CN113041344A - 一种柔嫩艾美耳球虫的壳聚糖/纳米粒及制备方法 - Google Patents

一种柔嫩艾美耳球虫的壳聚糖/纳米粒及制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种柔嫩艾美耳球虫的壳聚糖/纳米粒的制备方法，选用的重组病毒颗粒rSFV‑Etgam59，并予以壳聚糖包裹，制备成的壳聚糖/rSFV‑Etgam59纳米粒，具有预防鸡柔嫩艾美耳球虫病，减轻盲肠病变，降低卵囊排出量，减少免疫次数，安全性高的优势。

Description

一种柔嫩艾美耳球虫的壳聚糖/纳米粒及制备方法
技术领域
本发明提供了一种柔嫩艾美耳球虫的壳聚糖/(rSFV-Etgam59)纳米粒的制备方法，该疫苗可用于预防鸡柔嫩艾美耳球虫病，并且同时公开了纳米粒的制备方法以及抗柔嫩艾美耳球虫效果，属于基因工程技术领域。
背景技术
柔嫩艾美耳球虫（Eimeria tenella）相比较于其他几种鸡球虫，是致病性最强的虫种。鸡感染柔嫩艾美耳球虫后，可以导致体重下降，被毛凌乱等，严重时可以导致大批鸡只死亡。药物预防是目前生产实践环节控制球虫病最有效的措施，但是长期使用药物带来了球虫耐药性的出现，耐药性的出现迫使公司投入大量成本研发新药，长期以往陷入恶性循环当中。用疫苗免疫球虫病将成为球虫病防治的发展趋势，早期的球虫苗主要是活苗，分强毒苗和弱毒苗两种。它们在一定程度上解决了药物治疗的弊端，但不可否认，活苗也存在诸多缺陷，例如成本高、免疫途径受限、强毒苗致病、弱毒苗毒力返祖等缺点。研究人员期望能研制一种安全、简便、高效且成本低廉的疫苗来取代活苗。亚单位疫苗的出现给了鸡球虫病的预防提供了一种手段。亚单位疫苗是利用单抗和DNA重组技术生产出可产生保护作用的球虫蛋白质抗原，并制成疫苗进行免疫控制。但是亚单位疫苗的不足之处是免疫原性较低。
核酸疫苗不仅安全，高效，廉价和使用方便，而且还可以以其独特的诱发机体产生高水平的细胞免疫的能力，是控制鸡球虫病的一种重要手段。近年来，在DNA疫苗的基础上，更加发展出病毒颗粒疫苗。病毒颗粒这种疫苗形式，除了具备DNA疫苗的安全，高效，廉价和使用方便的优点外，还可以使其包装的DNA免受核酸酶的降解，增强抗原进入细胞的效率，充分发挥病毒样颗粒本身的免疫学特性。随着学者对免疫机制的不断研究,各种新型佐剂层出不穷,纳米佐剂的使用提高了生物利用度，使制剂的均匀性、分散性和吸收性也大大提高，是目前研究的热点。壳聚糖因为材料易得，来源丰富、在体内可生物降解、无毒副作用而研究最为深入，并且可以实现抗原的可控制释放，产生相当于常规疫苗多次接种激发的免疫效果，从而延长疫苗免疫期，减少免疫次数。
发明内容
本发明的目的是提供一种壳聚糖/rSFV-Etgam59纳米粒疫苗的制备方法，用于预防鸡柔嫩艾美耳球虫病。
本发明所述的一种柔嫩艾美耳球虫的壳聚糖/rSFV-Etgam59纳米粒制备，技术解决方案如下：
制备壳聚糖/rSFV-Etgam59纳米粒，首先包装出重组病毒颗粒rSFV-Etgam59。第一步首先构建出能正确传递和表达该基因的重组质粒pSMART2b-Etgam59，然后将重组质粒pSMART2b-Etgam59与辅助质粒pSHCAR共转染293T细胞，收取病毒原液并激活，在BHK-21细胞成功验证表达后，将激活的病毒颗粒用离子交联法制备壳聚糖纳米粒，包裹重组病毒颗粒。
本发明所述的一种壳聚糖/rSFV-Etgam59纳米粒疫苗的制备方法，包括以下步骤：
1）重组质粒pSMART2b-Etgam59的构建
设计引物PCR扩增柔嫩艾美耳球虫Etgam59基因，序列如下：
F：CGCGGATCCGATGACTCGTCTCGCCGCCTG；
R：CCCATCGATTTACTCAAATCCAAAAGAAGGAATGCCCA；
对鸡柔嫩艾美耳球虫配子体的提取：21日龄雏鸡经口感染1*104个孢子化卵囊，感染后约132h杀取盲肠，用PBS清洗盲肠浆膜面后剖开肠腹用4℃预冷的SAC溶液冲洗肠道，浸入SAC溶液中于37℃恒温摇床100rpm消化1.5h，刮取肠粘膜并用60目铜筛，260目网筛，17μm孔径的滤膜过滤，分别收集滤液。将收集的滤液3500rpm/min,离心5min.用PBS冲洗两次；
