CN112979813A - 一种可特异性结合检测人附睾蛋白4的结合蛋白及其制备方法和应用 - Google Patents

一种可特异性结合检测人附睾蛋白4的结合蛋白及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种可特异性结合检测人附睾蛋白4的结合蛋白及其制备方法和应用,涉及抗体技术领域。具体而言,本发明公开的结合蛋白包含第一抗原结合结构域或第二抗原结合结构域,该第一抗原结合结构域包含至少一个互补决定区,第二抗原结合结构域与第一抗原结合结构域具有至少80%的序列同一性。该结合蛋白可特异性结合HE4,并具有较好的结合活性以及亲和力,能用于检测HE4或用于诊断与HE4相关的疾病。

Description

一种可特异性结合检测人附睾蛋白4的结合蛋白及其制备方 法和应用
技术领域
本发明涉及抗体技术领域,具体而言,涉及一种可特异性结合检测人附睾蛋白4的结合蛋白及其制备方法和应用。
背景技术
卵巢癌在妇科肿瘤中发病率仅次于子宫颈癌和子宫体癌,而致死率却占据首位。这主要是因为卵巢深藏于腹腔之内,早期症状不明显,只有19%的卵巢癌患者在癌组织突破卵巢之前能够被发现,而大多数患者就诊时已处于晚期,并且容易腹腔转移及复发。卵巢癌如果早期治疗,其5年生存率可达92%,然而晚期的卵巢癌5年生存率不足50%。
早期卵巢癌的诊断方法有妇科检查、影像学检查、细胞学和组织学检测、肿瘤标志物等。妇科检查要发现盆腔可触及的异常,但需要有足够临床经验的医师。影像学诊断则包括超声、CT和阴道超声等方法,这些方法只能提示卵巢形态出现异常,需要细胞学和组织学检测配合进一步检查。
而肿瘤标志物--糖链抗原125(carbohydrate antigen 125,CA125)被广泛应用于卵巢癌的早期诊断,它的升高在Ⅰ期卵巢癌患者的检出率仅为50%,而在Ⅱ~Ⅳ期的检出率可高达90%~94%。但是CA125在某些良性疾病如子宫内膜异位症,盆腔炎等也会出现升高,且这种假阳性通过影像学不容易排除。所以,作为诊断早期卵巢癌的标志物,CA125的特异性还是不足的,迫切需要一种敏感性和特异性较强的标志物来辅助CA125提高卵巢癌的诊断水平。
随着研究的深入,发现在正常组织中,人附睾蛋白4(human epididymisprotein4,HE4)广泛表达于气管、唾液腺、肺组织、乳腺上皮细胞等,在肿瘤组织中,HE4在卵巢浆液性癌、子宫内膜癌、肺癌和间皮瘤等均有高表达。HE4是一种含有高度保守的WAP(Whey Acidic Proteins)结构域蛋白,该结构域含有由8个半胱氨酸组成的4个二硫键核心区域,长124个氨基酸,属于抗菌肽基因家族。
经研究发现,HE4在人体正常的卵巢组织中几乎没有表达,而在卵巢癌中,HE4的表达上调最为常见,在大多数非卵巢恶性肿瘤中的表达很少,甚至未见表达。HE4基因的过表达,使卵巢癌细胞增殖减弱,凋亡增强,侵袭减弱,肿瘤增长变慢,说明HE4能抑制卵巢癌细胞的增殖和转移,是抗肿瘤基因。由于HE4分子量小,可分泌入血,在正常卵巢组织不表达,健康人体的血清中HE4含量稳定,在卵巢癌组织高表达,血清HE4升高提示机体有卵巢肿瘤发病的可能,而HE4的表达独立于CA125的表达,单独检测优于CA125且联合检测可提高诊断能力,同时HE4水平在卵巢癌术后明显降低,可作为卵巢癌病情监测和疗效观察的指标,因此HE4可以作为一种有效的卵巢相关肿瘤的新型血清肿瘤标志物。
2008年,HE4被美国食品药品监督管理局(FDA)批准应用于卵巢癌的早期筛查及鉴别诊断,因此,实现对HE4快速、准确的检测,是实现早诊断、早治疗,提高卵巢癌患者治愈率、延长生存期和改善生存质量的前提和保障。
当前对HE4的检测以酶联免疫法(ELISA法)、化学发光等基于免疫学原理的方法为主,都需要对HE4具有高灵敏度、高特异性的单克隆抗体,目前国内用于检测HE4的单克隆抗体多来自于老鼠腹水,其抗体活性的亲和力差,无法很好地应用于检测HE4中。
鉴于此,特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种包括HE4抗原结合结构域的分离的结合蛋白、其制备方法和应用。该结合蛋白具有较好的结合活性以及亲和力,能够用于检测HE4或用于诊断与HE4表达异常的相关的疾病中,本申请为HE4的有效检测以及与HE4相关的疾病的诊断提供了更多选择。
名词定义
“抗原结合结构域”泛指包含CDR区的一切蛋白/蛋白片段,特别是抗体或抗体功能片段。“抗体”此用语包括多克隆抗体及单克隆抗体,“抗体功能片段”包括上述这些抗体的抗原化合物结合片段,包括Fab、F(ab’)2、Fd、Fv、scFv、双特异抗体和抗体最小识别单位,以及这些抗体和片段的单链衍生物。抗体的类型可以选择IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE或IgD。此外,“抗体”此用语包括天然发生的抗体以及非天然发生的抗体,包括例如嵌合型(chimeric)、双功能型(bifunctional)和人源化(humanized)抗体,以及相关的合成异构形式(isoforms)。“抗体”此用语可和“免疫球蛋白”互换使用。
抗体的“可变区”或“可变结构域”是指抗体的重链或轻链的氨基端结构域。重链的可变结构域可以被称为“VH”。轻链的可变结构域可以被称为“VL”。这些结构域通常是抗体的最可变的部分,并含有抗原结合位点。轻链或重链可变区(VL或VH)由被三个称为“互补决定区”或“CDR”的高变区打断的构架区构成。构架区和CDR的范围已被精确定义,例如在Kabat(参见《免疫重要的蛋白质的序列》(Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest),E.Kabat等,美国卫生与人类服务部(U.S.Department of Health and HumanServices),(1983))和Chothia中。抗体的构架区,即构成要件轻链和重链的组合的构架区,起到定位和对齐CDR的作用,所述CDR主要负责与抗原的结合。
当在本文中使用时,“骨架区”或“FR”区意味着抗体可变结构域的排除被定义为CDR的那些区域之外的区域。每个抗体可变结构域构架可以被进一步细分成被CDR分隔开的毗邻区域(FR1、FR2、FR3和FR4)。
通常情况下,重链和轻链的可变区VL/VH可由以下编号的CDR与FR按如下组合排列连接获得:FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。
当在本文中使用时,与多肽或核酸相关联的术语“纯化的”或“分离的”是指多肽或核酸不是处于其天然介质中或天然形式下。因此,术语“分离的”包括从其原始环境,例如如果它是天然存在的,从天然环境取出的多肽或核酸。例如,分离的多肽通常不含通常与其结合或通常与其混合或在溶液中的至少某些蛋白质或其他细胞组分。分离的多肽包括细胞裂解物中包含的天然生产的所述多肽,纯化或部分纯化形式的所述多肽,重组多肽,被细胞表达或分泌的所述多肽,以及在异源宿主细胞或培养物中的所述多肽。与核酸相关联,术语“分离的”或“纯化的”是指所述核酸不在其天然的基因组背景中(例如在载体中,作为表达盒,连接到启动子,或人工引入到异源宿主细胞中)。
