CN113030346A - 一种快速环保检测葡萄酒中氨基甲酸乙酯的方法 - Google Patents

一种快速环保检测葡萄酒中氨基甲酸乙酯的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种快速环保检测葡萄酒中氨基甲酸乙酯的方法，该方法包括以下步骤：先制备含内标氨基甲酸乙酯‑D5(EC‑D5)的待测试样和不同浓度的氨基甲酸乙酯(EC)标准溶液，然后利用基质改良剂改善萃取环境对其影响，分别对待测样本和待测标样进行萃取并进行GC‑MS测定，用EC标准溶液与内标浓度比‑EC标准溶液与内标色谱峰面积比作出标准工作曲线；最后通过GC‑MS测定出的测得待测样本中的氨基甲酸乙酯与内标的色谱峰面积比，带入标准曲线计算，获得葡萄酒样品中氨基甲酸乙酯的浓度。本发明通过基质改良剂改变萃取的基质环境，减少基质干扰，缩短萃取时间，提高检测灵敏度，同时该方法环保经济，能够在1个小时内获得准确的检测结果。

Description

一种快速环保检测葡萄酒中氨基甲酸乙酯的方法
技术领域
本发明属于检测技术领域，具体涉及一种快速环保检测葡萄酒中氨基甲酸乙酯的方法。
背景技术
氨基甲酸乙酯(EC)，又称尿烷，分子式为(H2NCOOC2H5)，无色无臭晶体或白色结晶粉末，易溶于水，半挥发极性化合物。自从上世纪80年代加拿大报道了一些发酵酒中EC含量较高开始，对于酒精饮料中的EC污染及其对人类健康威胁的研究越来越多，葡萄酒和中国黄酒中均有不同程度的EC污染，同时研究发现这些发酵酒中的EC污染是在发酵过程和贮藏过程中以多种方式伴随产生的，研究表明EC具有遗传性毒性和多位点致癌性，可能导致肺癌，皮肤癌，淋巴癌，肝癌等疾病。国际癌症研究机构(International Agency forResearch on Cancer，IARC)于2007年重新评估EC的致癌性后，将其列为2A组物质(“可能对人类有致癌作用”)，值得注意的是酒精饮料，其中的乙醇会协同增强EC对人类的致癌风险，建议酒精饮料的EC日均摄入量不超过80ng/kg mb。
由于文化和生活习惯，葡萄酒一直都是倍受欢迎的消费品。面对葡萄酒中EC的潜在威胁，美国将EC的最高残留量(MRL)设为15ng/mL。为了更好地研究发酵食品中的痕量EC，检测技术至关重要，已有研究表明荧光免疫分析法，高效液相色谱荧光检测器法(HPLC-FLD)，超高效液相色谱-质谱法，气相色谱-质谱联用法(GC-MS)和气相色谱氮磷检测器法(GC-NPD)等方法在对不同基质食品中EC的检测有着很好的运用。但是，葡萄酒中的EC是痕量物质，且葡萄酒基质复杂，一些极性化合物的出现会对检测灵敏度和准确度产生干扰，因此针对EC前处理技术的研究成为热点，目前使用GC-MS为主的前处理方法分为液液萃取法(LLE)，乙醇－K2HPO4－H2O双水相体系萃取法，固相萃取法(SPE)，固相微萃取法(SPME)，多次顶空固相萃取法(MHS-SPME)，填充吸附微萃取法(MEPS)等，经实践发现，SPE法和LLE法方法成熟，准确度高，已被检测机构广泛使用，SPME法虽然环保高效，但因其价格昂贵，萃取纤维头有记忆效应及寿命短的弊端，在定量和检测限方面不如SPE法和LLE法，但是除了SPME法，上述方法共同有着一个容易被忽略的问题—我们在检测这些污染物的同时，大量有机溶剂的使用也在时刻污染着环境，危害着检测人员的健康，甚至超过了EC本身的危害。因此本研究在方法选择上使用近几年发展迅速的单滴微萃取法(SDME)，该方法具有简单，高效，溶剂使用量少，富集倍数高，易与色谱与质谱联用等优势，已在农药残留和环境痕量污染物方面广泛应用。目前尚未见相关SDME技术在葡萄酒，中国黄酒，面包等食品中EC检测的应用。
单滴微萃取技术背景
