CN113025587A - 7β-羟基类固醇脱氢酶筛选方法、编码基因及应用 - Google Patents

7β-羟基类固醇脱氢酶筛选方法、编码基因及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种7β‑羟基类固醇脱氢酶筛选方法、编码基因及其在制备熊去氧胆酸及中间体中的应用；本发明提供了一种基于7β‑羟基类固醇脱氢酶蛋白三级结构的筛选方法，通过该方法挖掘了来源于Libanicoccus massiliensis、Clostridium sp.CL‑2、Clostridium butyricum的7β‑羟基类固醇脱氢酶，所述氨基酸序列如SED ID NO:1‑3所示，为此类酶的筛选提供了新的解决方案，大幅提升基因挖掘效率；通过上述系列7β‑羟基类固醇脱氢酶可立体选择性催化熊去氧胆酸中间体C‑7羰基生成7β‑羟基，具有光学纯度高、条件温和、环境友好等优点。

Description

7β-羟基类固醇脱氢酶筛选方法、编码基因及应用
技术领域
本发明涉及7β-羟基类固醇脱氢酶的筛选方法、编码基因及应用，特别涉及一种基于7β- 羟基类固醇脱氢酶三维模型的筛选方法、编码基因、含有该基因的重组表达载体和重组表达转化体，以及该酶或含有该酶的重组细胞制备熊去氧胆酸及其中间体中的应用。
背景技术
熊去氧胆酸是一种来自熊胆的次级胆汁酸，由初级胆汁酸经细菌代谢生成，在临床上主要用于胆结石、反流性胃炎、胆源性胰腺炎、脂肪性肝病、药物性肝病及病毒性肝炎等胆汁淤积性肝病。
经典的化学法制备熊去氧胆酸工艺以胆酸为原料，共需7步工艺制得。由于化学氧化是非选择性的，胆酸上的羧基和3α、7α-羟基在制备过程中必须经过反复保护和脱保护，且7- 酮-石胆酸的催化加氢步骤选择性不佳，工艺路线冗长，工艺总收率仅为27-32％。此外，中间产物7-酮-石胆酸的还原需利用金属钠或者Pd/C催化氢化，工业化放大生产不易控制，存在安全隐患。
随着分子生物学及蛋白定向进化技术的蓬勃发展，生物酶法在制备医药中间体方面的得到广泛应用。根据文献检索结果，基于酶法制备熊去氧胆酸的工艺主要有3条，如下所示：
Figure BDA0002335568220000021
路线a是一条化学酶法制备熊去氧胆酸的工艺路线，由Sun B等人报道(Biotechnology and bioengineering,2013,110:68-77)。首先利用次氯酸钠将胆酸氧化成去氢胆酸，后利用Comanomonas testosteroni 3α-羟基类固醇脱氢酶(HSDH)和Collinsella aerofaciens 7β-HSDH 将去氢胆酸还原成12-酮-熊去氧胆酸，最后通过wolff-kishner反应获得最终产物。
路线b同样是一条以胆酸为出发底物的化学酶法路线(Advanced Synthesis&Catalysis, 2009,351:1303-1311)。首先利用Bacteroides fragilis 7α-HSDH和商品化12α-HSDH(Genzyme Biochemicals Ltd.)氧化胆酸制备7,12-二酮-3α-胆烷酸，之后利用Clostridium absonum 7β-HSDH还原制备12-酮-熊去氧胆酸，最后通过wolff-kishner反应获得最终产物。
路线c是一条全生物酶法催化路线，随着国内鹅去氧胆酸价格持续下降，近年来国内主要以此路线制备熊去氧胆酸。CN105368828A利用Escherichia coli 7α-HSDH先对鹅去氧胆酸7α- 羟基进行氧化，之后利用Ruminococcus gnavus 7β-HSDH将7-酮-石胆酸还原成熊去氧胆酸。
综合3条化学酶法路线和熊去氧胆酸分子结构，所有酶法制备工艺中均需要7β-HSDH作为生物催化剂。作为工艺中的关键酶，目前报道的7β-HSDH来源非常有限，限制了熊去氧胆酸酶法制备工艺的开发。
据文献报道，来源于Collinsella aerofaciens的7β-HSDH(PDB编号：5FYD)已经完成蛋白晶体解析工作(Proteins:Structure,Function,and Bioinformatics,2016,84(6):859-865)。对比来源于E.coli的7α-HSDH(PDB编号：1AHH；Biochemistry,1996 35(24):7715-7530) 和7β-HSDH的晶体结构，在一级结构水平并没有显著区别，均具备短链脱氢酶家族 (Short-chain dehydrogenase superfamily,SDR superfamily)NAD(P)-的保守结合域；尽管两类酶展现出完全相反的立体选择性，但是在进化关系和催化残基的结构上并无显著差异。我们对晶体结构进行进一步解析后发现两类酶在蛋白的C-端表现出极大的分别，7β-HSDH的C- 端包含两个有序的α-螺旋结构(图1)，而7α-HSDH的C-端并无此特征，呈无规则卷曲结构 (图2)。分子对接结果表明，此特征区域恰好处于底物进入催化中心的通道上，推测是该特征结构影响了底物进入催化口袋的方式，造成完全不同的立体选择性。因此可利用同源建模对比HSDH蛋白C-端特征结构进一步确定7β-HSDH的立体选择性。
