CN113073116A - 一种表达新冠病毒Spike蛋白重组副流感病毒5型制备和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种表达冠状病毒Spike蛋白的重组副流感病毒5型载体，所述重组副流感病毒5型载体包含一种副流感病毒5型基因组，所述基因组包含冠状病毒Spike蛋白突变体的编码序列；所述冠状病毒Spike蛋白突变体的编码序列不含有副黏病毒转录终止序列，且冠状病毒Spike蛋白突变体的氨基酸序列上不含有Furin蛋白酶裂解位点。结果表明，免疫重组病毒rPIV5‑SH‑Spike组小鼠体内产生抗体针对新冠病毒Spike蛋白的特异性抗体，而rPIV5对照组小鼠未能检测到针对新冠病毒Spike蛋白的特异性抗体。表明rPIV5‑SH‑Spike重组病毒免疫小鼠能够刺激小鼠产生针对Spike蛋白的特异性抗体。

Description

一种表达新冠病毒Spike蛋白重组副流感病毒5型制备和应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种表达新冠病毒Spike蛋白重组副流感病毒 5型制备和应用。

背景技术

新冠肺炎的临床症状包括发热、干咳、乏力等，患者可出现鼻塞、流涕、咽痛、结膜炎等多种症状，重症患者可出现呼吸困难、低氧血症，严重者可发展为急性呼吸窘迫综合征、脓毒症休克等甚至导致死亡。疫苗接种是预防新冠病毒的最有效手段之一，目前各国已有多个研究机构进行新冠疫苗的制备，包括灭活疫苗，重组蛋白疫苗，重组腺病毒疫苗，mRNA疫苗以及病毒载体疫苗等。灭活疫苗可以有效地激发高水平的体液免疫，相对安全，但不能诱导细胞毒T淋巴细胞反应，不能够产生局部免疫反应；重组蛋白疫苗技术成熟，不良反应小，但生产速度较慢；重组腺病毒疫苗虽然免疫效果好，但可能会存在一定的不良反应，且人体内可能含有针对腺病毒载体的抗体，会影响疫苗效果；mRNA疫苗相对效果好，但存储运输条件相对较为苛刻，成本较高。

病毒载体疫苗具有多种优势，由于是活病毒载体，可在免疫机体内进行复制，诱导较强的免疫反应；可通过自然感染，如滴鼻、喷雾等方式进行免疫；可产生体液免疫与细胞免疫，除了激发全身免疫反应外，还可激发局部免疫反应，如在呼吸道中产生sIgA 抗体，发挥较强的免疫保护效果。目前，在新冠疫苗的研发过程中，已有多种病毒载体疫苗在研发过程中，并在动物模型中具有良好的免疫保护效果，如黄热病毒、痘病毒、新城疫病毒、水疱口炎病毒等。副流感病毒5型(PIV5)作为预防犬窝咳的疫苗在犬中应用已有数十年的历史，而且未被证实可引起任何其他动物包括人致病。

发明内容

本发明提供一种表达冠状病毒Spike蛋白的重组副流感病毒5型载体，所述重组副流感病毒5型载体包含一种副流感病毒5型基因组，所述基因组包含冠状病毒Spike蛋白突变体的编码序列；所述冠状病毒Spike蛋白突变体的编码序列不含有副黏病毒转录终止序列，且冠状病毒Spike蛋白突变体的氨基酸序列上不含有Furin蛋白酶裂解位点 (RRAR)。

可选的，所述冠状病毒为2019-nCoV。

可选的，所述副流感病毒5型基因组为：用序列甲替换一种副流感病毒5型基因组的小疏水蛋白基因核苷酸序列，所得；

所述序列甲为如下1)或2)或3)：

A)SEQ ID NO：1所示核苷酸序列第927位核苷酸由A突变为G、第3216位核苷酸由A突变为G、第2106位核苷酸由A突变为G，且第2044位至2055位替换为 GCA，得到的DNA分子；

B)在严格条件下与A)限定的DNA分子杂交且编码所述冠状病毒Spike蛋白突变体的DNA序列，冠状病毒Spike蛋白突变体的氨基酸序列上不含有Furin蛋白酶裂解位点(RRAR)，所述冠状病毒Spike蛋白突变体的编码序列不含有副黏病毒转录终止序列；

C)与A)或B)限定的DNA序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同一性且编码所述冠状病毒Spike蛋白突变体的DNA序列，冠状病毒Spike蛋白突变体的氨基酸序列上不含有Furin蛋白酶裂解位点(RRAR)，所述冠状病毒Spike 蛋白突变体的编码序列不含有副黏病毒转录终止序列。

冠状病毒Spike蛋白突变体的氨基酸序列为SEQ ID NO：2的第682位-685位的氨基酸Arg Arg Ala Arg(RRAR)替换为Ala(A)，其他序列保持不变，所得序列。

一种在细胞中表达冠状病毒Spike蛋白的方法，该方法包括使该细胞与上述的表达冠状病毒Spike蛋白的重组副流感病毒5型载体相接触。

一种表达冠状病毒Spike蛋白的重组副流感病毒5型载体的制备方法，包括如下步骤：

1)将副流感病毒5型全基因组反转录得到的cDNA插入克隆载体中，得到重组质粒pPIV5；

2)用序列甲替换步骤1)中重组质粒pPIV5中副流感病毒5型的小疏水蛋白基因核苷酸序列；

所述序列甲为如下1)或2)或3)：

A)SEQ ID NO：1所示核苷酸序列第927位核苷酸由A突变为G、第3216位核苷酸由A突变为G、第2106位核苷酸由A突变为G，且第2044位至2055位替换为GCA，得到的DNA分子；

B)在严格条件下与A)限定的DNA分子杂交且编码所述冠状病毒Spike蛋白突变体的DNA序列，冠状病毒Spike蛋白突变体的氨基酸序列上不含有Furin蛋白酶裂解位点(RRAR)，所述冠状病毒Spike蛋白突变体的编码序列不含有副黏病毒转录终止序列；

C)与A)或B)限定的DNA序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同一性且编码所述冠状病毒Spike蛋白突变体的DNA序列，冠状病毒Spike蛋白突变体的氨基酸序列上不含有Furin蛋白酶裂解位点RRAR，所述冠状病毒Spike蛋白突变体的编码序列不含有副黏病毒转录终止序列。

可选的，步骤1)中所述克隆载体为带有T7 RNA聚合酶启动子序列、带有丁肝核酶序列、T7 RNA聚合酶转录终止序列的克隆载体。

一种新型冠状病毒(2019-nCoV)疫苗的制备方法，所述疫苗的制备方法包括如下步骤：将上述表达冠状病毒Spike蛋白的重组副流感病毒5型载体、表达辅助蛋白的辅助重组质粒—NP、辅助重组质粒—P和辅助重组质粒—L共转染宿主细胞；所述表达辅助蛋白的辅助重组质粒—NP、辅助重组质粒—P和辅助重组质粒—L是将副流感病毒5 型的NP、P和L蛋白的编码基因分别插入哺乳动物表达载体中，得到辅助重组质粒— NP、辅助重组质粒—P和辅助重组质粒—L。

可选的，NP蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示；P蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO：4所示；L蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示。

可选的，所述宿主细胞为BSR-T7细胞，MDBK细胞,Vero细胞或BHK-21细胞。

上述方法制备得到的疫苗。

上述重组副流感病毒5型载体或上述方法制备的重组副流感病毒5型载体在如下任一一种中的应用：

(1)制备提高动物体内针对冠状病毒2019-nCoV Spike蛋白抗体水平的产品中的应用；

(2)制备预防或辅助预防冠状病毒2019-nCoV引起的疾病产品中的应用。

步骤3)中哺乳动物表达载体为pcDNA3.1(+)。

本发明技术方案，具有如下优点：

结果表明，免疫重组病毒rPIV5-SH-Spike组小鼠体内产生抗体针对新冠病毒Spike 蛋白的特异性抗体，而rPIV5对照组小鼠未能检测到针对新冠病毒Spike蛋白的特异性抗体。表明rPIV5-SH-Spike重组病毒免疫小鼠能够刺激小鼠产生针对Spike蛋白的特异性抗体。

首免后6周，每只小鼠滴鼻感染新冠病毒SARS-CoV-2，接种剂量10⁴，之后每天观察小鼠的临床症状，并在攻毒后第3天，每组各剖检5只小鼠，采集小鼠肺脏，研磨组织，取上清液提取RNA后利用实时荧光定量PCR方法检测新冠病毒在小鼠脏器中的复制水平。试验结果见图5，结果表明，免疫rPIV5-SH-Spike的小鼠肺脏病毒滴度显著低于对照组PIV5-WT组的肺脏病毒滴度，具有良好的免疫保护效果。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是实施例1利用RT-PCR对rPIV5-SH-Spike病毒基因组中Spike基因进行鉴定；

图2是实施例1利用间接免疫荧光对rPIV5-SH-Spike重组病毒感染细胞Spike 蛋白表达情况进行鉴定；

图3是实施例1利用Western blot对rPIV-SH-Spike重组病毒感染细胞Spike蛋白表达情况进行鉴定

图4是实施例1小鼠免疫后血清中针对SARS-CoV-2Spike蛋白ELISA抗体水平；

图5是实施例1中利用RT-qPCR检测新冠病毒在感染免疫后小鼠肺脏中N、ORF 与S基因的水平。

图6是实施例1中重组质粒pPIV5的图谱。

具体实施方式

下述pBlueScript SK II(+)-1载体，公众可从申请人处获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

实施例1

1.重组副流感病毒5型的制备

1.1PIV5反向遗传操作系统质粒的构建

1、合成载体病毒PIV5为本实验室在山东省某猪场健康猪体内分离得到的病毒株(命名为CHNSD-011)，利用Roche RNA提取试剂盒对该毒株提取RNA并利用PrimeScript^TM II1st Strand cDNA Synthesis Kit反转录，获得毒株的cDNA。将PIV5全长15246nt(见 SEQID NO：6)分为A-C共3个约5-5.5kb大小片段，A片段为PIV5全长(5’-3’)的第1bp-5030bp，B片段为PIV5全长(5’-3’)的第5016bp-9906bp，C片段为PIV5全长(5’-3’)的第9892-15246bp。利用引物分别进行PCR扩增，将DNA片段回收后的A、 B和C分别插入pEasy-BluntZero载体，经测序确认序列无误后保留，三片段的质粒分别命名为pZero-A、pZero-B与pZero-C。

