CN112972476B - 一种抑制马立克氏病病毒复制、预防或抗马立克氏病的药物 - Google Patents

一种抑制马立克氏病病毒复制、预防或抗马立克氏病的药物 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种抑制马立克氏病病毒复制的药物，包括去泛素化酶UL36抑制剂，以及一种预防或抗马立克氏病药物。通过抑制病毒编码的酶活性实验、CEF细胞水平上进行药物毒性实验、病毒CPE抑制实验和鸡马立克氏病模型实验，本发明首次筛选出去泛素化酶UL36抑制剂DUBs‑IN‑1及其衍生物，不仅能够在酶水平上抑制UL36的活性，在细胞水平上抑制马立克氏病病毒的复制，还可在动物水平上抑制马立克氏病肿瘤生长和内脏出血，且具有效果极强，剂量小的优点，可作为抗MD药物广泛用于养禽业防御马立克氏病的生产实践中。

Description

一种抑制马立克氏病病毒复制、预防或抗马立克氏病的药物
技术领域
本发明涉及化合物应用领域，具体涉及DUBs-IN-1及其衍生物作为抑制马立克氏病病毒复制以及抗马立克氏病发生药物的应用。
背景技术
马立克氏病(MD)是一种由于鸡感染致病型血清I型马立克氏病病毒(MDV)而引起的高度传染性、高致病性、淋巴组织增生性病毒性肿瘤病，此病世界各地广泛存在，我国与埃及是此病的高发病率国家。因此，MD对我国的养禽业是重要威胁。鸡是MDV最重要的自然宿主，MDV属于细胞结合性的疱疹病毒科，其分子结构和基因组成与α疱疹病毒相似。除非是在严格的无特定病原体(SPF)条件下饲养,否则所有鸡群都可能被感染，即便是经过疫苗免疫的鸡群也不能幸免。MD被认为是严重危害世界养鸡业的主要疫病之一，给世界家禽业带来了巨大的经济损失。
MD疫苗是目前广泛用来防御MD的主要手段，自20世纪70年代以来，疫苗在家禽养殖业开始普遍用于MD的控制。已经有研究表明，接种MD疫苗能在一定程度上减少鸡体发生MD恶性肿瘤和免疫抑制的概率，但MDV仍然可以感染经MD疫苗免疫的鸡，疫苗的免疫作用不能阻止鸡体内病毒的复制、成熟和释放。因此，经MD疫苗免疫并被MDV感染而不发病的鸡，就成为MDV新的传染源，同时，由于疫苗免疫引起的免疫压力，造成MDV毒力不断增强，进而造成新疫苗使用约10年，就会有毒力更强的MDV毒株的出现。因此，上述原因造成病毒突破疫苗免疫防御引起MD的暴发，是养禽业的重大威胁。而抑制MDV在鸡细胞内的复制是切断传染源，扼制MDV毒力增强的最有效办法，也是控制MD暴发，增强疫苗的防御效果的关键。
DUBs-IN-1中文名称为9-[(苯甲氧基)肟]-9H-茚并[1,2-B]吡嗪-2,3-二甲腈，中文别名为9-苄氧基亚氨基-9H-茚并[1,2-B]吡嗪-2,3-二甲腈，其CAS号为924296-18-4，其分子式为C20H11N5O，相对分子质量为337.33，是一种蛋白酶抑制剂。其药理功能目前还未见报道，且至今也未见任何关于DUBs-IN-1抗MD或任何抑制MDV病毒复制的报道。其结构式如下：
Figure BDA0002994147320000011
DUBs-IN-2，CAS号是924296-19-5，分子式是C15H9N5O，分子量是275.26，是DUBs-IN-1的一种衍生物，是一种蛋白酶抑制剂。其药理功能目前还未见报道，且至今也未见任何关于DUBs-IN-2抗MD或任何抑制MDV病毒复制的报道。其结构式如下：
Figure BDA0002994147320000021
DUBs-IN-3，CAS号是924296-17-3，分子式是C16H9N5O，分子量是287.28，是DUBs-IN-1的一种衍生物，是一种蛋白酶抑制剂。其药理功能目前还未见报道，且至今也未见任何关于DUBs-IN-3抗MD或任何抑制MDV病毒复制的报道。其结构式如下：
