CN113016802A - 富马酸在抑制蓝藻生长中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种富马酸在抑制蓝藻生长中的应用，在一定浓度的蓝藻水域中，施用40mg/L富马酸便可长期抑制蓝藻生长。与常见的小分子酸抑制剂(乙酸、盐酸)相比，抑制效果好且不会造成二次污染，生态安全性高。除此，富马酸不仅可以抑制水华优势种铜绿微囊藻，而且对小颤藻也有抑制效果，对蓝藻有普遍的应用性。因其可长期有效控制蓝藻且成本低廉、环境友好，适合向社会推广。

Description

富马酸在抑制蓝藻生长中的应用

技术领域

本发明属于抑藻剂领域，具体涉及富马酸在抑制富营养化水体中蓝藻生长的应用。

背景技术

如今，各类水源蓝藻“水华”现象频发，成为广受关注且急需解决的全球性问题。“水华”爆发不仅增加水体浊度影响视觉观赏性，而且产生毒素以及嗅味物质，严重影响水生生态系统及威胁人类身体健康。因此，研究如何有效控制藻类生长、改善富营养化水体水质以恢复健康的水生生态系统具有十分重要的意义。

铜绿微囊藻具有伪空胞，可通过浮力调节获得适宜生长的条件而大量繁殖。在我国大部分富营养化水体中，它在数量和发生频率上均属于优势藻种。常用的抑藻方法为物理法、化学法及生物法。物理法主要通过直接打捞，超声波法以及天然矿物絮凝等，成本较高且存在大水域难实施等问题。生物法通过引入水生生物来操纵食物网，可能会再次打破水生生态系统平衡。而对于突发性藻华，使用化学法控制仍旧是最有效的方法。目前常用的化学抑藻剂包括重金属，含卤杀菌剂，氧化剂等，存在潜在毒性、施用成本高、短期效应等问题。虽然部分化感物质可以达到较好的抑藻效果，但由于天然水体中有效成分少，提纯成本高等问题导致其应用受到限制。因此，发现高效可靠的绿色经济型抑藻剂尤为重要。

富马酸(以下简称FA)，又名延胡索酸，即反丁烯二酸，是由丁烯衍生出来的一种小分子有机酸。富马酸存在于延胡索属、牛肝菌属、地衣及冰岛海苔中。它主要被应用为酸度调节剂、抗氧化助剂、食品添加剂，化工原料或中间体。除此，它还是柠檬酸循环的一种中间体，细胞利用它从食物中产生三磷酸腺苷(ATP)。富马酸为无毒天然小分子，应用于天然水体中不会造成有害的环境影响。富马酸除上述应用外，还是一种有效的杀菌剂，但到目前尚未见其作为抑藻剂应用的报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种长期抑制蓝藻生长的抑藻剂，该抑藻剂使用方法安全高效、成本低廉、抑藻周期长。