2、改造pBlueScript SK II(+)(优宝生物，货号为VT1328)，改造后载体5’端带有T7 RNA聚合酶启动子序列，3’端带有丁肝核酶序列和T7 RNA聚合酶转录终止序列的pBlueScript SK II(+)，其他序列不变，改造后的载体命名为pBlueScript SK II(+)-1，将步骤1中得到的三个质粒，利用引物进行PCR扩增，获得分为三段(A、B、 C)的PIV5全基因组，将PIV5全基因组与pBlueScript SK II(+)-1进行同源重组连接，得到重组质粒pPIV5，重组质粒pPIV5图谱见图6(即在pBlueScript SK II(+)-1的中插入序列SEQ ID NO：6)，测序验证正确并保留。

以pPIV5为模板，以表2中的SphI-F(SEQ ID NO：7)与SphI-R(SEQ ID NO： 8)引物扩增片段SphI，并在片段3’端引入PmeI酶切位点；以BbvCI-F(SEQ ID NO： 9)与BbvCI-R(SEQ ID NO：10)引物扩增片段BbvCI，并在引物5’端引入PmeI酶切位点，将两片段回收备用。

表2

利用SphI-F与BbvCI-R引物扩增片段SphI和BbvCI，扩增得到的目的片段为将SphI和BbvCI片段中的小疏水蛋白基因替换为PmeI识别序列，命名为△SH(此步骤的目的为引入PmeI识别序列，删除小疏水蛋白基因)。

利用SphI与BbvCI双酶切pPIV5载体，回收后与片段△SH进行同源重组，获得携带有PmeI酶切位点的载体vPIV5-PmeI。vPIV5-PmeI载体为将重组质粒pPIV5中的小疏水蛋白基因(sh，为SEQ ID NO：6的第6303-6437位)替换为PmeI识别序列的片段，其他序列保持不变，得到的载体。

3、利用基因NP、P和L特异性引物对(NP的引物对为NP-F、NP-R；P的引物对为P-F、P-R；L的引物对为L-F、L-R)，步骤2中得到的重组质粒pPIV5进行扩增，获得NP的基因序列为基因组全长152位到1681位(NP蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO： 3所示)，P的基因序列为基因组全长1850位到3026位(P蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示)，L的基因序列为基因组全长序列8414位到15181位(L蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示)。将NP的基因序列插入购自Invitrogen公司的pcDNA3.1(+) (货号：V790-20)的HindIII位点，获得可在真核细胞中表达病毒蛋白NP的重组质粒 pcDNA-NP；将P的基因序列插入pcDNA3.1(+)的HindIII位点，获得可在真核细胞中表达病毒蛋白P的重组质粒pcDNA-P；将L的基因序列插入pcDNA3.1(+)的HindIII位点，获得可在真核细胞中表达病毒蛋白L的重组质粒pcDNA-L。

1.2重组病毒rPIV5感染性克隆的获得

1、将纯化提取所得步骤1.1中的pPIV5、pcDNA-NP、pcDNA-P与pcDNA-L 共转染稳定表达T7 RNA聚合酶的BSR T7/5细胞。

2、完成步骤1后72h，将转染后的BSR T7/5细胞与上清置于-80℃冻融后，接种MDBK细胞，4h后更换为含有2％FBS的DMEM培养基。

3、完成步骤2后72h，吸取细胞上清液，接种新的MDBK细胞，4h后更换为含有2％FBS的DMEM培养基。

4、完成步骤3后72h，重复步骤3一次，取细胞上清接种至新的MDBK细胞。 72h后，吸取MDBK细胞上清液进行血凝检测，能够产生血凝现象的上清液即为拯救成功的重组rPIV5，进行后续的检测与鉴定工作。

2.重组质粒pPIV5-SH-Spike的构建

1、利用Primestar HS高保真酶对新冠病毒参考序列(NCBI序列号：NC_045512.2)Spike蛋白表达质粒pcDNA-Spike(受赠于博迈德公司，Spike Protein of SARS-CoV-2Activates Macrophages and Contributes to Induction of Acute LungInflammations in Mice. https://doi.org/10.1101/2020.12.07.414706)进行扩增，并利用融合PCR的方法将Spike 编码序列中的部分位点进行突变，突变副黏病毒转录终止序列。具体操作为，利用 Spike-mut-1F、Spike-mut-1R，Spike-mut-2F、Spike-mut-2R，Spike-mut-3F、Spike-mut-3R， Spike-mut-4F、Spike-mut-4R(表1)四对引物分别对pcDNA-Spike质粒进行扩增，分别获得四个片段1,2,3,4，上述对Spike基因进行PCR扩增，通过上游引物Spike-mut-1F 在Spike基因编码区5’端添加同源臂与Kozak序列，通过下游引物Spike-mut-4R添加同源臂，电泳鉴定无误后对四个片段进行回收。

表1

2、利用引物Spike-mut-1F、Spike-mut-2R以片段1和2的混合物为模板进行扩增，获得片段1和片段2融合产物12(此步骤的目的是突变Spike基因序列第927位核苷酸 A为G)；利用引物Spike-mut-3F、Spike-mut-4R以片段3和4的混合物为模板进行扩增，获得片段3,4融合产物34(此步骤的目的是突变Spike基因序列第3216位核苷酸 A为G)。将两融合片段产物电泳鉴定无误后回收DNA产物备用。

3、利用In-Fusion无缝克隆试剂盒将Spike片段12、片段34及pBlueScript SK II(+)-1进行同源重组，构建Spike突变体质粒，片段12与34进行融合时将Spike基因序列第2106位A核苷酸突变为G，构建中间载体pBK-Spike，测序无误后提取质粒，保留备用。中间载体pBK-Spike为在pBlueScript SK II(+)-1中插入Spike基因的突变序列，Spike基因的突变序列为Spike基因的第927位核苷酸由A突变为G、第3216位核苷酸由A突变为G、第2106位A核苷酸突变为G。

4、利用Spike-mut-1F与Spike-Furin-del-R、Spike-Furin-del-F与Spike-mut-4R分别对pBK-Spike载体进行PCR扩增，得到Spike-mut-1和Spike-mut-2DNA分子，电泳确认DNA分子大小后进行回收备用(此步骤的目的是突变Spike蛋白的氨基酸序列上的Furin蛋白酶裂解位点RRAR氨基酸为A)。

5、以1.1中的片段pPIV5-PmeI为载体，与步骤4中的Spike-mut-1与Spike-mut-2片段进行同源重组连接，得到重组质粒pPIV5-SH-Spike，测序无误后保留备用。 pPIV5-SH-Spike为在vPIV5-PmeI载体PmeI识别位点插入DNA分子，该DNA分子为 spike基因的突变序列，该spike基因的突变序列为Spike基因(SEQ ID NO:1)的第927位核苷酸由A突变为G、第3216位核苷酸由A突变为G、第2106位核苷酸由A突变为 G，且第2044位至2055位的核苷酸替换为GCA。

3.表达新冠病毒Spike蛋白的重组副流感病毒5型的拯救

1、将纯化提取所得以上步骤中的pPIV5-SH-Spike、pcDNA-NP、pcDNA-P与 pcDNA-L四质粒共转染表达T7 RNA聚合酶的BSR T7/5细胞。

2、完成步骤1后72h，将BSR T7/5细胞与上清置于-80℃冻融后，接种MDBK细胞，4h后更换为含有2％FBS的DMEM培养基。

3、完成步骤2后72h，吸取细胞上清液，接种新的MDBK细胞，4h后更换为含有 2％FBS的DMEM培养基。

4、完成步骤3后72h，重复步骤3一次，接种至新的MDBK细胞。72h后，吸取 MDBK细胞上清液进行血凝检测，能够产生血凝的上清液即为拯救成功的重组 rPIV5-SH-Spike，进行后续的检测与鉴定工作。

4.重组病毒rPIV5-SH-Spike的鉴定

一、基因鉴定

提取重组病毒rPIV5-SH-Spike基因组RNA，进行反转录获得cDNA后，利用引物 SH-JF与SH-JR对包含有插入Spike基因的病毒基因组区域进行PCR扩增，获得PCR 扩增产物。

试验结果见图1，PCR扩增产物片段为4133bp，片段大小符合预期，经Sanger测序后确认，Spike基因已完全插入PIV5基因组中。

二、间接免疫荧光鉴定

1、取12孔细胞培养板，加入1mL含有MDBK细胞的含10％FBS的DMEM 培养液(约2×10⁵个MDBK细胞)，于37℃、5％CO₂培养过夜，至MDBK细胞约长至90％密度。

2、完成步骤1后，利用pH为7.2、0.01M的PBS缓冲液清洗细胞两次，弃去液体，更换为含2％FBS的DMEM培养基1mL，并接种重组病毒rPIV5-SH-Spike 10⁴ TCID₅₀，继续培养48h。

3、完成步骤2后，弃去细胞孔中上清，利用pH7.2、0.01M的PBS缓冲液洗涤2次，之后每孔加入1mL预冷的固定液(乙醇与丙酮按照3:2体积比混合配制而成)，静置20min，进行细胞固定与透化。

4、完成步骤3后，弃去孔中液体，每孔利用1mL PBS缓冲液洗涤3次，每次 5min；之后每孔加入500μL鼠抗PIV5或兔抗SARS-CoV-2病毒Spike蛋白多克隆抗体稀释液(由1体积份鼠/兔抗体和199体积份pH7.2、0.01M的PBS缓冲液混合而成，鼠抗PIV5稀释液购自武汉华美生物，货号：CSB-MA000160，兔抗SARS-CoV Spike 蛋白抗体，购自义翘神州，货号为40150-T62-COV2))，4℃过夜孵育8h。

5、完成步骤4后，弃去液体，利用PBS缓冲液1mL洗涤3次，每次5min；而后加入TRITC基团标记的羊抗鼠二抗(1:400体积比利用PBS缓冲液稀释)进行抗原抗体结合染色，37℃避光孵育1h。羊抗鼠二抗购自BioVision公司，货号：6921-100