现阶段7β-HSDH基因挖掘法主要根据已知序列比对的方式进行筛选，但同源性高的序列并不等同于相同的催化功能，仅选择同源性高的序列进行表达意味着错过更多7β-HSDH新酶，不确定性高。因此，开发一种基于三维模型的高效7β-HSDH序列筛选方法，挖掘催化性能良好的新型7β-HSDH，应用于熊去氧胆酸及其中间体的酶法制备工艺，具有重大的学术意义和应用价值。
发明内容
本发明的目的在于开发一种针对7β-HSDH高效基因挖掘法，筛选获得系列7β-HSDH新酶，并且能立体选择性还原熊去氧胆酸中间体C-7羰基生成7β-羟基，为熊去氧胆酸的化学酶法制备工艺提供更多酶源选择。
本发明采用的技术方案是：
本发明所述基于三维模型的7β-HSDH基因挖掘法通过检索NCBI和蛋白质PDB数据库获取已确定功能的7β-HSDH序列及蛋白晶体结构，选定模板序列并在NCBI数据库中进行氨基酸序列比对，选取同源性介于30-80％标注为SDR superfamily的序列，进一步筛选催化三联体S-Y-K及G-X-X-X-G-X-G特征性辅酶结合位点；特别的，将候选序列进行同源建模，通过分析比对7β-HSDH三维蛋白模型C-端特征性双α-螺旋结构，获得7β-HSDH候选序列。
本发明提供了来源于Libanicoccus massiliensis，Clostridium sp.CL-2，Clostridium butyricum 的7β-HSDH，通过上述基因挖掘法获得，将所选7β-HSDH进行全基因合成，构建重组大肠杆菌细胞，并验证7β-HSDH活力，所述的氨基酸序列分别如SEQ IDNO：1-3所示。
由于氨基酸序列的特殊性，任何含有SEQ NO：1-3所示氨基酸序列的多肽的片段或其变体，如其保守性变体、生物活性片段或衍生物，只要该多肽的片段或多肽变体与前述氨基酸序列同源性在90％以上，均属于本发明保护范围之列。具体的，所述改变可包括氨基酸序列中氨基酸的缺失、插入或替换；其中，对于变体的保守性改变，所替换的氨基酸具有与原氨基酸相似的结构或化学性质，如用亮氨酸替换异亮氨酸，变体也可具有非保守性改变，如用色氨酸替换甘氨酸。
本发明还设计所述7β-HSDH的编码基因。具体的，所述基因核苷酸序列如SEQ IDNO： 4-6所示。
由于核苷酸序列的特殊性，任何SEQ ID NO：4-6所示多核苷酸的变体，只要其与该多核苷酸具有90％以上同源性，均属于本发明保护范围之列。所述多核苷酸的变体是指一种具有一个或多个核苷酸改变的多核苷酸序列。此多核苷酸的变体可以使生的变位变异体或非生的变异体，包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换方式，它可能是一个多核苷酸的取代，缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。
本发明还涉及含有所述编码基因的重组载体，以及利用所述重组载体转化得到的重组基因工程菌。所述重组载体是用常规方法将本发明的7β-HSDH编码基因的核苷酸序列连接于各种载体上构建而成。所述载体可为本领域常规的各种载体，如各种质粒、噬菌体或病毒载体等，优选pET28a。较佳的，可通过下述方法获得本发明的重组表达载体：将通过PCR扩增所得的7β-hsdh基因产物与pMD-18T连接形成克隆载体。该克隆载体经限制性内切酶NcoI/BamHI双酶切，切胶回收后与同样经酶切处理回收的pET28a连接，构建本发明的 7β-HSDH重组表达质粒pET28a-7β-lmhsdh、pET28a-7β-cchsdh、pET28a-7β-cbhsdh。
本发明还提供一种含所述编码基因或所述重组载体的基因工程菌。所述基因工程菌可通过将本发明的重组表达载体转化至宿主微生物中获得。所述的宿主微生物可为本领域常规的各种宿主微生物，只要满足重组表达载体可以稳定自我复制且所携带的本发明的7β-HSDH基因可以有效表达。本发明优选大肠杆菌，更优选大肠杆菌E.coli BL21(DE3)。将重组质粒 pET28a-7β-lmhsdh、pET28a-7β-cchsdh、pET28a-7β-cbhsdh转化至E.coli BL21(DE3)中，获得重组大肠杆菌，以重组菌、酶液、细胞或酶液的固定化形式为酶源，进行生物催化。