本发明是这样实现的:
第一方面,实施例提供一种的分离的结合蛋白,所述结合蛋白如(1)或(2)所示:
(1)所述结合蛋白包含第一抗原结合结构域,所述第一抗原结合结构域包括如下互补决定区中的至少一个:
互补决定区CDR-VH1,其氨基酸序列为X1-Y-T-F-T-X2-Y-G-M-H,其中,X1是G或A,X2是Q、K或N;
互补决定区CDR-VH2,其氨基酸序列为W-X1-N-T-Y-T-G-X2-P-T-X3-A-D-X4-F-K-G,其中,X1是I或L,X2是E或N,X3是Y或H,X4是E或D;
互补决定区CDR-VH3,其氨基酸序列为X1-S-G-X2-G-Y-G-X3-S-P-D,其中,X1是I、V或L,X2是I、V或L,X3是S或T;
互补决定区CDR-VL1,其氨基酸序列为R-A-S-X1-S-X2-Y-X3-S-X4-H,其中,X1是K或Q,X2是I或L,X3是N、D或K,X4是I或L;
互补决定区CDR-VL2,其氨基酸序列为Y-X1-S-X2-S-X3-S,其中,X1是G或A,X2是Q、D或N,X3是I或L;
互补决定区CDR-VL3,其氨基酸序列为X1-X2-G-Y-S-X3-P-W,其中,X1是I或L,X2是Q或N,X3是T、F或W;
(2)所述结合蛋白包含第二抗原结合结构域,所述第二抗原结合结构域与所述第一抗原结合结构域具有至少80%的序列同一性。
在可选的实施方式中,所述第二抗原结合结构域与所述第一抗原结合结构域具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%的序列同一性,两者的序列同一性范围可在80%~100%选择。
上述互补决定区的氨基酸序列是本发明实施例首次揭示,该结合蛋白能特异性结合HE4,且具有较好的结合活性以及亲和力,能够用于检测HE4或诊断HE4相关的疾病,为与HE4相关的疾病的诊断、治疗或研究提供更多的选择。
在可选的实施方式中,所述互补决定区CDR-VH1中,X1为G;
所述互补决定区CDR-VH2中,X3为Y;
所述互补决定区CDR-VH3中,X3为S;
所述互补决定区CDR-VL1中,X1为Q;
所述互补决定区CDR-VL2中,X1为A;
所述互补决定区CDR-VL3中,X3为T。
在可选的实施方式中,所述第二抗原结合结构域与人附睾蛋白4具有KD≤8×10- 7mol/L、7×10-7mol/L、6×10-7mol/L、5×10-7mol/L、4×10-7mol/L、3×10-7mol/L、2×10- 7mol/L、1×10-7mol/L、9×10-8mol/L、8×10-8mol/L、7×10-8mol/L、6×10-8mol/L、5×10- 8mol/L、4×10-8mol/L、3×10-8mol/L、2×10-8mol/L、1×10-8mol/L、9×10-9mol/L或8×10- 9mol/L的亲和力。
进一步地,KD的范围为:7.85×10-9mol/L≤KD≤8.45×10-7mol/L。
其中,KD的检测参考本发明实施例中的方法进行。
在可选的实施方式中,所述互补决定区CDR-VH1中,X2为Q;
在可选的实施方式中,所述互补决定区CDR-VH1中,X2为K;
在可选的实施方式中,所述互补决定区CDR-VH1中,X2为N;
在可选的实施方式中,所述互补决定区CDR-VH2中,X1为I;
在可选的实施方式中,所述互补决定区CDR-VH2中,X1为L;
在可选的实施方式中,所述互补决定区CDR-VH2中,X2为E;
在可选的实施方式中,所述互补决定区CDR-VH2中,X2为N;
在可选的实施方式中,所述互补决定区CDR-VH2中,X4为E;
在可选的实施方式中,所述互补决定区CDR-VH2中,X4为D;
在可选的实施方式中,所述互补决定区CDR-VH3中,X1为I;
在可选的实施方式中,所述互补决定区CDR-VH3中,X1为V;
在可选的实施方式中,所述互补决定区CDR-VH3中,X1为L;
在可选的实施方式中,所述互补决定区CDR-VH3中,X2为I;
在可选的实施方式中,所述互补决定区CDR-VH3中,X2为V;
在可选的实施方式中,所述互补决定区CDR-VH3中,X2为L;
在可选的实施方式中,所述互补决定区CDR-VL1中,X2为I;
在可选的实施方式中,所述互补决定区CDR-VL1中,X2为L;
在可选的实施方式中,所述互补决定区CDR-VL1中,X3为N;
在可选的实施方式中,所述互补决定区CDR-VL1中,X3为D;
在可选的实施方式中,所述互补决定区CDR-VL1中,X3为K;
在可选的实施方式中,所述互补决定区CDR-VL1中,X4为I;
在可选的实施方式中,所述互补决定区CDR-VL1中,X4为L;
在可选的实施方式中,所述互补决定区CDR-VL2中,X2为Q;
在可选的实施方式中,所述互补决定区CDR-VL2中,X2为D;
在可选的实施方式中,所述互补决定区CDR-VL2中,X2为N;
在可选的实施方式中,所述互补决定区CDR-VL2中,X3为I;
在可选的实施方式中,所述互补决定区CDR-VL2中,X3为L;
在可选的实施方式中,所述互补决定区CDR-VL3中,X1为I;
在可选的实施方式中,所述互补决定区CDR-VL3中,X1为L;
在可选的实施方式中,所述互补决定区CDR-VL3中,X2为Q;
在可选的实施方式中,所述互补决定区CDR-VL3中,X2为N。
在可选的实施方式中,各互补决定区的突变位点选自以下突变组合1~61中的任一种:
Figure BDA0002320410280000051
Figure BDA0002320410280000061
在可选的实施方式中,所述互补决定区CDR-VH1中,X1为A;
所述互补决定区CDR-VH2中,X3为H;
所述互补决定区CDR-VH3中,X3为T;
所述互补决定区CDR-VL1中,X1为K;
所述互补决定区CDR-VL2中,X1为G;
所述互补决定区CDR-VL3中,X3为F;
在可选的实施方式中,各互补决定区的突变位点选自以下突变组合62~66中的任一种:
Figure BDA0002320410280000062
在可选的实施方式中,所述结合蛋白中包含至少3个互补决定区(如重链的3个互补决定区,或者轻链的3个互补决定区);或,所述结合蛋白包含至少6个互补决定区(如:重链的3个互补决定区以及轻链的3个互补决定区)。
在可选的实施方式中,所述结合蛋白为包含可变区和恒定区的完整抗体。
在可选的实施方式中,所述结合蛋白为抗体的功能性片段,例如纳米抗体、F(ab’)2、Fab’、Fab、Fv、scFv、双特异抗体和抗体最小识别单位中的任意一种。
上述抗体的功能片段通常具有与其来源抗体相同的结合特异性。本领域技术人员根据本发明实施方式记载的内容能理解,上述抗体的功能片段可以通过如酶消化的方法(包括胃蛋白酶或木瓜蛋白酶)和/或通过化学还原分裂二硫键的方法获得。上述抗体的功能片段还可以通过本领域技术人员所知的重组遗传学技术或通过例如自动肽合成仪合成获得。
在可选的实施方式中,所述结合蛋白包括序列依次如SEQ ID NO.1~4所示的轻链骨架区FR-L1、FR-L2、FR-L3及FR-L4,和/或,序列依次如SEQ ID NO.5~8所示的重链骨架区FR-H1、FR-H2、FR-H3及FR-H4。