6、完成步骤5后，弃去孔内液体，利用PBS缓冲液1mL洗涤3次，每次5min；而后加入FITC基团标记的羊抗兔二抗(1:200体积比利用PBS缓冲液稀释)，进行抗原抗体结合染色，37℃避光孵育1h。羊抗兔二抗购自碧云天生物技术有限公司，货号： A0562。

7、完成步骤6后，弃去孔内液体，利用PBST缓冲液1mL洗涤3次，每次5min，最后一次保留孔内PBST缓冲液不弃去，置于倒置荧光显微镜下观察。将重组病毒 rPIV5-SH-Spike替换为重组野生病毒rPIV5作为对照。

试验结果见图2。结果表明，重组病毒rPIV5-SH-Spike感染MDBK细胞48h后，可在细胞中检测到表达的PIV5 P蛋白(红色)与新冠病毒Spike蛋白(绿色)；而重组野生病毒rPIV5感染细胞后仅能检测到PIV5 P蛋白(红色)，不能检测到新冠病毒Spike 蛋白(绿色)，表明重组病毒rPIV5-SH-Spike可在感染后细胞中表达Spike蛋白。

三、Western blot鉴定

1、取6孔细胞培养板，加入2mL含有MDBK细胞的细胞培养液(约4×105个 CEF细胞/孔)，37℃、5％CO₂培养过夜，直至MDBK细胞生长成单层至约90％密度。

2、完成步骤1后，利用2mL PBS洗涤细胞三次，接种重组病毒rPIV5-SH-Spike 或rPIV5(接种剂量为10⁴TCID₅₀)并更换为含2％FBS的DMEM培养液，37℃、5％CO₂培养48h。

3、取完成步骤2的细胞，PBS洗涤三次后，加入PBS后利用细胞刮刀小新刮下细胞，离心，弃去上清收集细胞。

4、完成步骤3后，取所述细胞，利用IP裂解液进行裂解，得到细胞裂解液，10000g离心10min后小心吸取上清，加入Western Protein Loading Buffer，100℃变性10min 后冷却至室温。

5、完成步骤4后，将所述细胞裂解液进行SDS-PAGE和Western blot，采用兔抗新冠病毒Spike蛋白多克隆抗体(Sino Biological公司，0150-T62-COV2)作为一抗采根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔抗体(碧云天生物技术有限公司，货号：A0208) 作为二抗检测Spike蛋白；利用PIV5 P蛋白作为内参，鼠抗V5标签单克隆抗体(武汉华美生物技术有限公司，货号：CSB-MA000160)为一抗，HRP标记羊抗鼠抗体(Abcam 公司，货号：ab6789)作为二抗。

实验结果见图3。结果表明，重组病毒rPIV5-SH-Spike感染的MDBK细胞中能够在230KD大小位置检测到Spike蛋白特异性条带，而rPIV5感染的MDBK细胞中未检测到该特异性条带，表明重组病毒rPIV5-SH-Spike感染细胞后可表达新冠病毒Spike 蛋白。

四、重组病毒pPIV5-SH-Spike对新冠病毒SARS-CoV-2的免疫保护效果评价

将20只6周龄BALB/c小鼠随机分成两组，每组10只。实验组鼻腔接种50μL重组病毒rPIV5-SH-Spike，对照组鼻腔接种50μL重组病毒rPIV5，接种剂量均为 10⁶TCID₅₀/只。首次接种后15天，重复上述操作一次。免疫后持续观察每组小鼠的临床症状：包括是否出现食欲不振，被毛凌乱，呼吸困难和活动量减少等行为。

观察发现，rPIV5对照组与rPIV5-SH-Spike免疫组均未出现明显的临床症状，饮食正常，体重保持相对稳定。表明本研究构建的重组rPIV5及表达新冠病毒Spike蛋白的rPIV5-SH-Spike重组病毒对小鼠无副反应或不良反应，安全性良好。

在首次免疫后每间隔7天利用眼眶后静脉丛法采集小鼠血液，每组采集10只，制备血清，利用间接ELISA方法对小鼠体内针对Spike蛋白抗体水平进行检测。间接ELISA 方法的步骤为：

1)包板，用ELISA coating buffer(索莱宝公司，C1055)稀释SARS-2-S(Vazyme,货号：CG202-00)到1μg/mL，每孔加50μL，4℃孵育过夜。

2)移除抗原溶液，用PBS清洗3次。

3)封闭，每孔加100μL封闭液(含5％脱脂乳PBS缓冲液)，在37℃孵育至少1 小时。

4)移除封闭液，用PBS洗板3次；

5)用血清孵育，用抗体稀释液(即封闭液)稀释血清到正确的比例，小鼠血清稀释从1：25开始，按照排板要求，孔里加入100μL血清稀释液，在37℃孵育2小时，阴性对照为健康鼠的血清，阳性对照要确保检测出来。

6)移除血清稀释液，用PBST洗板5次。

7)用2抗(HRP-conjugated goat anti-mouse IgG，Abcam公司，货号ab6789)孵育，2抗用抗体稀释缓冲液稀释，anti-mouse igG的稀释比例是1：5000，按照排板要求，孔里加入100μL 2抗稀释液，在37℃孵育1.5小时。

8)移除2抗缓冲液，用PBST洗板5次。

9)每孔加入100μL TMB显色液(Beyotime，P0209)，轻微拍打孔板，使其混合均匀，在室温孵育一段时间，当阴性孔有变蓝的趋势时，每孔加入100μL终止液，终止反应。

10)用酶标仪在450nm处记录吸光值。

试验结果详见图4(图4中的“免疫后1、2、3、4周”均指“首免后”)，结果表明，免疫重组病毒rPIV5-SH-Spike组小鼠体内产生抗体针对新冠病毒Spike蛋白的特异性抗体，而rPIV5对照组小鼠未能检测到针对新冠病毒Spike蛋白的特异性抗体。表明 rPIV5-SH-Spike重组病毒免疫小鼠能够刺激小鼠产生针对Spike蛋白的特异性抗体。

首免后6周，每只小鼠滴鼻感染新冠病毒SARS-CoV-2，接种剂量10⁴TCID₅₀，之后每天观察小鼠的临床症状，并在攻毒后第3天，每组各剖检5只小鼠，采集小鼠肺脏，研磨组织，取上清液提取RNA后利用实时荧光定量PCR方法检测新冠病毒在小鼠脏器中的复制水平。试验结果见图5，结果表明，免疫rPIV5-SH-Spike的小鼠肺脏病毒滴度显著低于对照组PIV5-WT组的肺脏病毒滴度，具有良好的免疫保护效果。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

序列表

<110> 中国农业大学

<120> 一种表达新冠病毒Spike蛋白重组副流感病毒5型制备和应用

<160> 22

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 3822

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 1

atgtttgttt ttcttgtttt attgccacta gtctctagtc agtgtgttaa tcttacaacc 60

agaactcaat taccccctgc atacactaat tctttcacac gtggtgttta ttaccctgac 120

aaagttttca gatcctcagt tttacattca actcaggact tgttcttacc tttcttttcc 180

aatgttactt ggttccatgc tatacatgtc tctgggacca atggtactaa gaggtttgat 240

aaccctgtcc taccatttaa tgatggtgtt tattttgctt ccactgagaa gtctaacata 300

ataagaggct ggatttttgg tactacttta gattcgaaga cccagtccct acttattgtt 360

aataacgcta ctaatgttgt tattaaagtc tgtgaatttc aattttgtaa tgatccattt 420

ttgggtgttt attaccacaa aaacaacaaa agttggatgg aaagtgagtt cagagtttat 480

tctagtgcga ataattgcac ttttgaatat gtctctcagc cttttcttat ggaccttgaa 540

ggaaaacagg gtaatttcaa aaatcttagg gaatttgtgt ttaagaatat tgatggttat 600

tttaaaatat attctaagca cacgcctatt aatttagtgc gtgatctccc tcagggtttt 660

tcggctttag aaccattggt agatttgcca ataggtatta acatcactag gtttcaaact 720

ttacttgctt tacatagaag ttatttgact cctggtgatt cttcttcagg ttggacagct 780

ggtgctgcag cttattatgt gggttatctt caacctagga cttttctatt aaaatataat 840

gaaaatggaa ccattacaga tgctgtagac tgtgcacttg accctctctc agaaacaaag 900

tgtacgttga aatccttcac tgtagaaaaa ggaatctatc aaacttctaa ctttagagtc 960

caaccaacag aatctattgt tagatttcct aatattacaa acttgtgccc ttttggtgaa 1020

gtttttaacg ccaccagatt tgcatctgtt tatgcttgga acaggaagag aatcagcaac 1080

tgtgttgctg attattctgt cctatataat tccgcatcat tttccacttt taagtgttat 1140

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gtaattagag gtgatgaagt cagacaaatc gctccagggc aaactggaaa gattgctgat 1260

tataattata aattaccaga tgattttaca ggctgcgtta tagcttggaa ttctaacaat 1320

cttgattcta aggttggtgg taattataat tacctgtata gattgtttag gaagtctaat 1380

ctcaaacctt ttgagagaga tatttcaact gaaatctatc aggccggtag cacaccttgt 1440

aatggtgttg aaggttttaa ttgttacttt cctttacaat catatggttt ccaacccact 1500

aatggtgttg gttaccaacc atacagagta gtagtacttt cttttgaact tctacatgca 1560

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ggaacaaata cttctaacca ggttgctgtt ctttatcagg atgttaactg cacagaagtc 1860

cctgttgcta ttcatgcaga tcaacttact cctacttggc gtgtttattc tacaggttct 1920

aatgtttttc aaacacgtgc aggctgttta ataggggctg aacatgtcaa caactcatat 1980

gagtgtgaca tacccattgg tgcaggtata tgcgctagtt atcagactca gactaattct 2040

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gatttttgtg gaaagggcta tcatcttatg tccttccctc agtcagcacc tcatggtgta 3180

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tttgtgtctg gtaactgtga tgttgtaata ggaattgtca acaacacagt ttatgatcct 3420

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tcaccagatg ttgatttagg tgacatctct ggcattaatg cttcagttgt aaacattcaa 3540

