELISA试剂盒各组分的配制：配置试剂盒内检测ELISA酶标板、标准品、酶标抗体、样品稀释液、洗液、显色液A、显色液B、终止液、封板膜；
其中：标准品为标准品A-F：将TrypLE标准品使用稀释液稀释至40ng/mL、16ng/mL、6.4ng/mL、2.56ng/mL、1.024ng/mL、0.410ng/mL；酶标抗体：以1:5000-1:20000稀释的HRP-兔多克隆抗体；样品稀释液：pH=7.4的1×PBST，含0.05%Tween-20；20×洗液：pH=7.4的1×PBST，含0.05%Tween-20；显色液A为H2O2，显色液B为TMB；终止液：2mol/L浓H2SO4。
进一步的：所述TrypLE抗原标准品的原液浓度为20μg/mL；所述酶标抗体为HRP-兔多克隆抗体以按1：15000稀释。
利用所述试剂盒检测胰蛋白酶类似物TrypLE的检测方法，具体方法为：
（1）ELISA酶标板置于2-8℃保存；
（2）样品温育：设置标准品孔、空白孔和样本孔，标准品孔按顺序加入不同浓度的标准品100µl，空白孔加入样品稀释液100µl，样本孔中加入待测样本100µl，置于37℃温育30-120min；
（3）洗板：弃去孔中液体，用250µl /孔、1×洗液洗板3次，拍干样品孔中的残留液体；
（4）酶标抗体温育：每孔加入100µl酶标抗体，置于37℃温育30-90min；
（5）洗板：弃去孔中液体，用250µl /孔、1×洗液洗板3次，拍干样品孔中的残留液体；
（6）显色：将预先配置好的显色液按100µl/孔加入酶标板中，混匀，37℃避光温育15min；显色液为使用前10分钟将显色液A、显色液B等体积混合；
（7）终止：按100µl/孔加入终止液；
（8）读数：将酶标板放入酶标仪中测定OD450nm吸光度，读数在20min内完成；
（9）结果处理：每个标准品的平均OD值减去空白孔的OD值作为矫正值，以标准品的OD450nm值为因变量Y，以标准品浓度为自变量X做曲线；使用四参数Logisitic数学模型拟合方程：Y=((A-D)/(1+(x/C)^B))+D，以样品OD450nm吸光度值代入公式计算样品中TrypLE的含量。
所述酶标抗体温育时间为60min；样品温育时间为90min，显色液温育时间为20min；试剂盒的定量检测上限为40 ng/mL；四参数Logistic曲线拟合方程:y=(2.78741-1.08538)/[1+(x/18.65794)^ -1.08538]+0.06775，r^2=0.99997，检测范围为0.4096-40ng/ml。
本发明应用双抗体夹心酶联免疫吸附检测技术测定样品中TrypLE的微量残留。用捕获抗体包被96孔酶标板，制成固相抗体，随后加入标准品和检测样品，再加入辣根过氧化物酶标记的标记抗体，形成一个固相抗体-TrypLE-标记抗体的三明治结合物，反应结束后洗涤，然后加入底物进行显色反应，底物在HRP的催化下转化成蓝色，并在终止液的作用下转化成最终的黄色。在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算待测样品中TrypLE的含量。
用于定量检测各种生物制品的中间品、半成品和成品中TrypLE残留量的专用试剂盒。本试剂盒操作方便简单，可直接用于样品分析，重现性好，稳定性高。
本发明中制备的针对TrypLE的检测试剂盒，可以有效，快速，便捷的检测样品中TrypLE的残留量，这不仅填补了现有规定中对TrypLE残留检测的空白，并且可以帮助众多使用它的生物医药企业更好的进行产品的质量控制，通过试剂盒的性能验证，证实了所生产的试剂盒符合药物生产企业的检测。相比于其他同类型试剂盒，为了方便使用，我们在试剂盒制备过程中将标准品预先稀释至所需浓度，而不需要使用者进行配置，这进一步降低了因实验人员或条件导致的结果不稳定。综上所述，本研究所制备的试剂盒具有较好的特异性、敏感性、稳定性，可用于细胞培养中或生物医药生产中的胰酶类似物TrypLE的定量检测。
