CN112980816B - 一种β-半乳糖苷酶发酵培养基及其制备方法和应用 - Google Patents

一种β-半乳糖苷酶发酵培养基及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种β‑半乳糖苷酶发酵培养基及其制备方法和应用。本发明提供的乳酸菌培养基，其主要成分含有大豆乳清废水和糖蜜，营养丰富，适合培养微生物。本发明还提供该培养基的制备方法，及其在培养产β‑半乳糖苷酶菌株方面的应用，该培养基适用于多种乳酸菌的培养，并且可以获得更大的酶产量。本发明所述培养基配制简单、使用方便、成本低、适合工业化生产应用。

Description

一种β-半乳糖苷酶发酵培养基及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种β-半乳糖苷酶发酵培养基及其制备方法和应用。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
低聚半乳糖(Galactooligosaccharides)属于功能性低聚糖，其分子结构一般是在半乳糖或葡萄糖分子上连接1-7个半乳糖基，具有水溶性好、黏度低、耐酸耐热、口感清爽等特点。同时，低聚半乳糖还具有益生功能，作为人体肠道中双歧杆菌、嗜酸乳杆菌等益生菌的增殖因子，可以维持肠道菌群平衡，改善人体肠道的消化吸收功能。
目前，酶法合成是工业化生产低聚半乳糖的主要途径。β-半乳糖苷酶(β-Galactosidases EC 3.2.1.23)是一类重要的糖苷水解酶，催化β-半乳糖苷键发生水解，在食品工业中有着广泛的应用。某些种类的β-半乳糖苷酶由于具有构型保持酶作用机制，在水解β-半乳糖苷键的同时，还具有转半乳糖基作用，被用于工业化生产功能性低聚半乳糖。β-半乳糖苷酶的来源和活性直接影响酶法合成的低聚半乳糖的结构和产率。迄今为止，已发现多种微生物可以产生此酶，主要包括乳酸菌、环状芽孢杆菌、米曲霉、乳酸克鲁维酵母等。
乳酸菌是一类对人体有重要生理功能的益生菌，归类为公认的安全菌属(Generally Recognized as Safe,GRAS)范畴。现有技术中，乳酸菌的大规模培养和发酵生产仍以经典的MRS培养基或改良MRS培养基为主，虽然乳酸菌在MRS培养基上成长良好，生物量较大，但目前存在的问题是该培养基成分复杂，价格昂贵，质量和生产条件控制不易，不适于工业化生产，而且需加入过多的无机盐类，对人体和动物健康具有潜在的有害影响。因此，亟需寻找更为经济有效、易控和安全的乳酸菌发酵培养基。
发明内容
针对上述现有技术的不足，本发明提供一种生产成本较低、营养结构合理、高活菌数且能有效提高β-半乳糖苷酶产量的乳酸菌发酵新型培养基配方。发酵培养基中添加了大豆乳清废水和糖蜜，采用该培养基培养乳酸菌可以获得更大的生物量和半乳糖苷酶产量。
本发明是通过如下技术方案实现的：
本发明提供一种β-半乳糖苷酶发酵培养基，其特征在于，组分如下：大豆乳清废水中加入糖蜜2～8％(质量体积比)，酵母粉0.1～2％(质量体积比)，pH5.5～7.0。
本发明还提供上述培养基在培养β-半乳糖苷酶产生菌方面的应用。
本申请提供的一个或多个技术方案具有如下优点或有益效果：
(1)一种适合乳酸菌产β-半乳糖苷酶培养基，使最终发酵水平在50亿/ml以上，培养22小时测得的酶活达3534.4U/L。
(2)本发明整体发酵时间在16-24小时左右，发酵周期短，发酵速度快，节省大量人力物力，同时对操作水平要求较低，产酶量高，具有工业化开发价值。