需要说明的是,除上述公开的氨基酸序列外,所述结合蛋白的重链或轻链骨架区的种属来源可以为人,以构成人源化抗体。
在可选的实施方式中,所述结合蛋白包括抗体恒定区序列。
在可选的实施方式中,所述恒定区选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE以及IgD中任意一者的恒定区。
在可选的实施方式中,所述恒定区的种属来源为牛、马、乳牛、兔、骆驼、驴、鹿、貂、鸡、鸭、猪、绵羊、山羊、大鼠、小鼠、狗、猫、鹅、火鸡、斗鸡或人。
在可选的实施方式中,所述恒定区来源于小鼠。
在可选的实施方式中,所述抗体恒定区的轻链恒定区序列如SEQ ID No.9所示;所述抗体恒定区的重链恒定区序列如SEQ ID No.10所示。
具体的,SEQ ID No.1~10的序列如表1所示。
表1序列
Figure BDA0002320410280000071
Figure BDA0002320410280000081
第二方面,实施例提供一种分离的核酸,所述核酸为DNA或RNA,其编码如前述实施方式任一项所述的结合蛋白。
在本发明实施方式公开的上述结合蛋白的氨基酸序列基础上,本领域技术人员根据氨基酸对应的密码子能获得编码上述结合蛋白的核酸序列,并根据密码子的简并性,得到多种编码上述结合蛋白的核酸序列,无论是何种核酸序列,只要其编码上述结合蛋白,其均属于本发明的保护范围。
第三方面,实施例提供一种载体,其含有如前述实施方式所述的分离的核酸。
载体中的核酸序列与至少一种调节序列可操作连接。“可操作连接”指的是核酸序列以允许表达的方式与调节序列连接。调节序列选择用来在合适的宿主细胞中指导目的蛋白质的表达,调节序列包含启动子、增强子和其它的表达调控元件。
在本发明实施方式中,载体可指代包含本发明的核酸或其片段的、能够携带遗传信息并且可以将遗传信息递送到细胞中的分子或试剂。典型的载体包括质粒、病毒、噬菌体、黏粒和微型染色体。载体可以是克隆载体(即用于将遗传信息转移到细胞中的载体,可以繁殖所述细胞并且可以选择存在或不存在所述遗传信息的所述细胞)或表达载体(即包含必要的遗传元件从而允许所述载体的遗传信息在细胞中表达的载体)。因此,克隆载体可以包含选择标记,以及与所述克隆载体所指定的细胞类型相匹配的复制起点,而表达载体则包含对于影响指定靶细胞中的表达必要的调节元件。
本发明实施方式提供的核酸或其片段可以插入到合适的载体中,以形成携带本发明核酸片段的克隆载体或表达载体。这种新载体也是本发明实施方式的一部分。所述载体可包括质粒、噬菌体、黏粒、微型染色体或病毒,也包括只在特定细胞中瞬时表达的裸DNA。克隆载体和表达载体能够自发的复制,因此能够为用于随后克隆的高水平表达或高水平复制目的提供高拷贝数。表达载体可以包括用于驱动本发明的核酸片段表达的启动子,可选的编码使所述肽表达产物分泌或整合到膜上的信号肽的核酸序列,本发明实施方式提供的核酸片段,以及可选的编码终止子的核酸序列。当在生产菌株或细胞系中操作表达载体时,载体引入到宿主细胞中时可以整合到宿主细胞的基因组中,也可以不能被整合到宿主细胞基因组中。载体通常携带复制位点,以及能够在转化细胞中提供表型选择的标记序列。
第四方面,实施例提供一种宿主细胞,其含有如前述实施方式所述的载体。
本发明实施方式提供的表达载体可用于转化宿主细胞。这种转化后的宿主细胞也是本发明的一部分,可以是用于增殖本发明实施方式提供的核酸片段和载体、或用于重组制备本发明实施方式提供的结合蛋白的培养细胞或细胞系。本发明实施方式提供的宿主细胞包括微生物如细菌(如大肠杆菌、芽孢杆菌等)。宿主细胞也包括来自多细胞生物如真菌、昆虫细胞、植物细胞或哺乳动物细胞,优选来自哺乳动物的细胞,例如CHO细胞。
第五方面,实施例提供如前述实施方式任一项所述分离的结合蛋白的制备方法,其包括:培养如前述实施方式所述的宿主细胞,从培养基或培养的所述宿主细胞中获取所述结合蛋白。
所述制备方法可采用编码至少一部分上述结合蛋白的核酸载体转染宿主细胞,在合适的条件下培养该宿主细胞,并使其表达该结合蛋白。宿主细胞也可用一个或多个表达载体转染,该表达载体可单独或结合地包含编码至少一部分结合蛋白的DNA。利用常规的纯化蛋白质和肽的技术可从培养基或细胞裂解物中分离结合蛋白,所述技术包括硫酸铵沉淀,层析(如离子交换,凝胶过滤,亲合层析等)和/或电泳。
构建合适的含有目的编码和调控序列的载体可使用本领域公知的标准连接和限制技术进行。将分离的质粒、DNA序列或合成的寡核苷酸按需要的形式切割、加尾和再连接。可用任何方法向编码序列中引入突变以产生本发明实施例提供序列的变体,这些突变可以包含缺失或插入或置换等。
第六方面,实施例提供一种用于检测人附睾蛋白4水平异常的相关疾病的试剂或试剂盒,其包含如前述实施方式任一项所述的结合蛋白。
在可选的实施方式中,所述人附睾蛋白4水平异常的相关疾病包括:卵巢癌、子宫内膜癌、肺癌和间皮瘤。
第七方面,实施例提供如前述实施方式任一项所述的分离的结合蛋白在制备用于检测人附睾蛋白4水平异常的相关疾病的试剂或试剂盒中的应用。
在可选的实施方式中,所述人附睾蛋白4水平异常的相关疾病包括:卵巢癌、子宫内膜癌、肺癌和间皮瘤。
第八方面,实施例提供一种检测人附睾蛋白4的方法,其包括采用前述实施方式任一项所述的结合蛋白检测待测样本中的人附睾蛋白4。
在可选实施方式中,上述检测人附睾蛋白4的方法是以非疾病的诊断为目的。
需要说明的是,本领域技术人员可以基于抗体/抗原结合形成免疫复合物的特点,对待测样本中的人附睾蛋白4进行定性或定量检测。
基于抗体抗原结合形成的免疫复合物对抗原或抗体进行检测的方法包括:
(A)通过沉淀反应实现检测目的,包括:单向免疫扩散试验、双向免疫扩散试验、免疫比浊法、对流免疫电泳、免疫电泳以及免疫印迹法等;
(B)通过标记显示信号强度的指示剂实现检测目的,包括:免疫荧光法、放射免疫分析法以及酶联免疫分析法(例如双抗体夹心法、间接法或竞争法等)等;
在可选实施方式中,指示剂可以根据不同的检测方法合理选择,其包括但不限于如下描述的指示剂:
(a)免疫荧光法中,指示剂可以是荧光染料,例如是荧光素类染料(包括异硫氰酸荧光素(FITC)、羟基光素(FAM)、四氯光素(TET)等或其类似物)、罗丹明类染料(包括红色罗丹明(RBITC、四甲基罗丹明(TAMRA)、罗丹明B(TRITC)等或其类似物)、Cy系列染料(包括Cy2、Cy3、Cy3B、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy3等或其类似物)、Alexa系列染料(包括AlexaFluor350、405、430、488、532、546、555、568、594、610、33、647、680、700、750等或其类似物)、蛋白类染料(包括藻红蛋白(PE)、藻蓝蛋白(PC)、别藻蓝蛋白(APC)、多甲藻黄素-叶绿素蛋白(preCP)等);
(b)放射免疫分析法中,指示剂可以是放射性同位素,例如:212Bi、131I、111In、90Y、186Re、211At、125I、188Re、153Sm、213Bi、32P、94mTc、99mTc、203Pb、67Ga、68Ga、43Sc、47Sc、110mIn、97Ru、62Cu、64Cu、67Cu、68Cu、86Y、88Y、121Sn、161Tb、166Ho、105Rh、177Lu、172Lu和18F等。