本研究以环保节能和科学高效理念为出发点，研究单滴微萃取联用GC-MS法对葡萄酒中EC含量进行检测，由于在知网，万方，维普，谷歌学术等中外期刊数据库未检索到相关单滴微萃取技术对氨基甲酸乙酯的萃取。因此本研究的前期工作以该项技术原理中最基础的两种形式——顶空单滴微萃取法(HS-SDME)和直接浸入式单滴微萃取法(DI-SDME)进行预实验，在查阅总结现有相关技术文献时发现，该技术结合气相或气相色谱质谱联用，适用的目标化合物需具备水不溶或水溶性差、非极性或弱极性、易挥发或半挥发等性质，而使用的萃取液滴也需要具备蒸气压低、有一定黏度、不易挥发、水不溶或微溶、与目标物极性相似等性质。
对于氨基甲酸乙酯，其性质极易溶于水，酸性常数pKa在13.5±0.5，在酸性的葡萄酒中以离子态存在，和水结合稳定，不易摆脱与水分子氢键作用力进入有机液滴或者进入顶空。本研究的预实验也验证了这些问题，使用弱极性或非极性的庚烷、辛烷、癸烷、十一烷、十二烷、己醇、癸醇、辛醇等蒸气压低的稳定液滴萃取时，由于极性差异大，并不能有效萃取到EC，而且出峰时间各不相同，干扰极大。使用和EC极性相近的甲苯，二甲苯，三氯甲烷等液滴，用DI-SDME法，发现液滴共萃物多，对定量离子(m/z 62)存在严重干扰，在稀释酒样20倍时，能在加标400ng/mL以上的测试酒样中检出EC。不能满足大部分葡萄酒中痕量EC(20-40μg/L)的检测。用传统HS-SDME法，使用甲苯、二甲苯、正丙醇、异丙醇、异丁醇、异戊醇、叔戊醇、正丁醇、乙酸丁酯、丙酮、乙酸乙酯等与EC极性相似的液滴实验时，这些液滴易挥发，在室温25℃左右，最多维持3-7分钟，而在50℃以上或者搅拌速度400r/min以上，30秒都无法维持。这就违背了该项技术的萃取原理，在预实验中，使用35％的氯化钠调节样品离子强度，使用氢氧化钠调节样品pH至13.5，平衡温度60℃，搅拌转速250r/min，能够在加标100ng/mL酒样中检出EC，后续进行多点加标曲线验证，结果不成线性，这就说明样品量和顶空中的萃取量不成比例关系，违背了单滴微萃取技术的定量原理。EC的解离常数Pka＝13.5，这个参数表明在葡萄酒酸性条件下EC大部分以离子态存在，很难被有机液滴富集，理论上将样品pH调整至接近其Pka时，EC分子态占比增大，更容易被萃取液滴富集。但实际中，由于葡萄酒样中的乙醇影响和葡萄酒中有机酸，无机盐，碳水化合物等天然物质组成的缓冲体系影响，使用pH计来调整葡萄酒的酸碱极不稳定，只有调至pH＝13.5时保持相对稳定，但同时，强碱环境下会导致EC的水解，实验证明，在pH＝13.5条件下，EC含量在24小时内会降解50％以上，如果在加热提取过程中，降解速率加快，存在不稳定性。
现有单滴微萃取技术条件在葡萄酒样品中萃取痕量EC，存在技术瓶颈总结如下：
1.葡萄酒中的EC亲水性强，不易挥发进入顶空。
2.能使用的萃取液滴稳定性差，现有模式条件下不适合葡萄酒样品中EC的萃取。
3.葡萄酒种类繁多，基质复杂，存在与EC竞争吸附的干扰物，影响定性与定量。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术的不足，提供了一种快速环保检测葡萄酒中氨基甲酸乙酯的方法，该方法环保经济，一次检测仅需30mg的基质改良剂和2μL乙酸丁酯，能够在1个小时内实现萃取和GC-MS测定，比现有GB5009.223-2014法节约1个小时，且获得结构准确，检出下限低。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种快速环保检测葡萄酒中氨基甲酸乙酯的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
S1、待测试样制备：取1mL葡萄酒样品置于2mL的进样瓶中，加入10μL浓度为10μg/mL的EC-D5内标，制成含浓度为100ng/mLEC-D5内标的待测试样；
S2、配制标准溶液：分别配制含浓度为100ng/mLEC-D5内标的不同浓度的氨基甲酸乙酯标准溶液；
S3、将30mg基质改良剂加入到18mL顶空瓶，然后加入10μL的S1中制成的待测试样，迅速采用瓶盖密封顶空瓶，再将顶空瓶放置在25℃水浴中平衡，使用10μL的微量进样器吸取2μL乙酸丁酯，垂直插入顶空瓶中央，缓慢推出乙酸丁酯液滴，微量进样器的进样针尖至底部基质改良剂层2cm，萃取3min后，再抽回至微量进样器中获得待测样本；
