CN112285348B - 新冠病毒疫苗表达抗原蛋白的电化学发光免疫检测试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种新冠病毒疫苗表达抗原蛋白的电化学发光免疫检测试剂盒,所述试剂盒至少包含:包被有链霉亲和素的孔板、生物素标记的抗新冠棘突蛋白抗体1、SULFO标记的抗新冠棘突蛋白抗体2、洗涤液、读数液、新冠病毒S蛋白标准品和新冠病毒RBD蛋白标准品。本发明以生物素标记的抗新冠棘突蛋白的抗体1与链霉亲和素板进行连接作为固定相,以新冠S蛋白、RBD蛋白作为参照品,可被SULFO标记的抗体2识别,从而检测新冠抗原的表达情况。该试剂盒能准确灵敏地定量检测不同基质中的新冠S蛋白、RBD蛋白,样品的前处理过程简单,耗时少,可同时检测大量样品。本发明对于大批量样品的新冠病毒疫苗表达抗原的检测具有重要意义。

Description

新冠病毒疫苗表达抗原蛋白的电化学发光免疫检测试剂盒
技术领域
本发明涉及免疫检测领域,具体地说,涉及一种新冠病毒疫苗表达抗原蛋白的电化学发光免疫检测试剂盒。
背景技术
2019年至今,新冠疫情给全球经济,生活以及健康造成了巨大损失,新冠疫苗作为预防控制传染病最经济有效的手段,是控制新冠疫情的关键所在。新冠病毒疫苗 研发正在以前所未有的速度进行,根据WHO统计,截至12月2日,全球有超过214种候选疫苗正在研发,其中51种已经进入临床试验阶段, 13种疫苗进入Ⅲ期临床。其中主要的疫苗类型包括:病毒灭活疫苗、基因工程重组疫苗、病毒载体类疫苗、核酸类疫苗(质粒DNA、mRNA等)等多条技术路线齐头并进。从临床3期试验结果来看,取得了较好的临床效果。12月2日,英国政府宣布,该国药品和保健品管理局(MHRA)批准使用辉瑞公司和德国生物新技术公司研发的新冠疫苗,将从下周开始在全英推出,这一紧急授权为英国的疫苗部署扫清了道路。但其安全性、免疫原性、有效性等问题仍然备受关注。
对于不同类型的新冠疫苗而言,理想状态是应具有良好的免疫原性,到达体内后,能激发机体广泛的免疫应答(体液免疫与细胞免疫);能刺激B细胞产生强抗原,减少非中和或者弱抗原的产生;并对人体有持久的保护作用。
疫苗研发是一个科学,严谨,复杂的过程,往往需要5-10年的过程,但由于新冠疫情大规模爆发,需在更短的时间内有效控制新冠疫情的蔓延,这就要求对疫苗研发的全过程进行严格的质量控制。冠状病毒基因组依次编码棘突蛋白、包膜蛋白、膜蛋白和核衣壳蛋白。其中棘突蛋白是冠状病毒最重要的表面膜蛋白,含有两个亚基,S1亚基与S2亚基。其中S1主要包含有受体结合区(receptorbinding domain,RBD),负责识别细胞的受体。SARS-CoV-2 (2019-nCoV)的棘突蛋白与人血管紧张素转化酶2(Angiotensin-convertingenzyme 2,ACE2)蛋白互作来感染人的呼吸道上皮细胞。棘突蛋白承担新冠病毒与宿主细胞膜受体结合及膜融合功能,是新冠疫苗设计的关键靶点。棘突蛋白作为重要的免疫原蛋白关系到该疫苗是否能够刺激机体产生有效的保护性抗体。
现有检测新型冠状病毒疫苗的棘突蛋白的方法为酶联免疫法,由于实验周期长,不可控性因素多,检测重复性差;此外样本用量较多;大部分种类的疫苗抗原成分复杂,棘突蛋白含量较少,需要更加灵敏的方法进行检测与疫苗质量控制。
发明内容
本发明的目的是提供一种具有操作简单,高灵敏度、高特异性、高准确度、高精确度的电化学发光免疫检测试剂盒,用于新型冠状病毒及疫苗制品中棘突蛋白的快速检测。
为了实现本发明目的,第一方面,本发明提供一种新冠病毒疫苗表达抗原蛋白的电化学发光免疫检测试剂盒,所述试剂盒至少包含:包被有链霉亲和素的孔板(如96孔板)、生物素标记的抗新冠棘突蛋白抗体1、SULFO标记的抗新冠棘突蛋白抗体2、洗涤液和读数液,以及新冠病毒S蛋白(S三聚体蛋白)标准品和新冠病毒RBD蛋白标准品。
其中,所述抗新冠棘突蛋白抗体1的重链、轻链氨基酸序列分别如SEQ ID NO:1和2所示;所述抗新冠棘突蛋白抗体2的重链、轻链氨基酸序列分别如SEQ ID NO:3和4所示。抗体1、抗体2是从通过免疫小鼠新冠棘突蛋白进行亲和力测试与配对筛选并获取可变区序列并重组得到的。用新冠棘突蛋白免疫小鼠,采用杂交瘤技术制备单克隆抗体,从众多克隆中选择亲和力高,能够联合用于(抗体表位分析)检测新冠棘突蛋白的抗体对,然后分别进行生物素标记与SULFO标记。选择配对抗体的方法为生物膜干涉技术。抗体1、抗体2分别结合新型冠状病毒S蛋白或RBD蛋白的不同抗原表位。