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caagaacttg gaaagtatga gcagtatata aaatggccat ggtacatttg gctaggtttt 3660

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tgtagttgtc tcaagggctg ttgttcttgt ggatcctgct gcaaatttga tgaagacgac 3780

tctgagccag tgctcaaagg agtcaaatta cattacacat aa 3822

<210> 2

<211> 1273

<212> PRT

<213>人工序列

<400> 2

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Ser Ser Ala Asn Asn Cys Thr Phe Glu Tyr Val Ser Gln Pro Phe Leu

165 170 175

Met Asp Leu Glu Gly Lys Gln Gly Asn Phe Lys Asn Leu Arg Glu Phe

180 185 190

Val Phe Lys Asn Ile Asp Gly Tyr Phe Lys Ile Tyr Ser Lys His Thr

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Pro Ile Asn Leu Val Arg Asp Leu Pro Gln Gly Phe Ser Ala Leu Glu

210 215 220

Pro Leu Val Asp Leu Pro Ile Gly Ile Asn Ile Thr Arg Phe Gln Thr

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Leu Leu Ala Leu His Arg Ser Tyr Leu Thr Pro Gly Asp Ser Ser Ser

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325 330 335

Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala

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Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro

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Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe

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Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly

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<210>3

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<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

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<210>4

<211> 392

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 4

Met Asp Pro Thr Asp Leu Ser Phe Ser Pro Asp Glu Ile Asn Lys Leu

1 5 10 15

Ile Glu Thr Gly Leu Asn Thr Val Glu Tyr Leu Thr Ser Gln Gln Val

20 25 30

Thr Gly Thr Ser Ser Leu Gly Lys Asn Thr Ile Pro Pro Gly Val Thr

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Gly Leu Pro Thr Asn Ala Ala Glu Ala Lys Ile Gln Glu Ser Thr Asn

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165 170 175

Gln Ser Asp Gly Trp Glu Met Lys Ser Arg Ser Leu Ser Gly Ala Ile

180 185 190

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Val Thr Ser Val Gln Ser Leu Ala Leu Asn Val Asn Glu Ile Leu Asn

210 215 220

Thr Val Arg Asn Leu Asp Ser Arg Met Asn Gln Leu Glu Thr Lys Val

225 230 235 240

Asp Arg Ile Leu Ser Ser Gln Ser Leu Ile Gln Thr Ile Lys Asn Asp

245 250 255

Ile Val Gly Leu Lys Ala Gly Met Ala Thr Leu Glu Gly Met Ile Thr

260 265 270

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275 280 285

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Glu Leu Ala Arg Pro Thr Ala Thr Ser Val Lys Lys Ile Val Arg Lys

325 330 335

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<210> 5

<211> 2255

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 5

Met Ala Gly Ser Arg Glu Ile Leu Leu Pro Glu Val His Leu Asn Ser

1 5 10 15

Pro Ile Val Lys His Lys Leu Tyr Tyr Tyr Ile Leu Leu Gly Asn Leu

20 25 30

Pro Asn Glu Ile Asp Ile Asp Asp Leu Gly Pro Leu His Asn Gln Asn

35 40 45

Trp Asn Gln Ile Ala His Glu Glu Ser Asn Leu Ala Gln Arg Leu Val

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130 135 140

Leu Phe Thr Arg Ser Arg Glu Leu Ser Gly Asp Arg Arg Asp Ile Asp

145 150 155 160

Leu Lys Thr Val Val Ala Ala Trp His Asp Ser Asp Trp Lys Arg Ile

165 170 175

Ser Asp Phe Trp Ile Met Ile Lys Phe Gln Met Arg Gln Leu Ile Val

180 185 190

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195 200 205

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210 215 220

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225 230 235 240

Val Ser Asp Met Tyr Glu Gly Arg His Asn Ile Leu Ser Leu Cys Thr

245 250 255

Val Ser Thr Tyr Leu Asn Pro Leu Lys Lys Arg Ile Lys Tyr Leu Leu

260 265 270

Ser Leu Val Asp Asn Leu Ala Phe Gln Ile Gly Asp Ala Val Tyr Asn

275 280 285

Ile Ile Ala Leu Leu Glu Ser Phe Val Tyr Ala Gln Leu Gln Met Ser

290 295 300

Asp Pro Ile Pro Glu Leu Arg Gly Gln Phe His Ala Phe Val Cys Ser

305 310 315 320

Glu Ile Leu Asp Ala Leu Arg Gly Thr Asn Ser Phe Thr Gln Asp Glu

325 330 335

Ser Arg Thr Val Thr Thr Asn Leu Ile Ser Pro Phe Gln Asp Leu Thr

340 345 350

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355 360 365

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370 375 380

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385 390 395 400

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405 410 415

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420 425 430

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435 440 445

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450 455 460

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Ile Phe Ala Lys Leu Thr Lys Arg Met Arg Ser Cys Gln Val Ile Ala

565 570 575

Glu Ser Leu Leu Ala Asn His Ala Gly Lys Leu Met Lys Glu Asn Gly

580 585 590

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Asp Leu Asp Lys Val Ile Asn Gly Asp Ile Phe Ile Val Ser Pro Arg

725 730 735

Gly Gly Ile Glu Gly Leu Cys Gln Lys Ala Trp Thr Met Ile Ser Ile

740 745 750

Ser Val Ile Ile Leu Ser Ala Thr Glu Ser Gly Thr Arg Val Met Ser

755 760 765

Met Val Gln Gly Asp Asn Gln Ala Ile Ala Val Thr Thr Arg Val Pro

770 775 780

Arg Ser Leu Pro Thr Leu Glu Lys Lys Thr Ile Ala Phe Arg Ser Cys

785 790 795 800

Asn Leu Phe Phe Glu Arg Leu Lys Cys Asn Asn Phe Gly Leu Gly His

805 810 815

His Leu Lys Glu Gln Glu Thr Ile Ile Ser Ser His Phe Phe Val Tyr

820 825 830

Ser Lys Arg Ile Phe Tyr Gln Gly Arg Ile Leu Thr Gln Ala Leu Lys

835 840 845

Asn Ala Ser Lys Leu Cys Leu Thr Ala Asp Val Leu Gly Glu Cys Thr

850 855 860

Gln Ser Ser Cys Ser Asn Leu Ala Thr Thr Val Met Arg Leu Thr Glu

865 870 875 880

Asn Gly Val Glu Lys Asp Ile Cys Phe Tyr Leu Asn Ile Tyr Met Thr

885 890 895

Ile Lys Gln Leu Ser Tyr Asp Ile Ile Phe Pro Gln Val Ser Ile Pro

900 905 910

Gly Asp Gln Ile Thr Leu Glu Tyr Ile Asn Asn Pro His Leu Val Ser

915 920 925

Arg Leu Ala Leu Leu Pro Ser Gln Leu Gly Gly Leu Asn Tyr Leu Ser

930 935 940

Cys Ser Arg Leu Phe Asn Arg Asn Ile Gly Asp Pro Val Val Ser Ala

945 950 955 960

Val Ala Asp Leu Lys Arg Leu Ile Lys Ser Gly Cys Met Asp Tyr Trp

965 970 975

Ile Leu Tyr Asn Leu Leu Gly Arg Lys Pro Gly Asn Gly Ser Trp Ala

980 985 990

Thr Leu Ala Ala Asp Pro Tyr Ser Ile Asn Ile Glu Tyr Gln Tyr Pro

995 1000 1005

Pro Thr Thr Ala Leu Lys Arg His Thr Gln Gln Ala Leu Met Glu

1010 1015 1020

Leu Ser Thr Asn Pro Met Leu Arg Gly Ile Phe Ser Asp Asn Ala

1025 1030 1035

Gln Ala Glu Glu Asn Asn Leu Ala Arg Phe Leu Leu Asp Arg Glu

1040 1045 1050

Val Ile Phe Pro Arg Val Ala His Ile Ile Ile Glu Gln Thr Ser

1055 1060 1065

Val Gly Arg Arg Lys Gln Ile Gln Gly Tyr Leu Asp Ser Thr Arg

1070 1075 1080

Ser Ile Met Ser Lys Ser Leu Glu Ile Lys Pro Leu Ser Asn Arg

1085 1090 1095

Lys Leu Asn Glu Ile Leu Asp Tyr Asn Ile Asn Tyr Leu Ala Tyr

1100 1105 1110

Asn Leu Ala Leu Leu Lys Asn Ala Ile Glu Pro Pro Thr Tyr Leu

1115 1120 1125

Lys Ala Met Thr Leu Glu Thr Cys Ser Ile Asp Ile Ala Arg Ser

1130 1135 1140

Leu Arg Lys Leu Ser Trp Ala Pro Leu Leu Gly Gly Arg Asn Leu

1145 1150 1155

Glu Gly Leu Glu Thr Pro Asp Pro Ile Glu Ile Thr Ala Gly Ala

1160 1165 1170

Leu Ile Val Gly Ser Gly Tyr Cys Glu Gln Cys Ala Ala Gly Asp

1175 1180 1185

Asn Arg Phe Thr Trp Phe Phe Leu Pro Ser Gly Ile Glu Ile Gly

1190 1195 1200

Gly Asp Pro Arg Asp Asn Pro Pro Ile Arg Val Pro Tyr Ile Gly

1205 1210 1215

Ser Arg Thr Asp Glu Arg Arg Val Ala Ser Met Ala Tyr Ile Arg

1220 1225 1230

Gly Ala Ser Ser Ser Leu Lys Ala Val Leu Arg Leu Ala Gly Val

1235 1240 1245

Tyr Ile Trp Ala Phe Gly Asp Thr Leu Glu Asn Trp Ile Asp Ala

1250 1255 1260

Leu Asp Leu Ser His Thr Arg Val Asn Ile Thr Leu Glu Gln Leu

1265 1270 1275

Gln Ser Leu Thr Pro Leu Pro Thr Ser Ala Asn Leu Thr His Arg

1280 1285 1290

Leu Asp Asp Gly Thr Thr Thr Leu Lys Phe Thr Pro Ala Ser Ser

1295 1300 1305

Tyr Thr Phe Ser Ser Phe Thr His Ile Ser Asn Asp Glu Gln Tyr

1310 1315 1320

Leu Thr Ile Asn Asp Lys Thr Ala Asp Ser Asn Ile Ile Tyr Gln

1325 1330 1335

Gln Leu Met Ile Thr Gly Leu Gly Ile Leu Glu Thr Trp Asn Asn

1340 1345 1350

Pro Pro Ile Asn Arg Thr Phe Glu Glu Ser Thr Leu His Leu His

1355 1360 1365

Thr Gly Ala Ser Cys Cys Val Arg Pro Val Asp Ser Cys Ile Ile

1370 1375 1380

Ser Glu Ala Leu Thr Val Lys Pro His Ile Thr Val Pro Tyr Ser

1385 1390 1395

Asn Lys Phe Val Phe Asp Glu Asp Pro Leu Ser Glu Tyr Glu Thr

1400 1405 1410

Ala Lys Leu Glu Ser Leu Ser Phe Gln Ala Gln Leu Gly Asn Ile

1415 1420 1425

Asp Ala Val Asp Met Thr Gly Lys Leu Thr Leu Leu Ser Gln Phe

1430 1435 1440

Thr Ala Arg Gln Ile Ile Asn Ala Ile Thr Gly Leu Asp Glu Ser

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Val Ser Leu Thr Asn Asp Ala Ile Val Ala Ser Asp Tyr Val Ser