S4、将30mg基质改良剂装入顶空瓶，然后加入10μL S2中配制的含EC-D5内标的氨基甲酸乙酯标准溶液，迅速采用瓶盖密封顶空瓶，再将顶空瓶放置在25℃水浴中平衡，使用10μL的微量进样器吸取2μL乙酸丁酯，垂直插入顶空瓶中央，缓慢推出乙酸丁酯液滴，乙酸丁酯液滴至底部基质改良剂层2cm，萃取3min后，再抽回乙酸丁酯液滴于微量进样器中获得待测标样；
S3和S4中所述基质改良剂由无水碳酸钠、粉末状无水硫酸钠组成，所述无水碳酸钠、粉末状无水硫酸钠的质量比为3：2；
S5、采用S4中的方法，将S2中含EC-D5内标的不同浓度的氨基甲酸乙酯标准溶液制成不同浓度的氨基甲酸乙酯的待测标样，并通过GC-MS测定，用EC标准溶液与内标浓度比-EC标准溶液与内标色谱峰面积比作出标准工作曲线；
将S3中得到待测样本进行GC-MS测定，测得待测样本中的氨基甲酸乙酯的色谱峰面积与内标EC-D5的峰面积比，带入标准工作曲线，获得葡萄酒样品中氨基甲酸乙酯和内标EC-D5的浓度比，在乘以EC-D5的浓度获得葡萄酒样品中氨基甲酸乙酯的浓度。
本发明使用的基质改良剂是无水碳酸钠和无水硫酸钠复配，其中无水碳酸钠起改变萃取环境的pH和吸水作用，在碱性环境下EC大多以分子态存在，而与其极性相似的易挥发的有机酸则以离子态存在，减少了在萃取液滴中的竞争吸附。无水硫酸钠主要起吸水作用，克服基质水对EC的束缚影响，并作为基质改良剂的pH调节剂，使复配基质改良剂的pH值10.6-10.8之间(注：基质改良剂的pH值是以测定25℃、4g/L基质改良剂水溶液中的pH值来表示)。无水碳酸钠和粉末状无水硫酸钠以质量比为3：2的比例混合后，可使葡萄酒的基质从水体系液态转变为适合顶空萃取所需的改良环境。这是本发明的技术要点。
与传统单滴微萃取技术操作模式相比，传统技术需要有较高的平衡温度，较长的萃取时间，较大样品体积，较快的搅拌速率。这些条件都不适合针对葡萄酒中EC的萃取，而本发明通过基质改良后，在25℃的环境下进行，克服了温度过高造成易挥发液滴不稳定的问题，不需要磁力搅拌器的搅拌，采用极小的样品体积，先平衡后快速萃取的方式，克服了长时间平衡萃取液滴不稳定的问题；本发明在pH参数方面，无需调整样品溶液的pH，克服了葡萄酒样品调整pH时的不稳定性问题，设计的基质改良剂的pH适用于葡萄酒检测使用，本发明直接将葡萄酒样品的酸性液态环境转换为适宜的碱性环境。通过优化萃取条件，平衡快，萃取时间短，避免了长时间碱性环境中EC的水解，提高了检测效率。
上述的一种快速环保检测葡萄酒中氨基甲酸乙酯的方法，其特征在于，气相色谱的条件为：DB-WAXETR毛细管色谱柱，毛细管色谱柱的内径为0.25mm，长度为30m，高纯氦气的纯度为99.999％高纯氦气，载气流速为1mL/min，进样口温度为250℃，手动模式，不分流高压脉冲进样，柱箱程序升温：初始50℃持续1min，10℃/min升至120℃，5℃/min升至150℃，20℃/min升至240℃保持5min；
质谱条件为：EI模式，SIM扫描m/z 44，62，64，89，EC定量离子m/z 62，EC-D5定量离子m/z 64，选择乙酸丁酯中含有稳定物质柠檬酸三酯，柠檬酸三酯产生的离子m/z 157作为第二内标，用于校正进样误差和仪器响应波动。
上述的一种快速环保检测葡萄酒中氨基甲酸乙酯的方法，其特征在于，S3和S4中所述平衡的时间均为10min。
上述的一种快速环保检测葡萄酒中氨基甲酸乙酯的方法，其特征在于，S2中不同浓度的氨基甲酸乙酯标准溶液的浓度依次分别为2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、500ng/mL、1000ng/mL。
上述的一种快速环保检测葡萄酒中氨基甲酸乙酯的方法，其特征在于，在2ng/mL-1000ng/mL的线性范围内，R2＝0.9996,检出限2μg/L，定量限5μg/L，定量限2倍、5倍、10倍加标，回收率90％-105％。