Figure BDA0002994147320000022
发明内容
本发明为了抗鸡MD的发生，抑制MDV在鸡细胞内的复制，提高MD疫苗防御效果，扼制MDV毒力的增强，提供了一种DUBs-IN-1及其衍生物作为抑制MDV复制和抗鸡MD药物的新用途，基于MDV编码的去泛素化酶UL36活性抑制系统，以及细胞接种病毒和马立克氏病动物模型，筛选出DUBs-IN-1及其衍生物在安全浓度下能有效地抑制MDV的复制、攻毒实验动物模型肿瘤的产生。
本发明提供了一种抑制MDV复制的药物，包括去泛素化酶UL36抑制剂。UL36是疱疹病毒编码的N端具有去泛素化酶结构域的大被膜蛋白。经过本发明的研究，确定去泛素化酶UL36抑制剂能够在细胞水平抑制MDV复制，并且对鸡的细胞没有毒副作用。然而由于动物体内复杂的体内环境，细胞水平的数据无法指导实际的生产需要，本发明对去泛素化酶UL36抑制剂在动物水平(即活体鸡)的作用进行的进一步的研究，并确定了去泛素化酶抑制剂在鸡体内安全有效的使用剂量。
优选的是，所述去泛素化酶UL36抑制剂为DUBs-IN-1及其衍生物。本发明对5000余个蛋白酶抑制剂进行高通量筛选，初步缩小范围后，进一步筛选抑制去泛素化酶UL36活性的化合物。幸运的发现，DUBs-IN-1及其衍生物具有抑制去泛素化酶UL36的作用，DUBs-IN-1及其衍生物，均具有抗MD和MDV活性，优选的DUBs-IN-1的衍生物为DUBs-IN-2、DUBs-IN-3。
DUBs-IN-1、DUBs-IN-2、DUBs-IN-3作为一种蛋白酶抑制剂，目前只知道DUBs-IN-1可USP7和USP8，影响细胞内哪种信号通路未见报道。经过本发明的研究表明，针对细胞和鸡体的安全浓度范围内，DUBs-IN-1特异性的抑制去泛素化酶UL36的活性，而对鸡细胞本身的信号通路和蛋白无显著抑制作用。本发明对DUBs-IN-2、DUBs-IN-3的研究也得到了一致的结果。
上述任一项优选的是，所述去泛素化酶UL36抑制剂为DUBs-IN-1、DUBs-IN-2或DUBs-IN-3的至少一种，所述DUBs-IN-1、DUBs-IN-2或DUBs-IN-3抑制细胞内MDV的复制。通过向感染MDV的鸡细胞的培养体系中添加DUBs-IN-1、DUBs-IN-2或DUBs-IN-3，MDV复制受到显著抑制。DUBs-IN-1、DUBs-IN-2或DUBs-IN-3是在感染了MDV的CEF细胞(鸡胚成纤维细胞)或者DF-1细胞(鸡胚成纤维细胞系)水平上抑制病毒的复制。
上述任一项优选的是，所述去泛素化酶UL36抑制剂细胞水平作用浓度为0.01～300μM。所述细胞水平优选的细胞为CEF细胞或DF-1细胞。进一步优选的浓度为0.01～110μM，0.01～0.3μM，0.01μM、0.05μM、0.1μM、0.2μM、0.4μM、1.2μM、5.3μM、10.2μM、20.3μM、30.1μM、40.6μM、50.6μM、60.1μM、70.2μM、80.1μM、90.2μM、100μM、131μM、152μM、192μM、241μM、280μM、292μM、300μM。
优选的，所述去泛素化酶UL36抑制剂为DUBs-IN-1，DUBs-IN-1细胞水平的作用浓度为0.01～0.3μM。所述细胞水平优选的细胞为CEF细胞或DF-1细胞。0.01μM的DUBs-IN-1在CEF细胞水平抑制MDV的复制，优选的，0.02μM、0.05μM、0.07μM、0.1μM、0.13μM、0.17μM、0.19μM、0.21μM、0.24μM、0.27μM、0.3μM均有效抑制感染MDV的细胞内MDV的复制，同时对细胞本身没有毒副作用。DUBs-IN-1的浓度大于10nM时可显著减少病毒的复制。当浓度达到20nM时，基本上可以完全抑制病毒在细胞内的复制和对细胞的感染，并且在此浓度范围药物对细胞没有造成显著伤害。