附图说明
图1为纯化后的多克隆抗体凝胶电泳结果；图中：M为marker；1，2，3为多克隆抗体；
图2为用于检测胰蛋白酶类似物TrypLE的双抗夹心ELISA检测试剂盒的检测标准曲线图；
图3为用于检测胰蛋白酶类似物TrypLE的双抗夹心ELISA检测试剂盒的检测回归方程；
图4为使用所建立的ELISA方法检测不同样品的特异性结果。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例；基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
一、胰蛋白酶类似物抗体制备
1、材料、仪器、试剂
抗原及细胞：TrypLE标准品（纯度大于95％）购自美国GIBCO 公司，SP2/0骨髓瘤细胞。
实验动物：SPF级BALB/c小鼠，5周龄，体重约10g，雌性；新西兰兔2只，雌性，以上动物均由本公司实验动物室提供。
主要试剂：HRP 标记的羊抗鼠 IgG 购自北京中杉金桥生物技术有限公司；PEG4000 购自国药集团化学试剂公司；小鼠抗体亚类测定试剂盒和 HRP 为Sigma公司产品；RPMI1640 培养基为美国 GIBCO 公司产品；SPA-Sepharese 4B 和 G200为 GE 公司产品；TrypLE抗原标准品（0.5mg/ml）。
2、动物免疫：取 BALB/c小鼠，将TrypLE抗原40μg与弗氏完全佐剂混合，乳化，皮下及腹腔注射免疫小鼠，2周后，以相同剂量的TrypLE抗原与弗氏不完全佐剂混合，乳化，注射部位同前，第 2 次免疫小鼠；细胞融合前3d，以相同剂量无佐剂 TrypLE抗原经小鼠尾静脉加强免疫。
3、单克隆抗体制备：取无菌免疫小鼠的脾细胞，与SP2/0细胞在 PEG4000 作用下融合。采用间接ELISA 法筛选阳性杂交瘤细胞株，有限稀释法进行克隆化培养。取Balb/c小鼠，首先腹腔注射0.5ml液体石腊或降植烷进行预处理。1-2周后，腹腔内接种杂交瘤细胞。约2周后，用注射器抽取腹水，即可获得腹水单克隆抗体。另将杂交瘤细胞置于培养瓶中进行培养。在培养过程中，杂交瘤细胞产生并分泌单克隆抗体，收集培养上清液，离心去除细胞及其碎片，即可获得所需要的单克隆抗体。采用间接 ELISA 法测定各株杂交瘤细胞的腹水及培养上清效价。
4、多克隆抗体制备：抗体制备委托南京金斯瑞生物科技有限公司进行，使用动物为健康的新西兰兔，在免疫前四天进行预采血。第一次免疫时将200ug的佛氏完全佐剂与200ug抗原充分混匀接种兔子；第二次免疫为第14天，将200ug的佛氏完全佐剂与200ug抗原充分混匀接种兔子，在第21天时进行第一次采血检测，第三次免疫为第35天，将200ug的佛氏完全佐剂与200ug抗原充分混匀接种兔子。在第42天时进行第二次采血检测。采用抗原亲和树脂层析法纯化单克隆抗体，使用凝胶电泳法对纯化的抗体蛋白进行检测。采用间接ELISA 法测定纯化后抗体效价。
二、实验结果：
1、杂交瘤细胞株建立及单克隆抗体检测：经3次克隆，共获得4株稳定分泌抗TrypLE抗原的杂交瘤细胞株，分别命名为 A67、A78、C15、D26，其细胞培养上清抗体效价、腹水抗体效价及单抗亚类测定结果见表1。
表1：单克隆细胞株相关信息表
Figure DEST_PATH_IMAGE002
2、多克隆抗体纯化及检测：纯化后的多克隆抗体凝胶电泳结果如图1所示，纯化的多克隆抗体大小为25kd，其纯度为99%。ELISA检测结果如表2所示，结果显示：效价是符合S/B（signal/blank）≥2.1的最高稀释比例。