所述读数液是一种基于Tris的缓冲液,其中含有三丙胺(TPA)作为共轭反应物,可在电化学发光免疫分析中产生光。
进一步地,孔板上包被的链霉亲和素的浓度为2ug/ml。
孔板包被链霉亲和素之后,需进行封闭处理。例如,在96孔链霉亲和素板中加入150μL MSD封闭液,在室温下,封闭1h后,将液体甩干,并晾干密封。所用封闭液是含2%酪蛋白的PBS溶液。
所述洗涤液为含有0.5%v/v Tween-20的PBS溶液,pH7.4。
本发明中,PBS溶液的配制如下:将0.2722g KH2PO4,3.58g Na2HPO4.12H2O,8.0063gNaCl和0.2066g KCl溶于1L水中。
本发明中,上述洗涤液亦可作为样品稀释液。使用时,需要用水进行20倍稀释变成工作液。
进一步地,所述读数液为含有0.5 %v/v三丙胺的Tris溶液。
本发明中,Tris溶液的配制如下:将2.4228g Tris和8.766g NaCl溶于1L水中。
进一步地,所述生物素标记的抗新冠棘突蛋白抗体1中生物素与抗新冠棘突蛋白抗体1的摩尔比为为2:1,且生物素标记到抗新冠棘突蛋白抗体1的赖氨酸上。
进一步地,所述SULFO标记的抗新冠棘突蛋白抗体2中SULFO与抗新冠棘突蛋白抗体2的摩尔比为2:1,且SULFO标记到抗新冠棘突蛋白抗体1的赖氨酸上。
本发明的试剂盒中,所述生物素标记的抗新冠棘突蛋白抗体1、上述SULFO标记的抗新冠棘突蛋白抗体2、所述新冠病毒S蛋白标准品、所述新冠病毒RBD蛋白标准品可以是冻干粉形式。
本发明的新冠S蛋白、新冠RBD蛋白均为人细胞HEK293细胞表达,新冠S蛋白维持其天然三聚体的蛋白结构。该蛋白结构经过MALS与负染电镜进行了结构验证。新冠S蛋白、RBD蛋白在GenBank上的参考序列编号为QHD43416.1。
本发明试剂盒的检测原理:基于双抗体夹心法检测蛋白,96孔链霉亲和素板上的各实验孔与阳性对照孔均加入预混1h的生物素标记的抗新冠棘突蛋白抗体1和SULFO标记的抗新冠棘突蛋白抗体2以及梯度稀释的新冠S三聚体蛋白或新冠RBD蛋白。然后在化学发光仪上加入读数液进行读数。当待测的新冠棘突蛋白浓度越高时,则被结合到生物素抗新冠棘突蛋白抗体1的蛋白量越高,同时被SULFO标记的抗新冠棘突蛋白抗体2检测到的信号越高。根据用已知的新冠棘突蛋白的浓度所绘制的标准曲线,可以推算出待测样本中新冠棘突蛋白的含量。
第二方面,本发明提供所述试剂盒在新冠病毒疫苗抗原蛋白的电化学发光免疫检测及新冠疫苗质控中的应用。
第三方面,本发明提供新冠病毒疫苗抗原蛋白(S蛋白)的电化学发光免疫检测方法,包括:
1)配制不同浓度的新冠病毒S蛋白标准品溶液,浓度范围为3.052pg/mL~6250pg/mL;例如,配制浓度为6250pg/mL,3125pg/mL,1562.5pg/mL,781.25pg/mL,390.63pg/mL,195.31pg/mL,97.65pg/mL,48.83pg/mL,22.41pg/mL,12.21pg/mL,6.105pg/mL,3.052pg/mL和0pg/mL的S蛋白标准品溶液;
2)将上述新冠病毒S蛋白标准品溶液分别加入到包被有链霉亲和素的孔板中,25-30μL/孔,然后将各孔中加入50-100μL的生物素标记的抗新冠棘突蛋白抗体1溶液和50-100μL的SULFO标记的抗新冠棘突蛋白抗体2溶液,室温孵育1-1.5h后,倒掉孔板中的液体,用洗涤液洗板,然后每孔加入100μL读数液,在化学发光仪上读取光学信号值;
或者,将上述新冠病毒S蛋白标准品溶液25-30μL分别与50-100μL的生物素标记的抗新冠棘突蛋白抗体1溶液和50-100μL的SULFO标记的抗新冠棘突蛋白抗体2溶液混合,在震动板上室温孵育1h;然后将上述混合物加入到包被有链霉亲和素的孔板中,100μL/孔,室温孵育1-1.5h后,倒掉孔板中的液体,用洗涤液洗板,然后每孔加入100μL读数液,在化学发光仪上读取光学信号值;
3)建立反映新冠病毒S蛋白标准品溶液的浓度和光学信号值之间关系的标准曲线;
4)将步骤2)中的新冠病毒S蛋白标准品溶液替换成新冠病毒疫苗抗原蛋白待测样品,然后采用相同的方法测定待测样品的光学信号值,代入步骤3)的标准曲线中,得出待测样品中抗原蛋白的浓度。
新冠病毒S蛋白的检测下限为12.21pg/mL,线性检测范围为1562.5-12.21pg/mL。
第四方面,本发明提供新冠病毒疫苗抗原蛋白(RBD蛋白)的电化学发光免疫检测方法,包括:
1)配制不同浓度的新冠病毒RBD蛋白标准品溶液,浓度范围为0.3052pg/mL~625pg/mL;例如,配制浓度为625pg/mL,312.5pg/mL,156.25pg/mL,78.125pg/mL,39.063pg/mL,19.531pg/mL,9.765pg/mL,4.883pg/mL,2.241pg/mL,1.221pg/mL,0.6105pg/mL,0.3052pg/mL和0pg/mL的RBD蛋白标准品溶液;
2)将上述新冠病毒RBD蛋白标准品溶液分别加入到包被有链霉亲和素的孔板中,25-30μL/孔,然后将各孔中加入50-100μL的生物素标记的抗新冠棘突蛋白抗体1溶液和50-100μL的SULFO标记的抗新冠棘突蛋白抗体2溶液,室温孵育1-1.5h后,倒掉孔板中的液体,用洗涤液洗板,然后每孔加入100μL读数液,在化学发光仪上读取光学信号值;
或者,将上述新冠病毒RBD蛋白标准品溶液25-30μL分别与50-100μL的生物素标记的抗新冠棘突蛋白抗体1溶液和50-100μL的SULFO标记的抗新冠棘突蛋白抗体2溶液混合,在震动板上室温孵育1h;然后将上述混合物加入到包被有链霉亲和素的孔板中,100μL/孔,室温孵育1-1.5h后,倒掉孔板中的液体,用洗涤液洗板,然后每孔加入100μL读数液,在化学发光仪上读取光学信号值;
3)建立反映新冠病毒RBD蛋白标准品溶液的浓度和光学信号值之间关系的标准曲线;
4)将步骤2)中的新冠病毒RBD蛋白标准品溶液替换成新冠病毒疫苗抗原蛋白待测样品,然后采用相同的方法测定待测样品的光学信号值,代入步骤3)的标准曲线中,得出待测样品中抗原蛋白的浓度。
新冠病毒RBD蛋白的检测下限为1.221pg/mL,线性检测范围为156.25-1.221pg/mL。
与现有技术相比,本发明至少具有以下优点:
(一)本方法样本用量低,且方法稳定。该试剂盒可用于检测新冠灭活疫苗中S蛋白的含量、载体疫苗可表达S蛋白的含量或新冠mRNA疫苗在体内表达S蛋白的含量。
(二)与酶联免疫检测法相比,本发明采用预混模式,显著提高了检测通量。
(三)本发明以生物素标记的抗新冠棘突蛋白的抗体1与链霉亲和素板进行连接作为固定相,以新冠S三聚体蛋白、新冠RBD蛋白作为试剂盒参照品,可被SULFO标记的抗新冠棘突蛋白的抗体2识别,从而检测新冠抗原的表达情况。以此开发的检测试剂盒能准确灵敏地定量检测不同基质,如培养基、血清中的新冠S蛋白与新冠RBD蛋白,样品的前处理过程简单,耗时少,能同时检测大量的样品;并且,试剂盒中的蛋白试剂以冻干形式存在,保存时间长,液体无放射性污染。本发明对于大批量样品的新冠棘突蛋白的检测具有重要意义,并且对新冠不同类型的疫苗的工艺研发具有重要意义。
附图说明
图1为本发明较佳实施例中新冠抗原RBD蛋白参考品定量曲线。
图2为本发明较佳实施例中新冠抗原S蛋白参考品定量曲线。
图3为本发明较佳实施例中抗体1的亲和力测试结果,Kd=375 pM。
图4为本发明较佳实施例中抗体2的亲和力测试结果,Kd=57.6 pM。
图5为本发明较佳实施例中抗体1、抗体2结合新冠RBD蛋白的表位的分析结果。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明,但不用来限制本发明的范围。若未特别指明,实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段,所用原料均为市售商品。
以下实施例中使用的化学发光仪为Meso Scale Discovery厂家的电化学发光仪,型号为SQ120。
实施例1 新冠病毒疫苗表达抗原蛋白的电化学发光免疫检测试剂盒的构建
本实施例提供的新冠病毒疫苗表达抗原蛋白的电化学发光免疫检测试剂盒包含如下成分:
(1)预封闭的链霉亲和素板,规格为96孔板;96孔板上包被的链霉亲和素的浓度为2ug/ml。
(2)生物素标记的抗新冠棘突蛋白抗体1(生物素与抗新冠棘突蛋白抗体1的摩尔比为2:1),为冻干粉形式,规格为10 ug;抗体1的重链、轻链氨基酸序列分别如SEQ ID NO:1和2所示;
(3)SULFO标记的抗新冠棘突蛋白抗体2(SULFO与抗新冠棘突蛋白抗体2的摩尔比为2:1),为冻干粉形式,规格为10 ug;抗体2的重链、轻链氨基酸序列分别如SEQ ID NO:3和4所示;
(4)新冠S蛋白为冻干粉形式,规格为10 ug;
(5)新冠RBD蛋白为冻干粉形式,规格为10 ug;