配子体的纯化：用红细胞裂解液重悬沉淀，并加入灭菌 PBS 液涡旋震荡，使其充分混匀；在含配子体的 PBS 液中加入30% Percoll，同时制备 PBS液与 Percoll 为 1∶1的分离液；在 10 mL灭菌离心管中，分别加入2mL分离液，5 m L含配子体和30% Percoll 的PBS液，3200 r /min 离心15 min，取最下层沉淀物于另一灭菌离心管，用PBS液重悬、3200r/min、5min离心 ，用PBS洗涤4次，收集沉淀液氮保存；
提取配子体时期RNA并反转录为cDNA， 以鸡柔嫩艾美耳球虫配子体时期cDNA为模板，PCR扩增Etgam59，纯化后连接pMD18-T载体并保菌；测序正确后用无缝克隆的方法连接至pSMART2b的BamH1跟Cla1两个酶切位点，构建重组质粒pSMART2b-Etgam59；
提取无内毒素质粒pSMART2b-Etgam59，按照重组质粒2μg，lip2000 7μl，Opti-MEM500μl的量制备转染复合物，转入细胞培养汇合度60%-80%的293T细胞中，6h后换液，继续培养24-48h；裂解细胞并获取细胞蛋白，一抗为鸡柔嫩艾美耳球虫阳性血清，二抗为兔抗鸡，进行Western blot表达鉴定；
2）重组鸡球虫甲病毒颗粒制备
提取无内毒素质粒pSMART2b-Etgam59跟辅助质粒pSHCAR，二者按照1:1的量各1.5μg与lip2000 7μl共转染至293T细胞，6h后换液继续培养24-48h，之后收集病毒原液，可用于后续的透射电镜拍摄以及Western blot鉴定；
将收集的病毒原液激活：加入1/20体积α-糜蛋白酶10g/L以活化病毒，将p62糖蛋白裂解成E2和E3蛋白，室温孵育30min，然后加入1/15体积的aprotinin抑肽酶10g/L，室温孵育5min；紧接着将激活后的病毒感染BHk-21细胞2h，然后换液继续培养24-48h；
3）壳聚糖/rSFV-Etgam59纳米粒的制备
制备1%的壳聚糖醋酸溶液（CS，0.5mg/ml），PH值调节至4.8；三聚磷酸钠溶液（TPP，0.75mg/ml）；将CS溶液在磁悬浮搅拌器中搅拌10min，然后缓慢加入制备好的病毒颗粒，继续搅拌10min；然后滴加TPP溶液，待溶液由澄清色变为有乳光色沉淀的时候停止滴加，纳米粒的生成，然后继续搅拌20min。
本发明积极效果在于：
提供了一种携带鸡球虫抗原基因Etgam59的壳聚糖纳米粒。选用的重组病毒颗粒rSFV-Etgam59，并予以壳聚糖包裹，制备成的壳聚糖/rSFV-Etgam59纳米粒，具有预防鸡柔嫩艾美耳球虫病，减轻盲肠病变，降低卵囊排出量，减少免疫次数，安全性高的优势。
附图说明
图1 为Etgam59基因电泳图；
图2为重组质粒pSMART2b-Etgam59基因电泳图；
图3为 Western blot鉴定重组质粒在293T表达情况；
图4为重组鸡球虫甲病毒颗粒图；
图5 为Western blot鉴定甲病毒颗粒表达图；
图6为壳聚糖/rSFV-Etgam59纳米粒制备及电镜图；
图7为鸡脾脏淋巴细胞增殖；
图8 为壳聚糖缓释对于抗体水平的影响。
具体实施方式
通过以下实施例进一步举例描述本发明，并不以任何方式限制本发明。下面用实施例来进一步说明本发明的实质性内容，但本发明的内容并不局限于此。
实施例1
重组质粒pSMART2b-Etgam59的构建，鉴定及表达：
首先 Oligo7软件设计引物PCR扩增柔嫩艾美耳球虫Etgam59基因，序列如下：
F：CGCGGATCCGATGACTCGTCTCGCCGCCTG（BamH1)；
R：CCCATCGATTTACTCAAATCCAAAAGAAGGAATGCCCA (Cla1）；
然后对鸡柔嫩艾美耳球虫配子体的提取：21日龄雏鸡经口感染1*104个孢子化卵囊，感染后约132h杀取盲肠，用PBS清洗盲肠浆膜面后剖开肠腹用4℃预冷的SAC溶液冲洗肠道，浸入SAC溶液中（含0.5mg/ml透明质酸酶），于37℃恒温摇床（100rpm）消化1.5h，刮取肠粘膜并用60目铜筛，260目网筛，17μm孔径的滤膜过滤，分别收集滤液。将收集的滤液3500rpm/min,离心5min.用PBS冲洗两次。
配子体的纯化：用红细胞裂解液重悬沉淀，并加入适当体积的灭菌 PBS 液，涡旋震荡，使其充分混匀。随后，在含配子体的 PBS 液中加入30% Percoll，同时制备 PBS液与Percoll 为 1∶1的分离液。在 10 mL灭菌离心管中，分别加入2mL分离液( PBS 液与Percoll 为 1∶1) ，5 m L 含配子体和 30% Percoll 的PBS液，3200 r /min 离心15 min，取最下层沉淀物于另一灭菌离心管，用PBS液重悬、离心(3200r/min、5min) ，用PBS洗涤4次，收集沉淀液氮保存。