(c)酶联免疫分析法中,指示剂可以是催化底物显色的酶(例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶或葡萄糖氧化酶等)。
(d)化学发光免疫分析法中,指示剂可以是化学发光液,例如吖啶酯、辣根过氧化物酶和鲁米诺、碱性磷酸酶和AMPPD,电化学发光剂三联吡啶钌和三丙胺等。
基于此,在上述实施方式公开了的结合蛋白的基础上,本领域技术人员可以采用上述任意一种方法或几种方法的组合或其他的方法,实现对待测样本中人附睾蛋白4的定量或定性检测,无论选用何种方法,只要是利用了本发明公开的结合蛋白来检测人附睾蛋白4,其均属于本发明的保护范围。
在可选的实施方式中,所述结合蛋白标记有显示信号强度的指示剂,以使所述结合蛋白与人附睾蛋白4蛋白结合的复合物被检测。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案,下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍,应当理解,以下附图仅示出了本发明的某些实施例,因此不应被看作是对范围的限定,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明实施例1中HE4单克隆抗体的电泳图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚,下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者,按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市售购买获得的常规产品。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实验耗材:本实施例中限制性内切酶、Prime Star DNA聚合酶购自Takara公司。
MagExtractor-RNA提取试剂盒购自TOYOBO公司。
BD SMARTTMRACE cDNA Amplification Kit试剂盒购自Takara公司。
pMD-18T载体购自Takara公司。
质粒提取试剂盒购自天根公司。
引物合成和基因测序由Invitrogen公司完成。
分泌Anti-HE4 2A1单克隆抗体的杂交瘤细胞株为已有的杂交瘤细胞株,复苏备用。
实施例1
1.表达质粒的构建:
1.1引物序列如表2所示。
表2引物序列
Figure BDA0002320410280000111
1.2抗体可变区基因克隆及测序:
从分泌Anti-HE4 2A1单克隆抗体的杂交瘤细胞株中提取中RNA,用SMARTERTMRACE cDNA Amplification Kit试剂盒及试剂盒中的SMARTER II A Oligonucleotide和5'-CDS引物进行第一链cDNA合成,获得的第一链cDNA产物作为PCR扩增模板。轻链基因以Universal Primer A Mix(UPM)、Nested Universal Primer A(NUP)和mIg-kR引物进行扩增,重链基因以Universal Primer A Mix(UPM)、Nested Universal Primer A(NUP)和mIg-HR引物进行扩增。其中,轻链的引物对扩增出0.8KB左右的目的条带,重链的引物对扩增出1.4KB左右的目的条带。用琼脂糖凝胶电泳纯化回收,产物用rTaq DNA聚合酶进行加A反应后插入到pMD-18T载体中,转化到DH5α感受态细胞中,长出菌落后分别取重链及轻链基因克隆各4个克隆送Invitrogen公司进行测序。
1.3 Anti-HE4 2A1抗体可变区基因的序列分析
将上述测序得到的基因序列放在IMGT抗体数据库中进行分析,并利用VNTI11.5软件进行分析确定重链和轻链引物对扩增出的基因都是正确的,其中,轻链扩增出的基因片段中,VL基因序列为342bp,属于VkII基因家族,其前方有57bp的前导肽序列;重链引物对扩增出的基因片段中,VH基因序列为357bp,属于VH1基因家族,其前方有57bp的前导肽序列。
1.4、重组抗体表达质粒的构建
pcDNATM3.4
Figure BDA0002320410280000112
vector为构建的重组抗体真核表达载体,该表达载体已经引入HindIII、BamHI、EcoRI等多克隆酶切位点,并命名为pcDNA3.4A表达载体,后续简称3.4A表达载体;根据上述pMD-18T中抗体基因测序结果,设计Anti-HE4 2A1抗体的轻链和重链基因特异性引物,两端分别带有HindIII、EcoRI酶切位点和保护碱基,如表3所示。
表3序列信息
Figure BDA0002320410280000121
通过PCR扩增方法扩出0.75KB的轻链基因片段和1.42kb的重链基因片段。重链和轻链基因片段分别采用HindIII/EcoRI双酶切,3.4A载体采用HindIII/EcoRI双酶切,将片段和载体纯化回收后重链基因和轻链基因分别连接3.4A表达载体中,分别得到重链和轻链的重组表达质粒。
2.稳定细胞株筛选
2.1重组抗体表达质粒瞬时转染CHO细胞,确定表达质粒活性
质粒用超纯水稀释至400ng/ml,调节CHO细胞1.43×107cells/ml于离心管中,100μl质粒与700μl细胞混合,转入电转杯,电转,第3、5、7天取样计数,第7天收样检测。
包被液稀释HE4蛋白到指定浓度,每孔100μL,4℃过夜;次日,洗涤液清洗2次,拍干;加入封闭液(20%BSA+80%PBS),每孔120μL,37℃,60min,拍干;加入稀释后的细胞上清,100μL/孔,37℃,30min(部分上清60min);洗涤液清洗5次,拍干;加入羊抗鼠IgG-HRP,每孔100μL,37℃30min;洗涤液清洗5次,拍干;加入显色液A液(50μl/孔,含2.1g/L柠檬酸、12.25g/L柠檬酸、0.07g/L乙酰苯胺和0.5g/L过氧化脲),加入显色液B液(50μL/孔,含1.05g/L柠檬酸、0.186g/LEDTA·2Na、0.45g/L TMB和0.2ml/L浓HCl),10min;加入终止液(0.75g/EDTA·2Na和10.2ml/L浓H2SO4),50μL/孔;酶标仪上450nm(参考630nm)处读OD值。结果显示细胞上清稀释1000倍后反应OD仍大于1.0,未加细胞上清孔反应OD小于0.1,表明质粒瞬转后产生的HE4单克隆抗体对HE4蛋白有活性。
2.2重组抗体表达质粒线性化
准备下述试剂:Buffer 50μl、DNA 100μg/管、Puv I酶10μl、无菌水补至500μl,37℃水浴酶切过夜;先用等体积酚/氯仿/异戊醇(下层)25:24:1,再用氯仿(水相)依次进行抽提;0.1倍体积(水相)3M醋酸钠和2倍体积乙醇冰上沉淀,70%乙醇漂洗沉淀,去除有机溶剂,待乙醇挥发完全用适量的灭菌水进行复融,最后进行浓度的测定。