(3)本发明的生产方法简单、操作方便、实用性强，易于推广。乳清废水无须经过浓缩工艺，不需要添加无机盐和生长因子；在生产过程中产生的乳清废水中直接添加糖蜜、酵母粉即得，配置简单，耗能、成本低。
(4)大豆蛋白和豆制品加工过程中会产生大量的大豆乳清废水，其主要成分是小分子水溶性蛋白质、蔗糖、葡萄糖、低聚糖、无机盐等。糖蜜是是生产大豆浓缩蛋白过程中，醇溶部分物质，经过浓缩处理后的副产品，主要含有蔗糖和低聚糖等，行业利用价值较低。大豆乳清废水和糖蜜均为大豆蛋白生产加工过程中产生的副产物，处理费用高且目前行业内和实际生产中没有得到良好的应用，本配方培养基能充分利用这两种副产物的营养特性，极具实际应用价值。以大豆乳清废水为基础通过补充其他乳酸菌生长必需的营养成分为发酵基质的培养基进行大规模工业发酵生产将会显著降低生产成本，并且可以节约资源，提高收益，有利于保持产品质量的稳定，是一条行之有效的途径。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
本申请的一种或多种具体实施方式中，提供一种β-半乳糖苷酶发酵培养基，组分如下，大豆乳清废水中加入糖蜜2～8％(质量体积比)，酵母粉0.1～2％(质量体积比)，pH5.5～7.0。
大豆乳清废水含有的碳、氮源不足，营养成分不均衡，发明人实验发现无论是直接使用乳清废水或者经浓缩后的乳清废水对乳酸菌无法产生较好的生长促进作用，产酶量较低；而经过发酵实验优化，本实施方式中在大豆乳清废液基础上添加5％的糖蜜制备培养基，能显著提升菌种生物量和酶活产量，添加少量酵母粉能进一步提高这一促进作用。
β-半乳糖苷酶的代谢速度和菌体生物量增长并不是完全协同一致的过程，本申请提供的一种β-半乳糖苷酶发酵培养基能够保证产酶量的最大化，同时有较好的菌体生物量。并且在不同发酵阶段——菌种活化、种子培养、发酵培养，不需要对培养基成分进行更改，即可实现最终生物量和酶量的提升。
进一步的，所述蜜糖为5％，酵母粉为0.5％，pH 6.0，或，所述糖蜜4％，酵母粉0.3％，pH 6.0，或，糖蜜4.5％，酵母粉0.8％，pH 6.0。
本申请的一种或多种具体实施方式中，提供一种用所述培养基的乳酸菌产β-半乳糖苷酶发酵方法，具体步骤包括，菌种活化：将菌株接种于所述培养基进行活化，接种量为1.5-2.5％体积分数，活化培养2～3代得到种子发酵液；
发酵培养：吸取种子发酵液至装有适当所述培养基的发酵设备，接种量为1.5-2.5％体积分数，培养至少22小时。
进一步的，所述菌种活化的培养温度为35～40℃；所述发酵培养的温度为35-39℃，优选为37℃。所述培养为静止培养。接种量为2％体积分数。菌种活化的培养时间为16～24小时，发酵培养的培养时间为22-24小时。合适的培养条件和培养时间，使发酵过程稳定，降低培养成本，提高发酵培养的性价比，显著提升菌种生物量和酶活产量。
本申请的一种或多种具体实施方式中，提供一种β-半乳糖苷酶发酵培养基在培养β-半乳糖苷酶产生菌中的应用。
优选的，所述β-半乳糖苷酶产生菌为乳酸菌：德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus)、罗伊氏乳酸杆菌(Lactobacillusreuteri)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)之一。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本公开的技术方案，以下将结合具体的实施例与对比例详细说明本公开的技术方案。实施例中所述的试剂均为市售产品，所述操作方法如无特别说明均为本领域通用操作方法。