表2：间接ELISA法检测纯化抗体和血清的OD值
Figure DEST_PATH_IMAGE004
三、双抗体夹心ELISA的建立及验证
1、材料、仪器：纯化的单克隆抗体，酶标板，封闭液，包被抗体稀释液，TrypLE抗原，检测抗体。恒温培养箱，酶标仪，洗板机。
其中：抗体：制备的鼠单克隆抗体、兔多克隆抗体；抗原：TrypLE抗原；酶标板：康宁（货号：9018）。包被缓冲液：pH=9.6的0.05M碳酸盐缓冲液。洗液：pH =7.4的1×PBST（含0.05%Tween-20）；封闭液：pH=7.4的1×PBST（含3%BSA）；抗体稀释液：pH=7.4的1×PBST（含0.05%Tween-20）；显色液：显色液A为H2O2，显色液B为TMB（Cat：5120-0074，lot：10410532）；终止液：2mol/L浓H2SO4。
2、标准品浓度标定：目前TrypLE™ Select尚无国际约定校准品及国际约定参考测量程序，故依照该GB/T 21415 2008/ISO 17511:2003文件《体外诊断医疗器械 生物样品中量的测量校准品和控制物质赋值的计量学溯源性》第5章校准传递方案 5.6（具有制造商选定测量程序，但既无国际约定参考测量程序，也无国际约定校准品，不能在计量上溯源到SI的情况）中对制造商所确定的标准物质进行校准。使用BCA法（上海生工，BCA法微量蛋白质浓度测定试剂盒，批号G914DA0005）对所购买的TrypLE（gibco，批号2215065）进行标定。按照BCA蛋白检测试剂盒说明书进行TrypLE标准品进行浓度标定。
3、包被抗体、酶标抗体的最佳工作浓度的确定：将纯化后的包被抗体蛋白用包被液倍比稀释成3个浓度，即0.5ug/ml，1ug/ml，2ug/ml，5ug/ml，每孔100μl，4℃包被过夜；PBST洗涤后，每孔加入200ul的封闭液封闭。每孔加入100μl的浓稀释至适宜浓度的TrypLE标准品和阴性对照，37℃温育120min，洗涤；HRP标记的酶标抗体以1:5000，1:10000，1:15000，1:20000稀释，37℃温育90min，进行棋盘实验。之后加入显色液（A与B按比例1:1混合均匀），37℃作用15min，加入终止液，酶标仪测OD450nm吸光度。
4、各组分最佳工作时间的确定：设置样品温育的作用时间为0.5h，1h，1.5h，2h，之后按照ELISA程序进行至OD450读数，重复实验确定样品最佳温育时间。此后按照最佳的样品温育时间进行实验，将检测抗体温育时间分别设置为30 min、60 min、90 min进行实验，确定最佳的抗体孵育时间。最后，按照前两项得出的最佳作用时间进行实验，并将显色液最佳温育时间设为5，10，15，20min，酶标仪测OD450nm吸光度。
5、验证
A、线性范围：将TrypLE抗原标准品做系列稀释至0.4-150 ng/mL，用建立的双抗体夹心ELISA进行检测，进行3次重复，以抗原浓度( ng /mL)为横坐标，A450 nm 值为纵坐标，绘制标准曲线。
B、特异性：用建立的方法检测胰蛋白酶类似物TrypLE，牛血清白蛋白，胃蛋白酶，糜蛋白酶，验证方法的特异性。
C、检测限：用样本稀释液作为样本进行检测，重复测定20次，得出20次测量结果的吸光度值（A值），计算其平均值（M）和标准差（SD），得出M+2SD所对应的A值，根据试剂盒所用校准品的标曲线方程，将M+2SD所对应的A值带入上述方程中，求出对应的浓度值，即为检测限。