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Asn Trp Ile Ser Glu Cys Met Tyr Thr Lys Leu Asp Glu Leu Phe

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Met Tyr Cys Gly Trp Glu Leu Leu Leu Glu Leu Ser Tyr Gln Met

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Tyr Tyr Leu Arg Val Val Gly Trp Ser Asn Ile Val Asp Tyr Ser

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Tyr Met Ile Leu Arg Arg Ile Pro Gly Ala Ala Leu Asn Asn Leu

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Ala Ser Thr Leu Ser His Pro Lys Leu Phe Arg Arg Ala Ile Asn

1535 1540 1545

Leu Asp Ile Val Ala Pro Leu Asn Ala Pro His Phe Ala Ser Leu

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Asp Tyr Ile Lys Met Ser Val Asp Ala Ile Leu Trp Gly Cys Lys

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Arg Val Ile Asn Val Ile Ser Asn Gly Gly Asp Leu Glu Leu Val

1580 1585 1590

Val Thr Ser Glu Asp Ser Leu Ile Leu Ser Asp Arg Ser Met Asn

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Leu Ile Ala Arg Lys Leu Thr Leu Leu Ser Leu Ile His His Asn

1610 1615 1620

Gly Leu Glu Leu Pro Lys Ile Lys Gly Phe Ser Pro Asp Glu Lys

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Cys Phe Ala Leu Thr Glu Phe Leu Arg Lys Val Val Asn Ser Gly

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Leu Ser Ser Ile Glu Asn Leu Ser Asn Phe Met Tyr Asn Val Glu

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Asn Pro Arg Leu Ala Ala Phe Ala Ser Asn Asn Tyr Tyr Leu Thr

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Arg Lys Leu Leu Asn Ser Ile Arg Asp Thr Glu Ser Gly Gln Val

1685 1690 1695

Ala Val Thr Ser Tyr Tyr Glu Ser Leu Glu Tyr Ile Asp Ser Leu

1700 1705 1710

Lys Leu Thr Pro His Val Pro Gly Thr Ser Cys Ile Glu Asp Asp

1715 1720 1725

Ser Leu Cys Thr Asn Asp Tyr Ile Ile Trp Ile Ile Glu Ser Asn

1730 1735 1740

Ala Asn Leu Glu Lys Tyr Pro Ile Pro Asn Ser Pro Glu Asp Asp

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Ser Asn Phe His Asn Phe Lys Leu Asn Ala Pro Ser His His Thr

1760 1765 1770

Leu Arg Pro Leu Gly Leu Ser Ser Thr Ala Trp Tyr Lys Gly Ile

1775 1780 1785

Ser Cys Cys Arg Tyr Leu Glu Arg Leu Lys Leu Pro Gln Gly Asp

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His Leu Tyr Ile Ala Glu Gly Ser Gly Ala Ser Met Thr Ile Ile

1805 1810 1815

Glu Tyr Leu Phe Pro Gly Arg Lys Ile Tyr Tyr Asn Ser Leu Phe

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Ser Ser Gly Asp Asn Pro Pro Gln Arg Asn Tyr Ala Pro Met Pro

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Thr Gln Phe Ile Glu Ser Val Pro Tyr Lys Leu Trp Gln Ala His

1850 1855 1860

Thr Asp Gln Tyr Pro Glu Ile Phe Glu Asp Phe Ile Pro Leu Trp

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Asn Gly Asn Ala Ala Met Thr Asp Ile Gly Met Thr Ala Cys Val

1880 1885 1890

Glu Phe Ile Ile Asn Arg Val Gly Pro Arg Thr Cys Ser Leu Val

1895 1900 1905

His Val Asp Leu Glu Ser Ser Ala Ser Leu Asn Gln Gln Cys Leu

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Ser Lys Pro Ile Ile Asn Ala Ile Ile Thr Ala Thr Thr Val Leu

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Cys Pro His Gly Val Leu Ile Leu Lys Tyr Ser Trp Leu Pro Phe

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Thr Arg Phe Ser Thr Leu Ile Thr Phe Leu Trp Cys Tyr Phe Glu

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Arg Ile Thr Val Leu Arg Ser Thr Tyr Ser Gly Pro Ala Asn His

1970 1975 1980

Glu Val Tyr Leu Ile Cys Ile Leu Ala Asn Asn Phe Ala Phe Gln

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Thr Val Ser Gln Ala Thr Gly Met Ala Met Thr Leu Thr Asp Gln

2000 2005 2010

Gly Phe Thr Leu Ile Ser Pro Glu Arg Ile Asn Gln Tyr Trp Asp

2015 2020 2025

Gly His Leu Lys Gln Glu Arg Ile Val Ala Glu Ala Ile Asp Lys

2030 2035 2040

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Leu Ile Leu Lys Cys Gly Gly Thr Pro Asn Ala Arg Asn Leu Ile

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Asp Ile Glu Pro Val Ala Thr Phe Ile Glu Phe Glu Gln Leu Ile

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Cys Thr Met Leu Thr Thr His Leu Lys Glu Ile Ile Asp Ile Thr

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Asn Leu Gly Leu Leu Gly Lys Ile Ser Thr Ile Val Arg Leu Leu

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Thr Glu Arg Ile Leu Asn His Thr Ile Arg Asn Trp Leu Ile Leu

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Pro Pro Ser Leu Arg Met Ile Val Lys Gln Asp Leu Glu Phe Gly

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Ile Phe Arg Ile Thr Ser Ile Leu Asn Ser Asp Arg Phe Leu Lys

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Leu Ser Pro Asn Arg Lys Tyr Leu Ile Thr Gln Leu Thr Ala Gly

2180 2185 2190

Tyr Ile Arg Lys Leu Ile Glu Gly Asp Cys Asn Ile Asp Leu Thr

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Arg Pro Ile Gln Lys Gln Ile Trp Lys Ala Leu Gly Cys Val Val

2210 2215 2220

Tyr Cys His Asp Pro Val Asp Gln Arg Glu Ser Thr Glu Phe Ile

2225 2230 2235

Asp Ile Asn Ile Asn Glu Glu Ile Asp Leu Gly Ile Asp Gly Glu

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Glu Ile

2255

<210> 6

<211> 15246

<212> DNA

<213> 人工序列

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tggaacttat ggccttcgtg accgacctcg agtcagagta gttcaataag gacctatcaa 120