发明目的具体通过以下技术方案实现：

一种抑藻剂，其活性成分包含有富马酸。

进一步地，本发明还要求保护富马酸在抑制蓝藻生长中的应用。

具体地，所述蓝藻包括铜绿微囊藻和/或小颤藻。

上述蓝藻包括铜绿微囊藻菌株FACHB-315和小颤藻菌株FACHB-1052。

所述的富马酸的化学式为C₄H₄O₄。

所述蓝藻在水体中的藻密度(藻细胞浓度)范围不高于3.71×10⁶cells/mL，其光密度与藻细胞浓度之间存在如下关系：

Y＝32.175X+0.4928

其中Y为藻细胞浓度(单位：10⁶cells/mL)，X为藻液光密度OD₆₈₀。

本发明对比了富马酸对不同培养时期(对数期与稳定期)的铜绿微囊藻为原始接种藻液的抑制效果，结果表明富马酸均会不同程度的抑制其生长。

本发明与其他小分子有机酸及无机酸(乙酸、盐酸)进行了比较，结果表明同等条件下富马酸作用于铜绿微囊藻的效果优于其他小分子酸或无机酸。

本发明选择常见的铜绿微囊藻为主要藻种，小颤藻用于研究富马酸对蓝藻是否具有普适性。发现富马酸对上述两种菌株均有抑制效果。

本发明富马酸在抑制蓝藻生长中的应用方法为，向藻体水域中投加富马酸，以控制水域中蓝藻的生长。

优选地，所述富马酸的投加量不低于40mg/L。

本发明提出的作用机理为富马酸使藻细胞的主要光合色素叶绿素a含量下降，破坏光吸收与利用间的平衡关系，从而抑制藻细胞的光合作用，使得电子传递与转换能力降低。细胞膜发生不同程度的受损破裂，膜通透性增加。最终，藻细胞因光合作用及细胞完整性受到影响而死亡。

本发明与现有技术相比，选择的不饱和小分子有机酸，即富马酸，具有非常显著的抑藻特性。

本发明具有如下的有益效果：

(1)天然富马酸不仅来源广泛，而且是生物体的中间代谢产物，合成富马酸原料简单且应用安全。它是一种价格低廉且绿色友好的抑藻剂。

(2)富马酸可以长期控制蓝藻生长，达到抑藻效果的前提下对环境十分友好。

富马酸作为价格低廉、绿色友好的抑藻剂是一种可以长期控制蓝藻生长的方法。

附图说明

下面结合附图和具体实施方式对本发明做更进一步的具体说明，本发明的上述优点将会变得更加清楚。

图1为实施例1中FA抑制稳定期铜绿微囊藻FACHB-315生长过程中光密度变化与抑制率情况示意图。

图2为实施例1中FA对稳定期铜绿微囊藻FACHB-315的叶绿素a含量随时间变化的曲线图。

图3为实施例1中FA对稳定期铜绿微囊藻FACHB-315的叶绿素荧光动力学参数随时间变化的曲线图。

图4为实施例2中FA抑制对数期铜绿微囊藻FACHB-315生长过程中光密度变化与抑制率情况示意图。

图5为实施例3中FA与乙酸及盐酸对稳定期铜绿微囊藻FACHB-315的光密度变化与抑制率对比情况示意图。

图6为实施例3中FA与乙酸及盐酸对稳定期铜绿微囊藻FACHB-315的叶绿素a含量对比情况示意图。

图7为实施例3中FA与乙酸及盐酸对稳定期铜绿微囊藻FACHB-315的叶绿素荧光动力学参数对比情况示意图。

图8为实施例4在40mg/L的FA作用下不同初始光密度的铜绿微囊藻FACHB-315生长过程中光密度变化与抑制率情况示意图。

图9为实施例4在40mg/L的FA作用下不同初始光密度的铜绿微囊藻FACHB-315生长过程中叶绿素a变化情况示意图。

图10为实施例5中FA对稳定期小颤藻FACHB-1052在生长过程中光密度变化与抑制率情况示意图。

图11为实施例5中FA对稳定期小颤藻FACHB-1052在生长过程中叶绿素a含量随时间变化的曲线图。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。

(1)以下实施例涉及的材料

所用藻种铜绿微囊藻FACHB-315和小颤藻FACHB-1052由中国科学院水生生物研究所藻种库提供，采用BG11培养基培养，BG11的主要成分为：NaNO₃，1500mg/L；K₂HPO₄·3H₂O，40mg/L；Na₂CO₃，20mg/L；CaCl₂·2H₂O，36mg/L；MgSO₄·7H₂O，75mg/L；柠檬酸，6mg/L；柠檬酸铁胺，6mg/L；EDTA，1mg/L；H₃BO₃，2.86mg/L；MnCl₂·4H₂O，1.81mg/L；ZnSO₄·7H₂O，0.222mg/L；CuSO₄·5H₂O，0.079mg/L；Na₂MoO₄·2H₂O，0.39mg/L；Co(NO₃)₂·6H₂O，0.049mg/L；

实施示例中所用的富马酸(百灵威)的纯度为99％，乙酸及盐酸(南京化学试剂有限公司)为分析级。

(2)培养装置

铜绿微囊藻和小颤藻在光照培养箱(ZQLY-180GF)中培养，由上海知楚仪器有限公司提供，光照强度为2800Lx，温度为25±1℃，光暗比为12:12，每天定时摇动3次。

