CN112999361A - 基于选择素靶向的CuET@Fuc纳米递药系统、制备方法及其在抗肿瘤药物中的应用 - Google Patents

基于选择素靶向的CuET@Fuc纳米递药系统、制备方法及其在抗肿瘤药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种基于选择素靶向的CuET@Fuc纳米递药系统，包括以双硫仑铜络合物纳米晶体为核心，在双硫仑铜络合物纳米晶体外包被聚烯丙胺盐酸盐，形成CuET@PAH；岩藻多糖吸附在CuET@PAH的表面，构成靶向选择素的生物功能性层，由此形成岩藻多糖包被CuET@PAH的纳米颗粒CuET@Fuc。本发明还提供了一种基于选择素靶向的CuET@Fuc纳米递药系统的制备方法及其在抗肿瘤药物中的应用。本发明的纳米递药系统利用内核双硫仑铜络合物的抗肿瘤效果，结合修饰在其上的对P‑选择素具有靶向作用的岩藻多糖外壳，增强双硫仑铜纳米晶体在肿瘤部位的蓄积，极大地增强了肿瘤的治疗效果。

Description

基于选择素靶向的CuET@Fuc纳米递药系统、制备方法及其在 抗肿瘤药物中的应用
技术领域
本发明涉及抗癌药物递送系统术领域，具体而言涉及一种基于选择素靶向的CuET@Fuc纳米递药系统、制备方法及其在抗肿瘤药物中的应用。
背景技术
相比于传统化疗药物，双硫仑对机体几乎无毒，其在抗肿瘤过程中，主要利用肿瘤部位高铜离子表达的特性，与铜离子络合产生的配位化合物，从而在肿瘤部位定点的生成双硫仑抗肿瘤活性成分——双硫仑铜络合物。该化合物具有蛋白酶体抑制能力和诱导凋亡双重活性，从而达到抗肿瘤的效果。
现有技术公开了通过聚合物大分子或生物亲和性分子包载的双硫仑药物纳米递药系统，这种纳米递药系统虽然具有较强的抗瘤活性，且安全性高，但其借助大量敷料包裹纳米递药系统，药物的载药量不容乐观，通常只有10％左右，不能实现高载药递送。同时双硫仑发挥作用的活性成分需要将双硫仑递送至肿瘤部位与铜离子络合才能形成，由于机体中内皮网状系统的存在会使得大量纳米粒子在血液中被清除，能递送到肿瘤部位的双硫仑几乎很少，导致了有效成分含量较低。因此，为了产生很强的药效，需要进行大剂量的给药，而聚合物载体降解性较低，生物相容性差，因而实际应用中受限；该种递药系统也通常不具有靶向性，影响药物的递送效率以及治疗效果，进一步限制了其在实际中的应用。
公布号为CN110721318A的中国专利文献公开了一种双硫仑纳米颗粒，纳米颗粒由双硫仑、纳米金属氧化物和丝素蛋白组成，该纳米颗粒的载药量高，稳定性高，在交底计量下即能有效抑制肿瘤细胞增殖。但由于其递送的主要抗肿瘤药物是双硫仑和金属氧化物，递送至肿瘤后，即使利用肿瘤内弱酸环境可以将金属氧化物慢慢反应释放金属离子与溶解的双硫仑络合产生双硫仑铜络合物，但由于双硫仑本身不溶于水，靠其在肿瘤部位溶解的微量剂量，产生络合物的数量以及效率会比较低；此外该方法采用的是以丝素蛋白为载体的纳米载药技术，将双硫仑和金属氧化物作为药物装载在丝素蛋白载体中，虽然利用丝素蛋白的特点能增加纳米粒的包封率，但仍然存在载药量低的问题，同时该纳米体系没有主动靶向的靶头，只能依靠全身血液循环以及EPR效应来实现被动靶向，这样达到肿瘤部位的纳米粒相对来说可能会更低，需要大量给药。
发明内容
本发明的第一方面目的在于提供一种基于选择素靶向的CuET@Fuc纳米递药系统，以双硫仑铜络合物纳米晶体为核心，在双硫仑铜络合物纳米晶体外包被聚烯丙胺盐酸盐，形成CuET@PAH；岩藻多糖吸附在CuET@PAH的表面，构成靶向选择素的生物功能性层，由此形成岩藻多糖包被CuET@PAH的纳米颗粒CuET@Fuc。
如此，利用内核双硫仑铜络合物的抗肿瘤效果，结合修饰在其上的对P-选择素具有靶向作用的岩藻多糖外壳，增强双硫仑铜纳米晶体在肿瘤部位的蓄积，极大地增强了肿瘤的治疗效果。
在优选的实施例中，所述双硫仑铜络合物纳米晶体的平均粒径为150～300nm，电位为-15mV～-19mV。
在优选的实施例中，所述CuET@PAH的平均粒径为150～300nm，电位为+30mV～+38mV。
在优选的实施例中，所述纳米颗粒CuET@Fuc的平均粒径为150～300nm，电位为-15mV～-25mV。
根据本发明的第二方面的目的，还提出一种前述基于选择素靶向的CuET@Fuc纳米递药系统在抗肿瘤药物中的应用。
根据本发明的第三方面的目的，还提出一种基于选择素靶向的CuET@Fuc纳米递药系统的制备方法，先通过反溶剂法制备双硫仑铜纳米晶体，再通过静电吸附的方式在双硫仑铜纳米晶体表面修饰岩藻多糖，再通过离心收集的方式而成。
具体包括以下步骤：
S1、将双硫仑铜络合物溶解在有机溶剂中，配置双硫仑铜络合物的有机溶液；
S2、取步骤S1得到的双硫仑铜络合物的有机溶液，并将其快速加入到装有纯水的三颈烧瓶中进行搅拌并同时开启超声，搅拌结束后，收集双硫仑铜络合物纳米晶体CuETNCs；