gtttgggcaa tttttcgtcc ccgacacaaa aatgtcatcc gtgcttaaag catatgagcg 180

attcacactc actcaagaac tgcaagatca gagtgaggaa ggtacaatcc cacctacaac 240

actaaaaccg gtaatcaggg tatttatact aacctctaat aacccagagc taagatcccg 300

gcttcttcta ttctgcctac ggattgttct cagtaatggt gcaagggatt cccatcgctt 360

tggagcatta cttacaatgt tttcgctacc atcagccaca atgctcaatc atgtcaaatt 420

agctgaccag tcaccagaag ctgatatcga aagggtagag atcgatggct ttgaggaggg 480

atcattccgc ttaatcccca atgctcgttc aggtatgagc cgtggagaga tcaatgccta 540

tgctgcactt gcagaagatc tacctgacac actaaaccat gcaacacctt ttgttgattc 600

cgaagtcgag ggaactgcat gggatgagat tgagactttc ttagatatgt gttacagtgt 660

cctaatgcag gcatggatag tgacttgcaa gtgcatgact gcgccagacc aacctgctgc 720

ttctattgag aaacgcctgc aaaaatatcg tcagcaaggc aggatcaacc cgagatatct 780

cctgcaaccg gaggctcgaa gaataatcca gaatgtaatc cgaaagggaa tggtggtcag 840

acatttcctc acctttgaac tgcagcttgc ccgagcacaa agccttgtat caaataggta 900

ttatgctatg gtaggggatg ttggaaagta tatagagaat tgtggaatgg gaggcttctt 960

tttgacacta aaatatgcat taggaaccag atggcccaca cttgctttag ctgcattttc 1020

aggagagcta acaaagctaa agtccctcat ggcattatac cagacccttg gtgagcaggc 1080

ccgatatttg gccctattgg agtcaccaca tttgatggat tttgctgcag caaactaccc 1140

actgctatat agctatgcta tgggaatagg ctatgtgtta gatatcaaca tgaggaacta 1200

cgctttctcc agatcataca tgaataagac atatttccaa ttgggaatgg aaactgcaag 1260

aaaacaacag ggtgcagttg acatgaggat ggcagaagat ctcggtctaa ctcaagccga 1320

acgcaccgag atggcaaata cacttgccaa attgaccaca gcaaatcgag gggcagacac 1380

caggggagga gtcaacccgt tctcatctat cactgggaca actcaggtgc ccgctgcagc 1440

aacaggtgac acattcgaga gttacatggc agcggatcga ctgaggcaga gatatgctga 1500

tgcaggcacc cacgatgatg agatgccacc attggaagag gaggaagagg acgacacatc 1560

tgcaggtcca cgcactggac taactcttga acaagtggcc ttggacatcc agaacgcagc 1620

agttggagct cccatccata cagatgacct gaatgccgca ctgggtgatc ttgacatcta 1680

gacaattcag atcccaatct taaatcgaca cacctaattg accagttaga tggaactaca 1740

gtggattcca tgaggttcct gcctaccatc ggcttttaag aaaaaaatag gcccggacgg 1800

gttagcaaca agcgaccgcc gatgccaata acacaatcca caatctacaa tggatcccac 1860

tgatctgagc ttctccccag atgagatcaa taagctcata gagacaggcc tgaatactgt 1920

ggagtattta acttcccaac aagtcacagg aacatcctct cttggaaaga atacaatacc 1980

accaggggtc acaggactac caaccaatgc tgcagaggca aagatccaag agtcaaccaa 2040

ccatcagaag ggttcagttg gtgggggcgc aaaaccaaag aaaccgcgac caaaaattgc 2100

cattgtgcca gcagatgaca aaacggtgcc cggaaagccg atcccaaacc ctctattagg 2160

tctggactcc accccgagca cccaaactgt gcttgatcta agtgggaaaa cattaccatc 2220

aggatcctat aagggggtta aacttgcgaa ctttggaaaa gaaaatctga tgacacggtt 2280

catcgaggaa cccagagaga atcctatcgc aaccaattcc cccatcgatt ttaagagggg 2340

cagggatacc ggcgggttcc atagaaggga gtactcaatc ggatgggtgg gagatgaagt 2400

caaggtcact gagtggtgca atccatcctg ttctccaatc accgctgcag caaggcgatt 2460

tgaatgcact tgtcaccagt gtccagtcac ttgctctgaa tgtgaacgag atacttaata 2520

cagtgagaaa tttggactct cggatgaatc aactggagac aaaagtagat cgcattctct 2580

catctcagtc tctaatccag accatcaaga atgacatagt tggacttaaa gcagggatgg 2640

ctactttaga aggaatgatt acaactgtga aaatcatgga tccgggagtt cccagtaata 2700

ttactgtgga agatgtacgc aagaaactaa gtaaccatgc tgttgttgtg ccagaatcat 2760

tcaatgatag tttcttgact caatctgaag atgtaatttc acttgatgag ttggctcgac 2820

caactgcaac aagtgttaag aagattgtca ggaaggttcc tcctcagaag gatctgactg 2880

gattgaagat cacactagag caattggcaa aggattgcat cagcaaaccg aagatgaggg 2940

aagagtatct cctcaaaatc aaccaggctt ccagtgaggc tcagctaatt gacctcaaga 3000

aagcaatcat ccgcagtgca atttgatcaa gaaacaccca attacactac actggtatga 3060

cactgtacta accctgaggg ttttagaaaa aacgattaac gataaataag cccgaacact 3120

acacaccacc cgaggcagcc atgccatcca tcagcatccc cgcagacccc accaatccac 3180

gtcaatcaat aaaagcgttc ccaattgtga tcaaccgtga tgggggtgag aaaggtcgct 3240

tggttaaaca actacgcaca acctacttga atgacctaga tactcatgag ccactggtga 3300

cattcgtaaa tacttatgga ttcatctacg aacaggatcg gggaaatacc attgtcggag 3360

aggatcaaca tgggaagaaa agagaggctg tgactgctgc aatggttacc cttggatgtg 3420

ggcctaatct accatcatta gggaatgtcc tgggacaact gagtgaattc caggtcattg 3480

ttaggaagac atccagcaaa gcggaagaga tggtctttga aattgttaag tatccgagaa 3540

tatttcgggg tcatacatta atccagaaag gactagtctg tgtctccgca gaaaaatttg 3600

ttaagtcacc agggaaagta caatctggaa tggactatct cttcattccg acatttctgt 3660

cagtgactta ctgtccagct gcaatcaaat ttcaggtact tggccccatg ttgaaaatga 3720

gatcaagata cactcagagc ttacaacttg aactaatgat aagaatcctg tgtaagcccg 3780

attcgccact tatgaaggtc catatccctg acaaggaagg aagaggatgt cttgtatcag 3840

tatggttgca tgtatgcaat atcttcaaat caggaaacaa gaatggcagt gagtggcagg 3900

aatactggat gagaaagtgt gctaacatgc aacttgaagt gtcgattgca gatatgtggg 3960

gaccaactat cataattcat gccagaggtc acattcccaa aagtgctaag ttgttttttg 4020

gaaagggtgg atggagctgc catccacttc acgaagttgt tccaagtgtc actaagacac 4080

tatggtccgt gggctgtgag attacaaagg cgaaggcaat aatacaagag agtagcatct 4140

ctcttctcgt ggagactact gacatcataa gtccaaaagt caaaatttca tctaagcatc 4200

gccgctttgg gaaatcaaat tggggtctgt tcaagaaaac caaatcactg cccaacctga 4260

cggcgctgga atgactgacc cccaatcgag actacaccac ctcaaactat aggtgggtgg 4320

tacctcagtg attaatctcg taagcactga tcgtaggcta caacacacta atattatcca 4380

gattagagag cttaattagc tctgtattaa taataacact actattccaa taactggaat 4440

caccagcttg atttatctcc aaaatgattc aaagaaaaca aatcatatta agactatcct 4500

aagcacgaac ccatatcgtc cttcaaatca tgggtactat aattcaattt ctggtggtct 4560

cctgtctatt ggcaggagca ggcagtcttg atccagcagc cctcatgcaa atcggtgtca 4620

ttccaacaaa tgtccggcaa cttatgtatt atactgaggc ctcatcagca ttcattgttg 4680

tgaagttaat gcctacaatt gactcgccga ttagtggatg taatataaca tcaatttcaa 4740

gctataatgc aacagtgaca aaactcctac agccgatcgg tgagaatttg gagacgatta 4800

ggaaccagtt gattccaact cggaggagac gccggtttgc aggggtggtg attggattag 4860

ctgcattagg agtagctact gccgcacagg tcactgccgc agtagcacta gtaaaggcaa 4920

atgaaaatgc tgcggctata ctcaatctca aaaatgcaat ccaaaaaaca aatgcagcag 4980

ttgcagatgt ggtccaggcc acacaatcac taggaacggc agttcaagca gttcaagatc 5040

acataaacag tgtggtaagt ccagcaatta cagcagccaa ttgtaaagcc caagatgcta 5100

tcattggctc aatcctcaat ctctatttga ccgagttgac aactatcttc cacaatcaaa 5160

ttacaaaccc tgcattgagt cctattacaa ttcaagcttt aaggatccta ctagggagta 5220

ccttgccgac tgtggtcgaa aaatctttca atacccagat aagtgcggct gagcttctct 5280

catcagggtt attgacaggc cagattgtgg gattagattt gacctatatg cagatggtca 5340

taaaaattga gctgccaact ttagctgtac aacctgcaac ccagatcata gatctggcca 5400

ccatttctgc attcattaac aatcaagaag tcatggccca attaccaaca cgtgttattg 5460

tgactggcag cttgatccaa gcctatcccg catcgcaatg cactattaca cccaacactg 5520

tgtactgtag gtataatgat gcccgagtac tctcagatga tacgatggct tgcctccaag 5580

gtaacttgac aagatgcacc ttctctccag tggttgggag ctttctcact cgattcgtgc 5640

tgttcgatgg aatagtttat gcaaattgca ggtcgatgtt gtgcaagtgc atgcagcctg 5700

ctgctgtgat cctacagccg agttcatccc ctgtaactgt cattgacatg tacaaatgtg 5760

tgagtctgca gcttgacaat ctcagattca ccatcactca attggccaat gtaacctaca 5820

atagcaccat caagcttgaa acatcccaga tcttgcctat tgctccgttg gatatatccc 5880

agaatctagc tgcggtgaat aagagtctaa gtgatgcact acaacactta gcacaaagtg 5940

acacatacct ttctgcaatc acatcagcta cgactacaag tgtattatcc ataatagcaa 6000

tctgtcttgg atcgttaggt ttaatattaa taatcttgct cagtgtagtt gtgtggaagt 6060

tattgaccat tgtcgctgct aatcgaaata gaatggagaa ttttgtttat cataattcag 6120

cattccacca ctcacgatct gatctcagtg agaaaaatca acctgcaact cttggaacaa 6180

gataagacag taatccatta gtaattttta agaaaaaaac gataggaccg aaactagtat 6240

tgaaagaacc gtctcggtca atctaggtaa tcgagctgat accgtctcgg aaagctcaaa 6300

tcatgctgcc tgatccggaa gatccggaaa gcaaaaaagc tacaaggaga acaggaaacc 6360

taattatctg cttcctattc atcttctttc cgtttgtaaa cttcattgtt ccaactctaa 6420

gacacttgct gtcctaacac ctgctatagg ctatccactg catcatctct cctgccatac 6480

ttcctactca catcatatct attttaaaga aaaaagaggc ccgaacacta atcgtgccgg 6540

cagtgccact gcacacacaa cactacacat acaatacact acaatggttg cagaagatgc 6600

ccctgttagg ggcacttgcc gagtattatt tcgaacaaca actttaattt ttctatgcac 6660

actattagca ttaagcatct ctatccttta tgagagttta ataacccaaa agcaaatcat 6720

gagccaagca ggctcaactg gatctaattc tagattagga agtatcactg atcttcttaa 6780

taatattctc tctgtcgcaa atcagattat atataactct gcagtcgctc tacctctaca 6840

attggacact cttgaatcaa cactccttac agccattaag tctcttcaaa caagtgacaa 6900

gctagaacag aactgctcgt ggggtgctgc actgattaat gataatagat acattaatgg 6960

catcaatcag ttctatttct caattgctga gggtcgcaag ctgacacttg gcccacttct 7020

taatatacct agtttcattc caactgccac gacaccagag ggctgcacca ggatcccatc 7080

attctcgctc accaagacac actggtgtta tacacacaat gttatcctga atggatgcca 7140

ggatcatgta tcctcaaatc aatttgtttc catgggaatc attgaaccca cttctgccgg 7200

gtttccatcc cttcgaaccc taaagactct atatctcagc gatggggtca atcgtaagag 7260

ctgctctatc agtacagttc cggggggttg tatgatgtac tgtttcgtct ctactcaacc 7320

agagagggat gactactttt ctaccgctcc tccagaacaa cgaattatta taatgtacta 7380

taatgataca atcgtagagc gcataattaa tccacccggg gtactagatg tatgggcaac 7440

attgacccca ggaacaggaa gcggggtata ttatttaggt tgggtactct ttccaatata 7500

tggcggcgtg attaaagata cgagtttatg gaataatcaa gcaaataaat actttatccc 7560

ccagatggtt gctgctctct gctcacaaaa ccaggcaact caagtccaaa atgctaagtc 7620

atcatactat agcagctggt ttggcaatcg aatgattcag tctgggatcc tggcatgtcc 7680

tcttcaacag gatctaacca atgagtgttt agttctgccc ttttctaatg atcaggtgct 7740

tatgggtgct gaagggagat tatacatgta tggtgactcg gtgtattact accaaagaag 7800

caatagttgg tggcctatga ccatgctgta taaggtaacc ataacattca ctaatggtca 7860

gccatctgct atatcagctc agaatgtgcc cacacagcag gtccctagac ctgggacagg 7920

aagctgctct gcaacaaata gatgtcccgg tttttgcttg aaaggagtgt atgctgatgc 7980

ctggttactg accaaccctt cgtctaccag tacatttgga tcagaagcaa ccttcactgg 8040

ttcttatctc aacgcagcaa ctcagcgtat caatccgacg atgtatatcg cgaacaacac 8100

acagatcata agctcacagc aatttggatc aagcggtcaa gaagcagcat atggccacac 8160

aacttgtttt agggacacag gctctgttat ggtatactgt atctatatta ttgaattgtc 8220

ctcatctctc ttaggacaat ttcagattgt cccatttatc cgtcaggtga cactatccta 8280

aaggcagaag catccaggtc tgacccagcc aatcaaagca ttataccaga ccatggaatg 8340

cataccaaac attattgaca ctaatgacac acaaaattgg ttttaagaaa aaccaagaga 8400

acaataggcc agaatggctg ggtctcggga gatattactc cctgaagtcc atctcaattc 8460

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cgacattgac gatttaggtc cattacataa tcaaaattgg aatcaaatag cacatgaaga 8580