2.3重组抗体表达质粒稳定转染,加压筛选稳定细胞株
质粒用超纯水稀释至400ng/ml,调节CHO细胞1.43×107cells/ml于离心管中,100μl质粒与700μl细胞混合,转入电转杯,电转,次日计数;25μmol/L MSX 96孔加压培养约25天。
显微镜下观察标记长有细胞的克隆孔,并记录汇合度;取培养上清,送样检测;挑选抗体浓度、相对浓度高的细胞株转24孔,3天左右转6孔;3天后保种批培,调整细胞密度0.5×106cells/ml,2.2ml进行批培养,细胞密度0.3×106cells/ml,2ml进行保种;7天6孔批培上清送样检测,挑选抗体浓度及细胞直径较小的细胞株转TPP保种传代。
3.重组抗体生产
3.1细胞扩培
细胞复苏之后先在125ml规格的摇瓶中培养,接种体积为30ml,培养基为100%Dynamis培养基,放置于转速120r/min,温度为37℃,二氧化碳为8%的摇床中。培养72h,以50万cells/ml接种密度接种扩培,扩培体积根据生产需求进行计算,培养基为100%Dynamis培养基。之后每72h扩培一次。当细胞量满足生产需求时,严格控制接种密度为50万cells/ml左右进行生产。
3.2摇瓶生产及纯化
摇瓶参数:转速120r/min,温度为37℃,二氧化碳为8%。流加补料:在摇瓶中培养至72h时开始每天补料,HyCloneTM Cell BoostTM Feed 7a每天流加初始培养体积的3%,Feed 7b每天流加量为初始培养体积的千分之一,一直补到第12天(第12天补料)。葡萄糖在第六天补加3g/L。第13天收样。用ProteinA亲和层析柱进行亲和纯化。取4μg纯化的抗体进行还原性SDS-PAGE,4μg外来对照抗体作为对照,电泳图如图1所示。在还原性SDS-PAGE后显示两条带,1条Mr为50KD(即重链,SEQ ID NO.12),另一条Mr为28KD(即轻链,SEQ IDNO.14)。
实施例2
抗体的性能检测。
检测实施例1提供的抗体及其突变体的活性。
经分析,实施例1提供的HE4单克隆抗体(WT)的重链可变区如SEQ ID NO.11所示,其轻链可变区如SEQ ID NO.13所示,重链的各互补决定区以及轻链的各互补决定区的序列请参照表4。
表4序列信息
Figure BDA0002320410280000131
备注:X1、X2、X3和X4均为待突变位点。
在实施例1提供的HE4单克隆抗体的基础上,在互补决定区中对与抗体活性有关的位点进行突变,见表5。
表5与抗体活性有关的突变位点
Figure BDA0002320410280000132
Figure BDA0002320410280000141
活性鉴定
包被液(PBS)稀释HE4蛋白到1μg/ml进行微孔板包被,每孔100μL,4℃过夜;次日,洗涤液(PBS)清洗2次,拍干;加入封闭液(20%BSA+80%PBS),每孔120μL,37℃,60min,拍干;加入稀释后的HE4单克隆抗体,100μL/孔,37℃,30min(部分上清60min);洗涤液清洗5次,拍干;加入羊抗鼠IgG-HRP,每孔100μL,37℃,30min;洗涤液清洗5次,拍干;加入显色液A液(50μL/孔),加入显色液B液(50μL/孔),10min;加入终止液,50μL/孔;酶标仪上450nm(参考630nm)处读OD值。结果见表6。
表6抗体及其突变体的活性数据
样品浓度(ng/ml) 250 125 62.5 31.25 15.625 0
WT 1.572 1.031 0.605 0.388 0.143 0.054
突变1 2.074 1.514 0.944 0.753 0.408 0.092
突变2 1.909 1.464 0.865 0.612 0.384 0.049
突变3 1.985 1.509 0.897 0.691 0.394 0.087
突变4 1.904 1.471 0.845 0.707 0.397 0.043
突变5 0.045 - - - - -
突变6 0.033 - - - - -
由表6可知,WT和突变1~4具有较好的结合活性,而突变5~6在抗体浓度为125ng/ml时无法检测样品。
实施例1提供的抗体及其突变体的亲和力检测。
在突变1的基础上,对其他位点进行突变,各突变的序列见下表7。
表7与抗体亲和力相关的突变位点
Figure BDA0002320410280000142
Figure BDA0002320410280000151
Figure BDA0002320410280000161
亲和力分析
利用AMC传感器,纯化出来的抗体用PBST稀释到指定浓度,PK2-HE4(170516)用PBST进行梯度稀释。
运行流程:缓冲液1(PBST)中平衡60s,抗体溶液中固化抗体300s,缓冲液2(PBST)中孵育180s,抗原溶液中结合420s,缓冲液2中解离1200s,用10mM pH 1.69GLY溶液及缓冲液3进行传感器再生,输出数据。(KD表示平衡解离常数即亲和力;kon表示结合速率;kdis表示解离速率。)
表8亲和力检测数据
Figure BDA0002320410280000162
Figure BDA0002320410280000171
Figure BDA0002320410280000181
由表8可知,突变1以及突变1-1~60的KD值较低,说明表8中突变的位点对抗体亲和力没有或无太大消极影响,突变后仍具有较好的亲和力。
在WT的基础上,对其他位点进行突变,并检测各突变体的亲和力,各突变体的序列如表9所示,对应的亲和力数据参照表10。
表9以WT为骨架进行的突变
Figure BDA0002320410280000182
表10以WT为骨架进行的突变的亲和力检测
K<sub>D</sub>(M) kon(1/Ms) kdis(1/s) K<sub>D</sub>(M) kon(1/Ms) kdis(1/s)
WT 8.45E-07 4.44E+03 3.75E-03 WT 1-3 1.79E-07 6.75E+03 1.21E-03
WT 1-1 6.70E-07 4.24E+03 2.84E-03 WT 1-4 6.39E-07 3.32E+03 2.12E-03
WT 1-2 1.41E-07 3.21E+04 4.53E-03 WT 1-5 5.47E-07 5.87E+03 3.21E-03
由表10可知,WT和WT1-1~WT1-6均具有较好的亲和力,说明表9中的突变位点对于抗体亲和力无较大影响。
裸抗稳定性检测
将本发明实施例提供的HE4单克隆抗体置于4℃(冰箱)、-80℃(冰箱)、37℃(恒温箱)放置21天,取7天、14天、21天样品进行状态观察,并对21天样品进行活性检测,结果显示三种考核条件下抗体放置21天均未见明显蛋白状态变化,活性也未随考核温度的升高呈下降越势,说明自产抗体稳定。下表为突变1抗体考核21天的酶免活性检测OD结果。结果请参照表11。
表11检测结果
样品浓度(ng/ml) 250 62.5 0
4℃,21天样品 2.057 0.876 0.071
-80℃,21天样品 2.041 0.882 0.069
37℃,21天样品 2.086 0.907 0.054