S3、将聚烯丙胺盐酸盐和岩藻多糖分别溶于水中，配置聚烯丙胺盐酸盐水溶液和岩藻多糖水溶液；
S4、将步骤S2中得到的CuET NCs置于超声中，逐滴加入步骤S3中的聚烯丙胺盐酸盐水溶液，得到第一混悬液，并继续超声，之后将装有第一混悬液的容器转移至磁力搅拌器上均匀搅拌至反应结束，均匀搅拌至反应结束，反应结束后进行离心，收集聚烯丙胺盐酸盐包被的CuET NCs，得到CuET@PAH；
S5、将步骤S4中得到的CuET@PAH置于超声中，逐滴加入步骤S3中的岩藻多糖水溶液，得到第二混悬液，并继续超声，之后将装有第二混悬液的容器转移至磁力搅拌器上均匀搅拌至反应结束，反应结束后进行离心，收集岩藻多糖包被的CuET@PAH，得到CuET@Fuc。
在优选的实施例了中，步骤S1中，所述双硫仑铜络合物为双硫仑和二价铜离子的络合物；
所述有机溶剂为甲醇、乙醇、丙酮、乙腈以及异丙醇中的任一种；
所述双硫仑铜络合物的有机溶液浓度为0.5～2mg/mL。
在优选的实施例中，步骤S2中，有机溶液和纯水的体积比为1:10～1:100，搅拌速度为500rpm～25000rpm，超声频率为20～40kHz，功率为150～300W。
在优选的实施例中，步骤S3中，聚烯丙胺盐酸盐的浓度为1～40mg/mL，岩藻多糖的浓度为1～40mg/mL。
在优选的实施例中，步骤S4中，超声频率为20～40kHz，功率为150～300W，聚烯丙胺盐酸盐溶液加入速度为0.1～10mL/min，搅拌时间为1～12h。
在优选的实施例中，步骤S5中，超声频率为20～40kHz，功率为150～300W，岩藻多糖溶液加入速度为0.1～10mL/min，搅拌时间为1～12h。
与现有技术相比，本发明的显著有益效果在于：
1、本发明的纳米递药系统，直接以双硫仑铜络合物纳米晶体为内核，通过聚丙烯盐酸盐的修饰使其带有正电荷，从而通过静电吸附的方式，在聚丙烯盐酸盐包被的双硫仑铜络合物纳米晶体表面吸附包被岩藻多糖，从而构成所需的纳米递药系统，即纳米颗粒CuET@Fuc。
双硫仑铜络合物纳米晶体可直接产生作用，阻断NF-κB通路，抑制NF-κB表达，通过细胞毒性机质，诱导肿瘤细胞凋亡，同时抑制肿瘤细胞的生存、增殖和转移；避免了在给药过程中需要双硫仑与铜离子进行络合带来的有效成分含量低的问题；同时，其表面的岩藻多糖外壳对P-选择素具有纳摩尔亲和性，在体内能准确的靶向到P-选择素表达的血管附近，因此，使纳米颗粒CuET@Fuc可主动靶向肿瘤附近血管腔内的P-选择素，实现纳米颗粒的靶向递送，且岩藻多糖外壳具有较大的分子量，可以实现对晶体进行保护，避免纳米晶体在血液中被快速清除，通过岩藻多糖外壳主动靶向和对内核的保护，将纳米颗粒CuET@Fuc准确快速有效的递送至肿瘤处，解决了双硫仑铜络合物纳米晶体递药难的问题，且准确的递送以及有效成分的直接作用使得本发明的递药系统具有高效性，不需要大量给药即可以达到很好的疗效。
2、本发明的双硫仑铜络合物纳米晶体的粒径均在150nm～300nm之间，粒径较小，粒子之间比表面积得到显著性的增大，使得晶体在水中具有良好的分散性，且纳米晶体由于小尺寸带来的比表面积的增加，导致溶解速度的增加，又极大的提高了双硫仑铜络合物在水中的溶解度。本发明的双硫仑铜络合物在水中浓度至1～2mg/mL时，依然可以保持良好的分散性，其稀释液依旧具有明显的纳米乳光，表明其具有较好的溶解性及分散性。
3、本发明通过反溶剂法制备双硫仑铜纳米晶体，通过静电吸附的方式在双硫仑铜纳米晶体表面修饰岩藻多糖，再通过离心收集的方式而成，制备简单，易于操作，便于进一步工业化生产；且该给药体系是以晶体为核心，在晶体外面修饰了岩藻多糖而不是将药物包载在岩藻多糖纳米粒中，从而使得制备出的纳米晶体颗粒CuET@Fuc具有高负载量和靶向作用，载药量可达69.0％，药效更好；本发明的CuET@Fuc对多种肿瘤24小时的IC50值均低于400ng/m，且可显著提高肿瘤部位晶体的蓄积量，在24小时和48小时内增加倍数在5倍～13倍之间。
应当理解，前述构思以及在下面更加详细地描述的额外构思的所有组合只要在这样的构思不相互矛盾的情况下都可以被视为本公开的发明主题的一部分。另外，所要求保护的主题的所有组合都被视为本公开的发明主题的一部分。
结合附图从下面的描述中可以更加全面地理解本发明教导的前述和其他方面、实施例和特征。本发明的其他附加方面例如示例性实施方式的特征和/或有益效果将在下面的描述中显见，或通过根据本发明教导的具体实施方式的实践中得知。
附图说明
图1a是实施例1制备的包被过程中CuET NCs，CuET@PAH，CuET@Fuc的粒径表征图。
图1b是实施例1制备的包被过程中CuET NCs，CuET@PAH，CuET@Fuc的电位表征图。
图2是实施例1制备的CuET NCs和CuET@Fuc的XRD散射图。
图3是实施例1制备的CuET NCs对多种肿瘤细胞的24小时细胞毒性的IC50值比较图。
图4是实施例1制备的CuET NCs和CuET@Fuc在体血药浓度时间曲线图。