优选的，所述去泛素化酶UL36抑制剂为DUBs-IN-2，DUBs-IN-2细胞水平的作用浓度为0.01～110μM，所述细胞水平优选的细胞为CEF细胞或DF-1细胞。进一步优选的DUBs-IN-2细胞水平的作用浓度为0.01μM、0.2μM、0.4μM、1.2μM、5.3μM、10.2μM、20.3μM、30.1μM、40.6μM、50.6μM、60.1μM、70.2μM、80.1μM、90.2μM、100μM、110μM。所述剂量有效抑制感染MDV的细胞内MDV的复制，同时对细胞本身没有毒副作用。
优选的，所述去泛素化酶UL36抑制剂为DUBs-IN-3时细胞水平的作用浓度为0.01～300μM，所述细胞水平优选的细胞为CEF细胞或DF-1细胞。进一步优选的DUBs-IN-3细胞水平的作用浓度为0.01μM、0.2μM、0.4μM、1.2μM、5.3μM、10.2μM、20.3μM、30.1μM、40.6μM、50.6μM、60.1μM、70.2μM、80.1μM、90.2μM、100μM、131μM、152μM、192μM、241μM、280μM、292μM、300μM。所述剂量有效抑制感染MDV的细胞内MDV的复制，同时对细胞本身没有毒副作用。
上述任一项优选的是，所述MDV为血清I型MDV。
本发明还提供了一种预防或抗MD药物，包括上述任一项所述的抑制MDV复制的药物。
优选的，本发明提供的预防或抗MD药物，包括去泛素化酶UL36抑制剂。本发明首次在动物体内对去泛素化酶UL36及其抑制剂的作用进行的研究，发现在MD动物模型体内去泛素化酶UL36抑制剂特异性地对MDV的去泛素化酶产生抑制作用，而对动物体内自身的去泛素化酶没有抑制作用，对动物体没有产生毒副作用。
优选的是，所述去泛素化酶UL36抑制剂包括DUBs-IN-1、DUBs-IN-2或DUBs-IN-3的至少一种。
上述任一项优选的是，所述去泛素化酶UL36抑制剂动物水平使用剂量不低于0.01mg/(kg·d)(所述动物水平是指鸡体内)。进一步优选的使用剂量不低于0.04mg/(kg·d)，或大于0.05mg/(kg·d)，或0.5～30mg/(kg·d)，或0.1～6mg/(kg·d)，或0.04～2.5mg/(kg·d)，或0.02～78mg/(kg·d)，或0.01～42mg/(kg·d)，或0.01～69mg/(kg·d)，或0.5～130mg/(kg·d)，或0.1～80mg/(kg·d)，或0.3～100mg/(kg·d)，优选为0.04、0.08、0.11、0.21、0.31、0.41、0.51、0.7、0.9、1.1、1.9、2.3、3.2、4.7、5.9、7.2、8.9、9.8、11、13、17、21、27、29、31、42、51、61、68、71、78、91、111、120、125、130mg/(kg·d)。
优选的，采用DUBs-IN-1作为去泛素化酶UL36抑制剂，DUBs-IN-1的使用剂量不低于0.04mg/(kg·d)。所述剂量抑制感染MDV的鸡体内MDV的复制。DUBs-IN-1的使用剂量在大于0.05mg/(kg·d)，可显著抑制感染MDV的鸡的内出血和肿瘤等症状的出现，也即DUBs-IN-1可抑制鸡MD的发生。
上述任一项优选的是，所述预防或抗MD药物的给药方式包括口服、腹腔注射或肌肉注射。