本发明还涉及所述7β-HSDH在生物催化熊去氧胆酸中间体C-7羰基生成7β-羟基的应用。特别的，所述的应用为：以含7β-HSDH编码基因的重组基因工程菌经发酵培养获得的湿菌体破碎液为生物催化剂，于pH 5.0-9.0的缓冲液中，加入底物、辅助底物和NAD(P)-，在20-50℃、 50-250rpm条件下反应；所述辅助底物为葡萄糖，添加葡萄糖脱氢酶(GDH)构成辅酶循环体系；所述的催化剂用量以湿菌体的重量计为10-50g/L，所述底物的初始浓度为0.05-1.0 mol/L，所述辅助底物的用量为10-80g/L，所述GDH以含gdh基因的工程菌经发酵培养获得，所述湿菌体重量计为0.5-50g/L。
反应式如下：
Figure BDA0002335568220000051
本发明的有益效果主要体现在：提供了一种基于三维模型的高效7β-HSDH基因挖掘法，为筛选功能确定的7β-HSDH新酶提供了一个新解决方案，大幅提升基因挖掘效率；提供了分别来源于Libanicoccus massiliensis，Clostridium sp.CL-2，Clostridiumbutyricum的三个 7β-HSDH新酶，均为首次报道，与已报道的7β-HSDH序列同源性较低，对熊去氧胆酸中间体具有极佳的立体选择性；本发明构建的7β-HSDH重组菌株催化制备熊去氧胆酸及其中间体具有光学纯度高、条件温和、环境友好等优点，具有较大的工业化应用潜力。
附图说明
图1为C.aerofaciens 7β-HSDH蛋白晶体结构；
图2为E.coli 7α-HSDH蛋白晶体结构；
图3为7β-HSDH同源建模结果；A为L.massiliensis 7β-HSDH同源建模三级结构，B为 Clostridium sp.CL-2 7β-HSDH同源建模三级结构，C为Clostridium butyricum 7β-HSDH同源建模三级结构；
图4为筛选的7β-HSDH序列与Collinsella aerofaciens 7β-HSDH的氨基酸序列比对图谱； CbHSDH来源于Clostridium butyricum，CcHSDH来源于Clostridium sp.CL-2，LmHSDH来源于Libanicoccus massiliensis，CaHSDH来源于Collinsella aerofaciens；
图5为7β-HSDH重组菌诱导表达SDS-PAGE图谱；泳道M为蛋白质分子量Marker，泳道1为E.coli BL21(DE3)破碎上清液，泳道2为IPTG诱导E.coli BL21(DE3)/pET28a-7β-cchsdh 破碎上清液，泳道3为IPTG诱导E.coli BL21(DE3)/pET28a-7β-lmhsdh破碎上清液，泳道4 为IPTG诱导E.coli BL21(DE3)/pET28a-7β-cbhsdh破碎上清液。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1：7β-羟基类固醇脱氢酶基因挖掘
本发明所述7β-羟基类固醇脱氢酶通过基因数据库挖掘的方法获得。步骤1：选取蛋白晶体结构已解析的C.aerofaciens 7β-HSDH(PDB编号：5FYD)作为模板，在NCBI数据库中进行BLAST，选取同源性介于30-80％标注为SDR superfamily序列92条；步骤2：将motif1 (G-X-X-X-G-X-G特征性辅酶结合位点)和motif 2(S-Y-K催化三联体)合并，对步骤1中序列进行重新比对，逐一排除催化三联体不匹配，NAD(P)-结合区域不匹配，氨基酸数目差异显著序列，确定8条序列符合全部要求；步骤3：将步骤2所得序列与已报道且功能确定的 7β-HSDH进行比对，排除同源性>90％序列，确保所选序列无侵专问题，选定5条序列；步骤4：以C.aerofaciens 7β-HSDH(PDB编号：5FYD)作为模板(与模板序列同源性≥30％即满足同源建模要求)，对步骤3所选序列利用Modeller 9.23进行同源建模，根据C-端特征性双α-螺旋结构选定来源于C.butyricum，Clostridium sp.CL-2，L.massiliensis 7β-HSDH作为候选序列进行验证(图3)，利用PDBsum上述三个同源建模结果进行评估，结果表明三个模型中位于最适区域的氨基酸分别为94.4％，95.8％，93.1％(评估标准高于90％即为可信模型)。
将7β-CbHSDH、7β-CcHSDH、7β-LmHSDH所选序列与C.aerofaciens 7β-HSDH进行同源比对和一级结构分析(图4)，与7β-CaHSDH模板的序列同源性分别为41.91％、43.3％和74.52％，一级结构中包含SDR superfamily保守结构域。7β-CbHSDH、7β-CcHSDH、 7β-LmHSDH特征性辅酶结合位点(G-X-X-X-G-X-G)分别为G15-G19-G21，G15-G19-G21 和G16-G20-G22。此外，可以确定7β-CbHSDH、7β-CcHSDH、7β-LmHSDH三个完全保守的氨基酸残基为S143-Y156-K160，S143-Y156-K160和S145-Y158-K162，对应于SDR superfamily 的催化三联体结构。