从表11可知,在不同温度下存放21天后,本发明实施例的HE4抗体依然可以将抗原检测出,说明本发明实施例提供的抗体具有较好的稳定性。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已,并不用于限制本发明,对于本领域的技术人员来说,本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 东莞市朋志生物科技有限公司
<120> 一种可特异性结合检测人附睾蛋白4的结合蛋白及其制备方法和应用
<130> 250
<160> 14
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Thr Val Ser Leu Ser Cys
20
<210> 2
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 2
Trp Tyr Gln Gln Lys Ser His Lys Ser Pro Arg Leu Leu Ile Lys
1 5 10 15
<210> 3
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 3
Gly Ile Pro Ser Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr
1 5 10 15
Leu Ser Ile Asn Ser Val Lys Pro Glu Asp Glu Gly Leu Tyr Tyr Cys
20 25 30
<210> 4
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 4
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
1 5 10
<210> 5
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 5
Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser
20 25
<210> 6
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 6
Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met Gly
1 5 10
<210> 7
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 7
Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr Leu Gln
1 5 10 15
Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Met Ala Thr Tyr Phe Cys
20 25 30
<210> 8
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 8
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 9
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 9
Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln
1 5 10 15
Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr
20 25 30
Pro Arg Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln
35 40 45
Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
50 55 60
Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg
65 70 75 80
His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro
85 90 95
Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys
100 105
<210> 10
<211> 203
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 10
Ala Lys Thr Thr Ala Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Val Cys Gly
1 5 10 15
Asp Thr Thr Gly Ser Ser Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Leu Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu
50 55 60
Ser Ser Ser Val Thr Val Thr Ser Ser Thr Trp Pro Ser Gln Ser Ile
65 70 75 80
Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys
85 90 95
Ile Glu Pro Arg Gly Pro Thr Ile Lys Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Asn Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp
145 150 155 160
Phe Val Asn Asn Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg
165 170 175
Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln
180 185 190
His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe Lys
195 200
<210> 11
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 11
Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Ala Tyr Thr Phe Thr Lys Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr His Ala Asp Asp Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Met Ala Thr Tyr Phe Cys
85 90 95