上述任一项优选的是，采用DUBs-IN-1作为去泛素化酶UL36抑制剂时，当口服时，DUBs-IN-1剂量为0.5～30mg/(kg·d)。优选的，DUBs-IN-1效果最佳的口服剂量为25mg/(kg·d)。其他优选的DUBs-IN-1口服剂量为0.5、0.7、0.9、1.1、1.9、2.3、3.2、4.7、5.9、7.2、8.9、9.8、11、13、17、21、27、29、30mg/(kg·d)。优选的是，当腹腔注射时，DUBs-IN-1剂量为0.04～2.5mg/(kg·d)。优选的，DUBs-IN-1效果最佳的腹腔注射剂量为2.1mg/(kg·d)。其他优选的DUBs-IN-1腹腔注射剂量为0.04、0.06、0.09、1.1、1.3、1.8、2.1、2.3、2.5mg/(kg·d)。优选的是，当肌肉注射时，DUBs-IN-1剂量为0.1～6mg/(kg·d)。优选的，DUBs-IN-1效果最佳的肌肉注射剂量为5.0mg/(kg·d)。其他优选的DUBs-IN-1肌肉注射剂量为0.1、0.3、0.7、1.2、1.9、2.6、3.8、4.2、4.8、5.2、5.7、6.0mg/(kg·d)。所述剂量抑制感染MDV的鸡体内MDV的复制；抑制感染MDV的鸡的内出血和肿瘤等症状的出现；抑制鸡MD的发生。
上述任一项优选的是，采用DUBs-IN-2作为去泛素化酶UL36抑制剂。当口服时DUBs-IN-2剂量为0.02～78mg/(kg·d)，优选的是0.02、0.03、0.11、0.31、0.5、0.7、0.9、1.1、1.9、2.3、3.2、4.7、5.9、7.2、8.9、9.8、11、13、17、21、27、29、31、42、51、61、68、71、78mg/(kg·d)。当腹腔注射时DUBs-IN-2剂量为0.01～42mg/(kg·d)，优选的是0.01、0.03、0.11、0.31、0.5、0.7、0.9、1.1、1.9、2.3、3.2、4.7、5.9、7.2、8.9、9.8、11、13、17、21、27、29、31、38、42mg/(kg·d)。当肌肉注射时DUBs-IN-2剂量为0.01～69mg/(kg·d)，优选的是0.01、0.03、0.11、0.31、0.5、0.7、0.9、1.1、1.9、2.3、3.2、4.7、5.9、7.2、8.9、9.8、11、13、17、21、27、29、31、42、51、56、61、69mg/(kg·d)。所述剂量抑制感染MDV的鸡体内MDV的复制；抑制感染MDV的鸡的内出血和肿瘤等症状的出现；抑制鸡MD的发生。
上述任一项优选的是，采用DUBs-IN-3作为去泛素化酶UL36抑制剂。当口服时DUBs-IN-3剂量为0.5～130mg/(kg·d)，优选的是0.5、0.7、0.9、1.1、1.9、2.3、3.2、4.7、5.9、7.2、8.9、9.8、11、13、17、21、27、29、31、42、51、61、68、71、78、91、111、120、125、130mg/(kg·d)。当腹腔注射时DUBs-IN-3剂量为0.1～80mg/(kg·d)，优选的是0.1、0.2、0.35、0.5、0.7、0.9、1.1、1.9、2.3、3.2、4.7、5.9、7.2、8.9、9.8、11、13、17、21、27、29、31、38、42、51、61、75、80mg/(kg·d)。当肌肉注射时DUBs-IN-3剂量为0.3～100mg/(kg·d)，优选的是0.3、0.5、0.7、0.9、1.1、1.9、2.3、3.2、4.7、5.9、7.2、8.9、9.8、11、13、17、21、27、29、31、42、51、56、61、71、81、96、100mg/(kg·d)。所述剂量抑制感染MDV的鸡体内MDV的复制；抑制感染MDV的鸡的内出血和肿瘤等症状的出现；抑制鸡MD的发生。