选取7β-LmHSDH、7β-CcHSDH和7β-CbHSDH氨基酸序列(SEQ ID NO：1-3所示)，以大肠杆菌为宿主进行密码子偏好性进行优化，根据表达载体pET28a的特点设计了NcoI和BamHI，通过基因工程的常规操作以全基因合成的方法合成了该7β-羟基类固醇脱氢酶基因7β-lmhsdh、7β-cchsdh和7β-cbhsdh(SEQ ID NO：4-6所示)，对应核苷酸序列长度为804bp，786bp和786bp。
实施例2：重组表达载体及工程菌的构建
利用NcoI和BamHI限制性内切酶对实施例1中合成的7β-lmhsdh、7β-cchsdh和7β-cbhsdh 基因片段进行双酶切以及回收处理，并利用T4 DNA连接酶将该片段与用相同的限制性内切酶处理的商品化载体pET28a在16℃下连接过夜，从而构建得到重组表达载体pET28a-7β-lmhsdh、pET28a-7β-cchsdh、pET28a-7β-cbhsdh。将构建完成的重组表达载体转化至E.coli BL21(DE3)感受态细胞中，涂布于含终浓度50μg/mL卡那霉素的LB平板，37℃下培养过夜；于平板上长出的菌落中随机挑取克隆进行菌落PCR鉴定，阳性克隆测序验证，结果表明重组表达载体成功转化至表达宿主E.coli BL21(DE3)中，且7β-lmhsdh、7β-cchsdh和7β-cbhsdh基因已成功克隆至pET-28a的NcoI和BamHI位点。
实施例3：含有重组7β-羟基类固醇脱氢酶菌体细胞的制备
将实施例2构建的基因工程菌pET28a-7β-lmhsdh、pET28a-7β-cchsdh、pET28a-7β-cbhsdh 接种至含有50μg/mL卡那霉素的LB培养基中，37℃培养至菌体浓度OD600值为0.4-0.6，再向LB液体培养基中加入终浓度0.1mmol/L的IPTG，28℃诱导培养过夜后，将培养液于4℃、 12000rpm离心5min，弃去上清液，分别收集含有重组7β-LmHSDH、7β-CcHSDH和 7β-CbHSDH的湿菌体。各称取1g湿菌体，悬浮于10mL pH 7.5磷酸缓冲液，进行超声破碎，利用SDS-PAGE电泳对可溶性重组蛋白分子大小和表达量进行验证(图5)。7β-LmHSDH、 7β-CcHSDH和7β-CbHSDH重组蛋白理论大小均为29.6kDa，与SDS-PAGE谱图相符。
实施例4：含有重组葡萄糖脱氢酶菌体细胞的制备
将重组菌BL21(DE3)/pET28a-gdh接种至含有50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基，在 37℃培养12h，再以体积浓度2％接种量接种至新鲜的含有50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃培养至菌体浓度OD600值为0.4-0.6，再向LB液体培养基中加入终浓度为0.1mmol/L的IPTG，28℃诱导培养过夜后，将培养液在4℃、12000rpm离心5min，弃去上清液，收集含有重组GDH的湿菌体。该菌体破碎液可应用于NAD(P)-辅酶循环。
实施例5：重组菌pET28a-7β-lmhsdh催化制备3,12-二酮-7β-胆烷酸
以实施例3方法获得的BL21(DE3)/pET28a-7β-lmhsdh菌体为催化剂，以去氢胆酸为底物。
转化体系：10mL pH 7.5磷酸盐缓冲液中加入10g/L重组BL21(DE3)/pET28a-7β-lmhsdh 湿菌体破碎液，10g/L去氢胆酸，20mg/L NADP-，10g/L葡萄糖，2g/L GDH湿菌体破碎液，反应温度30℃，搅拌转速200rpm，反应3h后用乙腈淬灭反应，HPLC检测产物3,12-二酮-7β- 胆烷酸反应收率100％。HPLC检测条件见参考文献(Applied Microbiology andBiotechnology, 2011,90(1),127-135)。
实施例6：重组菌BL21(DE3)/pET28a-7β-cchsdh催化制备3,12-二酮-7β-胆烷酸
以实施例3方法获得的BL21(DE3)/pET28a-7β-cchsdh菌体为催化剂，以去氢胆酸为底物。其它操作同实施例5，反应3h后用乙腈淬灭反应，HPLC检测产物3,12-二酮-7β-胆烷酸反应收率为88.1％。
实施例7：重组菌BL21(DE3)/pET28a-7β-cbhsdh催化制备3,12-二酮-7β-胆烷酸
以实施例3方法获得的BL21(DE3)/pET28a-7β-cbhsdh菌体为催化剂，以去氢胆酸为底物。其它操作同实施例5，反应3h后用乙腈淬灭反应，HPLC检测产物3,12-二酮-7β-胆烷酸反应收率100％。