本发明与现有技术相比具有以下优点：
1、本发明对萃取结果影响最大的葡萄酒基质体系和EC性质为焦点，使用并优化了基质改良剂的配比，以改变萃取的基质环境，减少基质干扰，缩短萃取时间，提高检测灵敏度。
2、本发明萃取模式与传统顶空单滴微萃取的模式不同，原理不同，是根据基质改良剂和EC性质特点设计的专属萃取模式，通过优化该模式下的萃取条件，实现了单滴微萃取技术在葡萄酒中EC检测的应用，同时也拓宽了单滴微萃取技术在针对亲水性化合物提取时的应用思路。
3、基质改良剂辅助的顶空单滴微萃取模式条件下，找到了最适的样品体积范围，解决了在样品-顶空-萃取液滴三相中EC浓度的不成线性关系的难题，该技术条件下辅以同位素内标校正，EC浓度在(2，5，10，20，50，100，200，500，1000)ng/mL范围内线性相关，线性相关系数R2＝0.9996，为准确定量奠定基础。
4、为了克服单滴微萃取手动进样与仪器响应带来的误差问题，选择合适的外部内标不容易，同时外部内标的引入，给液滴溶解EC的能力带来不确定性，本研究大胆尝试使用萃取液滴乙酸丁酯中固有物质柠檬酸三酯产生的质量离子m/z 157为第二内标，对进样分析过程进行实时期间核查，能够消除进样与仪器响应波动带来的不确定因素。
5、本发明与传统单滴微萃取模式不同，一是不需要依靠磁力搅拌器来搅拌样品溶液辅助萃取，不需要调节离子强度，也不需要调节样品原溶液的pH；二是相对较低的温度条件下进行，不需要传统技术的高温条件；三是不需要使液滴长时间暴露在顶空或者样品溶液中，本发明使用基质改良剂能够在短时间内有效提升EC进入顶空的扩散速率，从而实现相对不稳定的液滴能在较短的稳定时间内对其的快速的萃取；四是本发明同传统技术相比，样品体积并不是越大越好，最终发现10μL样品量能够满足检测需求。五是本发明的萃取速度较传统技术快，重现性好。
下面通过附图和实施例对本发明的技术方案作进一步的详细说明。
附图说明
图1是本发明的萃取氨基甲酸乙酯的结构示意图。
图2是本发明实施例的标准曲线图。
图3是传统单滴微萃取技术HS-SDME模式的结构示意图。
图4是传统单滴微萃取技术DL-SDME模式的结构示意图。
图5是相同酒样下三种模式的响应峰面积柱状图。
图6-1是不同萃取溶剂下EC峰面积的柱状图。
图6-2是不同萃取溶剂下EC峰面积和液滴稳定时间的柱状图。
图7是乙酸丁酯液滴的体积与EC峰面积的关系柱状图。
图8是葡萄酒样品体积与EC峰面积的柱状关系图。
图9是萃取微量进样器的针尖与样品距离与EC峰面积的柱状关系图。
图10是四种不同添加比例的干燥剂与EC的峰面积的关系图。
图11是无水碳酸钠和无水硫酸钠复配与EC峰面积的关系图。
图12是基质改良剂与EC峰面积的关系图。
图13是萃取温度与EC峰面积的关系图。
图14是平衡时间与EC峰面积的关系图。
图15是萃取时间与EC峰面积的关系图。
具体实施方式
实施例1
本实施例快速环保检测葡萄酒中氨基甲酸乙酯的方法包括以下步骤：
S1、待测试样制备：取1mL葡萄酒样品置于2mL的进样瓶中，加入10μL浓度为10μg/mL的EC-D5内标，制成含浓度为100ng/mLEC-D5内标的待测试样；
S2、配制标准溶液：分别配制含浓度为100ng/mLEC-D5内标的不同浓度的EC标准溶液；
S3、将30mg基质改良剂加入到18mL顶空瓶，然后加入10μL的S1中制成的待测试样，迅速采用瓶盖密封顶空瓶，再将顶空瓶放置在25℃水浴中平衡，使用10μL的微量进样器吸取2μL乙酸丁酯，垂直插入顶空瓶中央，缓慢推出乙酸丁酯液滴，微量进样器的进样针尖至底部基质改良剂层2cm，萃取3min后，再抽回至微量进样器中获得待测样本；
S4、将30mg基质改良剂装入顶空瓶，然后加入10μL S2中配制的含EC-D5内标的EC标准溶液，迅速采用瓶盖密封顶空瓶，再将顶空瓶放置在25℃水浴中平衡，使用10μL的微量进样器吸取2μL乙酸丁酯，垂直插入顶空瓶中央，缓慢推出乙酸丁酯液滴，乙酸丁酯液滴至底部基质改良剂层2cm，萃取3min后，再抽回至微量进样器中获得待测样本；