(3)检测方法

铜绿微囊藻和小颤藻的藻浓度用紫外分光光度计(岛津，UV2700)计数，以680nm处的藻液吸光度，即藻细胞的光密度作为浓度特征值，记作OD₆₈₀；

叶绿素a的测定参照《中华人民共和国国家环境保护标准》HJ897-2017中的方法进行一些改进，将收集的5mL藻液通过0.7μm的玻璃纤维滤膜，收集藻细胞于4℃冰箱冷冻过夜，加入4mL体积比为9：1的丙酮：水超声提取4小时后，在4500rmp转速下离心10分钟后，取上清液测定630nm、647nm、664nm和750nm处的吸光度；

取1mL藻液，暗适应15分钟后用水样调制叶绿素荧光仪(Water-PAM)测定叶绿素荧光动力学参数，分别是最大光能转化率Fv/Fm，光能利用效率α以及最大相对电子传递速率rETRmax。后两个参数反映在光合作用-辐射强度快速响应曲线中，本发明中曲线光强度分别设定为0、35、100、250、400、600、850和1000μmolphotonsm^-2s^-1，每个光强度照射时间为20s，通过对RLC进行拟合得到初始斜率α及最大光合速率rETRmax。

(4)数据处理

富马酸对藻细胞的抑制率(IR)公式为：

IR＝(1-N/N₀)×100％

其中IR是抑制率，N是加入抑制剂的实验组中的光密度值OD₆₈₀，N₀是空白对照组中的光密度值OD₆₈₀。

叶绿素a的计算公式为：

其中Chl-a的质量单位是μg/L，V₁是加入的提取液体积(mL),V是过滤的藻液体积(L)，A₆₆₄、A₆₄₇、A₆₃₀和A₇₅₀分别是提取上清液在664nm、647nm、630nm和750nm波长下的吸光度值。

最大光能转化率Fv/Fm计算公式为：

Fv/Fm＝ΔF/Fm＝(Fm-F₀)/Fm

其中，ΔF是暗适应后样品最大的荧光强度(Fm)与初始状态的荧光强度(F₀)的差值。

通过对RLC曲线进行拟合得到初始斜率α以及最大光合速率rETRmax，分别反映的是光能利用效率和最大相对电子传递速率。

实施例1

富马酸对稳定期铜绿微囊藻FACHB-315的抑制效果。

在无菌操作台中向已灭菌的250mL三角瓶中加入75mL的BG11培养基，投加等体积不同浓度的FA储备液(实验组)或BG11培养基(对照组)，并接入培养至稳定期的铜绿微囊藻FACHB-315，使得最终藻液的初始光密度OD₆₈₀为0.08且FA的投加量分别为0mg/L(对照组)，1mg/L，15mg/L，30mg/L和40mg/L，其中每个对照组和实验组设置3个平行样品，将藻液放入光照培养箱中培养，光照强度为2800Lx，温度为25±1℃，光暗比为12:12，每天定时摇动3次且随机更换一次摆放位置。在培养初期0d及培养过程中2d，4d，6d和8d时取样并测试其光密度OD₆₈₀，叶绿素a含量，以及叶绿素荧光动力学参数，共同结果评估FA对稳定期铜绿微囊藻的抑制效果。

图1为8d内(含8d)铜绿微囊藻FACHB-315的光密度及对应抑制率变化情况。由图可见，对照组的藻细胞密度随着实验时间的增长而不断增大，实验组的藻细胞密度较对照组出现下降，当FA浓度小于40mg/L时，它对铜绿微囊藻的抑制效果相对较弱。第0d没有明显影响，从第2d起，40mg/L的FA使得藻体持续性死亡，培养过程中抑制率从74.19％增长至90.51％，而15mg/L与30mg/L的FA表现出不同程度的抑制作用，但仍旧处于生长状态，1mg/L的FA在整个培养周期中与对照组基本无明显差异。