实施例8：重组菌BL21(DE3)/pET28a-7β-lmhsdh催化制备熊去氧胆酸
以实施例3方法获得的BL21(DE3)/pET28a-7β-lmhsdh菌体为催化剂，以7-酮-石胆酸为底物。
转化体系：10mL pH 8.0Tris-HCl缓冲液中加入10g/L重组BL21(DE3)/pET28a-7β-lmhsdh 湿菌体破碎液，10g/L 7-酮-石胆酸，20mg/L NADP-，10g/L葡萄糖，2g/L GDH湿菌体破碎液，反应温度30℃，搅拌转速200rpm，反应24h后用乙腈淬灭反应，HPLC检测产物熊去氧胆酸反应收率为21.7％。HPLC检测条件见参考文献(Process Biochemistry,2015,50 (4),598-604)。
实施例9：重组菌BL21(DE3)/pET28a-7β-cchsdh催化制备熊去氧胆酸
以实施例3方法获得的BL21(DE3)/pET28a-7β-cchsdh菌体为催化剂，以7-酮-石胆酸为底物。其它操作同实施例8，反应24h后用乙腈淬灭反应，HPLC检测产物熊去氧胆酸反应收率为0.4％。
实施例10：重组菌BL21(DE3)/pET28a-7β-cbhsdh催化制备熊去氧胆酸
以实施例3方法获得的BL21(DE3)/pET28a-7β-cbhsdh菌体为催化剂，以7-酮-石胆酸为底物。其它操作同实施例8，反应24h后用乙腈淬灭反应，HPLC检测产物熊去氧胆酸反应收率为0.6％。
序列表
<110> 上海奥博生物医药技术有限公司
<120> 7β-羟基类固醇脱氢酶筛选方法、编码基因及应用
<130> 2019.12.9
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 267
<212> PRT
<213> Libanicoccus massiliensis
<400> 1
Met Thr Asn Leu Arg Glu Lys Tyr Gly Glu Trp Gly Val Val Leu Gly
1 5 10 15
Ala Thr Glu Gly Val Gly Glu Ala Phe Cys Lys Lys Leu Ala Glu Gly
20 25 30
Gly Met Asn Leu Val Met Val Gly Arg Arg Glu Glu Leu Leu Arg Glu
35 40 45
Lys Gly Glu Lys Phe His Glu Glu Tyr Gly Val Asp Tyr Lys Val Val
50 55 60
Arg Ala Asp Leu Ser Cys Pro Asp Glu Ala Cys Glu Ala Val Phe Ser
65 70 75 80
Ala Thr Glu Gly Leu Asp Leu Gly Phe Met Ser Tyr Val Ala Cys Leu
85 90 95
His His Phe Gly Lys Phe Gln Asn Thr Ser Leu Glu Asp His Glu Lys
100 105 110
Met Val Asn Val Asn Val Ile Ser Phe Leu Arg Met Phe His His Phe
115 120 125
Met Gly Ile Phe Ala Ala Gln Asp Arg Gly Ala Val Ile Asn Val Ser
130 135 140
Ser Met Thr Gly Ile Ser Ser Ser Pro Trp Asn Ala Glu Tyr Gly Ala
145 150 155 160
Gly Lys Ala Tyr Ile Leu Lys Leu Thr Glu Ala Val Ala Cys Glu Cys
165 170 175
Glu Lys Thr Gly Val Asp Val Glu Val Cys Thr Leu Gly Thr Thr Leu
180 185 190
Thr Pro Thr Ala Ile Lys Asn Phe Pro Lys Gly Pro Val Gly Asp Gln
195 200 205
Val Val Lys Leu Ala Leu Thr Pro Asp Glu Val Ala Asp Glu Ala Phe
210 215 220
Glu Lys Leu Gly Lys Glu Phe Ser Ile Ile Thr Gly Glu Arg Asn Lys
225 230 235 240
Lys Ser Val His Asp Trp Lys Ala Asn His Thr Glu Asp Glu Tyr Ile
245 250 255
Arg Tyr Met Gly Ser Phe Tyr Ala Asp Gln Asp
260 265
<210> 2
<211> 262
<212> PRT