提取配子体时期RNA并反转录为cDNA， 以鸡柔嫩艾美耳球虫配子体时期cDNA为模板，PCR扩增Etgam59，纯化后连接pMD18-T载体并保菌。送去生物公司测序正确后用无缝克隆的方法连接至pSMART2b的BamH1跟Cla1两个酶切位点，构建重组质粒pSMART2b-Etgam59（参见图1-2）。
提取无内毒素质粒pSMART2b-Etgam59，按照重组质粒2μg，lip2000 7μl，Opti-MEM500μl的量制备转染复合物，转入细胞培养汇合度60%-80%的293T细胞中，6h后换液，继续培养24-48h。裂解细胞并获取细胞蛋白，一抗为鸡柔嫩艾美耳球虫阳性血清，二抗为兔抗鸡，进行Western blot表达鉴定（参见图3）。
实施例2
重组鸡球虫甲病毒颗粒制备及表达鉴定
提取无内毒素质粒pSMART2b-Etgam59跟辅助质粒pSHCAR，二者按照1:1的量（各1.5μg）与lip2000 7μl共转染至293T细胞，6h后换液继续培养24-48h，之后收集病毒原液，可用于后续的透射电镜拍摄以及Western blot鉴定（参见图4）。
收集的病毒原液需要激活才具有感染力。激活步骤：首先需要加入1/20体积α-糜蛋白酶（10g/L）以活化病毒（将p62糖蛋白裂解成E2和E3蛋白），室温孵育30min，然后加入1/15体积的aprotinin抑肽酶（10g/L），室温孵育5min。紧接着将激活后的病毒感染BHk-21细胞2h，然后换液继续培养24-48h，用Western blot法鉴定表达情况（参见图5）。
实施例3
壳聚糖/rSFV-Etgam59纳米粒的制备
制备1%的壳聚糖醋酸溶液（CS，0.5mg/ml），PH值调节至4.8。三聚磷酸钠溶液（TPP，0.75mg/ml）。首先将CS溶液在磁悬浮搅拌器中搅拌10min，然后缓慢加入制备好的病毒颗粒，继续搅拌10min。然后以一定的速率滴加TPP溶液，待溶液由澄清色变为有乳光色沉淀的时候停止滴加，这时候就有纳米粒的生成，然后继续搅拌20min。将制备的纳米粒拿去做透射电镜观察以及后续的免疫试验（参见图6）。
试验例1
壳聚糖/rSFV-Etgam59纳米粒抗柔嫩艾美耳球虫保护效果
将240只6日龄健康雏鸡随机分成6组，每组40只。免疫组按照7日龄首免，14日龄二免的免疫程序分别按照每只鸡160μl的壳聚糖/rSFV-Etgam59纳米粒（对重组病毒颗粒包封率为64.7%±2.8）和100μl的重组甲病毒颗粒rsfv-Etgam59进行肌肉注射：壳聚糖纳米粒组肌肉注射100μl。同时设立阴性对照组（白对照）和阳性对照组（红对照）：白对照组作不免疫不攻虫处理，红对照组作不免疫攻虫处理。在免疫之前到宰杀之前每组随机采血5只，并进行脾脏淋巴细胞的分离，测定抗体水平变化以及脾脏淋巴细胞增殖情况。二免7天后口服接种孢子化柔嫩艾美耳球虫卵囊1×104个/只进行攻虫试验，并对存活率，相对增重率，盲肠病变计分，OPG，ACI等进行统计，最终以ACI（综合抗球虫指数）来评价壳聚糖/rSFV-Etgam59纳米粒对鸡的免疫保护效果。并且每组留10只鸡分别在35日龄以及42日龄继续采血。检测每组7日龄，14日龄，21日龄，28日龄，35日龄，42日龄的抗体水平的变化。各组实验鸡的ACI测评见表1：
表1.壳聚糖/rSFV-Etgam59纳米粒抗E.tenella的抗球虫指数
组别 存活率（%） 相对增重率（%） 病变值 OPG ACI
CS/rSFV-Etgam59 100 86 7 1 178
rSFV-Etgam59 100 82 9 1 172
CS（壳聚糖纳米粒） 100 42 22 10 110
阳性对照 100 36 25 10 101
阴性对照 100 100 0 0 200
药物组 100 94 2 0 192
结论：从表1中可以看出：综合免疫成本跟时间因素，我们选择两次免疫程序。在剖检时我们统计各免疫组指标，除药物组外，CS/rSFV-Etgam59组的相对增重率最高，病变值跟OPG扣分最低，综合分析得出CS/rSFV-Etgam59纳米粒组的ACI最高为178，明显高于阳性对照组，显示出了良好的保护效果。