D、定量限：重复测定不同的低浓度参考物质各10次后，分别记录其结果平均值记为M1，M2等。根据公式：测量偏差=（M-理论值）/理论值×100%，计算10次测量浓度结果的平均值M和标准差SD，得出变异系数CV=SD/M×100%。选取变异系数≤15%的最低浓度作为定量限。
E、准确性--标准偏差：重复测定高（32 ng/ml）、中（20 ng/ml）、低（2 ng/ml）浓度参考物质3次后，其结果平均值记为M，根据公式：测量偏差=（M-理论值）/理论值×100%，要求测量偏差≤15%。
F、准确性--加标回收率：选择合适浓度的样本，分为体积相同的3-4份。在其中2-3份样本中加入不同浓度相同体积的待测物标准液制备待回收分析样本，加入体积小于原体积的10% ，制成2-3个不同加入浓度的待回收分析样本，计算加入的待测物的浓度。在另一份样本中加入同样体积的无待测物的容剂，制成基础样本。对样本进行3次重复测定，计算均值。加入浓度=标准液浓度×标准液体积/(样本体积+标准液体积)。回收率=（待回收样本浓度均值-基础样本浓度均值）/加入浓度×100%。平均回收率=（回收率1+回收率2+…+回收率n）/n×100%，所求的的回收率与平均回收率的差值应≤±10%。
G、重复性：分别将试剂盒内标准品A和B、C和D等体积混匀制成不同浓度的检测样本，各重复检测10次，计算10次测量浓度结果的平均值M和标准差SD，得出变异系数CV=SD/M×100%，结果要求批内变异系数≤10%，批间变异系数≤15%。
四、ELSIA 试剂盒的制备：
1、ELISA试剂盒预包酶标板的制备：酶标板：康宁生产的酶标板。包被缓冲液：pH=9.6的0.05M碳酸盐缓冲液；封闭液：pH =7.4的1×PBST（含3%BSA）；洗液：pH =7.4的1×PBST（含0.05%Tween-20）。
抗体包被：将纯化后的单克隆抗体用包被缓冲液稀释至2ug/ml，充分混匀，按100μl/孔加入空的酶标板，用封板膜封板，在冰箱中4℃放置过夜。
洗板：次日取出酶标板，恢复至室温后，每孔加入200ul 1×PBST洗液，洗板4次，洗板结束后将酶标板倒扣在干净吸水纸上，拍去残留洗液。
封闭：洗板结束后，每孔加入200μl封闭液，用封板膜封板，37℃温育 2h。
洗板：封闭结束后，每孔加入200ul 1×PBST洗液，洗板4次，洗板结束后将酶标板倒扣在干净吸水纸上，拍去残留洗液。
2、ELISA试剂盒各组分的配制：配置试剂盒内酶标板、标准品A、标准品B、标准品C、标准品D、标准品E、标准品F、酶标抗体、样品稀释液、洗液（20×）、显色液A、显色液B、终止液、封板膜等。
酶标板：预包酶标板。标准品A-F：将TrypLE标准品使用稀释液稀释至40ng/mL、16ng/mL、6.4ng/mL、2.56ng/mL、1.024ng/mL、0.410ng/mL；酶标抗体：按1：15000稀释的兔多克隆抗体。样品稀释液：pH=7.4的1×PBST（含0.05%Tween-20）；洗液(20×)：pH=7.4的1×PBST（含0.05%Tween-20）；显色液A为H2O2，显色液B为TMB；终止液：2mol/L浓H2SO4；具体组分、储存条件见表3。
表3：试剂盒组分配制
Figure DEST_PATH_IMAGE006
3、本试验所需自备试验器材：酶标仪、酶标板恒温振荡器或恒温培养箱、洗板机。高精度移液器及一次性吸头（0.5-10µl、10-100µl、30-300µl、100-1000µl）。去离子水、吸水纸、EP管。
4、试剂准备：1×洗液：取洗液（20×）1份，加19份去离子水配制成工作浓度洗液（1×）。洗液（20×）中如果有结晶形成，应置于室温或37℃水浴轻轻摇晃，待结晶完全溶解后再进行稀释。未用完的洗液（20×）应置于2-8℃储存。
底物液的配制：使用前10分钟将显色液A、显色液B等体积混合，避光。确保底物液不被污染，如混合后的底物液已经变蓝，请勿使用。