图5是实施例1制备的CuET NCs和CuET@Fuc在荷瘤小鼠组织分布实验的药物浓度图。
图6是实施例1制备的CuET@Fuc和其他处理组经尾静脉注射入黑色素瘤荷瘤鼠后的治疗情况。
具体实施方式
为了更了解本发明的技术内容，特举具体实施例并配合所附图式说明如下。
在本公开中参照附图来描述本发明的各方面，附图中示出了许多说明的实施例。本公开的实施例不必定意在包括本发明的所有方面。应当理解，上面介绍的多种构思和实施例，以及下面更加详细地描述的那些构思和实施方式可以以很多方式中任意一种来实施。
根据本发明的示例性实施例的基于选择素靶向的CuET@Fuc纳米递药系统，在制备过程中，首先通过反溶剂法制备双硫仑铜纳米晶体，再通过静电吸附的方式在双硫仑铜纳米晶体表面修饰岩藻多糖，再通过离心收集，即可得到选择素靶向的岩藻多糖包被双硫仑铜络合物纳米晶体CuET@Fuc。
所得的纳米颗粒CuET@Fuc，利用内核双硫仑铜络合物对肿瘤细胞的高毒性，结合修饰在其上的对P-选择素具有靶向作用的岩藻多糖外壳，增强双硫仑铜纳米晶体在肿瘤部位的蓄积，极大地增强了肿瘤的治疗效果。
作为示例性制备得到的基于选择素靶向的CuET@Fuc纳米递药系统，包括以双硫仑铜络合物纳米晶体为核心，在双硫仑铜络合物纳米晶体外包被聚烯丙胺盐酸盐，形成CuET@PAH；岩藻多糖吸附在CuET@PAH的表面，构成靶向选择素的生物功能性层，由此形成岩藻多糖包被CuET@PAH的纳米颗粒CuET@Fuc。本发明示例的纳米颗粒CuET@Fuc的平均粒径为150～300nm，电位为-15mV～-25mV。
在优选的实施例中，所述双硫仑铜络合物纳米晶体的平均粒径为150～300nm，电位为-15mV～-19mV。
在优选的实施例中，所述CuET@PAH的平均粒径为150～300nm，电位为+30mV～+38mV。
作为本发明实施例性实施，前述制备的具体实施过程包括：
S1、将双硫仑铜络合物溶解在有机溶剂中，配置双硫仑铜络合物的有机溶液。
S2、取步骤S1得到的双硫仑铜络合物的有机溶液，并将其快速加入到装有纯水的三颈烧瓶中进行搅拌并同时开启超声，搅拌结束后，收集双硫仑铜络合物纳米晶体CuETNCs。
S3、将聚烯丙胺盐酸盐和岩藻多糖分别溶于水中，配置聚烯丙胺盐酸盐水溶液和岩藻多糖水溶液。
S4、将步骤S2中得到的CuET NCs置于超声中，逐滴加入步骤S3中的聚烯丙胺盐酸盐水溶液，得到第一混悬液，并继续超声，之后将装有第一混悬液的容器转移至磁力搅拌器上均匀搅拌至反应结束，均匀搅拌至反应结束，反应结束后进行离心，收集聚烯丙胺盐酸盐包被的CuET NCs，得到CuET@PAH。
S5、将步骤S4中得到的CuET@PAH置于超声中，逐滴加入步骤S3中的岩藻多糖水溶液，得到第二混悬液，并继续超声，之后将装有第二混悬液的容器转移至磁力搅拌器上均匀搅拌至反应结束，反应结束后进行离心，收集岩藻多糖包被的CuET@PAH，得到CuET@Fuc。
在优选的实施例了中，步骤S1中，所述双硫仑铜络合物为双硫仑和二价铜离子的络合物。
所述有机溶剂为甲醇、乙醇、丙酮、乙腈以及异丙醇中的任一种，有机溶剂包括但不限于上述溶剂，应当理解为，只需要将双硫仑铜络合物溶解即可。
所述双硫仑铜络合物的有机溶液浓度为0.5～2mg/mL。
在优选的实施例中，步骤S2中，有机溶液和纯水的体积比为1:10～1:100，搅拌速度为500rpm～25000rpm，超声频率为20～40kHz，功率为150～300W。
在优选的实施例中，步骤S3中，聚烯丙胺盐酸盐的浓度为1～40mg/mL，岩藻多糖的浓度为1～40mg/mL。
在优选的实施例中，步骤S4中，超声频率为20～40kHz，功率为150～300W，聚烯丙胺盐酸盐溶液加入速度为0.1～10mL/min，搅拌时间为1～12h。
在优选的实施例中，步骤S5中，超声频率为20～40kHz，功率为150～300W，岩藻多糖溶液加入速度为0.1～10mL/min，搅拌时间为1～12h。
为了便于更好的理解，下面结合几个具体实例对本发明进行进一步说明，但制备工艺不限于此，且本发明内容不限于此。
【实施例1】
S1、将30mg双硫仑铜络合物溶解在20mL乙腈中，配置1.5mg/mL双硫仑铜络合物的乙腈溶液。
S2、取双硫仑铜络合物的乙腈溶液2mL，在搅拌中快速加入到装有50mL纯水的三颈烧瓶中，在40Hz，120W的超声条件下并以2500rpm的速度搅拌，超声搅拌结束后，收集双硫仑铜络合物纳米晶体(CuET NCs)。
S3、将20mg聚烯丙胺盐酸盐溶于4mL水中，配置5mg/mL的烯丙胺盐酸盐溶液，将20mg岩藻多糖溶于4mL水中水溶液，配置5mg/mL的岩藻多糖溶液。
S4、将S2中的纳米晶体收集并置于32Hz，300W的超声中，以3mL/min的速度逐滴加入S3中的聚烯丙胺盐酸盐水溶液，之后置于磁力搅拌器中匀速搅拌3h，反应结束后离心收集包被后的纳米晶体，得到聚烯丙胺盐酸盐包被的双硫仑铜络合物纳米晶体(CuET@PAH)。