Leu Ser Gly Leu Gly Tyr Gly Thr Ser Pro Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
115
<210> 12
<211> 322
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 12
Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Ala Tyr Thr Phe Thr Lys Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr His Ala Asp Asp Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Met Ala Thr Tyr Phe Cys
85 90 95
Leu Ser Gly Leu Gly Tyr Gly Thr Ser Pro Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Ala Pro Ser Val Tyr
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Val Cys Gly Asp Thr Thr Gly Ser Ser Val Thr Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Leu Thr Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Thr Ser Ser
180 185 190
Thr Trp Pro Ser Gln Ser Ile Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser
195 200 205
Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Glu Pro Arg Gly Pro Thr Ile Lys
210 215 220
Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys Pro Ala Pro Asn Leu Leu Gly Gly Pro
225 230 235 240
Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser
245 250 255
Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp
260 265 270
Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn Val Glu Val His Thr
275 280 285
Ala Gln Thr Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val
290 295 300
Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu
305 310 315 320
Phe Lys
<210> 13
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 13
Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Thr Val Ser Leu Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser Ile Tyr Lys Ser
20 25 30
Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser His Lys Ser Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Lys Tyr Gly Ser Asp Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Lys Pro
65 70 75 80
Glu Asp Glu Gly Leu Tyr Tyr Cys Leu Gln Gly Tyr Ser Phe Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 14
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 14
Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Thr Val Ser Leu Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser Ile Tyr Lys Ser
20 25 30
Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser His Lys Ser Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Lys Tyr Gly Ser Asp Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Lys Pro
65 70 75 80
Glu Asp Glu Gly Leu Tyr Tyr Cys Leu Gln Gly Tyr Ser Phe Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala
100 105 110
Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly
115 120 125
Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Asp Ile
130 135 140
Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu
145 150 155 160
Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr
180 185 190
Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Asn Glu Cys
210

Claims (10)

1.一种分离的结合蛋白,其特征在于,所述结合蛋白如(1)或(2)所示:
(1)所述结合蛋白包含第一抗原结合结构域,所述第一抗原结合结构域包括如下互补决定区中的至少一个:
互补决定区CDR-VH1,其氨基酸序列为X1-Y-T-F-T-X2-Y-G-M-H,其中,X1是G或A,X2是Q、K或N;
互补决定区CDR-VH2,其氨基酸序列为W-X1-N-T-Y-T-G-X2-P-T-X3-A-D-X4-F-K-G,其中,X1是I或L,X2是E或N,X3是Y或H,X4是E或D;