<213> Clostridium sp. CL-2
<400> 2
Met Asn Phe Arg Glu Lys Tyr Gly Gln Trp Ala Ile Val Leu Gly Ala
1 5 10 15
Thr Glu Gly Ile Gly Lys Ser Asp Ala Phe Glu Leu Ala Arg Arg Gly
20 25 30
Met Asp Val Ile Leu Val Gly Arg Arg Arg Glu Ala Leu Glu Asn Leu
35 40 45
Ala Lys Asp Ile Asn Ala Glu Thr Gly Ser Glu Val Lys Val Leu Cys
50 55 60
Gln Asp Leu Ser Glu Tyr Asp Ala Ala Asp Lys Ile Ile Glu Ala Thr
65 70 75 80
Lys Asp Leu Asp Met Gly Leu Val Asn Tyr Val Ala Cys Leu His Ser
85 90 95
Met Gly Gln Tyr Asn Lys Val Asp Tyr Ser Lys Tyr Glu Gln Met Tyr
100 105 110
Arg Val Asn Ile Arg Thr Phe Ser Lys Leu Leu His His Phe Ile Gly
115 120 125
Leu Phe Lys Glu Arg Asp Arg Gly Ala Phe Val Thr Ile Gly Ser Leu
130 135 140
Ser Gly Trp Thr Ser Leu Pro Phe Cys Ala Glu Tyr Ala Ala Gln Lys
145 150 155 160
Ala Tyr Met Met Ala Leu Thr Glu Gly Val Ala Tyr Glu Cys Lys Asn
165 170 175
Thr Asn Val Asp Val Leu Leu Leu Thr Ala Gly Ser Thr Ile Thr Pro
180 185 190
Thr Trp Leu Lys Asn Lys Pro Ala Asp Glu Asp Ala Val Ala Ala Ala
195 200 205
Met Tyr Pro Glu Asp Val Ser Arg Glu Gly Phe Asp Gln Leu Gly Lys
210 215 220
Lys Leu Ser Tyr Leu Ala Gly Glu Arg Asn Arg Arg Asn His His Lys
225 230 235 240
Arg Ile Ser Glu His Asp Arg Asp Glu Ile Ile Glu Glu Leu Gly Lys
245 250 255
Met Phe Thr His Met Ala
260
<210> 3
<211> 261
<212> PRT
<213> Clostridium butyricum
<400> 3
Met Asn Phe Arg Glu Lys Tyr Gly Gln Trp Gly Ile Val Leu Gly Ala
1 5 10 15
Thr Asp Gly Ile Gly Lys Ala Ser Ala Tyr Glu Leu Ala Asn Arg Gly
20 25 30
Met Asp Val Ile Leu Val Gly Arg Arg Lys Asp Ala Leu Glu Ala Leu
35 40 45
Ala Lys Asp Ile His Asp Lys His Gly Val Glu Val Arg Val Leu Pro
50 55 60
Gln Asp Leu Ser Glu Tyr Asp Ala Ala Glu Lys Ile Ile Glu Ser Ile
65 70 75 80
Lys Asp Leu Asp Met Gly Leu Ile Glu Tyr Val Ala Cys Leu His Ala
85 90 95
Met Gly Gln Tyr Asn Asn Val Asn Tyr Ser Lys Tyr Glu Gln Met Tyr
100 105 110
Arg Ile Asn Ile Arg Thr Phe Ser Lys Leu Leu His His Tyr Ile Gly
115 120 125
Glu Phe Lys Asn Arg Asn Arg Gly Ala Phe Val Thr Ile Gly Ser Leu
130 135 140
Ser Gly Trp Thr Ser Leu Pro Phe Cys Ala Glu Tyr Ala Ala His Lys