具体实验方法：
（1）从已平衡至室温的铝箔袋中取出试验所需板条置于2-8℃保存。
（2）样品温育：设置标准品孔、空白孔和样本孔，标准品孔按顺序加入不同浓度的标准品100µl，空白孔加入样品稀释液100µl，样本孔中加入待测样本100µl，然后置于37℃温育0.5h。
（3）洗板：弃去孔中液体，用1×洗液洗板3次（250µl /孔），拍干样品孔中的残留液体。（每次加入洗液后，如采用手洗板，加洗液后可静置1min并轻微震荡；如采用洗板机洗板，加洗液后可轻微震荡5s。）
（4）酶标抗体温育：每孔加入100µl酶标抗体，然后置于37℃温育0.5h。
（5）洗板：同步骤3。
（6）显色：将预先配置好的底物液加入酶标板中，混匀（100µl/孔），37℃避光温育15min。
（7）终止：加入终止液，100µl/孔。
（8）读数：将酶标板放入酶标仪中测定450nm处的OD值，读数应在20min内完成。
（9）结果处理：每个标准品的平均OD值减去空白孔的OD值作为矫正值。以标准品的OD450nm值为因变量Y，以标准品浓度为自变量X做曲线。推荐使用四参数Logisitic数学模型拟合方程：Y=((A-D)/(1+(x/C)^B))+D，以样品OD450nm吸光度值代入公式计算样品中TrypLE的含量。
五、结果
1、TrypLE标准品浓度标定：使用BCA试剂盒，对标准品原液进行蛋白质定量检测：经过3名实验员在1个月内30次的检测结果见表4，最终确定标准品原液的浓度为20μg/mL。
表4： BCA检测TrypLE浓度结果
Figure DEST_PATH_IMAGE008
2、双抗体夹心ELISA建立
A、包被抗体、检测抗体的最佳工作浓度的确定：酶标仪测OD450nm吸光度的结果如表4所示，综合考虑强抗原的OD450nm值在2.0左右、阴性血清OD450nm值较低且本底较低、P/N值最大的组合，最终选定捕获抗体用2ug/ml包板，检测抗体稀释15000倍的组合进行检测方法的建立。
双抗体夹心ELISA 检测抗原含量操作简便，灵敏度高，特异性强，适合准确定量有生物活性的物质。在细胞培养以及基因工程药物生产中，按《中国药典》（2020 版）要求，需要进行胰酶等添加物进行质量控制。本发明建立的胰蛋白酶类似物ELISA 检测方法，以鼠单克隆抗体作为包被抗体，兔多克隆抗体抗作为检测抗体，这样具有较高的特异性、敏感性。
在细胞培养中，胰蛋白酶作为解离细胞的消化剂被广泛使用。但常用的胰蛋白酶是一种动物源性的蛋白酶，存在着动物源病毒感染的风险，且使用时必须添加特异性酶抑制剂才可中止消化。TrypLE作为一种通过生物工程制备的非动物源性胰蛋白酶类似物，因其制备方式，不仅有效的防止了动物源性中可能存在的生物污染，并且纯度较高从而具有更强的特异性，并且终止消化时不需要特异性酶抑制剂，只需要使用稀释液进行稀释即可停止反应，这样极大程度上减少了对培养细胞的干扰。基于以上优点，TrypLE已经逐渐替代传统的胰蛋白酶在细胞培养中发挥，目前TrypLE已经在国内外的药物生产企业中得到了广泛的应用。
胰蛋白酶现行标准收载于《中国药典》2020年版第二部，收录的检测项目未包含残留量检测，滞后于目前药品生产与质量控制中的要求。这不仅在细胞培养过程中带来潜在的风险，会给相关生物制品的临床使用造成安全隐患，也是生物制品生产检定用动物细胞基质制备及质量控制中仍需完善的一环。而TrypLE作为目前较为常用且潜力巨大的胰蛋白酶类似物，在细胞培养，重组蛋白药物制备，疫苗生产等过程中广泛使用，其残留检测的重要性愈发显著。
表5：不同工作浓度的两种抗体组合的OD值测定表
Figure DEST_PATH_IMAGE010