互补决定区CDR-VH3,其氨基酸序列为X1-S-G-X2-G-Y-G-X3-S-P-D,其中,X1是I、V或L,X2是I、V或L,X3是S或T;
互补决定区CDR-VL1,其氨基酸序列为R-A-S-X1-S-X2-Y-X3-S-X4-H,其中,X1是K或Q,X2是I或L,X3是N、D或K,X4是I或L;
互补决定区CDR-VL2,其氨基酸序列为Y-X1-S-X2-S-X3-S,其中,X1是G或A,X2是Q、D或N,X3是I或L;
互补决定区CDR-VL3,其氨基酸序列为X1-X2-G-Y-S-X3-P-W,其中,X1是I或L,X2是Q或N,X3是T、F或W;
(2)所述结合蛋白包含第二抗原结合结构域,所述第二抗原结合结构域与所述第一抗原结合结构域具有至少80%的序列同一性。
2.根据权利要求1所述的分离的结合蛋白,其特征在于,所述互补决定区CDR-VH1中,X1为G;
所述互补决定区CDR-VH2中,X3为Y;
所述互补决定区CDR-VH3中,X3为S;
所述互补决定区CDR-VL1中,X1为Q;
所述互补决定区CDR-VL2中,X1为A;
所述互补决定区CDR-VL3中,X3为T;
优选地,所述第二抗原结合结构域与人附睾蛋白4具有KD≤8.45×10-7mol/L的亲和力;
优选地,所述互补决定区CDR-VH1中,X2为Q;
优选地,所述互补决定区CDR-VH1中,X2为K;
优选地,所述互补决定区CDR-VH1中,X2为N;
优选地,所述互补决定区CDR-VH2中,X1为I;
优选地,所述互补决定区CDR-VH2中,X1为L;
优选地,所述互补决定区CDR-VH2中,X2为E;
优选地,所述互补决定区CDR-VH2中,X2为N;
优选地,所述互补决定区CDR-VH2中,X4为E;
优选地,所述互补决定区CDR-VH2中,X4为D;
优选地,所述互补决定区CDR-VH3中,X1为I;
优选地,所述互补决定区CDR-VH3中,X1为V;
优选地,所述互补决定区CDR-VH3中,X1为L;
优选地,所述互补决定区CDR-VH3中,X2为I;
优选地,所述互补决定区CDR-VH3中,X2为V;
优选地,所述互补决定区CDR-VH3中,X2为L;
优选地,所述互补决定区CDR-VL1中,X2为I;
优选地,所述互补决定区CDR-VL1中,X2为L;
优选地,所述互补决定区CDR-VL1中,X3为N;
优选地,所述互补决定区CDR-VL1中,X3为D;
优选地,所述互补决定区CDR-VL1中,X3为K;
优选地,所述互补决定区CDR-VL1中,X4为I;
优选地,所述互补决定区CDR-VL1中,X4为L;
优选地,所述互补决定区CDR-VL2中,X2为Q;
优选地,所述互补决定区CDR-VL2中,X2为D;
优选地,所述互补决定区CDR-VL2中,X2为N;
优选地,所述互补决定区CDR-VL2中,X3为I;
优选地,所述互补决定区CDR-VL2中,X3为L;
优选地,所述互补决定区CDR-VL3中,X1为I;
优选地,所述互补决定区CDR-VL3中,X1为L;
优选地,所述互补决定区CDR-VL3中,X2为Q;
优选地,所述互补决定区CDR-VL3中,X2为N;
优选地,各互补决定区的突变位点选自以下突变组合1~61中的任一种:
Figure FDA0002320410270000021
Figure FDA0002320410270000031
Figure FDA0002320410270000041
优选地,所述结合蛋白包含至少3个互补决定区;或,所述结合蛋白包含至少6个互补决定区;
优选地,所述结合蛋白为抗体或其功能性片段;
优选地,所述结合蛋白选自纳米抗体、F(ab’)2、Fab’、Fab、Fv、scFv、双特异抗体和抗体最小识别单位中的任意一种;
优选地,所述结合蛋白包括序列依次如SEQ ID NO.1~4所示的轻链骨架区FR-L1、FR-L2、FR-L3及FR-L4,和/或,序列依次如SEQ ID NO.5~8所示的重链骨架区FR-H1、FR-H2、FR-H3及FR-H4;
优选地,所述结合蛋白还包括抗体恒定区序列;
优选地,所述恒定区选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE和IgD中的任意一者的恒定区;
优选地,所述恒定区的种属来源为牛、马、乳牛、猪、绵羊、山羊、大鼠、小鼠、狗、猫、兔、骆驼、驴、鹿、貂、鸡、鸭、鹅、火鸡、斗鸡或人;
优选地,所述恒定区来源于小鼠;
优选地,所述抗体恒定区的轻链恒定区序列如SEQ ID No.9所示,所述抗体恒定区的重链恒定区序列如SEQ ID No.10所示。
3.根据权利要求1所述的分离的结合蛋白,其特征在于,所述互补决定区CDR-VH1中,X1为A;
所述互补决定区CDR-VH2中,X3为H;
所述互补决定区CDR-VH3中,X3为T;
所述互补决定区CDR-VL1中,X1为K;
所述互补决定区CDR-VL2中,X1为G;
所述互补决定区CDR-VL3中,X3为F;
优选地,各互补决定区的突变位点选自以下突变组合62~66中的任一种:
Figure FDA0002320410270000042
Figure FDA0002320410270000051
4.一种分离的核酸,其特征在于,所述核酸为DNA或RNA,其编码如权利要求1~3任一项所述的结合蛋白。
5.一种载体,其特征在于,其含有如权利要求4所述的分离的核酸。
6.一种宿主细胞,其特征在于,其含有如权利要求5所述的载体。
7.如权利要求1~3任一项所述的分离的结合蛋白的制备方法,其特征在于,其包括:培养如权利要求6所述的宿主细胞,从培养基或培养的所述宿主细胞中获取所述结合蛋白。
8.一种用于检测人附睾蛋白4水平异常的相关疾病的试剂或试剂盒,其特征在于,其包含如权利要求1~3任一项所述的结合蛋白;
优选地,所述人附睾蛋白4水平异常的相关疾病包括:卵巢癌、子宫内膜癌、肺癌和间皮瘤。
9.如权利要求1~3任一项所述的分离的结合蛋白在制备用于检测人附睾蛋白4水平异常的相关疾病的试剂或试剂盒中的应用;
优选地,所述人附睾蛋白4水平异常的相关疾病包括:卵巢癌、子宫内膜癌、肺癌和间皮瘤。
10.一种检测人附睾蛋白4的方法,其特征在于,其包括采用权利要求1~3任一项所述的结合蛋白检测待测样本中的人附睾蛋白4;
优选地,所述方法是通过沉淀反应实现人附睾蛋白4的检测的方法或者是通过标记显示信号强度的指示剂实现人附睾蛋白4检测的方法;
优选地,所述通过沉淀反应实现人附睾蛋白4的检测选自如下方法中的任意一种或几种:单向免疫扩散试验、双向免疫扩散试验、免疫比浊法、对流免疫电泳、免疫电泳以及免疫印迹法;
优选地,所述通过标记显示信号强度的指示剂实现人附睾蛋白4检测的方法选自如下方法中的任意一种或几种:免疫荧光法、放射免疫分析法、酶联免疫分析法以及化学发光免疫分析法;
优选地,所示指示剂选自荧光染料、放射性同位素、催化底物显色的酶和化学发光试剂中的任意一种。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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