145 150 155 160
Ala Tyr Met Met Thr Leu Thr Glu Gly Val Ala Tyr Glu Cys Lys Asp
165 170 175
Thr Asn Val Asp Val Leu Leu Leu Ser Ala Gly Ser Thr Ile Thr Pro
180 185 190
Thr Trp Leu Lys Asn Lys Pro Ser Asp Pro Lys Val Val Glu Ala Ala
195 200 205
Met Tyr Pro Glu Asp Val Val Lys Asp Gly Phe Glu Gln Leu Gly Thr
210 215 220
Lys Phe Thr Tyr Leu Ala Gly Glu Leu Asn Arg Glu Lys Met Lys Lys
225 230 235 240
Asn Asn Glu Met Asp Arg Asn Asp Leu Ile Ala Lys Leu Gly Lys Met
245 250 255
Phe Asp His Met Ala
260
<210> 4
<211> 804
<212> DNA
<213> Libanicoccus massiliensis
<400> 4
atgacgaatc tgcgcgagaa gtacggcgag tggggcgttg ttcttggtgc caccgagggc 60
gtgggcgagg ccttctgcaa gaagctcgcc gagggcggca tgaacctggt catggtgggc 120
cgccgcgagg agctgctgcg cgagaagggc gagaagttcc acgaggagta cggcgttgac 180
tataaggtcg tgcgcgccga cctgtcctgt cccgacgagg cctgcgaggc ggtcttctcg 240
gccaccgagg gtcttgacct gggcttcatg agctacgttg cctgcctgca ccactttggc 300
aagttccaga acacctcgct tgaggaccac gagaagatgg tgaacgtcaa cgtcatcagc 360
ttcctgcgca tgttccatca cttcatgggc atcttcgccg cccaggaccg tggcgccgtg 420
atcaacgtct cgtccatgac gggcatctcg agttccccgt ggaacgccga gtacggcgcg 480
ggcaaggcct acatcctgaa gctcaccgag gccgtggcct gcgagtgcga gaagacgggc 540
gtcgacgtgg aggtctgcac gcttggcacc acgctcacgc ccacggccat caagaacttc 600
cccaagggcc cggtgggcga tcaggtcgtc aagctcgcgc tcacgcccga cgaggtcgcc 660
gacgaggcgt tcgagaagct cggcaaggag ttctccatca tcacgggcga gcgcaacaag 720
aagagcgtgc atgactggaa ggccaaccac accgaggacg agtacatccg ctacatgggc 780
tcgttctacg ccgaccagga ctaa 804
<210> 5
<211> 789
<212> DNA
<213> Clostridium sp. CL-2
<400> 5
atgaatttta gagaaaagta tggacaatgg gcaatagttt taggagcaac tgaaggaata 60
ggaaagtctg atgcatttga attagcaaga agaggcatgg acgtaatttt agttggaaga 120
agaagagagg ctttagaaaa cttggctaaa gatataaatg cagaaacagg aagtgaagtt 180
aaagtattat gtcaagacct ttcagaatat gatgctgctg ataaaataat agaagcaact 240
aaagatttgg atatgggatt agttaactat gtagcatgtt tacattctat gggacaatat 300
aataaggttg attattctaa gtatgagcaa atgtacagag ttaatataag aacattctct 360
aaattattac atcactttat aggattattt aaagaaagag acagaggagc atttgtaaca 420