图2为上述对照组与实验组在培养周期内的叶绿素a含量变化，该结果与生长趋势基本一致，略有延迟效应，第0d及2d叶绿素a含量差异不显著，从第4d起，除1mg/L的FA实验组与对照组无明显差异外，其余实验组叶绿素a含量均明显下降。

图3为上述对照组与实验组在生长过程中光合系统电子传递相关参数的变化。与生长密度和叶绿素a含量不同的是，它们是最早表现出抑制效果的潜在参数。由图可见，在培养周期内，低于30mg/L的实验组参数较对照组基本无明显降低，而30mg/L与40mg/L在第0d就已经表现出显著的降低，在第2d抑制效果尤其明显，在后期培养中，30mg/L的FA实验组会逐渐恢复光利用效率，而40mg/L的FA实验组藻体持续性死亡，丧失光能利用率及电子传递能力。

实施例2

富马酸对对数期铜绿微囊藻FACHB-315的抑制效果。

操作步骤同实施例1，不同之处是接入的藻细胞为培养至对数期的铜绿微囊藻FACHB-315。

图4为8d内(含8d)铜绿微囊藻FACHB-315的光密度及对应抑制率变化情况。与稳定期藻种生长趋势基本一致，但15mg/L与30mg/L的FA实验组对对数期藻种的抑制率显著高于稳定期的接种藻。类似地，1mg/L的FA实验组仍然与对照组无明显差异，40mg/L的FA实验组显著地被抑制且持续性死亡。由此说明，相同浓度的FA对对数期接种藻种的抑制效果更好，即对数期铜绿微囊藻的耐受性较稳定期铜绿微囊藻差。

实施例3

不同小分子酸抑制剂对稳定期铜绿微囊藻FACHB-315的抑制效果。

在无菌操作台中向已灭菌的250mL三角瓶中加入75mL的BG11培养基，投加FA、乙酸、盐酸的储备液(实验组)或BG11培养基(对照组)，并接入培养至稳定期的铜绿微囊藻FACHB-315，使得最终藻液的初始光密度OD₆₈₀为0.08且抑制剂的投加量为40mg/L，值得说明的是投加盐酸后的体系pH等同于投加FA后的pH，其中每个对照组和实验组设置3个平行样品，将藻液放入光照培养箱中培养，光照强度为2800Lx，温度为25±1℃，光暗比为12:12，每天定时摇动3次且随机更换一次摆放位置。在培养初期0d及培养过程中2d，4d，6d和8d时取样并测试其光密度OD₆₈₀，叶绿素a含量，以及叶绿素荧光动力学参数，共同结果评估不同小分子酸抑制剂对铜绿微囊藻的抑制效果。

图5为不同抑制剂对铜绿微囊藻的对比抑制情况。由图可见，第2d时，三种抑制剂相比对照组均有一定程度的抑制，但是三者差异并不显著。从第4到8天时，三种不同类型的酸抑制剂表现出不同程度的抑制效果，FA抑制率显著高于盐酸与乙酸，其中乙酸的抑制率最低。

图6为不同抑制剂对铜绿微囊藻叶绿素a含量的影响情况，该结果与生长情况一致。三种抑制剂均可使铜绿微囊藻的叶绿素a含量下降，其中FA可完全长期抑制其生长，叶绿素a含量不仅相对对照组下降而且不会随时间的增加而增大，是三种抑制剂中最有效且能长期抑制铜绿微囊藻生长的抑制剂。

图7为上述三种抑制剂对铜绿微囊藻光合系统电子传递相关参数的对比变化。由图可见，三种抑制剂在第0d时藻细胞的光能转化率已经出现不同程度的抑制，其抑制能力的趋势与藻细胞光密度变化一致。FA实验组各光合系统参数在第2d骤降至0，完全失去光利用能力且不会恢复，而另外两种酸抑制剂在第2d藻细胞各指标骤降后又有恢复光利用的能力。说明虽然三种抑制剂均会破坏藻细胞光系统的光吸收与利用间的平衡，但是FA会使其完全失去平衡而无法恢复。