S3和S4中所述基质改良剂由无水碳酸钠、粉末状无水硫酸钠组成，所述无水碳酸钠、粉末状无水硫酸钠的质量比为3：2；
S5、采用S4中的方法，将S2中含EC-D5内标的不同浓度的EC标准溶液制成不同浓度的EC待测标样，并通过GC-MS测定，用EC标准溶液与内标EC-D5浓度比-EC标准溶液与内标EC-D5色谱峰面积比作出标准工作曲线；
将S3中得到待测样本进行GC-MS测定，测得待测样本中的氨基甲酸乙酯的色谱峰面积与内标EC-D5的峰面积比，带入标准工作曲线，获得葡萄酒样品中氨基甲酸乙酯和内标EC-D5的浓度比，在乘以EC-D5的浓度获得葡萄酒样品中氨基甲酸乙酯的浓度。GC-MS测定中气相色谱的条件为：DB-WAXETR毛细管色谱柱，毛细管色谱柱的内径为0.25mm，长度为30m，高纯氦气的纯度为99.999％高纯氦气，载气流速为1mL/min，进样口温度为250℃，手动模式，不分流高压脉冲进样，柱箱程序升温：初始50℃持续1min，10℃/min升至120℃，5℃/min升至150℃，20℃/min升至240℃保持5min；
GC-MS测定中质谱条件为：EI模式，SIM扫描m/z 44，62，64，89，EC定量离子m/z 62，EC-D5定量离子m/z 64，选择乙酸丁酯中含有稳定物质柠檬酸三酯，柠檬酸三酯产生的离子m/z 157作为第二内标，用于校正进样误差和仪器响应波动。
本实施例中，标准工作曲线绘制过程为：
标准储备液配制：分别称取固体EC和EC-D5，用甲醇配置成浓度为100μg/mL的EC标准储备液和内标EC-D5储备液。-18℃冷冻保存，有效期6个月。
标准中间使用液配制：分别取100μg/mL的EC标准储备液1mL于10mL容量瓶中，用纯水定容至10mL，配成10μg/mL的EC标准中间液A，从中间液A中取0.1mL于10mL容量瓶中，用纯水定容至10mL，配成100ng/mL的中间液B；取100μg/mL内标EC-D5储备液1mL于10mL容量瓶中，用纯水定容至10mL，配成10μg/mLEC-D5标准中间液。4℃冷藏，有效期1个月。
标准溶液系列配制：分别取10μg/mL的EC标准中间液A 0.1mL,0.05mL,0.02mL,0.01mL及100ng/mLEC标准中间液B 0.5mL,0.2mL,0.1mL,0.05mL，0.02mL于8个1mL容量瓶中，分别加入10μL浓度为10μg/mLEC-D5标准中间液后，用纯水定容至1mL，即配制成(2，5，10，50，100，200，500，1000)ng/mL的标准系列，内标浓度一致为100ng/mL。空白为加入10μg/mL的EC-D5标准中间液的1mL纯水。
标准曲线的绘制：按照本实施例前述萃取方法，取10μL标准系列溶液加入含有30mg基质改良剂的顶空萃取瓶中，进行萃取后，手动进样，GC-MS分析，仪器自动获得EC峰面积和EC-D5峰面积，以EC/EC-D5的浓度比为横坐标，以EC峰面积和EC-D5峰面积的比为纵坐标，绘制内标法标准工作曲线。
如图2所示，在2ng/mL-1000ng/mL的线性范围内，曲线方程为Y＝0.83683X+0.02188，R2＝0.9996，表明曲线拟合线性良好，可以用于EC的检测，通过测试，检出限为2μg/L，定量限为5μg/L，以定量限2倍、5倍、10倍加标，回收率90％-105％。
采用实施例1中的检测方法和GB5009.223-2014法通过对不同产区、不同品种、不同色泽、不同年份等10个葡萄酒样品进行检测比对得出以下结果，如表1所示。
表1两种方法检测10个葡萄酒样品进的结果
Figure BDA0003028220080000111
在P＝0.05条件下经单因素方差分析，P(sig)＝0.986>0.05，说明两种方法结果无显著差异。证明本发明方法的可行性和准确性。但与GB5009.223-2014的方法相比较，测定时间节约1个小时，能够实现快速测定的目的。
直接借鉴现有技术对葡萄酒中EC进行测量所遇到的问题：