S5、将S4中的CuET@PAH收集并置于32Hz，300W的超声中，以3mL/min的速度逐滴加入S3中的岩藻多糖水溶液，之后置于磁力搅拌器中匀速搅拌3h，反应结束后离心收集包被后的纳米晶体，得到岩藻多糖包被的CuET@PAH(CuET@Fuc)。
【实施例2】
S1、将10mg双硫仑铜络合物溶解在20mL乙腈中，配置0.5mg/mL双硫仑铜络合物的乙腈溶液。
S2、取双硫仑铜络合物的乙腈溶液2mL，在搅拌中快速加入到装有20mL纯水的三颈烧瓶中，在40Hz，120W的超声条件下并以500rpm的速度搅拌，超声搅拌结束后，收集双硫仑铜络合物纳米晶体(CuET NCs)。
S3、将20mg聚烯丙胺盐酸盐溶于20mL水中，配置1mg/mL的烯丙胺盐酸盐溶液，将20mg岩藻多糖溶于20mL水中水溶液，配置1mg/mL的岩藻多糖溶液。
S4、将S2中的纳米晶体收集并置于32Hz，300W的超声中，以0.1mL/min的速度逐滴加入S3中的聚烯丙胺盐酸盐水溶液，之后置于磁力搅拌器中匀速搅拌1h，反应结束后离心收集包被后的纳米晶体，得到聚烯丙胺盐酸盐包被的双硫仑铜络合物纳米晶体(CuET@PAH)。
S5、将S4中的CuET@PAH收集并置于32Hz，300W的超声中，以0.1mL/min的速度逐滴加入S3中的岩藻多糖水溶液，之后置于磁力搅拌器中匀速搅拌1h，反应结束后离心收集包被后的纳米晶体，得到岩藻多糖包被的CuET@PAH(CuET@Fuc)。
【实施例3】
S1、将10mg双硫仑铜络合物溶解在10mL乙醇中，配置1mg/mL双硫仑铜络合物的乙醇溶液。
S2、取双硫仑铜络合物的乙醇溶液2mL，在搅拌中快速加入到装有80mL纯水的三颈烧瓶中，在40Hz，120W的超声条件下并以1000rpm的速度搅拌，超声搅拌结束后，收集双硫仑铜络合物纳米晶体(CuET NCs)。
S3、将20mg聚烯丙胺盐酸盐溶于2mL水中，配置10mg/mL的烯丙胺盐酸盐溶液，将20mg岩藻多糖溶于2mL水中水溶液，配置10mg/mL的岩藻多糖溶液。
S4、将S2中的纳米晶体收集并置于32Hz，300W的超声中，以0.8mL/min的速度逐滴加入S3中的聚烯丙胺盐酸盐水溶液，之后置于磁力搅拌器中匀速搅拌5h，反应结束后离心收集包被后的纳米晶体，得到聚烯丙胺盐酸盐包被的双硫仑铜络合物纳米晶体(CuET@PAH)。
S5、将S4中的CuET@PAH收集并置于32Hz，300W的超声中，以0.8mL/min的速度逐滴加入S3中的岩藻多糖水溶液，之后置于磁力搅拌器中匀速搅拌5h，反应结束后离心收集包被后的纳米晶体，得到岩藻多糖包被的CuET@PAH(CuET@Fuc)。
【实施例4】
S1、将20mg双硫仑铜络合物溶解在10mL丙酮中，配置2mg/mL双硫仑铜络合物的丙酮溶液。
S2、取双硫仑铜络合物的丙酮溶液2mL，在搅拌中快速加入到装有120mL纯水的三颈烧瓶中，在40Hz，120W的超声条件下并以4000rpm的速度搅拌，超声搅拌结束后，收集双硫仑铜络合物纳米晶体(CuET NCs)。
S3、将60mg聚烯丙胺盐酸盐溶于3mL水中，配置20mg/mL的烯丙胺盐酸盐溶液，将60mg岩藻多糖溶于3mL水中水溶液，配置20mg/mL的岩藻多糖溶液。
S4、将S2中的纳米晶体收集并置于32Hz，300W的超声中，以1.5mL/min的速度逐滴加入S3中的聚烯丙胺盐酸盐水溶液，之后置于磁力搅拌器中匀速搅拌5h，反应结束后离心收集包被后的纳米晶体，得到聚烯丙胺盐酸盐包被的双硫仑铜络合物纳米晶体(CuET@PAH)。
S5、将S4中的CuET@PAH收集并置于32Hz，300W的超声中，以1.5mL/min的速度逐滴加入S3中的岩藻多糖水溶液，之后置于磁力搅拌器中匀速搅拌5h，反应结束后离心收集包被后的纳米晶体，得到岩藻多糖包被的CuET@PAH(CuET@Fuc)。
【实施例5】
S1、将36mg双硫仑铜络合物溶解在20mL异丙醇腈中，配置1.8mg/mL双硫仑铜络合物的异丙醇溶液。
S2、取双硫仑铜络合物的异丙醇溶液2mL，在搅拌中快速加入到装有160mL纯水的三颈烧瓶中，在40Hz，120W的超声条件下并以10000rpm的速度搅拌，超声搅拌结束后，收集双硫仑铜络合物纳米晶体(CuET NCs)。
S3、将60mg聚烯丙胺盐酸盐溶于2.1mL水中，配置29mg/mL的烯丙胺盐酸盐溶液，将60mg岩藻多糖溶于2.1mL水中水溶液，配置29mg/mL的岩藻多糖溶液。
S4、将S2中的纳米晶体收集并置于32Hz，300W的超声中，以6mL/min的速度逐滴加入S3中的聚烯丙胺盐酸盐水溶液，之后置于磁力搅拌器中匀速搅拌8h，反应结束后离心收集包被后的纳米晶体，得到聚烯丙胺盐酸盐包被的双硫仑铜络合物纳米晶体(CuET@PAH)。
S5、将S4中的CuET@PAH收集并置于32Hz，300W的超声中，以6mL/min的速度逐滴加入S3中的岩藻多糖水溶液，之后置于磁力搅拌器中匀速搅拌8h，反应结束后离心收集包被后的纳米晶体，得到岩藻多糖包被的CuET@PAH(CuET@Fuc)。