(6)浓缩(20×)洗涤液(样品稀释液):含有0.5% (v/v) Tween-20的PBS (pH7.4)溶液,规格为30 mL;
(7)读取液:含有三丙胺(TPA)的Tris溶液,规格为10 mL。
实施例2 试剂盒操作步骤及结果计算
拆开真空包装袋并取出96孔板中,在室温下放置5分钟备用。配制6250pg/mL,3125pg/mL,1562.5pg/mL,781.25pg/mL,390.63pg/mL,195.31pg/mL,97.65pg/mL,48.83pg/mL,22.41pg/mL,12.21pg/mL,6.105pg/mL,3.052pg/mL和0pg/mL的新冠S蛋白梯度系列标准液以及625pg/mL、312.5pg/mL、156.25pg/mL、78.125pg/mL、39.063pg/mL、19.531pg/mL、9.765pg/mL、4.883pg/mL、2.241pg/mL、1.221pg/mL、0.6105pg/mL、0.3052pg/mL、0pg/mL的RBD蛋白梯度系列标准液。将梯度系列标准液25μL、样品25μL分别加入到普通低吸附酶标板中,然后加入50ul的生物素标记的抗新冠棘突蛋白抗体1与50ul的SULFO标记的抗新冠棘突蛋白抗体2。标样和样品做3个重复,在震动板上室温孵育1h;然后将混合物100ul加到链霉亲和素板中,室温反应1h。倒出孔中的液体,用稀释好的洗剂液洗3次,将链霉亲和素板倒置在吸水纸上拍干;向各孔中加入100μL读取液,在化学发光仪上进行读数。
以阳性孔的数值-阴性孔(S蛋白或RBD蛋白的浓度为0pg/mL)的数值信号值为纵坐标,相应标准品浓度值为横坐标,分别得到新冠RBD蛋白(图1)、新冠S蛋白(图2)的标准曲线。
实施例3试剂盒加速实验
将实施例1的试剂盒放置于37℃保存,分别取0、7、14、21、28d的试剂盒,以新冠抗原RBD参考品作为拟合曲线,计算不同时间标准曲线的EC50值。不同时间的测定结果见表1:
Figure 622843DEST_PATH_IMAGE001
从以上结果可以看出,EC50变化不大,试剂盒在-20℃条件下至少可保存12个月以上。
实施例4 试剂盒组分冻融实验
将实施例1的试剂盒中冻干组分按照说明书溶解后,进行分装(EP管体积为200uL,每管加入5ug),置于-20℃保存,分别冻融1、2、3次,以新冠抗原RBD蛋白参考品作为标准曲线,计算不同时间曲线的EC50值。不同时间的测定结果见表2:
Figure 25006DEST_PATH_IMAGE002
从以上结果可以看出,EC50变化不大,试剂盒中冻干粉组分在-20℃条件下冻融3次内对活性无影响。
实施例5 试剂盒精密度考察实验
将实施例1的试剂盒进行20个批次分析。以新冠抗原RBD蛋白参考品作为拟合曲线,计算板间,板内的EC50值。结果见表3、表4:
Figure 834830DEST_PATH_IMAGE003
Figure 703560DEST_PATH_IMAGE004
从以上结果可以看出,EC50变化不大,说明试剂盒精密度良好。
实施例6 试剂盒准确度考察实验
将实施例1的试剂盒按照试剂盒操作步骤,设置10pg/ml、4pg/ml、2pg/ml高、中、低三个浓度,以新冠抗原RBD蛋白参考品作为拟合标准曲线,计算不同质控浓度的值。不同质控值结果见表5:
Figure 333256DEST_PATH_IMAGE005
从以上结果可以看出,试剂盒准确度良好。
实施例7 抗新冠棘突蛋白抗体的筛选及亲和力测定与表位分析
1、亲和力测定
在Biacore T200仪器(Cytiva)上,抗体1与抗体2用固定anti-mouse antibody的CM5芯片(Cytiva)进行一定量的捕获,然后进样不同浓度的新冠RBD蛋白,最后用glycine-Hcl,PH1.5进行再生。数据用分析软件进行分析。抗体1的亲和力测定结果见图3,抗体2的亲和力测定结果见图4。其他单抗亲和力结果见表6,其中抗体1、抗体2亲和力较高。
Figure 945634DEST_PATH_IMAGE006
2、表位分析
在Fortebio仪器(octec 96e)上,用HIS1K传感器捕获一定量的新冠RBD蛋白,然后进样饱和浓度的抗体1,随之进样抗体2,最后用glycine-Hcl,PH1.5进行再生。数据用分析软件进行分析。抗体1、抗体2结合新冠RBD蛋白的表位分析结果见图5。