B、各组分最佳工作时间的确定：不同样品温育时间的结果如表6所示，标准品回算浓度在0.4096ng/ml时差异较大，温育90min的结果更接近理论浓度，结合质控品的检测结果，确定样品最佳温育时间为90min。
表6 不同样品孵育时间测得的回算浓度
Figure DEST_PATH_IMAGE012
不同酶标抗体温育时间的结果如表7所示，40ng/ml标准品显色30min的OD值较低，显色60min标准品回算浓度更接近理论值，显色90min的空白OD值略高，结合质控品的检测结果，故确定酶标抗体最佳温育时间为60min。
表7：不同酶标抗体孵育时间测得的回算浓度
Figure DEST_PATH_IMAGE014
最后不同显色液温育时间的结果如表7所示，40ng/ml标准品显色5min、10min的OD值均较低，显色15min的标准品回算浓度和质控品检测值更接近理论值，确定检测抗体最佳温育时间为60min。最终确定样品最佳温育时间为90min，检测抗体最佳温育时间为60min，显色液最佳温育时间为20min。
表8：不同底物显色时间测得的回算浓度
Figure DEST_PATH_IMAGE016
3、方法的验证
A、标准曲线的建立：结果如图2、3所示，TrypLE浓度为0.4-40ng/ml时线性较好，四参数Logistic曲线拟合方程：y=(2.59170-0.07557)/[1+(x/16.13153)^-1.15933]+0.07557，r^2=0.99989。检测曲线和回归方程的结果显示，当蛋白浓度大于40 ng/mL时曲线趋于平缓，说明结合的抗原量达到饱和，因此将40 ng/mL作为定量检测上限。结合样品中TrypLE的浓度范围，舍弃60ng/ml、80ng/ml、100ng/ml这三个点后。四参数Logistic曲线拟合方程:y=(2.78741-1.08538)/[1+(x/18.65794)^ -1.08538]+0.06775，r^2=0.99997，固优化后的标准曲线检测范围为0.4096-40ng/ml。
B、特异性：如图4所示，除TrypLE抗原外，牛血清白蛋白，胃蛋白酶，糜蛋白酶的浓度与 A450 nm 值均无相关性，表明建立的方法具有较好的特异性。
C、检测限的确定：20次样本稀释液的平均OD值为0.046，标准差SD值为0.0016，然后根据上述公式A=M+2SD，并将所得A值带回原标准曲线，求得检测限为0.258ng/ml。结果如表9所示。
表9： 样本稀释液检测的OD值
Figure DEST_PATH_IMAGE018
D、定量限：选定的低浓度值分别为0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7ng/ml，分别重复测定10次后，其浓度平均值、标准偏差、变异系数以及测量偏差的结果如表10所示，其中变异系数≤15%的最低浓度为0.5ng/ml，故选择此浓度作为定量限。
表10： 低浓度定量限检测
Figure DEST_PATH_IMAGE020
E、准确性--标准偏差：标准偏差的检测结果如表11所示，三个不同浓度的OD值测量偏差均远小于15%，结果表明试剂盒的准确性较好。
表11： 高中低浓度参考物测量偏差表
Figure DEST_PATH_IMAGE022
F、准确性--加标回收率：回收率检测结果如表12所示，其中回收率均≤±10%，表明其他干扰物质对本方法的准确性影响较小。
表12： 回收率测量表
Figure DEST_PATH_IMAGE024
B D是指病毒样本。
BD/5是病毒样本使用样本稀释液稀释5倍(400uL BD加入1600uL 样本稀释液)；
BD/5+0，是指360uL 5倍稀释后病毒样本加入40uL 样本稀释液，即360uL BD/5加入40uL 样本稀释液。100ng/mL，是将10uL 1ug/mL中间液,加入90uL样本稀释液。