实施例4

富马酸对不同初始光密度的铜绿微囊藻FACHB-315的抑制效果。

在无菌操作台中向已灭菌的250mL三角瓶中加入75mL的BG11培养基，投加FA的储备液(实验组)或BG11培养基(对照组)，并接入培养至不同时期的铜绿微囊藻FACHB-315，使得最终藻液的初始光密度OD₆₈₀为0.05，0.10和0.17且FA的投加量为40mg/L，其中每个对照组和实验组设置3个平行样品，将藻液放入光照培养箱中培养，光照强度为2800Lx，温度为25±1℃，光暗比为12:12，每天定时摇动3次且随机更换一次摆放位置。在培养初期0d及培养过程中2d，4d，6d和8d时取样并测试其光密度OD₆₈₀，叶绿素a含量，共同结果评估FA对不同初始浓度铜绿微囊藻的抑制效果。

图8为不同初始光密度铜绿微囊藻在40mg/L的FA处理下对其生长密度及抑制率对比情况。由图可见，随着初始光密度的增加，FA对铜绿微囊藻的抑制能力逐渐减弱。藻的初始光密度值从0.05到0.10在FA的作用下表现出较好的抑制效果，而当初始光密度值增加至0.17时，FA对铜绿微囊藻只是较小程度的抑制，在生长周期内仍呈生长状态。

图9为FA对不同初始光密度铜绿微囊藻在生长周期内叶绿素a含量的影响情况，该结果与藻密度生长情况基本一致，说明FA对铜绿微囊藻有显著的长期抑制作用需要藻密度不高于3.71×10⁶cells/mL，即初始光密度值OD₆₈₀不高于0.10。

实施例5

富马酸对稳定期小颤藻FACHB-1052的抑制效果。

在无菌操作台中向已灭菌的250mL三角瓶中加入75mL的BG11培养基，投加等体积不同浓度的FA储备液(实验组)或BG11培养基(对照组)，并接入培养至稳定期的小颤藻FACHB-1052，使得最终藻液的初始光密度OD₆₈₀为0.10且FA的投加量分别为0mg/L(对照组)，1mg/L，15mg/L，30mg/L和40mg/L，其中每个对照组和实验组设置3个平行样品，将藻液放入光照培养箱中培养，光照强度为2800Lx，温度为25±1℃，光暗比为12:12，每天定时摇动3次且随机更换一次摆放位置。在培养初期0d及培养过程中2d，4d，6d和8d时取样并测试其光密度OD₆₈₀，叶绿素a含量，共同结果评估FA对小颤藻的抑制效果。

图10为8d内(含8d)小颤藻FACHB-1052的光密度及对应抑制率变化情况。由图可见，对照组的藻细胞密度随着实验时间的增长而不断增大，实验组的藻细胞密度较对照组出现下降，FA的浓度从1到30mg/L时，它对小颤藻的抑制效果并不显著。当FA浓度等于40mg/L时，藻密度在培养周期内逐渐减小且抑制率较高，从第2d起，40mg/L的FA实验组就表现出显著的抑制效果，使得藻体持续性死亡。

图11为上述对照组与实验组在培养周期内的叶绿素a含量变化，该结果与生长趋势一致。总体看来，40mg/L的FA实验组对两种蓝藻均有显著的抑制作用，说明FA是一种有效的抑制蓝藻生长的抑制剂，而低于40mg/L的FA实验组对两种藻的抑制效果略有不同，又体现了藻种之间的差异性。

本发明提供了一种富马酸在抑制蓝藻生长中的应用的思路及方法，具体实现该技术方案的方法和途径很多，以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。本实施例中未明确的各组成部分均可用现有技术加以实现。

Claims (6)

1.一种抑藻剂，其特征在于，其活性成分包含有富马酸。

2.富马酸在抑制蓝藻生长中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述蓝藻包括铜绿微囊藻和/或小颤藻。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述蓝藻在水体中的藻密度范围不高于3.71×10⁶cells/mL。

5.根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于，向藻体水域中投加富马酸，以控制水域中蓝藻的生长。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述富马酸的投加量不低于40mg/L。

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