上述任一项优选的是，DUBs-IN-1、DUBs-IN-2或DUBs-IN-3抑制感染MDV鸡MD肿瘤生成。
本发明的有益处效果是：本发明首次筛选出DUBs-IN-1及其衍生物，尤其是DUBs-IN-1、DUBs-IN-2以及DUBs-IN-3不仅能够在酶水平上抑制UL36的活性，在细胞水平上抑制MDV的复制，还可在动物水平上抑制MD肿瘤生长和内脏出血，且具有效果极强，剂量小的优点，可作为抗MD药物广泛用于养禽业防御MD的生产实践中，具有良好经济价值及研究意义。
目前，MDV的毒力不断增强，接种了疫苗的鸡群仍然有可能暴发MD。在此现状下，本发明找到了一个控制MD的新途径，并能增强MD疫苗的效果，而且应用前景广泛。
附图说明
图1为本发明实施例1的DUBs-IN-1对UL36酶活性抑制示意图。
图2为本发明实施例2的DUBs-IN-1浓度与细胞死亡率关系示意图。
图3为本发明实施例2在MDV或MDV+药物处理三天后细胞病变CPE(cytopathiceffect)图。
图4为本发明实施例2的药物浓度与MDV的CPE面积关系图。
图5为本发明实施例2中代表CT值和标准质粒拷贝之间线性关系的标准曲线图。
图6为本发明实施例2的CEF细胞中MDV基因组拷贝数与药物浓度关系图。
图7为本发明实施例3的MD模型鸡T细胞中MDV基因组拷贝数与药物浓度关系图。
图8为本发明实施例3的MD模型鸡MD发病率与药物浓度关系图。
图9为本发明实施例3的药物浓度与MD模型鸡的肿瘤数量关系示意图。
具体实施方式
本发明通过以下实施例进行更加清晰、完整的描述，但所描述的实例仅是本发明一部分实施例，并非全部。所述实施例为帮助理解本发明，不应依此来局限本发明的保护范围。
实施例1
DUBs-IN-1抑制MDV编码的UL36的酶活性。
酶反应体系：在100μL反应体系中含2.5nM UL36蛋白，1×反应缓冲液(50mM HEPESpH7.8，0.1mg/mL BSA，0.5mM EDTA，1mM DTT)，添加反应荧光底物Ub-AMC，37℃孵育，在荧光分光光度计上测量荧光强度变化。添加5μM的DUBs-IN-1的反应体系作为“抑制剂组”，未加DUBs-IN-1但添加了等量溶剂DMSO的反应体系作为“无抑制剂组”。结果如图1，“无抑制剂组”中UL36正常水解Ub-AMC并产生荧光信号，而“抑制剂组”中的UL36的活性受到抑制，荧光信号未增加。此结果说明DUBs-IN-1抑制了MDV编码的UL36的酶活性。
实施例2
DUBs-IN-1在CEF细胞水平上抑制MDV复制。
CEF细胞的制备及MDV的感染：
1、取9～11日龄SPF鸡胚，用酒精棉擦拭鸡胚，由气室向四周擦拭消毒。然后将鸡胚放入超净工作台，将气室部位朝上。小心地用高压灭菌后的镊子敲破气室，并夹掉蛋壳。
2、换用新的无菌镊子揭开尿囊绒毛膜，弃去卵壳和卵黄膜。用灭菌镊子夹住鸡胚的头部，轻轻将其移动至平皿。
3、用灭菌镊子固定好头部，用灭菌剪刀剪去头部，四肢，脏器，用灭菌PBS反复冲洗至无色。
4、用灭菌剪刀将组织块剪碎至无大颗粒组织，加入8mL灭菌PBS清洗，静置1min，用移液枪弃去混有红细胞及组织碎片的悬液。
5、按组织块体积的3～5倍加入0.25％胰蛋白酶，置于37℃水浴锅中消化15min，期间不断摇晃，待组织变白色且松散后，加入终浓度为10％的FBS终止消化，并将细胞反复吹打使分散为单个细胞。
6、用灭菌纱布过滤细胞悬液后，将滤液加入到离心管中，1000r/min室温下离心8min，弃去上清。
7、用含有10％FBS的DMEM培养基重悬细胞，稀释至合适浓度后加至细胞培养瓶中，放置于37℃，5％CO2培养箱内培养，直至细胞长成单层细胞并且达到80％丰度。