BD/5+A（B/C/100ng/mL）：病毒样本使用样本稀释液稀释5倍后，加入10%体积的标准品A（B/C/100ng/ml），即360uL BD/5加入40uL 标品A（B/C/100ng/ml）。
G、重复性：重复性结果要求批内变异系数≤10%，批间变异系数≤15%，表明该方法的重复性好，结果稳定，对外界干扰因素的抵抗能强。结果如表13所示，
表13：变异系数测量表
Figure DEST_PATH_IMAGE026
本发明中制备的针对TrypLE的检测试剂盒，可以有效，快速，便捷的检测样品中TrypLE的含量，这不仅填补了现有规定中对TrypLE残留检测的空白，并且可以帮助众多使用它的生物医药企业更好的进行产品的质量控制，通过试剂盒的性能验证，证实了所生产的试剂盒符合药物生产企业的检测。相比于其他同类型试剂盒，为了方便使用，我们在试剂盒制备过程中将标准品预先稀释至所需浓度，而不需要使用者进行配置，这进一步降低了因实验人员或条件导致的结果不稳定。综上所述，本研究所制备的试剂盒具有较好的特异性、敏感性、稳定性，可用于细胞培养中或生物医药生产中的胰蛋白酶类似物TrypLE定量检测。
本发明应用双抗体夹心酶联免疫吸附检测技术测定样品中TrypLE的微量残留。用捕获抗体包被96孔酶标板，制成固相抗体，随后加入标准品和检测样品，再加入酶标抗体，形成一个固相抗体-TrypLE-标记抗体的三明治结合物，反应结束后洗涤，然后加入底物进行显色反应，底物在HRP的催化下转化成蓝色，并在终止液的作用下转化成最终的黄色。在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算待测样品中TrypLE的含量。
用于定量检测各种生物制品的中间品、半成品和成品中TrypLE的专用试剂盒。本试剂盒操作方便简单，可直接用于样品分析，重现性好，稳定性高。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (10)

1.一种用于检测胰蛋白酶类似物TrypLE的双抗夹心ELISA检测试剂盒，包括：包被有捕获抗体的酶标板制成的固相抗体、酶标抗体、TrypLE标准品、样品稀释液、包被缓冲液、封闭液、ELISA酶标板洗涤液、显色液和终止液。
2.根据权利要求1所述的用于检测胰蛋白酶类似物TrypLE的双抗夹心ELISA检测试剂盒，其特征在于：所述捕获抗体为采用TrypLE抗原免疫小鼠，经融合、克隆、筛选得到的单克隆抗体，捕获抗体用0.5-5ug/ml包板。
3.根据权利要求2所述的用于检测胰蛋白酶类似物TrypLE的双抗夹心ELISA检测试剂盒，其特征在于：所述捕获抗体为抗TrypLE抗原的鼠单克隆抗体；捕获抗体用2ug/ml包板。
4.根据权利要求1或2所述的用于检测胰蛋白酶类似物TrypLE的双抗夹心ELISA检测试剂盒，其特征在于：所述酶标抗体为HRP-兔多克隆抗体；大小为25kd，其纯度为99%。
5.根据权利要求1所述的用于检测胰蛋白酶类似物TrypLE的双抗夹心ELISA检测试剂盒，其特征在于：所述样品稀释液为 pH=7.4的1×PBST，含PBST 体积0.05%的Tween-20；包被缓冲液为 pH=9.6的0.05M碳酸盐缓冲液；封闭液为 pH =7.4的1×PBST，含PBST 体积3%的BSA；ELISA酶标板洗涤液为 pH=7.4的1×PBST，含0.05%Tween-20；显色液为显色液A和显色液B等体积混合，显色液A为H2O2，显色液B为TMB；终止液为2mol/L浓H2SO4。