实施例1：
(1)β-半乳糖苷酶发酵培养基的制备
种子、菌种活化、发酵培养基的组分：大豆乳清废水中加入糖蜜5％(质量体积比)，酵母粉0.5％(质量体积比)，按照上述组分混合，用1mol/L的NaOH调pH至6.0，在105℃高温下灭菌10分钟即可。
(2)对比实验1
种子、菌种活化、发酵培养基组分：大豆蛋白胨0.6％，胰蛋白胨0.6％，蛋白胨0.6％，牛肉浸膏1.2％，葡萄糖1％，低聚糖0.5％，乳糖0.5％，酵母粉0.5％；最佳生长因子添加量：胡萝卜汁15％，西红柿汁15％，黄豆芽汁15％，11°啤酒5％；
上述培养基均为蒸馏水配制，pH7.0，用于培养细菌。
上述培养基使用前都在115℃高温下灭菌30分钟。
(3)对比实验2
种子、菌种活化、发酵培养基组分：乳清59.43g/mL，牛肉膏8.44g/L，酵母粉8.85g/L，磷酸氢二钾3.48g/L；
上述培养基均为蒸馏水配制，pH6.5，用于培养细菌。
上述培养基使用前都在115℃高温下灭菌30分钟。
(4)对比实验3
种子、菌种活化、发酵培养基组分：蛋白胨1％，葡萄糖0.5％，大豆低聚糖1.5％，酵母膏1.0％，西红柿汁12％；
上述培养基均为蒸馏水配制，pH6.5，用于培养细菌。
上述培养基使用前都在115℃高温下灭菌30分钟。
(5)对比实验4
种子、菌种活化、发酵培养基的组分：葡萄糖10g/L，胰蛋白胨10g/L，牛肉膏10g/L，酵母粉5g/L，柠檬酸二铵2g/L，磷酸氢二钾2g/L，MgSO4·7H2O0.58g/L，MnSO4·H2O 0.25g/L，吐温80为1mL/L，PH 6.5。
上述培养基均为蒸馏水配制，pH6.5，用于培养细菌。
上述培养基使用前都在115℃高温下灭菌30分钟。
本专利提供的培养基配方成分简单，配制方便，成本低，保存期长，产酶量高，适合工业化生产应用。
实施例2：利用β-半乳糖苷酶发酵培养基培养保加利亚乳杆菌
(1)本实施例中的菌株种子培养液、活化培养基、发酵培养基的配制同实施例1。
菌种活化：将产转糖基β-半乳糖苷酶的乳酸菌菌株接种于菌种活化培养基进行活化，接种量为2％体积分数，35～40℃静止培养16～24小时，活化2～3代得到种子发酵液。
发酵培养：吸取种子发酵液至装有适当发酵培养基的100mL三角瓶中，接种量为2％体积分数，37℃静止培养。培养22小时后，采用稀释涂布平板法测定菌体生长量。
β-半乳糖苷酶水解活性测定：取发酵液600uL，4℃、7000r/min离心1min,弃去上清液，向湿菌体中加入2mmol/L的ONPG溶液450uL,40℃水浴反应10min，加1mLNa2CO3溶液终止反应，12000r/min离心1min，上清液测OD400。
活力单位规定：以40℃水解ONPG释放1umol邻硝基苯酚的酶量为一个酶活力单位(U)，以U/L计。
经测定，实施例1(1)培养22小时生长量达到5.2×109cfu/mL，测得的酶活3534.4U/L。
(2)对比实验1
参照实施例2(1)，所不同的是：
①菌株活化培养基、种子培养基和发酵培养基同实施例1(2)所述。
②保加利亚乳杆菌在发酵培养基中培养22小时后生长量为1.8×109cfu/mL，测得的酶活2096.6U/L。
(3)对比实验2
参照实施例2(1)，所不同的是：
①菌株活化培养基、种子培养基和发酵培养基同实施例1(3)所述。
②保加利亚乳杆菌在发酵培养基中培养22小时后生长量为6.81×108cfu/mL，测得的酶活2244.7U/L。
(4)对比实验3
参照实施例2(1)，所不同的是：
①菌株活化培养基、种子培养基和发酵培养基同实施例1(4)所述。