【实施例6】
S1、将24mg双硫仑铜络合物溶解在20mL甲醇中，配置1.2mg/mL双硫仑铜络合物的甲醇溶液。
S2、取双硫仑铜络合物的甲醇溶液2mL，在搅拌中快速加入到装有200mL纯水的三颈烧瓶中，在40Hz，120W的超声条件下并以18000rpm的速度搅拌，超声搅拌结束后，收集双硫仑铜络合物纳米晶体(CuET NCs)。
S3、将100mg聚烯丙胺盐酸盐溶于2.5mL水中，配置40mg/mL的聚烯丙胺盐酸盐溶液，将100mg岩藻多糖溶于2.5mL水中水溶液，配置40mg/mL的岩藻多糖溶液。
S4、将S2中的纳米晶体收集并置于32Hz，300W的超声中，以8mL/min的速度逐滴加入S3中的聚烯丙胺盐酸盐水溶液，之后置于磁力搅拌器中匀速搅拌12h，反应结束后离心收集包被后的纳米晶体，得到聚烯丙胺盐酸盐包被的双硫仑铜络合物纳米晶体(CuET@PAH)。
S5、将S4中的CuET@PAH收集并置于32Hz，300W的超声中，以8mL/min的速度逐滴加入S3中的岩藻多糖水溶液，之后置于磁力搅拌器中匀速搅拌12h，反应结束后离心收集包被后的纳米晶体，得到岩藻多糖包被的CuET@PAH(CuET@Fuc)。
【实施例7】
S1、将30mg双硫仑铜络合物溶解在20mL乙腈中，配置1.5mg/mL双硫仑铜络合物的乙腈溶液。
S2、取双硫仑铜络合物的乙腈溶液2mL，在搅拌中快速加入到装有50mL纯水的三颈烧瓶中，在40Hz，120W的超声条件下并以25000rpm的速度搅拌，超声搅拌结束后，收集双硫仑铜络合物纳米晶体(CuET NCs)。
S3、将20mg聚烯丙胺盐酸盐溶于4mL水中，配置5mg/mL的烯丙胺盐酸盐溶液，将20mg岩藻多糖溶于4mL水中水溶液，配置5mg/mL的岩藻多糖溶液。
S4、将S2中的纳米晶体收集并置于32Hz，300W的超声中，以10mL/min的速度逐滴加入S3中的聚烯丙胺盐酸盐水溶液，之后置于磁力搅拌器中匀速搅拌12h，反应结束后离心收集包被后的纳米晶体，得到聚烯丙胺盐酸盐包被的双硫仑铜络合物纳米晶体(CuET@PAH)。
S5、将S4中的CuET@PAH收集并置于32Hz，300W的超声中，以10mL/min的速度逐滴加入S3中的岩藻多糖水溶液，之后置于磁力搅拌器中匀速搅拌12h，反应结束后离心收集包被后的纳米晶体，得到岩藻多糖包被的CuET@PAH(CuET@Fuc)。
【对比例1】
S1、将20mg双硫仑铜络合物溶解在30mL乙腈中，配置1.5mg/mL双硫仑铜络合物的乙腈溶液。
S2、取双硫仑铜络合物的乙腈溶液2mL，在搅拌中快速加入到装有16mL纯水的三颈烧瓶中，在40Hz，120W的超声条件下并以2500rpm的速度搅拌，超声搅拌结束后，收集双硫仑铜络合物纳米晶体(CuET NCs)。
【对比例2】
S1、将20mg双硫仑铜络合物溶解在30mL乙腈中，配置1.5mg/mL双硫仑铜络合物的乙腈溶液。
S2、取双硫仑铜络合物的乙腈溶液2mL，在搅拌中快速加入到装有240mL纯水的三颈烧瓶中，在40Hz，120W的超声条件下并以2500rpm的速度搅拌，超声搅拌结束后，收集双硫仑铜络合物纳米晶体(CuET NCs)。
【对比例3】
S1、将20mg双硫仑铜络合物溶解在30mL乙腈中，配置1.5mg/mL双硫仑铜络合物的乙腈溶液。
S2、取双硫仑铜络合物的乙腈溶液2mL，在搅拌中快速加入到装有50mL纯水的三颈烧瓶中，在40Hz，120W的超声条件下并以2500rpm的速度搅拌，超声搅拌结束后，收集双硫仑铜络合物纳米晶体(CuET NCs)。
S3、将180mg聚烯丙胺盐酸盐溶于4mL水中，配置45mg/mL的烯丙胺盐酸盐溶液。
S4、将S2中的纳米晶体收集并置于32Hz，300W的超声中，以3mL/min的速度逐滴加入S3中的聚烯丙胺盐酸盐水溶液，之后置于磁力搅拌器中匀速搅拌3h，反应结束后离心收集包被后的纳米晶体，得到聚烯丙胺盐酸盐包被的双硫仑铜络合物纳米晶体(CuET@PAH)。
【对比例4】
S1、将20mg双硫仑铜络合物溶解在30mL乙腈中，配置1.5mg/mL双硫仑铜络合物的乙腈溶液。
S2、取双硫仑铜络合物的乙腈溶液2mL，在搅拌中快速加入到装有50mL纯水的三颈烧瓶中，在40Hz，120W的超声条件下并以2500rpm的速度搅拌，超声搅拌结束后，收集双硫仑铜络合物纳米晶体(CuET NCs)。
S3、将2mg聚烯丙胺盐酸盐溶于4mL水中，配置0.5mg/mL的烯丙胺盐酸盐溶液。
S4、将S2中的纳米晶体收集并置于32Hz，300W的超声中，以3mL/min的速度逐滴加入S3中的聚烯丙胺盐酸盐水溶液，之后置于磁力搅拌器中匀速搅拌3h，反应结束后离心收集包被后的纳米晶体，得到聚烯丙胺盐酸盐包被的双硫仑铜络合物纳米晶体(CuET@PAH)。
【对比例5】