6.根据权利要求1所述的用于检测胰蛋白酶类似物TrypLE的双抗夹心ELISA检测试剂盒，其特征在于：所述TrypLE标准品为标准品A-F：将TrypLE标准品使用稀释液稀释至40ng/mL、16ng/mL、6.4ng/mL、2.56ng/mL、1.024ng/mL、0.410ng/mL。
7.权利要求1所述用于检测胰蛋白酶类似物TrypLE的双抗夹心ELISA检测试剂盒的制备方法，其特征在于：具体方法为：
（1）制备检测ELISA酶标板：包被缓冲液将抗TrypLE抗原的单克隆抗体稀释成0.5-5ug/ml，混匀后按100μl/孔加入空的酶标板，用封板膜封板；4℃包被过夜；PBST洗涤后，封闭液封闭37℃温育120min；封闭结束后PBST洗涤；
（2）ELISA试剂盒各组分的配制：配置试剂盒内检测ELISA酶标板、标准品、酶标抗体、样品稀释液、洗液、显色液A、显色液B、终止液、封板膜；
其中：标准品为标准品A-F：将TrypLE标准品使用稀释液稀释至40ng/mL、16ng/mL、6.4ng/mL、2.56ng/mL、1.024ng/mL、0.410ng/mL；酶标抗体：以1:5000-1:20000稀释的HRP-兔多克隆抗体；样品稀释液：pH=7.4的1×PBST，含0.05%Tween-20；20×洗液：pH=7.4的1×PBST，含0.05%Tween-20；显色液A为H2O2，显色液B为TMB；终止液：2mol/L浓H2SO4。
8.根据权利要求7所述用于检测胰蛋白酶类似物TrypLE的双抗夹心ELISA检测试剂盒的制备方法，其特征在于：所述TrypLE抗原标准品的原液浓度为20μg/mL；包被缓冲液将抗TrypLE抗原的单克隆抗体稀释成2ug/ml；所述酶标抗体为HRP-兔多克隆抗体以按1：15000稀释。
9.利用权利要求1所述试剂盒检测胰蛋白酶类似物TrypLE的检测方法，其特征在于：具体方法为：
（1）ELISA酶标板置于2-8℃保存；
（2）样品温育：设置标准品孔、空白孔和样本孔，标准品孔按顺序加入不同浓度的标准品100µl，空白孔加入样品稀释液100µl，样本孔中加入待测样本100µl，置于37℃温育30-120min；
（3）洗板：弃去孔中液体，用250µl /孔、1×洗液洗板3次，拍干样品孔中的残留液体；
（4）酶标抗体温育：每孔加入100µl酶标抗体，置于37℃温育30-90min；
（5）洗板：弃去孔中液体，用250µl /孔、1×洗液洗板3次，拍干样品孔中的残留液体；
（6）显色：将预先配置好的显色液按100µl/孔加入酶标板中，混匀，37℃避光温育15min；显色液为使用前10分钟将显色液A、显色液B等体积混合；
（7）终止：按100µl/孔加入终止液；
（8）读数：将酶标板放入酶标仪中测定OD450nm吸光度，读数在20min内完成；
（9）结果处理：每个标准品的平均OD值减去空白孔的OD值作为矫正值，以标准品的OD450nm值为因变量Y，以标准品浓度为自变量X做曲线；使用四参数Logisitic数学模型拟合方程：Y=((A-D)/(1+(x/C)^B))+D，以样品OD450nm吸光度值代入公式计算样品中TrypLE的含量。
10.根据权利要求9所述利用试剂盒检测胰蛋白酶类似物TrypLE的检测方法，其特征在于：所述酶标抗体温育时间为60min；样品温育时间为90min，显色液温育时间为20min；试剂盒的定量检测上限为40 ng/mL；四参数Logistic曲线拟合方程:y=(2.78741-1.08538)/[1+(x/18.65794)^ -1.08538]+0.06775，r^2=0.99997，检测范围为0.4096-40ng/ml。
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