gtctaactta gcccaacgct tggtaaatgt aagaaatttt ctaattaccc acatctctga 8640

tcttagaaag ggccattggc aagagtatgt caatgtaata ctgtggccgc gaattcttcc 8700

cttgatcccg gattttaaaa tcaatgacca attgcctcta ctcaaaaatt gggacaagtt 8760

agttaaagaa tcatgttcag taatcaatgc gggtacttcc cagtgcattc agaatctcag 8820

ctatggactg acaggtcgtg ggaacctctt tacacgatca cgtgaactct ctggtgaccg 8880

cagggatatt gatcttaaga cggttgtggc agcatggcat gactcagact ggaaaagaat 8940

aagtgatttt tggattatga tcaaattcca gatgagacaa ttaattgtta ggcaaacaga 9000

tcataatgat cctgatttaa tcacgtatat cgaaaataga gaaggcataa tcatcataac 9060

ccctgaactg gtagcattat ttaacactga gaatcataca ctaacataca tgacctttga 9120

aattgtactg atggtttcag atatgtacga aggtcgtcac aacattttat cactatgcac 9180

agttagcact tacctgaatc ctctgaagaa aagaataaaa tatttattga gccttgtaga 9240

taacttagct tttcagatag gtgatgctgt atataacata attgctttgc tagaatcctt 9300

tgtatatgca cagttgcaaa tgtcagatcc catcccagaa ctcagaggac aattccatgc 9360

attcgtatgt tctgagattc ttgatgcact aaggggaact aatagtttca cccaggatga 9420

atcaagaact gtgacaacca atttgatatc cccattccaa gatctgaccc cagatcttac 9480

ggctgaattg ctctgtataa tgaggctttg gggacacccc atgctcaccg ccagtcaagc 9540

tgcgggaaag gtacgcgagt ccatgtgtgc tggaaaagta ttagactttc ccaccattat 9600

gaaaacacta gcctttttcc atactattct gatcaatgga tacaggagga agcatcatgg 9660

agtatggcca cccttaaact taccgggtaa tgcttcaaag ggtctcacgg aacttatgaa 9720

tgacaatact gagataagct atgaattcac acttaagcat tggaaggaaa tctctcttat 9780

aaaattcaag aaatgttttg atgcagacgc aggtgaggaa ctcagtatat ttatgaaaga 9840

taaagcaatt agtgccccaa aacaagattg gatgagtgtg tttagaagaa gcctaatcaa 9900

acagcgccat cagcatcatc aggtccccct accaaatcca ttcaatcgac ggctattgct 9960

aaactttctc ggagatgaca aattcgaccc gaatgtggag ctacagtatg taacatcagg 10020

tgagtatcta catgatgaca cgttttgtgc atcatattca ctaaaagaga aggaaattaa 10080

acctgatggt cgaatttttg caaagttgac taagagaatg agatcatgtc aagttatagc 10140

agaatctctt ttagcgaacc atgctgggaa gttaatgaaa gagaatggtg ttgtgatgaa 10200

tcagctatca ttaacaaaat cactattaac aatgagtcag attggaataa tatccgagaa 10260

agctagaaaa tcgactcgag ataacataaa tcaacctggt ttccagaata tccagagaaa 10320

taaatcacat cactccaagc aagtcaatca gcgagatcca agtgatgact ttgaattggc 10380

agcatctttt ttaactactg atctcaaaaa atattgttta caatggaggt accagacaat 10440

tatcccattt gctcaatcat taaacagaat gtatggttat cctcatctct ttgagtggat 10500

tcacttacgg ctaatgcgta gtacacttta cgtgggggat cccttcaacc caccagcaga 10560

taccagtcaa tttgatctag ataaagtaat taatggagat atcttcattg tatcacccag 10620

aggtggaatt gaagggctat gtcaaaaggc ttggacaatg atatctatct ctgtgataat 10680

tctatctgcc acagagtctg gcacacgagt aatgagtatg gtgcagggag ataatcaagc 10740

aattgctgtc accacacgag taccaaggag cctgccgact cttgagaaaa agactattgc 10800

ttttagatct tgtaatctat tctttgagag gttaaaatgt aataattttg gattaggtca 10860

ccatttgaaa gaacaagaga ctatcattag ttctcacttc tttgtttata gcaagagaat 10920

attctatcag gggaggattc taacgcaagc cttaaaaaat gctagtaagc tctgcttgac 10980

agctgatgtc ctaggagaat gtacccaatc atcatgttct aatcttgcaa ctactgtcat 11040

gaggttaact gagaatggtg ttgaaaaaga tatctgtttc tacttgaata tctatatgac 11100

catcaaacag ctctcctatg atatcatctt ccctcaagtg tcaattcctg gagatcagat 11160

cacattagaa tacataaata atccacacct ggtatcacga ttggctcttc tgccatccca 11220

gctaggaggt ctaaactacc tgtcatgcag taggctgttc aatcgaaaca taggagaccc 11280

ggtggtttcc gcagttgcag atcttaagag attaattaaa tcaggatgta tggattactg 11340

gatcctttat aacttattag ggagaaaacc gggaaacggc tcatgggcta ctttagcagc 11400

tgacccgtac tcaatcaata tagagtatca atacccccca actacagctc ttaagaggca 11460

cacccaacaa gctctgatgg aactcagtac gaatccaatg ttacgtggca tattctctga 11520

caatgcacag gcagaagaaa ataatcttgc tagatttctc ctggataggg aggtgatctt 11580

tccgcgtgta gctcacatca tcattgagca aaccagtgtc gggaggagaa aacagattca 11640

aggatatttg gattcaacta gatcaataat gagtaaatca ctagaaatta agcccttgtc 11700

caataggaag cttaatgaaa tactggatta caacatcaat tacctagctt acaatttggc 11760

attactcaag aatgctattg aacctccgac ttatttgaaa gcaatgactc ttgaaacatg 11820

tagcatcgac attgcaagga gcctccggaa gctctcctgg gccccactct tgggtgggag 11880

aaatcttgaa gggttagaga cgccagatcc cattgaaatt actgcaggag cattaattgt 11940

tggatcgggc tactgtgaac agtgtgctgc aggagacaat cgattcacat ggtttttctt 12000

gccatctggt atcgagatag gaggggatcc ccgtgataat cctcctatcc gtgtaccgta 12060

cattggctcc aggactgatg agaggagggt agcctcaatg gcatacatca ggggtgcctc 12120

gagtagccta aaagcagttc ttagactggc gggagtgtac atctgggcat tcggagatac 12180

tctggagaat tggatagatg cactggattt gtctcacact agagttaaca tcacacttga 12240

acagctgcaa tccctcaccc cacttccaac ctctgccaat ctaacccatc ggttggatga 12300

tggcacaact accctaaagt ttactcctgc gagctcttac accttttcaa gtttcactca 12360

tatatcaaat gatgagcaat acctgacaat taatgacaaa actgcagatt caaatataat 12420

ctaccaacag ttaatgatca ctggactcgg aattttagaa acatggaata atcccccaat 12480

caatagaaca ttcgaagaat ctaccctaca tttgcacact ggtgcatcat gttgtgtccg 12540

acctgtggac tcctgcatca tctcagaagc attaacagtc aagccacata ttacagtacc 12600

gtacagcaat aaatttgtat ttgatgaaga cccgctatct gaatatgaga ctgcaaaact 12660

ggaatcgtta tcatttcaag cccaattagg caacattgat gctgtagata tgacaggtaa 12720

attaacatta ttgtcccaat tcactgcaag gcagattatt aatgcaatca ctggactcga 12780

tgagtctgtc tctcttacta atgatgccat tgttgcatca gactatgtct ccaattggat 12840

tagtgaatgc atgtatacca aattagatga attatttatg tattgtgggt gggaactact 12900

attggaacta tcctatcaaa tgtattatct gagggtagtt gggtggagta atatagtgga 12960

ttattcttac atgatcttga gaagaatccc gggtgcagca ttaaacaatc tggcatctac 13020

attaagtcat ccaaaacttt tccgacgagc tatcaaccta gatatagttg cccccttaaa 13080

tgctcctcat tttgcatctc tggactacat caagatgagt gtggatgcaa tactctgggg 13140

ctgtaaaaga gtcatcaatg tgatctccaa tggaggggac ttagaattag ttgtgacatc 13200

tgaagatagc cttattctca gtgaccgatc catgaatctc attgcaagga aattaacttt 13260

attatcactg attcaccata atggtttgga actaccaaag attaaggggt tctctcctga 13320

tgagaagtgt ttcgctttga cagaattttt gaggaaagtg gtgaactcag ggttgagttc 13380

aatagagaac ctatcaaatt ttatgtacaa tgtggagaac ccacggcttg cagcattcgc 13440

cagcaacaat tactacctga ccagaaaatt attgaattca atacgagata ctgagtcggg 13500