attggatctt tatctggatg gacttcatta ccattctgtg ctgaatatgc agctcaaaaa 480
gcatatatga tggcattaac agaaggtgtt gcatatgagt gcaaaaatac aaatgtagat 540
gtattattat taacagcagg ctctacaatt actccaactt ggctaaagaa taaaccagct 600
gatgaagatg ctgtagctgc tgctatgtat ccagaagatg tttcaagaga aggatttgat 660
caattaggta aaaagttatc ttacttagca ggagaaagaa atagaagaaa tcatcataag 720
agaatttcag aacatgatag agatgaaata attgaagaat taggtaagat gtttacacat 780
atggcataa 789
<210> 6
<211> 786
<212> DNA
<213> Clostridium butyricum
<400> 6
atgaatttta gagaaaaata tggtcagtgg ggaattgttt taggggcaac agatggaatt 60
ggtaaagcta gtgcttatga attagctaat agaggtatgg atgtaatttt agtgggaaga 120
agaaaggatg cattagaggc gttagcaaaa gatatacatg ataaacatgg agttgaagta 180
agggtattac ctcaagattt atctgaatat gatgcggctg aaaaaataat agaatcaatc 240
aaagatttag atatgggatt aatagaatat gttgcatgtc tccatgcaat gggccagtat 300
aacaatgtta attattctaa atatgagcag atgtacagaa ttaatataag aaccttctca 360
aaattattgc atcattatat aggtgaattt aaaaatagaa atagaggtgc atttgtaaca 420
attggttctt tatctgggtg gacttcattg ccattttgtg cagagtatgc tgcacataaa 480
gcttatatga tgacgctaac agaaggggtt gcatatgaat gcaaggacac taacgtagat 540
gtattgttat tatctgctgg atcaacaatt acaccaacat ggttaaaaaa taaaccatca 600
gatcctaagg tagttgaagc tgctatgtat ccagaagatg ttgtaaaaga tggatttgag 660
caattaggaa cgaaattcac atatttagca ggtgaattaa atagagaaaa aatgaaaaaa 720
aataatgaaa tggatagaaa tgatttgatt gcaaaattag gtaagatgtt tgatcacatg 780
gcataa 786

Claims (4)

1.一种7β-羟基类固醇脱氢酶基因挖掘筛选方法，其特征在于所述方法为：以已解析蛋白晶体结构的7β-羟基类固醇脱氢酶作为筛选模板，在NCBI及PDB数据库中进行同源比对，进一步筛选含催化三联体S-Y-K及G-X-X-X-G-X-G特征性辅酶结合位点的序列，通过同源建模，对比三维蛋白模型C-端特征性双α-螺旋结构，筛选获得新型7β-羟基类固醇脱氢酶。
2.如权利要求1所述的方法筛选获得的7β-羟基类固醇脱氢酶，分别来源于Libanicoccus massiliensis，Clostridium sp.CL-2，Clostridium butyricum，其特征在于所述重组7β-羟基类固醇脱氢酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:1-3所示。
3.如权利要求2所述的7β-羟基类固醇脱氢酶生物催化制备熊去氧胆酸及其中间体中的应用，其特征在于所述的应用为：于缓冲体系中加入葡萄糖脱氢酶、葡萄糖和NAD(P)-，以7β-羟基类固醇脱氢酶或含有该酶的重组细胞作为生物催化剂，立体选择性催化熊去氧胆酸中间体C-7羰基生成7β-羟基，制备光学纯熊去氧胆酸及中间体。
4.如权利要求3所述的熊去氧胆酸及中间体的酶法制备方法，其特征在于所述熊去氧胆酸及中间体的结构式如下：
Figure FDA0002335568210000011
R1为氢、羰基或羟基，R2为氢、羰基或羟基。
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