CN113648337B - 雷公藤红素在制备抑制马立克氏病病毒复制的药物中的应用 - Google Patents

雷公藤红素在制备抑制马立克氏病病毒复制的药物中的应用 Download PDF

Info

Publication number
CN113648337B
CN113648337B CN202110324973.0A CN202110324973A CN113648337B CN 113648337 B CN113648337 B CN 113648337B CN 202110324973 A CN202110324973 A CN 202110324973A CN 113648337 B CN113648337 B CN 113648337B
Authority
CN
China
Prior art keywords
tripterygium wilfordii
tripterine
triptolide
mdv
extract
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202110324973.0A
Other languages
English (en)
Other versions
CN113648337A (zh
Inventor
艾永兴
许家翠
李占军
徐媛媛
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Jilin University
Original Assignee
Jilin University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Jilin University filed Critical Jilin University
Priority to CN202110324973.0A priority Critical patent/CN113648337B/zh
Publication of CN113648337A publication Critical patent/CN113648337A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN113648337B publication Critical patent/CN113648337B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
    • A61K36/18—Magnoliophyta (angiosperms)
    • A61K36/185—Magnoliopsida (dicotyledons)
    • A61K36/37—Celastraceae (Staff-tree or Bittersweet family), e.g. tripterygium or spindletree
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/4353—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems
    • A61K31/436—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems the heterocyclic ring system containing a six-membered ring having oxygen as a ring hetero atom, e.g. rapamycin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/56—Compounds containing cyclopenta[a]hydrophenanthrene ring systems; Derivatives thereof, e.g. steroids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/56—Compounds containing cyclopenta[a]hydrophenanthrene ring systems; Derivatives thereof, e.g. steroids
    • A61K31/58—Compounds containing cyclopenta[a]hydrophenanthrene ring systems; Derivatives thereof, e.g. steroids containing heterocyclic rings, e.g. danazol, stanozolol, pancuronium or digitogenin