S1、将20mg双硫仑铜络合物溶解在30mL乙腈中，配置1.5mg/mL双硫仑铜络合物的乙腈溶液。
S2、取双硫仑铜络合物的乙腈溶液2mL，在搅拌中快速加入到装有50mL纯水的三颈烧瓶中，在40Hz，120W的超声条件下并以2500rpm的速度搅拌，超声搅拌结束后，收集双硫仑铜络合物纳米晶体(CuET NCs)。
S3、将20mg聚烯丙胺盐酸盐溶于4mL水中，配置45mg/mL的烯丙胺盐酸盐溶液，将200mg岩藻多糖溶于4mL水中水溶液，配置50mg/mL的岩藻多糖溶液。
S4、将S2中的纳米晶体收集并置于32Hz，300W的超声中，以3mL/min的速度逐滴加入S3中的聚烯丙胺盐酸盐水溶液，之后置于磁力搅拌器中匀速搅拌3h，反应结束后离心收集包被后的纳米晶体，得到聚烯丙胺盐酸盐包被的双硫仑铜络合物纳米晶体(CuET@PAH)。
S5、将S4中的CuET@PAH收集并置于32Hz，300W的超声中，以3mL/min的速度逐滴加入S3中的岩藻多糖水溶液，之后置于磁力搅拌器中匀速搅拌3h，反应结束后离心收集包被后的纳米晶体，得到岩藻多糖包被的CuET@PAH(CuET@Fuc)。
【对比例6】
S1、将20mg双硫仑铜络合物溶解在30mL乙腈中，配置1.5mg/mL双硫仑铜络合物的乙腈溶液。
S2、取双硫仑铜络合物的乙腈溶液2mL，在搅拌中快速加入到装有50mL纯水的三颈烧瓶中，在40Hz，120W的超声条件下并以2500rpm的速度搅拌，超声搅拌结束后，收集双硫仑铜络合物纳米晶体(CuET NCs)。
S3、将20mg聚烯丙胺盐酸盐溶于4mL水中，配置45mg/mL的烯丙胺盐酸盐溶液，将1mg岩藻多糖溶于4mL水中水溶液，配置0.25mg/mL的岩藻多糖溶液。
S4、将S2中的纳米晶体收集并置于32Hz，300W的超声中，以3mL/min的速度逐滴加入S3中的聚烯丙胺盐酸盐水溶液，之后置于磁力搅拌器中匀速搅拌3h，反应结束后离心收集包被后的纳米晶体，得到聚烯丙胺盐酸盐包被的双硫仑铜络合物纳米晶体(CuET@PAH)。
S5、将S4中的CuET@PAH收集并置于32Hz，300W的超声中，以3mL/min的速度逐滴加入S3中的岩藻多糖水溶液，之后置于磁力搅拌器中匀速搅拌3h，反应结束后离心收集包被后的纳米晶体，得到岩藻多糖包被的CuET@PAH(CuET@Fuc)。
对比例1～6改变参数如表1所示。
表1实施例1和对比例1～6的参数变化
名称 制备晶体名 有机相水相比例 PAH浓度(mg/mL) Fucoidan浓度(mg/mL)
实施例1 CuET@Fuc 1:25 5 5
对比例1 CuET NCs 1:8 / /
对比例2 CuET NCs 1:120 / /
对比例3 CuET@PAH 1:25 45 /
对比例4 CuET@PAH 1:25 0.5 /
对比例5 CuET@Fuc 1:25 5 50
对比例6 CuET@Fuc 1:25 5 0.25
表1中“/”表示上一步制备从粒径电位指标上看已不符合要求，下一步操作不再进行
【测试】
以下测试所用的样品皆为实施例1中制备得到的。
1、粒径和电位
将CuET NCs，CuET@PAH和CuET@Fuc分别用去离子水配置成浓度为300μg/mL的溶液，然后在37℃下测其粒径和电位。该给药体系最终需要通过静脉给药，因此粒径不能过大也不能过小，最好在50nm～300nm之间。其粒径结果图如图1a和1b所示，CuET NCs纳米晶体平均粒径为184.4±2.94，电位为-19.6±0.61mV；CuET@PAH平均粒径为185.5±4.36nm，电位为35.3±2.52mV；CuET@Fuc平均粒径为189.7±7.23nm，电位为-20.1±2.7mV；证明制得的纳米粒粒径比较均一，电位翻转显示包被成功。
分别对对比例1～6制备的样品进行粒径和电位测试，结果如表2所示。
表2对比例1～6的平均粒径和电位
名称 制备晶体名 平均粒径(nm) 平均电位(mV)
对比例1 CuET NCs 340.87±18.86 -18.3±2.3
对比例2 CuET NCs / /
对比例3 CuET@PAH 399.73±5.78 +35.8±1.7
对比例4 CuET@PAH 191.07±2.84 -5.73±0.8
对比例5 CuET@Fuc 415.30±55.25 -21.9±1.3
对比例6 CuET@Fuc 196.67±4.36 +22.3±2.7
由表2可知，在制备CuET NCs过程中，有机相和水相比例小于1:10时，晶体的平均粒径会超过300nm(对比例1平均粒径：340.87±18.86nm)；有机相和水相比例大于1:100时，晶体几乎收集不到(对比例2)。在制备CuET@PAH中间晶体和CuET@Fuc过程中，聚丙烯酸盐酸盐溶液或岩藻多糖溶液浓度超过40mg/mL时，晶体的平均粒径依旧超过300nm(对比例3平均粒径：399.73±5.78nm；对比例5平均粒径：415.30±55.25nm)；聚丙烯酸盐酸盐溶液或岩藻多糖溶液浓度低于1mg/mL时，虽然获得晶体粒径良好(对比例4平均粒径：191.07±2.84nm；对比例5平均粒径：196.67±4.36nm)，但根据电位并未反转现象判断，包被并未成功(对比例4平均电位：-5.73±0.8mV(包被成功应为正电荷)；对比例6平均电位：+22.3±2.7mV，(包被成功应为负电荷))。