由于现有技术中单滴微萃取技术在葡萄酒EC检测的应用非常少，没有相关有价值的文献参考，在方案初期尝试使用传统单滴微萃取技术中的HS-SDME和DL-SDME两种方式进行研究。
如图3所示，HS-SDME模式下，经优化，使用乙酸丁酯为萃取液滴，取2mL葡萄酒样品，加入葡萄酒样质量的35％的氯化钠，使用氢氧化钠调节样品pH至13.5，平衡温度60℃，平衡时间40分钟，搅拌转速250r/min,萃取时间1min，能够在加标100ng/mL酒样中检出EC，峰面积2264，而加标200ng/mL，400ng/mL酒样中获得的EC峰面积分别为2584和2890，加标量和萃取峰面积不成线性比例关系，同时对水中的EC标准溶液进行测试，只能在400ng/mL的标准溶液中萃取获得的EC峰面积829，这就更加确信该条件下不能检测葡萄酒中的痕量EC。如此低的响应和萃取率不能满足痕量检测定量需求。
如图4所示，DL-SDME模式，直接萃取葡萄酒样存在严重干扰无法定性EC，而经优化，使用甲苯为萃取液滴，取0.5mL酒样稀释20倍，加入酒样35％的氯化钠，使用氢氧化钠调节样品pH至13.5，平衡温度60℃，搅拌转速100r/min，萃取时间10min，能在加标400ng/mL的测试酒样中检出EC，获得峰面积748，同上，响应和萃取率不能满足痕量检测定量需求。
而本发明使用基质改良辅助HS-SDME模式，在优化的萃取参数：10μL酒样，30mg基质改良剂(无水碳酸钠：无水硫酸钠＝3：2)，25℃平衡10分钟，使用2μL乙酸丁酯在18mL规格的顶空瓶底部距离样品层2cm,萃取3min，进GC-MS分析，获得加标400ng/mL的测试酒样中EC峰面积为85323，是HS-SDME模式的30倍，是DL-SDME模式的100倍，而EC标准水溶液的响应峰面积为127298，是传统模式的100倍，完全满足葡萄酒中痕量EC的检测，同时也证明了本研究的假设，水对EC的束缚制约着传统单滴微萃取技术对葡萄酒中EC的萃取，通过基质改良，克服水的影响，同时营造碱性环境，有助于提升EC进入顶空中的比例。
以下通过试验分析本发明中各项参数选择过程，及分析相关原理。
(1)萃取溶剂的选择
HS-SDME技术中，萃取液滴需要具备在针尖悬挂的稳定性，与萃取目标相似的极性及不会干扰目标物，选择合适的萃取液滴是提高萃取目标物灵敏度的关键。本实验在同一萃取条件下考察了不同的萃取液滴，如图6-1结果所示，单滴微萃取常使用的非极性的，水不溶的高级烷烃和高级醇很难萃取到葡萄酒中的EC，而乙酸丁酯，丙酮，甲苯等中等极性的液滴均能萃取到EC，本实验进一步对萃取响应和液滴稳定性进行考察，如图6-2结果所示，虽然十一烷，十二烷，正辛醇等长链烷烃和高级脂肪醇的稳定性很好，但他们很难萃取到葡萄酒中的EC，这可能是与EC极性差异所致。而与EC极性相似的乙酸丁酯，丙酮，甲苯等液滴，均能萃取到EC，其中乙酸丁酯在萃取EC的响应和液滴稳定性方面相对最好。当然图6-1中选择的萃取溶剂只是发明人尝试的诸多溶剂中的若干中代表而已，并非说明发明人只是尝试这几十种溶剂而挑选出最优者。
采用本发明的方法在其他检测条件不变的情况下，进一步对乙酸丁酯液滴的体积进行考察，如图7所示，从图中看出：液滴体积越大，EC响应越高，但是当乙酸丁酯液滴的体积为2.5μL时极易脱落，故选择相对稳定的2μL的乙酸丁酯作为萃取液滴的最佳体积。
(2)单滴萃取时葡萄酒样品体积的选择
由图8结果看出，葡萄酒样品体积在10-100μL范围内，体积越大，EC的峰面积响应呈下降趋势，这与HS-SDME技术在达到相平衡状态下，样品体积越大，顶空中的目标物浓度越高的理论相悖，说明在该模式下，样品体积越大越不容易实现样品-顶空-萃取液滴三相中EC浓度的正比例关系，而在样品体积为5μL，10μL和20μL时，既能够满足所需求的响应，也能够实现萃取定量所需的重现性，以及满足样品-顶空-萃取液滴三相中EC浓度的正比例关系。故选择EC响应最高的10μL为样品测试体积。
(3)萃取液滴与葡萄酒样品的距离选择