在不同克隆的抗体中进行配对抗体的选择,选择标准是:(1)亲和力高;(2)表位不同。满足该条件的抗体对,在检测新冠疫苗表达抗原的实验中灵敏度较高。另外,通过检测抗体1为中和性抗体,可以竞争新冠RBD与ACE2的结合,抗体2为非中和性抗体,且抗体稳定,可长期储存。
虽然,上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述,但在本发明基础上,可以对之做一些修改或改进,这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此,在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进,均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 北京百普赛斯生物科技股份有限公司
<120> 新冠病毒疫苗表达抗原蛋白的电化学发光免疫检测试剂盒
<130> KHP201119345.6YS
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Tyr Ser
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Arg Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Ser Gly Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Asn Asp Tyr Asp Glu Gly Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 2
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Gln Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Val Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Ala Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Glu Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Leu
85 90 95
Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105
<210> 3
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Tyr
20 25 30
Pro Met His Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Phe Lys Trp Met
35 40 45
Gly Leu Ile Tyr Thr Asp Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Glu Glu Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys
85 90 95
Val Arg Gly Glu Asn Trp Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Leu Thr Val Ser Ser
115
<210> 4
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Val Thr Met Thr Cys Thr Ala Ser Ser Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Leu Trp
35 40 45
Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu
65 70 75 80
Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Tyr His Arg Ser Pro
85 90 95
Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105

Claims (10)