②保加利亚乳杆菌在发酵培养基中培养22小时后生长量为2.2×109cfu/mL，测得的酶活1585.7U/L
(5)对比实验4
参照实施例2(1)，所不同的是：
①菌株活化培养基、种子培养基和发酵培养基的组分为：葡萄糖10g/L，胰蛋白胨10g/L，牛肉膏10g/L，酵母粉5g/L，柠檬酸二铵2g/L，磷酸氢二钾2g/L，MgSO4·7H2O 0.58g/L，MnSO4·H2O 0.25g/L，吐温80为1mL/L，PH 6.5
②保加利亚乳杆菌在发酵培养基中培养22小时后生长量为1.6×109cfu/mL,测得的酶活1124.8U/L。
以上对比实验表明，利用本专利提供的培养基培养保加利亚乳杆菌，获得了较高的生物量，而且β-半乳糖苷酶产量高，较传统MRS培养基提高了2倍。原因可能是菌株对蔗糖的利用率高于其他几种碳源，而糖蜜和豆清水中含有的子苏糖、棉子糖等低聚糖能进一步促进乳酸菌的增殖和代谢活动；酵母粉作为小分子蛋白、肽、氨基酸、核苷酸、维生素和微量元素的天然来源，用来培养乳酸菌可以获得较好的细胞生长速率和有效的生物量。因此，本专利提供的培养基营养丰富，搭配平衡，能有效促进乳酸菌的生长并保持良好的乳酸菌细胞活性。
实施例3
如实施例2(1)所述，所不同的是所用的产转糖基β-半乳糖苷酶乳酸菌菌株为罗伊氏乳酸杆菌(Lactobacillus reuteri)。在发酵培养基中培养22小时后生长量为3.4×109cfu/mL，测得的酶活2155.6U/L。
实施例4
如实施例2(1)所述，所不同的是所用的产转糖基β-半乳糖苷酶乳酸菌菌株为嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)，其培养温度为38℃。在发酵培养基中培养20小时后生长量为4.1×109cfu/mL，测得的酶活2003.2U/L。
应注意的是，以上实例仅用于说明本发明的技术方案而非对其进行限制。尽管参照所给出的实例对本发明进行了详细说明，但是本领域的普通技术人员可根据需要对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围。

Claims (7)

1.一种乳酸菌产β-半乳糖苷酶的发酵方法，其特征在于，菌种活化：将菌株接种于培养基进行活化，接种量为1.5-2.5%体积分数，活化培养2～3代得到种子发酵液；
发酵培养：吸取种子发酵液至装有适当所述培养基的发酵设备，接种量为1.5-2.5%体积分数，培养至少22小时；
所述培养基组分为大豆乳清废水中加入质量体积比为5%的糖蜜，质量体积比为0.5%的酵母粉，pH 6.0；
所述乳酸菌为德氏乳杆菌保加利亚亚种。
2.如权利要求1所述的发酵方法，其特征在于，所述菌种活化的培养温度为35～40℃；所述发酵培养的温度为35-39℃。
3.如权利要求2所述的发酵方法，其特征在于，所述发酵培养的温度为37℃。
4.如权利要求1所述的发酵方法，其特征在于，所述培养为静止培养。
5.如权利要求1所述的发酵方法，其特征在于，接种量为2%体积分数。
6.如权利要求1所述的发酵方法，其特征在于，所述菌种活化的培养时间为16～24小时，所述发酵培养的培养时间为22-24小时。
7.一种培养基在培养β-半乳糖苷酶产生菌中的应用，其特征在于，所述培养基组分为大豆乳清废水中加入质量体积比为5%的糖蜜，质量体积比为0.5%的酵母粉，pH 6.0；
所述β-半乳糖苷酶产生菌为德氏乳杆菌保加利亚亚种。
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