采用本发明的方法在其他检测条件不变的情况下，研究萃取液滴与葡萄酒样品的距离对检测结果的影响。由图9可知，萃取微量进样器的针尖与样品的距离越远，EC峰面积响应越低，而在该模式下使用的针尖最深能够距离瓶底样品1cm，在1-2cm范围内响应接近，考虑该模式条件下改良剂吸水放热，距离太近影响液滴的稳定性，故选择2cm为针尖至样品层的距离。
(3)基质改良剂的选择
本发明提出的基质改良剂在单滴微萃取技术中实属少见，根据葡萄酒基质特点和氨基甲酸乙酯的性质，本研究经过初筛，对四种可行干燥剂进行研究，采用本发明的方法在其他检测条件不变的情况下，如图10结果看出，干燥剂的加入相对不添加干燥剂，对EC峰面积影响很大，四种干燥剂均能显著提升EC的峰面积，而干燥剂的量并不是越多越好，由于四种干燥剂的密度不同和顶空瓶底部面积有限，过多的干燥剂都会降低EC的峰面积，其中40mg的无水硫酸钠和20mg的无水碳酸钠效果最佳。从实验现象来看，无水硫酸钠干燥样品的效果明显优于无水碳酸钠，但二者对EC的萃取效果却相近，这就表明无水碳酸钠的碱性性质同样对葡萄酒中EC的萃取有影响。理论上讲，EC的酸度系数PKa在13.5左右，葡萄酒的pH环境为3.5-4，其中离子态的EC比重更大，不易被液滴溶解，而当有无水碳酸钠碱性环境的影响，葡萄酒中的分子态EC比重增加，更易被萃取液滴富集。
进一步，实验对较优的无水碳酸钠和无水硫酸钠这两种物质进行复配，复配干燥剂pH值以25℃，4g/L的水溶液代表。由图11结果可知，无水碳酸钠比例越大，pH越高，EC峰面积随着pH的变化呈先上升后下降趋势，而无水硫酸钠在复配干燥剂种的比例能够起到微调PH的作用从而影响萃取EC的效果。由于EC是一种酯类，碱性中存在水解可能，所以碱性条件对于萃取EC是把双刃剑，当无水碳酸钠和无水硫酸钠比例为3：2时EC峰面积相对较高，因此，选择无水碳酸钠和无水硫酸钠作为基质改良剂。
由于基质改良剂的用量也和EC的萃取效率有关，因此实验最后考察了基质改良剂的不同质量。如图12可知，EC峰面积随着基质改良剂质量的增加，先增大后平稳下降。这说明基质改良剂质量小，不能够完全去除葡萄酒基质中水的影响，而基质改良剂质量越大，占顶空瓶底部面积的比例增大，厚度增加，会影响EC向顶空中的扩散。因此，基质改良剂用量为30mg时EC峰面积最大。
最终选择使用基质改良剂的条件为：10μL葡萄酒样，30mg基质改良剂(无水碳酸钠：无水硫酸钠＝3：2)。
(4)萃取温度的选择
采用本发明的方法在其他检测条件不变的情况下，由于该模式条件下使用的基质改良剂用途是提供干燥和碱性环境，对温度比较敏感，预实验中，当温度高于50℃时，萃取液滴只能进行0.5min—1min的萃取，同时温度的升高，使吸附水分的干燥剂开始相变，释放出部分水分干扰检测，同时高温下的碱性环境，EC逐渐开始降解，导致EC的响应大幅下降，因此考察了20-40℃内的萃取温度，如图13所示，在25℃时，萃取响应最优。
(4)平衡时间的选择
采用本发明的方法在其他检测条件不变的情况下，萃取液滴是极性液体，易挥发，不能长时间萃取，故本研究摸索了先平衡后快速萃取的模式，图14显示在0-30min的平衡时间内，10min条件下EC的响应最优，而20min后，EC响应开始大幅降低，这是由于时间过长，EC在碱性环境中逐渐开始降解。
(5)萃取时间的选择
采用本发明的方法在其他检测条件不变的情况下，考察了0.5-7min的萃取时间，由图15可知：萃取时间为3min时EC峰面积响应最高，时间短，萃取不完全，响应相对较低，而时间越长，液滴的不稳定性增加，给重现性带来困难，同时时间长意味着EC在碱性环境中降解的风险增加，实验结果也证明了这一点。