8、从液氮中取出病毒，用培养基适当稀释，使病毒的最终浓度为200PFU。
9、将病毒加入铺好的单层CEF细胞中。
CCK-8法检测DUBs-IN-1对CEF的细胞毒性：
1、CEF细胞的DUBs-IN-1处理，具体操作为：在96孔板中每孔铺入20000个CEF细胞，用培养基将DUBs-IN-1稀释成浓度梯度，将含有DUBs-IN-1浓度梯度的培养基加入96孔板，每孔体积为100μL，于37℃，5％CO2培养箱内培养72h。
2、CCK-8法检测细胞活力，具体操作为：在上述96孔板中每孔加入10μL CCK-8溶液，随后将培养板放入37℃，5％CO2培养箱内孵育3h，用酶标仪测定在波长450nm处的吸光值(OD值)，各平行孔的OD值取平均数。抑制率％＝(对照细胞OD450-加药细胞OD450)/(对照细胞OD450-空白OD450)×100％，用Graph Pad Prism 8作图。横坐标为药物浓度，纵坐标为细胞死亡率，如图2所示。实验进行三次重复。以此确定DUBs-IN-1对CEF细胞的安全浓度。
DUBs-IN-1在CEF细胞水平上抑制MDV复制的检测：
1、形态学观察：在6孔板中每孔铺入200000个细胞，待其贴壁长成单层细胞后，将其培养基分别更换为含有等体积的DMSO、终浓度为5nM、10nM、20nM、50nM和100nM的抑制剂药物的培养基，并以200PFU每孔接种MDV，三天后在显微镜下观察MDV病毒所致的CPE，如图3所示，并记录CPE面积，用Graph Pad Prism 8作图，横坐标为药物浓度，纵坐标为CPE面积，如图4所示，实验进行三次重复。
2、拷贝数变化
a、标准曲线的绘制
根据血清I型MDV基因组基因序列，构建了荧光定量PCR标准品质粒，质粒包含血清I型MDV基因组特异序列，并以标准质粒序列为基础设计了一对实时荧光定量PCR引物：上游引物序列如Seq ID NO:1所示，下游引物序列如Seq ID NO:2所示。通过对标准质粒进行Q-PCR，应用CT值和标准质粒拷贝数绘制了具有良好的线性关系的标准曲线，如图5所示，实验进行三次重复。
b、病毒拷贝数的测定
在6孔板中每孔铺入200000个细胞，待其贴壁长成单层细胞后，将其培养基分别更换为含有等体积的DMSO、终浓度为5nM、10nM、20nM、50nM和100nM的抑制剂药物的培养基，以200PFU每孔接毒。以每孔为单位提取基因组。用上述引物进行Q-PCR。根据结果进行定量分析。将每组得到的CT值代入标准曲线得到拷贝数。用Graph Pad Prism 8作图。横坐标为药物浓度，纵坐标为拷贝数，如图6所示。实验进行三次重复。
实施例3
DUBs-IN-1在鸡MD病模型水平上抑制MDV复制和MD的发生。
具体操作为：取1日龄SPF鸡，按MDV滴度为1000PFU，攻毒方式为腹腔接种，这些攻毒鸡按每天给予腹腔注射DUBs-IN-1处理，实验分为0.001、0.005、0.01、0.04、0.1、0.15和0.2共7组，未给药处理，只注射等量DMSO的组作为对照组。每组10只鸡。攻毒后20天翅下血管取血，分离T淋巴细胞，按200000个细胞数量进行MDV基因拷贝数的定量分析，如图7。统计攻毒后50天内各组鸡的MD发病率，如图8。攻毒后50天或在此期间濒临死亡时，进行剖检，记录内脏肿瘤数量，其中统计肝脏和脾脏的肿瘤数量做图。如图9。与对照组相比，随着给药量增加，MDV攻毒鸡的MD发病率显著下降，甚至在高剂量组未见显著发病表现；T细胞内MDV基因组拷贝数显著下降；内脏肿瘤数量显著减少，高剂量组个体几乎无显著肿瘤出现。说明DUBs-IN-1可抑制MDV在鸡体内的复制，可抑制鸡MD的发生。
实施例4