2、XRD
将CuET NCs和CuET@Fuc纳米晶体用X射线衍射进行分析，结果如图2所示，CuETNCs和CuET@Fuc纳米晶体在对应CuET的衍射峰处峰形相似，出峰位置相同，显示包被前后并未改变双硫仑铜纳米晶体的理化结构，证明本发明中CuET@Fuc纳米晶体体系是通过静电吸附的物理方式结合，并没有改变CuET的药物结构，保证了CuET药物的有效性。
3、抗肿瘤活性
(1)采用MTT法，选择对数生长期的4T1鼠乳腺癌细胞，CT26鼠结肠癌细胞，B16F10鼠黑色素瘤细胞，Mcf-7人原位ER阳性乳腺癌细胞，MDA-MB-231人高转移性恶性乳腺癌细胞，HCT116人结肠癌细胞，Hepg2人肝癌细胞，A549人肺腺癌细胞，HOS人骨肉瘤细胞，调整细胞数为8000个/mL接种于96孔培养板，细胞贴壁生长24h，培养基为含10％胎牛血清，1％青霉素/链霉素的DMEM高糖培养基。
(2)弃去培养基，加入CuET NCs晶体，晶体浓度按照4000，2000，1000，500，250，150，75，37.25ng/mL分成八个给药组，同时设置空白对照。
(3)加过药的细胞在37℃，5％CO2的环境中孵育24h，每孔加入10μLMTT试剂，在细胞培养箱中孵育3h，吸出培养基，向每孔加入100μL的DMSO溶液，最后用酶标仪测定570nm处的吸光度。
(4)计算肿瘤生长抑制率(％)＝(1-实验组OD值/对照组OD值)×100％。将数据导入GraphPad prism 6.01。计算在此环境下CuET NCs对各组肿瘤细胞的IC50值。
(5)结果如图3所示，CuET NCs纳米晶体对多种肿瘤细胞均具有很强的杀伤作用，IC50值均处于一个较低的水平，显示出CuET NCs纳米晶体具有很强且广泛的抗肿瘤活性，对癌细胞具有较强的抑制作用。
4、CuET@Fuc在血液中的代谢
(1)取4～6周龄的C57BL/C雌鼠，构建小鼠皮下肿瘤模型，待肿瘤大小为60～100mm3时，随机将小鼠分为2组，每组3只：
①CuET NCs组；②CuET@Fuc组。
(2)通过尾静脉注射各组晶体药物，在给药后的5min，10min，30min，1h，2h，4h，10h，12h，24h，48h，72h用毛细管眼眶取血20μL。
(3)离心，取上清，用Nanodrop在433nm处测定血清中双硫仑铜络合物的浓度，并记录制作血药浓度时间曲线
结果如图4所示，根据72小时的血药浓度曲线，CuET NCs组在前4小时浓度下降急速，并在48小时时，血液中的药物浓度已低于仪器的最低检测限，而CuET@Fuc组的血药下降速度具有明显的延缓趋势，并在72小时依旧可以测出药量，可以证明通过岩藻多糖包被，CuET@Fuc能够显著的延缓晶体在血液中的代谢速度。
5、药物在肿瘤部位的蓄积
(1)取4～6周龄的C57BL/C雌鼠，构建小鼠皮下肿瘤模型，待肿瘤大小为60～100mm3时，随机将小鼠分为四组，每组3只：
①CuET NCs组(12h)②CuET@Fuc组(12h)③CuET NCs组(24h)④CuET@Fuc组(24h)。
(2)通过尾静脉注射各组晶体药物，在给药后的12h和24h处死小鼠，并立刻取出小鼠的心，肝，脾，肺，肾，脑和肿瘤，并各称取100mg的脏器(不足100mg的部位按照全部质量取用)放置于1.5mL离心管中。
(3)向各个离心管中加入0.2mL的生理盐水，用匀浆机将各部分组织匀浆处理。待匀浆结束后，向各个离心管中分别加入1mL乙腈，之后用涡旋仪混合1分钟后离心，取上清液，并将上清液烘至即将干燥的状态，再次加入0.2mL乙腈重悬，用高效液相色谱仪测定各个组织中的纳米晶体药量，结果如图5所示：
在给药12小时后，CuET NCs组和CuET@Fuc组在肿瘤中均有较高的药物蓄积，而在24h，CuET NCs组在肿瘤中的药物分布出现明显的降低，而CuET@Fuc组在肿瘤部位的分布依旧处于较高的水平，可以证明CuET@Fuc能够显著的增加药物在肿瘤部位的蓄积并能在一定时间内增强药物在肿瘤部位停留的时间。
6、肿瘤治疗能力
(1)取4～6周龄的C57BL/C雌鼠，构建小鼠皮下肿瘤模型，待肿瘤大小为60～100mm3时，随机将小鼠分为4组，每组8～10只：
①生理盐水组；②载体组(岩藻多糖和聚丙烯胺盐酸盐自组装的纳米粒)；③CuETNCs组④CuET@Fuc组。
(2)以开始给药的时间为第一天，分别在第1，2，4，5，7，8天分别在尾静脉注射对应药物到小鼠体内。
(3)在接下来的14天内，每天称量小鼠体重并用游标卡尺测量小鼠肿瘤的大小。并根据下式计算肿瘤体积：