    • A61K31/585—Compounds containing cyclopenta[a]hydrophenanthrene ring systems; Derivatives thereof, e.g. steroids containing heterocyclic rings, e.g. danazol, stanozolol, pancuronium or digitogenin containing lactone rings, e.g. oxandrolone, bufalin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A61P31/22—Antivirals for DNA viruses for herpes viruses

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Natural Medicines & Medicinal Plants (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Alternative & Traditional Medicine (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Medicines Containing Plant Substances (AREA)
  • Heterocyclic Carbon Compounds Containing A Hetero Ring Having Oxygen Or Sulfur (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

本发明提供了一种抑制马立克氏病病毒复制的药物，包括去泛素化酶UL36抑制剂，所述去泛素化酶UL36抑制剂为雷公藤提取物，以及一种预防或抗马立克氏病的药物。通过抑制病毒编码的酶活性实验、CEF细胞水平上进行药物毒性实验、病毒CPE抑制实验和鸡MD模型实验证明了所述雷公藤提取物能有效地抑制马立克氏病病毒的复制和鸡MD肿瘤的产生，在禽类养殖业具有良好的应用前景。

Description

雷公藤红素在制备抑制马立克氏病病毒复制的药物中的应用
技术领域
本发明涉及天然化合物应用领域，具体涉及雷公藤提取物作为抑制马立克氏病病毒复制以及抗马立克氏病发生药物的应用。
背景技术
马立克氏病(MD)是一种由于鸡感染致病型血清I型马立克氏病病毒(MDV)而引起的高度传染性、高致病性、淋巴组织增生性病毒性肿瘤病，此病世界各地广泛存在，我国与埃及是此病的高发病率国家。因此，MD对我国的养禽业是重要威胁。鸡是MDV最重要的自然宿主，MDV属于细胞结合性的疱疹病毒科，其分子结构和基因组成与α疱疹病毒相似。除非是在严格的无特定病原体(SPF)条件下饲养,否则所有鸡群都可能被感染，即便是经过疫苗免疫的鸡群也不能幸免。MD被认为是严重危害世界养鸡业的主要疫病之一，给世界家禽业带来了巨大的经济损失。
MD疫苗是目前广泛用来防御MD的主要手段，自20世纪70年代以来，疫苗在家禽养殖业开始普遍用于MD的控制。已经有研究表明，使用的MDV疫苗能保护机体不发生MD恶性肿瘤，但MDV仍然可以感染经MD疫苗免疫的鸡，疫苗的免疫作用不能阻止鸡体内病毒的复制、成熟和释放。因此，经MD疫苗免疫并被MDV感染而不发病的鸡，就成为MDV新的传染源，同时，由于疫苗免疫引起的免疫压力，造成MDV毒力不断增强，进而造成新疫苗使用约10年，就会有毒力更强的MDV毒株的出现。因此，上述原因造成病毒突破疫苗免疫防御引起MD的暴发，是养禽业的重大威胁。而抑制MDV在鸡细胞内的复制是切断传染源，扼制MDV毒力增强的最有效办法，也是控制MD暴发，增强疫苗的防御效果的关键。
雷公藤红素的中文别名是南蛇藤素，英文名是Celastrol，其英文别名是Tripterine，CAS号为34157-83-0。雷公藤红素是从雷公藤属植物中提取的一种纯天然五环三萜类化合物，为红色针状晶体，其分子式为 C29H38O4，相对分子质量为450.61，是一种有效的天然蛋白酶体抑制剂。已有研究表明，雷公藤红素具有抗肿瘤、抗炎、抗氧化、止痛等多种药理活性，但至今未见任何关于雷公藤红素抗马立克氏病或任何抑制MDV病毒复制及活性的报道。
Figure BDA0002994216620000011
发明内容
本发明为了抗鸡MD的发生，抑制MDV在鸡细胞内的复制，提高MD疫苗防御效果，扼制MDV毒力的增强，提供了一种雷公藤提取物作为抑制MDV复制和抗鸡马立克氏病药物的新用途，基于MDV编码的去泛素化酶UL36活性抑制系统，以及细胞接种病毒和马立克氏病动物模型，筛选出雷公藤提取物在安全浓度下能有效地抑制MDV的复制、攻毒实验动物模型肿瘤的产生。
本发明提供了一种抑制MDV复制的药物，包括雷公藤提取物。本发明所述的雷公藤提取物为以下化合物或混合物的一种或几种：包括雷公藤粗提物；包括雷公藤植物中提取得到的总混合物；包括雷公藤成分大类提取物，分别为二萜类、三萜类、倍半萜吡啶生物碱类、倍半萜多元醇酯类；包括雷公藤去皮根部的乙醇提取加三氯甲烷或三氯甲烷-乙醇萃取以及硅胶柱层析后经减压干燥的提取物；包括雷公藤红素及以雷公藤红素分子为基础的衍生物，如在括A/B环的醌甲基、C－3位羟基和C－29位羧基上的引入乙酰基、酰胺基、氨基、磺酸基、吲哚类基团、甲氧基、氨基酸酯类。A/B环C-6位的有磺化、硫化作用、酯化反应等。具有抗MDV和MD的有效成分，具有抗MDV和MD的效果；还包括以下单一的纯化产物中。