tcaagtagca gtcacctcat attatgaatc attagaatat attgatagtc ttaagctaac 13560

cccacatgtg cctggtacct catgcattga ggatgatagt ctatgtacaa atgattacat 13620

aatctggatc atagagtcta atgcaaactt ggagaagtat ccaattccaa atagccctga 13680

ggatgattcc aatttccata actttaagtt gaatgctcca tcgcaccata ccttacgccc 13740

attagggttg tcatcaactg cttggtataa gggtataagc tgttgcaggt accttgagcg 13800

attaaagcta ccacaaggtg atcatttata tattgcagaa ggtagtggtg ccagtatgac 13860

aatcatagaa tacctattcc caggaagaaa gatatattac aattctttat ttagtagtgg 13920

tgacaatccc ccacaaagaa attatgcacc aatgcctact cagttcattg agagtgtccc 13980

atacaagctc tggcaagcac acacagatca atatcccgag atttttgagg acttcatccc 14040

tctatggaac ggaaatgccg ccatgactga cataggaatg acagcttgtg tagaattcat 14100

catcaatcga gtcggcccaa ggacttgcag tttagtacat gtagatttgg aatcaagtgc 14160

aagcttaaat caacaatgcc tgtcaaagcc gataattaat gctatcatca ctgctacaac 14220

tgttttgtgc cctcatgggg tgcttattct gaaatatagt tggttgccat ttactagatt 14280

tagtactttg atcactttct tatggtgcta ctttgagaga atcactgttc ttaggagcac 14340

atattctggt ccagctaatc atgaggttta tttaatttgt atccttgcca acaactttgc 14400

attccagact gtctcgcagg caacaggaat ggcgatgact ttaaccgatc aagggtttac 14460

tttgatatca cctgaaagaa taaatcagta ttgggatggt cacttgaagc aagaacgtat 14520

cgtagcagaa gcaattgata aggtggttct aggagaagat gctctattca attcgagtga 14580

taatgaatta attctcaaat gtggagggac accaaatgca cggaatctta tcgatatcga 14640

gccagtcgca actttcatag aatttgaaca actgatctgc acaatgttaa caacccactt 14700

gaaggaaata attgatataa caaggtctgg aacccaggat tatgaaagtt tattactcac 14760

tccttacaat ttaggtcttc ttggtaaaat cagtacgata gtgagattat taacagaaag 14820

gattctaaat catactatca ggaattggtt gatcctccca ccttcgctcc ggatgatcgt 14880

gaagcaggac ttggaattcg gcatattcag gattacttcc atcctcaatt ctgatcggtt 14940

cctgaagctt tctccaaata ggaaatactt gattacacaa ttaactgcag gctacattag 15000

gaaattgatt gagggggatt gtaatatcga tctaaccagg cctatccaaa aacaaatctg 15060

gaaagcatta ggttgtgtag tctattgtca cgatccagta gatcaaaggg aatcaacaga 15120

gtttattgat ataaatatta atgaagaaat agacctcggg atcgatggcg aggaaatcta 15180

aatatatcaa gaatcagaat tagtttaaga aaaaagaagt ggattaatct tggttttccc 15240

cttggt 15246

<210> 7

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

aggtcgatgt tgtgcaagtg catgcagc 28

<210> 8

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

ggtggtttaa acagatttga gctttccgag acggtag 37

<210> 9

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

aaatctgttt aaaccacctg ctataggcta tccactgcat 40

<210> 10

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

agtgtcagct tgcgaccctc agc 23

<210> 11

<211> 65

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

gtctcggaaa gctcaaatcg tttaaacgcc accatgtttg tttttcttgt tttattgcca 60

ctagt 65

<210> 12

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

tgatagattc ctttctctac agtgaaggat 30

<210> 13

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

atccttcact gtagagaaag gaatctatca 30

<210> 14

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

agagtaagca actgaattct ctgcaccaag tgacat 36

<210> 15

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

atgtcacttg gtgcagagaa ttcagttgct tactct 36

<210> 16

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

agcagttgtg aagttcttct cttgtgcagg gacata 36

<210> 17

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

tatgtccctg cacaagagaa gaacttcaca actgct 36

<210> 18

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

ggatagccta tagcaggtgt ttaaacttat gtgtaatgta atttgactcc tttgagcact 60

<210> 19

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

cagactaatt ctcctgcaag tgtagctagt caatccatca ttgcct 46

<210> 20

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

tgactagcta cacttgcagg agaattagtc tgagtctgat aact 44

<210> 21

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

caactcttgg aacaagataa gacagt 26

<210> 22

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

catcttctgc aaccattgta gtgt 24

Claims (10)

1.一种表达冠状病毒Spike蛋白的重组副流感病毒5型载体，其特征在于，所述重组副流感病毒5型载体包含一种副流感病毒5型基因组，所述基因组包含冠状病毒Spike蛋白突变体的编码序列；所述冠状病毒Spike蛋白突变体的编码序列不含有副黏病毒转录终止序列，且冠状病毒Spike蛋白突变体的氨基酸序列上不含有Furin蛋白酶裂解位点。

2.根据权利要求1所述的表达冠状病毒Spike蛋白的重组副流感病毒5型载体，其特征在于，所述冠状病毒为2019-nCoV。

3.根据权利要求1或2所述的表达冠状病毒Spike蛋白的重组副流感病毒5型载体，其特征在于，所述副流感病毒5型基因组为：用序列甲替换一种副流感病毒5型基因组的小疏水蛋白基因序列，所得；

所述序列甲为如下1)或2)或3)：

A)SEQ ID NO：1所示核苷酸序列第927位核苷酸由A突变为G、第3216位核苷酸由A突变为G、第2106位核苷酸由A突变为G，且第2044位至2055位替换为GCA，得到的DNA分子；

B)在严格条件下与A)限定的DNA分子杂交且编码所述冠状病毒Spike蛋白突变体的DNA序列，冠状病毒Spike蛋白突变体的氨基酸序列上不含有Furin蛋白酶裂解位点，所述冠状病毒Spike蛋白突变体的编码序列不含有副黏病毒转录终止序列；

C)与A)或B)限定的DNA序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同一性且编码所述冠状病毒Spike蛋白突变体的DNA序列，冠状病毒Spike蛋白突变体的氨基酸序列上不含有Furin蛋白酶裂解位点，所述冠状病毒Spike蛋白突变体的编码序列不含有副黏病毒转录终止序列。

4.一种在细胞中表达冠状病毒Spike蛋白的方法，其特征在于，该方法包括使该细胞与如权利要求1至3中任一项所述的表达冠状病毒Spike蛋白的重组副流感病毒5型载体相接触。

5.一种表达冠状病毒Spike蛋白的重组副流感病毒5型载体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)将副流感病毒5型全基因组反转录得到的cDNA插入克隆载体中，得到重组质粒pPIV5；

2)用序列甲替换步骤1)中重组质粒pPIV5中副流感病毒5型的小疏水蛋白基因核苷酸序列；

所述序列甲为如下1)或2)或3)：

A)SEQ ID NO：1所示核苷酸序列第927位核苷酸由A突变为G、第3216位核苷酸由A突变为G、第2106位核苷酸由A突变为G，且第2044位至2055位替换为GCA，得到的DNA分子；

B)在严格条件下与A)限定的DNA分子杂交且编码所述冠状病毒Spike蛋白突变体的DNA序列，冠状病毒Spike蛋白突变体的氨基酸序列上不含有Furin蛋白酶裂解位点，所述冠状病毒Spike蛋白突变体的编码序列不含有副黏病毒转录终止序列；

C)与A)或B)限定的DNA序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同一性且编码所述冠状病毒Spike蛋白突变体的DNA序列，冠状病毒Spike蛋白突变体的氨基酸序列上不含有Furin蛋白酶裂解位点，所述冠状病毒Spike蛋白突变体的编码序列不含有副黏病毒转录终止序列。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤1)中所述克隆载体为带有T7 RNA聚合酶启动子序列、带有丁肝核酶序列、T7 RNA聚合酶转录终止序列的克隆载体。

7.一种新型冠状病毒(2019-nCoV)疫苗的制备方法，其特征在于，所述疫苗的制备方法包括如下步骤：将权利要求1-3任一所述表达冠状病毒Spike蛋白的重组副流感病毒5型载体、表达辅助蛋白的辅助重组质粒—NP、辅助重组质粒—P和辅助重组质粒—L共转染宿主细胞；所述表达辅助蛋白的辅助重组质粒—NP、辅助重组质粒—P和辅助重组质粒—L是将副流感病毒5型的NP、P和L蛋白的编码基因分别插入哺乳动物表达载体中，得到辅助重组质粒—NP、辅助重组质粒—P和辅助重组质粒—L。

8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述宿主细胞为BSR-T7细胞，MDBK细胞,Vero细胞或BHK-21细胞。

9.权利要求7或8所述方法制备得到的疫苗。

10.权利要求1-3任一所述重组副流感病毒5型载体或权利要求5或6所述方法制备的重组副流感病毒5型载体在如下任一一种中的应用：

(1)制备提高动物体内针对冠状病毒2019-nCoV Spike蛋白抗体水平的产品中的应用；

(2)制备预防或辅助预防冠状病毒2019-nCoV引起的疾病产品中的应用。

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