通过循序渐进的摸索条件，最终确定本发明的检测方法，通过优化，对待同一加标葡萄酒样(加标量400ng/mL)，在本发明模式下，从不使用基质改良剂的EC峰面积791，到发现样品体积的影响，获得EC响应峰面积12088，到使用单一干燥剂的EC响应峰面积53443，再到复配干燥剂的优选，获得EC响应峰面积65271，再到最终优化条件下的EC响应峰面积85323，经历100倍左右的响应提升，因此本发明人的方法能够实现快速检测葡萄酒中的痕量EC。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制。凡是根据发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效变化，均仍属于本发明技术方案的保护范围内。

Claims (5)

1.一种快速环保检测葡萄酒中氨基甲酸乙酯的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
S1、待测试样制备：取1mL葡萄酒样品置于2mL的进样瓶中，加入10μL浓度为10μg/mL的EC-D5内标，制成含浓度为100ng/mL的EC-D5内标的待测试样；
S2、配制标准溶液：分别配制含浓度为100ng/mL的EC-D5内标的不同浓度的氨基甲酸乙酯标准溶液；
S3、将30mg基质改良剂加入到18mL顶空瓶，然后加入10μL的S1中制成的待测试样，迅速采用瓶盖密封顶空瓶，再将顶空瓶放置在25℃水浴中平衡，使用10μL的微量进样器吸取2μL乙酸丁酯，垂直插入顶空瓶中央，缓慢推出乙酸丁酯液滴，微量进样器的进样针尖至底部基质改良剂层2cm，萃取3min后，再抽回至微量进样器中获得待测样本；
S4、将30mg基质改良剂装入顶空瓶，然后加入10μL S2中配制的含EC-D5内标的氨基甲酸乙酯标准溶液，迅速采用瓶盖密封顶空瓶，再将顶空瓶放置在25℃水浴中平衡，使用10μL的微量进样器吸取2μL乙酸丁酯，垂直插入顶空瓶中央，缓慢推出乙酸丁酯液滴，乙酸丁酯液滴至底部基质改良剂层2cm，萃取3min后，再抽回至微量进样器中获得待测标样；
S3和S4中所述基质改良剂由无水碳酸钠、粉末状无水硫酸钠组成，所述无水碳酸钠、粉末状无水硫酸钠的质量比为3：2；
S5、采用S4中的方法，将S2中含EC-D5内标的不同浓度的氨基甲酸乙酯标准溶液制成不同浓度的氨基甲酸乙酯的待测标样，并迅速通过GC-MS测定，用EC标准溶液与内标浓度比-氨基甲酸乙酯标准溶液与内标色谱峰面积比作出标准工作曲线；
将S3中得到待测样本迅速进行GC-MS测定，测得待测样本中的氨基甲酸乙酯的色谱峰面积与内标EC-D5的峰面积比，带入标准工作曲线，经计算获得葡萄酒样品中氨基甲酸乙酯的浓度。
2.根据权利要求1所述的一种快速环保检测葡萄酒中氨基甲酸乙酯的方法，其特征在于，气相色谱的条件为：DB-WAXETR毛细管色谱柱，毛细管色谱柱的内径为0.25mm，长度为30m，高纯氦气的纯度为99.999％高纯氦气，载气流速为1mL/min，进样口温度为250℃，手动模式，不分流高压脉冲进样，柱箱程序升温：初始50℃持续1min，10℃/min升至120℃，5℃/min升至150℃，20℃/min升至240℃保持5min；
质谱条件为：EI模式，SIM扫描m/z 44，62，64，89，EC定量离子m/z 62，EC-D5定量离子m/z 64，选择乙酸丁酯中含有稳定物质柠檬酸三酯，柠檬酸三酯产生的离子m/z 157作为第二内标，用于校正进样误差和仪器响应波动。
3.根据权利要求1所述的一种快速环保检测葡萄酒中氨基甲酸乙酯的方法，其特征在于，S3和S4中所述平衡的时间均为10min。
4.根据权利要求1所述的一种快速环保检测葡萄酒中氨基甲酸乙酯的方法，其特征在于，S2中不同浓度的氨基甲酸乙酯标准溶液的浓度依次分别为2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、500ng/mL、1000ng/mL。
5.根据权利要求4所述的一种快速环保检测葡萄酒中氨基甲酸乙酯的方法，其特征在于，在2ng/mL-1000ng/mL的线性范围内，R2＝0.9996,检出限2μg/L，定量限5μg/L，定量限2倍、5倍、10倍加标，回收率90％-105％。
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