用壳聚糖包裹病毒颗粒制备成的纳米粒免疫组，因为壳聚糖纳米粒的缓释效果，所以在28日龄左右之前的抗体水平不如病毒颗粒免疫组。但在28日龄之后壳聚糖/rSFV-Etgam59免疫组的抗体水平依然呈现上升趋势，病毒颗粒免疫组的抗体水平基本不变甚至略有下降趋势（参见图7）。
序列表
<110> 吉林大学
<120> 一种柔嫩艾美耳球虫的壳聚糖/纳米粒及制备方法
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1617
<212> DNA
<213> 柔嫩艾美耳球虫(Eimeriatenella)
<400> 1
atgactcgtc tcgccgcctg cgctgcactc gccgccgtgg ctctcgccgc cgggcagtca 60
gtggccatgc ccacggccat ccccgtagaa gtgccaatgg acgagtatgg ccaggcgaag 120
acctaccagg acactgacat ccccaccagc acctccacgg ctgccccgga gagcccgcag 180
caatggttcg agggcttcag ccgcgcagtg cagaagcagc tgcagctgca ggagaacttg 240
atgcggcagc tggtgaggga catccaggag tacctgacgg aggcctttgg ctggaacgag 300
tcggactcct cggccctggc gcgggtgaac accatgctgg acatgatcag caagcgcatg 360
gccgtgactc gggacgcagc gaacgaggtc agcaccacgg aaaccgagcc gcaggcagtg 420
cgcgacgcca ctcgcaactt catgaaggaa gtaagggtgc aggacatcgt cgtggacgcg 480
ctgtgggcct ctctccgggg cgtgcagacg agtgcctgga tgagtggggt gtcgagcact 540
attgacgaga gagatgtgct ggctgtggcc aacagagccg ctgaggagtt cctggcccgc 600
atgtaccaca acctgcgcgc agcaggagtt gctgaggagg acattgtgaa gtatgtgccg 660
cggactccgg cggatccgag cagcagcgag ccccgcaaca tgggcaagaa gggccgcagc 720
tacggctacg gccacggcta cggctgcggc tacagctacc ccctgtacag ttacggctgc 780
ccctactcca gctgcggcta cagctacccc ttctacgcct ccacctgggg ctaccccagc 840
ccccttgcct ggggctaccc cagccactcc agcttctact ggcgccgcct gggcgctgca 900
gcctgcccgg actgcgcccc cgccccggcc cccgagcccg agttcataat tccccccact 960
gctttccgtg gcctccagga ggaggccatg atgggaactc cctatgcaaa ccccatgatg 1020
ggaactccca tgatgggaac tccctacgcc aaccccatga tggcctcccc ctacaccacc 1080
cccatgatgg gagcttctaa caccaacccc accatggcaa ctccctacac caaccccacc 1140
atggctactc cttacaccaa ccccactatg ggaactccct acaccaaccc cactatggga 1200
actccctaca caaactccat gggaactccc tacacaaact ccatgggagc tccctacaca 1260
aactccatgg gaactcccta caccaacccc actatggggg ccccctacac caaccctacc 1320
atggcaaccc cctacaccaa ccccgctatg ggggccccct acaccaaccc caccatgggg 1380