①雷公藤倍半萜类生物碱：wilforine(雷公藤次碱)、wilfordine(雷公藤定碱)、wilforgine(雷公藤吉碱)、wilfortrine(雷公藤春碱)、wilforzine(雷公藤增碱)、wilfordmine(euonine，雷公藤新碱)、 wilforidine(雷公藤碱戊)、wilfordconine(雷公藤康碱)、wilfordsine(雷公藤明碱)、euonymine、 wilfordsuine(雷公藤植碱)、wilfordinine(雷公藤定宁)、isowilfortrine(异雷公藤春碱)、 isowilfordine(异雷公藤碱)、peritassinesA、南蛇藤蛇碱、tripfordine A，B，C、celacinnine(苯乙烯南蛇碱)、celafurine(呋喃南蛇碱)、celabenzine(苯代南蛇碱)、celallocinnine(南蛇藤别肉桂酰胺碱)、雷公藤碱已(Wilfomine)、新雷公藤灵碱(Neowilforine)等精眯类生物碱、卫矛碱和翅卫矛辛宁等生物碱(薛冠明；薛蕾；闫德友；雷公藤化学成分、生物活性及其资源利用概述,2013,青海农林科技,24-28)。
②雷公藤的三萜类化合物中齐墩果烷型、乌苏烷型、何帕烷型、木栓烷型、去甲木栓烷型和羊毛甾烷型，具体的包括celastolide、triptohypols A～F、hypodiol、wilforicacids A～F、regelone、 3-methyl-23-olxotingenol、regelin、demethylregelin、triptotin C、wilforic acid B(ⅩⅤ)、2， 3-dihydroxy 1，3，5(10)，7-tetraene-6α(1-hydroxyethyl)-24-nor-D:A-friedooleane-29-oic acid(ⅩⅥ)和dulcioic acid(ⅩⅦ)(薛冠明；薛蕾；闫德友；雷公藤化学成分、生物活性及其资源利用概述,2013,青海农林科技,24-28.)；雷公藤内酯甲(wilforlide A)、雷公藤内酯乙(wilforlide B)、 3-epikatonic acid(白洁(导师:杨更亮).雷公藤活性成分提取分离及改性方法的研究(Thesis)河北大学(2004))；黑曼酮酯甲(regelin A)、黑曼酮酯乙(regelin B)、黑曼酮酯丙(regelin C)、黑曼酮酯丁(regelin D)、黑曼醇酯甲(RegelidiolA)、黑曼醇酯乙(Reglidio1 B)(白洁(导师:杨更亮).雷公藤活性成分提取分离及改性方法的研究(Thesis)河北大学(2004))；cangoronine、 demethylregelin、萨拉子酸(salaspermic acid)、3-hydroxy-2-oxo-3-fridelen-20α-carboxylicacid(杨光忠；郭夫江；李援朝；雷公藤多苷三萜类成分的研究,2000,中国药学杂志,50-51.)；3β -hydroxy-D∶B-friedoolean-5∶6epoxy-29-oicacid(杨光忠；郭夫江；李援朝；雷公藤多苷三萜类成分的研究,2000,中国药学杂志,50-51.)；雷公藤三萜内酯甲(TriptotriterpenoidallaetoneA)、雷公藤三萜酸甲、乙、丙(Triptotriterpenicacid A，B，C)、3，24-二氧代木栓烷-2-9-羧(3， 24-Dioxo-fridelen-2-9-oic)(白洁(导师:杨更亮).雷公藤活性成分提取分离及改性方法的研究 (Thesis)河北大学(2004).)等。
③雷公藤的二萜类化合物可分为:二萌醌类、雷公藤甲素衍生物、贝壳杉烷型、泪柏醚型、松香烷型、海松烷型、对映贝壳杉烷型和其他二萜类，其中包括雷公藤甲素等环氧二萜内酯类化合物，包括 triptobenzenes A～N、triptoquinone H、16-ydroxy-9，20-poxy-aurane、triptolide(Ⅹ)、triptodiolide(Ⅺ)、 triptochlorolide(Ⅻ)、tripterifordin(ⅩⅢ)、13-pi-anoyloxide-8-icacid(ⅩⅣ)等(薛冠明；薛蕾；闫德友；雷公藤化学成分、生物活性及其资源利用概述,2013,青海农林科技,24-28.)。
A、松香烷型按其化学结构可以将此类二萜化合物分为五类:三环氧型二萜(或雷公藤内酯醇衍生物)、山海棠素型二萜(含苯环和内酯环的松香烷型)、山海棠酸型二萜(含苯环和3位双键的松香烷型)、雷酚萜型二萜(仅含苯环的松香烷型)、二萜醌型(C环为醌环的松香烷型)。