V(体积)＝W(宽度)2×L(长度)/2。
结果如图6所示，③④治疗组的小鼠肿瘤的生长被抑制，④治疗组的治疗效果更为显著，再结合实施例4中的结果，可以证明本发明的蛋岩藻多糖包被的双硫仑铜纳米晶体可以通过显著的保留晶体在肿瘤部位的蓄积而大大增加晶体药物作用时间从而产生更高效的肿瘤治疗能力肿瘤治疗能力。
虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然其并非用以限定本发明。本发明所属技术领域中具有通常知识者，在不脱离本发明的精神和范围内，当可作各种的更动与润饰。因此，本发明的保护范围当视权利要求书所界定者为准。

Claims (11)

1.一种基于选择素靶向的CuET@Fuc纳米递药系统，其特征在于：以双硫仑铜络合物纳米晶体为核心，在双硫仑铜络合物纳米晶体外包被聚烯丙胺盐酸盐，形成CuET@PAH；岩藻多糖吸附在CuET@PAH的表面，构成靶向选择素的生物功能性层，由此形成岩藻多糖包被CuET@PAH的纳米颗粒CuET@Fuc。
2.根据权利要求1所述的基于选择素靶向的CuET@Fuc纳米递药系统，其特征在于：所述双硫仑铜络合物纳米晶体的平均粒径为150～300nm，电位为-15mV～-19mV。
3.根据权利要求1所述的基于选择素靶向的CuET@Fuc纳米递药系统，其特征在于：所述CuET@PAH的平均粒径为150～300nm，电位为+30mV～+38mV。
4.根据权利要求1所述的基于选择素靶向的CuET@Fuc纳米递药系统，其特征在于：所述纳米颗粒CuET@Fuc的平均粒径为150～300nm，电位为-15mV～-25mV。
5.一种根据权利要求1所述的基于选择素靶向的CuET@Fuc纳米递药系统在抗肿瘤药物中的应用。
6.一种权利要求1～4中任意一项所述的基于选择素靶向的CuET@Fuc纳米递药系统的制备方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
S1、将双硫仑铜络合物溶解在有机溶剂中，配置双硫仑铜络合物的有机溶液；
S2、取步骤S1得到的双硫仑铜络合物的有机溶液，并将其快速加入到装有纯水的三颈烧瓶中进行搅拌并同时开启超声，搅拌结束后，收集双硫仑铜络合物纳米晶体CuET NCs；
S3、将聚烯丙胺盐酸盐和岩藻多糖分别溶于水中，配置聚烯丙胺盐酸盐水溶液和岩藻多糖水溶液；
S4、将步骤S2中得到的CuET NCs置于超声中，逐滴加入步骤S3中的聚烯丙胺盐酸盐水溶液，得到第一混悬液，并继续超声，之后将装有第一混悬液的容器转移至磁力搅拌器上均匀搅拌至反应结束，均匀搅拌至反应结束，反应结束后进行离心，收集聚烯丙胺盐酸盐包被的CuET NCs，得到CuET@PAH；
S5、将步骤S4中得到的CuET@PAH置于超声中，逐滴加入步骤S3中的岩藻多糖水溶液，得到第二混悬液，并继续超声，之后将装有第二混悬液的容器转移至磁力搅拌器上均匀搅拌至反应结束，反应结束后进行离心，收集岩藻多糖包被的CuET@PAH，得到CuET@Fuc。
7.根据权利要求6所述的基于选择素靶向的CuET@Fuc纳米递药系统的制备方法，其特征在于：步骤S1中，所述双硫仑铜络合物为双硫仑和二价铜离子的络合物；
所述有机溶剂为甲醇、乙醇、丙酮、乙腈以及异丙醇中的任一种；
所述双硫仑铜络合物的有机溶液浓度为0.5～2mg/mL。
8.根据权利要求6所述的基于选择素靶向的CuET@Fuc纳米递药系统的制备方法，其特征在于：步骤S2中，有机溶液和纯水的体积比为1:10～1:100，搅拌速度为500rpm～25000rpm，超声频率为20～40kHz，功率为150～300W。
9.根据权利要求6所述的基于选择素靶向的CuET@Fuc纳米递药系统的制备方法，其特征在于：步骤S3中，聚烯丙胺盐酸盐的浓度为1～40mg/mL，岩藻多糖的浓度为1～40mg/mL。
10.根据权利要求6所述的基于选择素靶向的CuET@Fuc纳米递药系统的制备方法，其特征在于：步骤S4中，超声频率为20～40kHz，功率为150～300W，聚烯丙胺盐酸盐溶液加入速度为0.1～10mL/min，搅拌时间为1～12h。
11.根据权利要求6所述的基于选择素靶向的CuET@Fuc纳米递药系统的制备方法，其特征在于：步骤S5中，超声频率为20～40kHz，功率为150～300W，岩藻多糖溶液加入速度为0.1～10mL/min，搅拌时间为1～12h。
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BIAN JANG ET AL.: ""Fucoidan-coated CuS nanoparticles for chemo-and photothermal therapy against cancer"", 《ONCOTARGET》 *

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