1.新冠病毒疫苗表达抗原蛋白的电化学发光免疫检测试剂盒,其特征在于,所述试剂盒至少包含:包被有链霉亲和素的孔板、生物素标记的抗新冠棘突蛋白抗体1、SULFO标记的抗新冠棘突蛋白抗体2、洗涤液和读数液,以及新冠病毒S蛋白标准品和新冠病毒RBD蛋白标准品;
其中,所述抗新冠棘突蛋白抗体1的重链、轻链可变区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:1和2所示;所述抗新冠棘突蛋白抗体2的重链、轻链可变区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:3和4所示;
所述读数液中含有三丙胺。
2.根据权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,孔板上包被的链霉亲和素的浓度为2ug/ml。
3.根据权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,所述洗涤液为含有0.5%v/v Tween-20的PBS溶液,pH7.4。
4.根据权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,所述读数液为含有0.5 %v/v三丙胺的Tris溶液。
5.根据权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,所述生物素标记的抗新冠棘突蛋白抗体1中生物素与抗新冠棘突蛋白抗体1的摩尔比为2:1。
6.根据权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,所述SULFO标记的抗新冠棘突蛋白抗体2中SULFO与抗新冠棘突蛋白抗体2的摩尔比为2:1。
7.根据权利要求1-6任一项所述的试剂盒,其特征在于,所述生物素标记的抗新冠棘突蛋白抗体1、所述SULFO标记的抗新冠棘突蛋白抗体2、所述新冠病毒S蛋白标准品、所述新冠病毒RBD蛋白标准品为冻干粉形式;
所述包被有链霉亲和素的孔板为96孔板。
8.权利要求1-7任一项所述试剂盒在新冠病毒疫苗表达抗原蛋白的电化学发光免疫检测中的应用,所述应用为非疾病诊断和治疗目的。
9.新冠病毒疫苗抗原蛋白的电化学发光免疫检测方法,所述方法为非疾病诊断和治疗目的,其特征在于,包括:
1)配制不同浓度的新冠病毒S蛋白标准品溶液,浓度范围为3.052pg/mL~6250pg/mL;
2)将上述新冠病毒S蛋白标准品溶液分别加入到包被有链霉亲和素的孔板中,25-30μL/孔,然后将各孔中加入50-100μL的生物素标记的抗新冠棘突蛋白抗体1溶液和50-100μL的SULFO标记的抗新冠棘突蛋白抗体2溶液,室温孵育1-1.5h后,倒掉孔板中的液体,用洗涤液洗板,然后每孔加入100μL读数液,在化学发光仪上读取光学信号值;
3)建立反映新冠病毒S蛋白标准品溶液的浓度和光学信号值之间关系的标准曲线;
4)将步骤2)中的新冠病毒S蛋白标准品溶液替换成新冠病毒疫苗抗原蛋白待测样品,然后采用相同的方法测定待测样品的光学信号值,代入步骤3)的标准曲线中,得出待测样品中抗原蛋白的浓度;
其中,生物素标记的抗新冠棘突蛋白抗体1、SULFO标记的抗新冠棘突蛋白抗体2、洗涤液、读数液和新冠病毒S蛋白标准品来自权利要求1-7任一项所述的试剂盒。
10.新冠病毒疫苗抗原蛋白的电化学发光免疫检测方法,所述方法为非疾病诊断和治疗目的,其特征在于,包括:
1)配制不同浓度的新冠病毒RBD蛋白标准品溶液,浓度范围为0.3052pg/mL~625pg/mL;
2)将上述新冠病毒RBD蛋白标准品溶液分别加入到包被有链霉亲和素的孔板中,25-30μL/孔,然后将各孔中加入50-100μL的生物素标记的抗新冠棘突蛋白抗体1溶液和50-100μL的SULFO标记的抗新冠棘突蛋白抗体2溶液,室温孵育1-1.5h后,倒掉孔板中的液体,用洗涤液洗板,然后每孔加入100μL读数液,在化学发光仪上读取光学信号值;
3)建立反映新冠病毒RBD蛋白标准品溶液的浓度和光学信号值之间关系的标准曲线;
4)将步骤2)中的新冠病毒RBD蛋白标准品溶液替换成新冠病毒疫苗抗原蛋白待测样品,然后采用相同的方法测定待测样品的光学信号值,代入步骤3)的标准曲线中,得出待测样品中抗原蛋白的浓度;
其中,生物素标记的抗新冠棘突蛋白抗体1、SULFO标记的抗新冠棘突蛋白抗体2、洗涤液、读数液和新冠病毒RBD蛋白标准品来自权利要求1-7任一项所述的试剂盒。
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