三环氧型二萜(或雷公藤内酯醇衍生物)包括triptolide(雷公藤甲素，雷公藤内酯醇，雷藤素甲，雷藤内酯醇)、tripdiolide(雷公藤乙素，雷藤素乙，雷公藤内酯二醇)、tripterolide(雷藤素丙，2α-羟基雷藤素乙)、 triptonide(雷公藤内酯酮)、triptolidenol(雷醇内酯，15-羟基雷公藤内酯醇)、16-hydroxy-triptolide(16-羟基雷公藤内酯醇)、tripchlorolide(雷藤氯内酯醇，雷公藤氯内酯醇)、triptetraolide(雷公藤内酯四醇)、isotriptetraolide (异雷公藤内酯四醇)、triptriolide(雷藤内酯三醇，雷公藤内酯三醇)、tripdioltonide(雷公藤内酯二醇酮)、13， 14-epoxide 9，11，12-trihydroxytriptolide(13，14-环氧9，11，12-三羟雷公藤内酯)、2-epitripdiolide(2-表雷公藤乙素)、neotriptetraolide(新雷公藤内酯四醇)、2β-hydroxytriptonide(2β-羟基雷公藤内酯酮)、 15-hydroxytriptonide(15-羟基雷公藤内酯酮)、12-epitriptriolide(12-表雷藤内酯三醇)、dichlorotriptetraolide(双氯雷公藤内酯四醇)、14β-Acetoxy-(7，8)β，(9，11)β，(12，13)α-tris(epoxy)-2β，19-dihydroxy-18(4 →3)abeo-abieta-3-en-18-oic acid lactone、(7，8)β，(9，11)β-bis(epoxy)-2β，19-dihydroxy-14-oxo-18(4→3)abeo-abieta-3，12-dien-18-oic acid lactone(薛冠明；薛蕾；闫德友；雷公藤化学成分、生物活性及其资源利用概述,2013,青海农林科技,24-28.)。
山海棠素型二萜(含苯环和内酯环的松香烷型):包括triptophenolide(Hypolide)(雷酚内酯，山海棠素)、 triptonolide(雷酚酮内酯)、triptophenolidemethyl ether(雷酚内酯甲醚)、neotriptophenolide(雷酚新内酯)、 isoneotripto-phenolide(异雷酚新内酯)、triptobenzene E-G、triptobenzene K、triptobenzene I、雷酚新内酯苷、 7β，14，19-trihydroxy-18(4→3)abeo-abieta-3，8，11，13-tetraen-18-oicacid lactone、19-hydroxy-18(4→ 3)abeo-abieta-3，8，11，13-tetraen-18-oic acidlactone、19-hydroxy-7-oxo-18(4→3)abeo-abieta-3，8，11， 13-tetraen-18-oic acidlac-tone、7β，19-dihydroxy-14-methoxy-18(4→3)abeo-abieta-3，8，11，13-tetraen-18-oic acid lactone、12-glucosyl-isotriptophenoilde、14-glu-cosyl-triptophenoilde、5α，14-dihydroxybutenolide(李建友；夏素霞；宋少江；雷公藤二萜类化学成分及在研新药的研究进展,2012,沈阳药科大学学报,29: 901-908.)。
山海棠酸型二萜(含苯环和3位双键的松香烷型)：triptobenzene D、hypoglicacid(山海棠酸)、triptinin A-B、triptobenzeneH、triptowilfolide、16-hydroxytriptobenzeneH、triptohairic acid、18(4→3)abeo-abieta-3， 8，11，13-tetraen-18-oic acid、7-oxo-18(4→3)abeo-abieta-3，8，11，13-tetraen-18-oic acid、15-hydroxy-18-norabieta-3，8，11，13-tetraene-3-oic acidmethyl ester、triptonoditerpenic acid(雷酚二萜酸，雷藤二萜酸)、triptonoditerpenic acid B(雷藤二萜酸B)(李建友；夏素霞；宋少江；雷公藤二萜类化学成分及在研新药的研究进展,2012,沈阳药科大学学报,29:901-908.)。
雷酚萜型二萜(仅含苯环的松香烷型)：triptonoterpene(雷酚萜)、trip-tonoterpene methyl ether(雷酚萜甲醚)、neotrip-tonoterpene(wilforol E)、triptobenzene A-C、triptobenzene J、triptobenzene L-N、trip-tobenzene O、triptobenzene P、triptobenzene Q、triptobenzene Y、triptonoterpenol(雷酚萜醇)、triptonodiol、 3-epi-triptobenzene B、3β，11，19-trihydroxy-14-methoxy-abieta-8，11，13-triene、triptobenzene L、wilforol F、triptocallol、3-oxo-14-methoxy-abieta-8，11，13-triene、3α-hydroxy-abieta-8，11，13-triene、3β -hydroxy-14-methoxy-abieta-8，11，13-triene、14-hydroxy-abieta-8，11，13-triene、18-norabieta-4，8，11，13-tetraen-3-one、hinokione、8，11，13-abietatriene-3-one、hinokiol、dehydroabieticacid(李建友；夏素霞；宋少江；雷公藤二萜类化学成分及在研新药的研究进展,2012,沈阳药科大学学报,29:901-908.)。