将DUBs-IN-1通过口服、腹腔注射、肌肉注射方式作用于鸡MD病模型，实验表明三种给药方式均能够有效的抑制MDV在鸡体内的复制，抑制鸡MD的发生。表1为三种给药方式，及细胞水平实验中，DUBs-IN-1的安全范围、有效范围和最佳剂量。
表1:
Figure BDA0002994147320000081
实施例5
验证DUBs-IN-1对去泛素化酶UL36特异性的抑制作用。本发明通过实验验证并表明，DUBs-IN-1、DUBs-IN-2、DUBs-IN-3对鸡的USP1、USP7、USP8、USP2、USP5、USP10、USP13、USP15、USP16、USP20、USP33、USP18、USP19、USP28、USP37、USP46、USP47、USP51、CYLD、UCH-L1、UCH-L5、OTU1、OTU4、OTU7等去泛素化酶没有显著抑制作用(>114μM)。
实验方法同UL36酶学抑制实验。USP1、USP7、USP8等酶使用1～3nM酶浓度，去泛素化酶UL36抑制剂浓度>114μM对上述酶活性无显著抑制作用。
参考文献：实验方法及鉴定标准参考：Chen,J.,et al.,Selective and cell-active inhibitors of the USP1/UAF1deubiquitinase complex reverse cisplatinresistance in non-small cell lung cancer cells.Chem Biol,2011.18(11):p.1390-400.
实施例6
本发明对去泛素化酶UL36抑制剂的筛选。
我们使用APExBio公司包括的所有5000余个蛋白酶抑制剂进行高通量筛选。其中人的USP1抑制剂ML-323(Cas No.1572414-83-5)、PR-619(Cas No.2645-32-1)、SJB3-019A(Catalog No.B1307)、Pimozide(Cas No.2062-78-4)、GW7647(Cas No.265129-71-3)、Flupenthixol(Cas No.51529-01-2)、Trifluoperazine(Cas No.440-17-5)、Rottlerin(Cas No.82-08-6)等；以及USP7/8抑制剂HBX19818(Cas No.1426944-49-1)、P 22077(CasNo.1247819-59-5)、GNE-6640(Cas No.2009273-67-8)、GNE-6776(Cas No.2009273-71-4)、NSC 632839(Cas No.157654-67-6)、BAY 11-7082(Cas No.19542-67-7)、USP7-IN-1(CasNo.1381291-36-6)、C598-0466(Catalog No.A8740)、NSC 632839(Cas No.157654-67-6)等对UL36无显著抑制作用(>114μM)。
实施例7
利用表1中各种给药方式下，DUBs-IN-1的最佳剂量，对健康鸡进行给药，对健康鸡进行MD的预防。结果表明，DUBs-IN-1作为MD的预防药物，有效降低了鸡MDV感染率，降低MD的发病率。并且证明口服、肌肉注射、腹腔注射都是预防有效的给药方式。
通过预防给药后的鸡进行MDV感染，再检测鸡MDV感染率和MD的发病率，以及机体内病毒水平等可以验证上述结果。
实施例8
实施例8与实施例1-7实验方法及检测方法相同，不同的是采用将DUBs-IN-2通过口服、腹腔注射、肌肉注射方式作用于鸡MD病模型。经过实验研究，其有效浓度及安全浓度如表2所示。
表2：
Figure BDA0002994147320000091