ggcccctaca ccacccccat ggctggccag gcctaccccg cctacccagc agctgcagca 1440
gctggccagc gcaggagcat gggccccacc caggggccca tggggcgcat gggcacttcg 1500
ggcagccagt acaacagccc cgcgggctac accggcggtt accgcggcct gagtgccttc 1560
gaggcccccg agttcttcga gccccccatg ggcattcctt cttttggatt tgagtaa 1617

Claims (2)

1.一种壳聚糖/rSFV-Etgam59纳米粒疫苗的制备方法，其特征在于；
包装出重组病毒颗粒rSFV-Etgam59；构建出能正确传递和表达该基因的重组质粒pSMART2b-Etgam59，然后将重组质粒pSMART2b-Etgam59与辅助质粒pSHCAR共转染293T细胞，收取病毒原液并激活，在BHK-21细胞成功验证表达后，将激活的病毒颗粒用离子交联法制备壳聚糖纳米粒，包裹重组病毒颗粒。
2. 如权利要求1所述的一种壳聚糖/rSFV-Etgam59纳米粒疫苗的制备方法，包括以下步骤：
1）重组质粒pSMART2b-Etgam59的构建
设计引物PCR扩增柔嫩艾美耳球虫Etgam59基因，序列如下：
F：CGCGGATCCGATGACTCGTCTCGCCGCCTG；
R：CCCATCGATTTACTCAAATCCAAAAGAAGGAATGCCCA；
对鸡柔嫩艾美耳球虫配子体的提取：21日龄雏鸡经口感染1*104个孢子化卵囊，感染后约132h杀取盲肠，用PBS清洗盲肠浆膜面后剖开肠腹用4℃预冷的SAC溶液冲洗肠道，浸入SAC溶液中于37℃恒温摇床100rpm消化1.5h，刮取肠粘膜并用60目铜筛，260目网筛，17μm孔径的滤膜过滤，分别收集滤液；将收集的滤液3500rpm/min,离心5min.用PBS冲洗两次；
配子体的纯化：用红细胞裂解液重悬沉淀，并加入灭菌 PBS 液涡旋震荡，使其充分混匀；在含配子体的 PBS 液中加入30% Percoll，同时制备 PBS液与 Percoll 为 1∶1的分离液；在 10 mL灭菌离心管中，分别加入2mL分离液，5 m L含配子体和30% Percoll 的PBS液，3200 r /min 离心15 min，取最下层沉淀物于另一灭菌离心管，用PBS液重悬、3200r/min、5min离心 ，用PBS洗涤4次，收集沉淀液氮保存；
提取配子体时期RNA并反转录为cDNA， 以鸡柔嫩艾美耳球虫配子体时期cDNA为模板，PCR扩增Etgam59，纯化后连接pMD18-T载体并保菌；测序正确后用无缝克隆的方法连接至pSMART2b的BamH1跟Cla1两个酶切位点，构建重组质粒pSMART2b-Etgam59；
提取无内毒素质粒pSMART2b-Etgam59，按照重组质粒2μg，lip2000 7μl，Opti-MEM 500μl的量制备转染复合物，转入细胞培养汇合度60%-80%的293T细胞中，6h后换液，继续培养24-48h；裂解细胞并获取细胞蛋白，一抗为鸡柔嫩艾美耳球虫阳性血清，二抗为兔抗鸡，进行Western blot表达鉴定；
2）重组鸡球虫甲病毒颗粒制备
提取无内毒素质粒pSMART2b-Etgam59跟辅助质粒pSHCAR，二者按照1:1的量各1.5μg与lip2000 7μl共转染至293T细胞，6h后换液继续培养24-48h，之后收集病毒原液，可用于后续的透射电镜拍摄以及Western blot鉴定；
将收集的病毒原液激活：加入1/20体积α-糜蛋白酶10g/L以活化病毒，将p62糖蛋白裂解成E2和E3蛋白，室温孵育30min，然后加入1/15体积的aprotinin抑肽酶10g/L，室温孵育5min；紧接着将激活后的病毒感染BHk-21细胞2h，然后换液继续培养24-48h；
3）壳聚糖/rSFV-Etgam59纳米粒的制备
制备1%的壳聚糖醋酸溶液（CS，0.5mg/ml），PH值调节至4.8；三聚磷酸钠溶液（TPP，0.75mg/ml）；将CS溶液在磁悬浮搅拌器中搅拌10min，然后缓慢加入制备好的病毒颗粒，继续搅拌10min；然后滴加TPP溶液，待溶液由澄清色变为有乳光色沉淀的时候停止滴加，纳米粒的生成，然后继续搅拌20min。
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