实施例9
实施例9与实施例1-7实验方法及检测方法相同，不同的是采用将DUBs-IN-3通过口服、腹腔注射、肌肉注射方式作用于鸡MD病模型。经过实验研究，其有效浓度及安全浓度如表3所示。
表3：
Figure BDA0002994147320000092
序列表
<110> 吉林大学
<120> 一种抑制马立克氏病病毒复制、预防或抗立克氏病的药物
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
agtcctgcgt cttcagtt 18
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cagaagtcgc tattgtcc 18

Claims (9)

1.一种抑制马立克氏病病毒复制的药物，包括去泛素化酶UL36抑制剂，所述去泛素化酶UL36抑制剂为DUBs-IN-1、DUBs-IN-2、DUBs-IN-3的至少一种。
2.如权利要求1所述的抑制马立克氏病病毒复制的药物，其特征在于，所述DUBs-IN-1、DUBs-IN-2或DUBs-IN-3抑制鸡细胞内马立克氏病病毒的复制。
3.如权利要求2所述的抑制马立克氏病病毒复制的药物，其特征在于，所述去泛素化酶UL36抑制剂细胞水平的作用浓度为0.01~300μM。
4.如权利要求1-3任一项所述的 抑制马立克氏病病毒复制的药物，其特征在于，所述马立克氏病病毒为血清I型马立克氏病病毒，所述去泛素化酶UL36抑制剂为DUBs-IN-1时细胞水平的作用浓度为0.01～0.3μM，所述去泛素化酶UL36抑制剂为DUBs-IN-2时细胞水平的作用浓度为0.01～110μM，所述去泛素化酶UL36抑制剂为DUBs-IN-3时细胞水平的作用浓度为0.01～300μM。
5.一种预防或抗马立克氏病药物，包括权利要求1-4任一项所述的抑制马立克氏病病毒复制的药物。
6.如权利要求5所述的预防或抗马立克氏病药物，其特征在于，所述去泛素化酶UL36抑制剂包括DUBs-IN-1、DUBs-IN-2或DUBs-IN-3的至少一种，所述去泛素化酶UL36抑制剂动物水平使用剂量不低于0.01mg/(kg·d)。
7.如权利要求6所述的预防或抗马立克氏病药物，其特征在于，所述预防或抗马立克氏病药物的给药方式包括口服、腹腔注射或肌肉注射。
8.如权利要求7所述的预防或抗马立克氏病药物，其特征在于，采用DUBs-IN-1作为去泛素化酶UL36抑制剂时，当口服时DUBs-IN-1剂量为0.5~30 mg/(kg·d)，当腹腔注射时DUBs-IN-1剂量为0.04 ~2.5 mg/(kg·d)，当肌肉注射时DUBs-IN-1剂量为0.1~6 mg/(kg·d)；采用DUBs-IN-2作为去泛素化酶UL36抑制剂时，当口服时DUBs-IN-2剂量为0.02~78 mg/(kg·d)，当腹腔注射时DUBs-IN-2剂量为0.01 ~42mg/(kg·d)，当肌肉注射时DUBs-IN-2剂量为0.01~69 mg/(kg·d)；采用DUBs-IN-3作为去泛素化酶UL36抑制剂时，当口服时DUBs-IN-3剂量为0.05~130 mg/(kg·d)，当腹腔注射时，DUBs-IN-3剂量为0.1 ~80mg/(kg·d)，当肌肉注射时，DUBs-IN-3剂量为0.3~100 mg/(kg·d)。
9.如权利要求8所述的预防或抗马立克氏病药物，其特征在于，DUBs-IN-1、DUBs-IN-2或DUBs-IN-3抑制感染马立克氏病病毒鸡MD肿瘤生成。
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