二萜醌型(C环为醌环的松香烷型)：Triptoquinone A～G(雷藤二萜醌A～G，雷藤对醌A～G)、triptoquinone H(雷藤二萜醌H，雷藤对醌H)、trip-toquinone(quinone 21)、triptotin A-B(李建友；夏素霞；宋少江；雷公藤二萜类化学成分及在研新药的研究进展,2012,沈阳药科大学学报,29:901-908.)。
B、贝壳杉烷型主要包括：tripterifordin(hypodiolide A)(雷公藤福定，山海棠二萜内酯A)、tripterinin、 16-hydroxy-19，20-epoxy-kaurane、neotripterifordin、16α-hydroxy-19，20-epoxy-19R*-ethoxy-kaurane、16 α-hydroxy-19，20-epoxy-19S*-ethoxy-kaurane、16α-hydroxy-19，20-epoxy-20R*-ethoxy-kaurane、16α -hydroxy-19，20-epoxy-20R*-hydroxy-kaurane、16α-hydroxykauran-19，20-dioicacid、16α-(-)-kauran-17， 19-dioic acid、kaurane-16，19，20-triol、doianoterpene A-D、entkauranol(ent-17β-hydroxy kaurane)[24]、 ent-19-hydroxykaur-16-en、ent-17，19-dihydroxykaur-15-en、(-)-16α-hydroxykauran-19-oic acid、(-) -17-hydroxy-16α-kauran-19-oic acid、16α，19-di-hydroxy-ent-kaurane(李建友；夏素霞；宋少江；雷公藤二萜类化学成分及在研新药的研究进展,2012,沈阳药科大学学报,29:901-908.)。
C、其他类型二萜：3-epi-manoyl oxide-18-oic acid、13-epi-19-nor-manoyloxide-18-oic acid、labd-13(E) -ene-8α，15-diol、14，15-dihydroxy-8，13-epoxy-labd-14-en-19-oate、8β，19-dihydroxy-3-oxopimar-5-ene (李建友；夏素霞；宋少江；雷公藤二萜类化学成分及在研新药的研究进展,2012,沈阳药科大学学报,29: 901-908.)。
上述为雷公藤提取物、雷公藤成分大类提取物以及下述各单体化合物均具有抗MDV和MD的有效成分。
所述雷公藤粗提物是指按照国家药品标准提取的混合物又称雷公藤片(国家食品药品监督管理总局国家药品标准(修订)颁布件批件号:ZGB2015-12.(2016)中国药品标准17,370-372.)。
所述雷公藤植物中提取得到的总混合物是指雷公藤植物中提取得到各种大类混合物，包括雷公藤倍半萜类生物碱、倍半萜多元醇酯类、雷公藤的三萜类化合物和雷公藤的二萜类化合物中的至少一种，所述雷公藤植物中提取得到的总混合物可以是将商业化试剂或人工合成的试剂混合而成，也可以是从雷公藤植物中提取而成，制备或提取方法为现有技术内容，不是本发明保护的主题。
所述雷公藤成分大类提取物，分别为二萜类、三萜类、倍半萜吡啶生物碱类、倍半萜多元醇酯类，所述雷公藤成分大类提取物可以是将商业化试剂或人工合成的试剂混合而成，也可以是从雷公藤植物中提取而成，制备或提取方法为现有技术内容，不是本发明保护的主题。(以下为各大类提取物制备方法示例，本发明的发明点在于利用雷公藤各大类提取物作为UL36抑制剂抑制MDV复制，并不在于制备方法本身，因此本发明的保护范围并不限于以下方法：二萜类大类提取物：(1)王思燚；汪丽；陈宣钦,et al.；昆明山海棠茎叶中的二萜类成分及生物活性研究,2020,昆明理工大学学报(自然科学版),45:108-114.(2)韦玮；金日显；陈燕军；二萜类化合物的提取与纯化工艺研究进展,2007,中国实验方剂学杂志,66-70.)；三萜类大类提取物：(1)方剑乔；马凤森；楼芳芳,et al.以三萜类为主要成分的雷公藤提取物的制备方法及其制药用途[Patent]CN103919835A.；(2)李江(导师:穆淑珍).黔产昆明山海棠的化学成分研究(Thesis)贵州大学 (2019).(3)张玉梅(导师:穆淑珍).雷公藤多苷提取工艺的研究(Thesis)贵州大学(2018).；倍半萜吡啶生物碱类：(1)孙翠翠(导师:金郁,黄晓晶).雷公藤中倍半萜类生物碱的分析制备与质谱规律研究(Thesis) 华东理工大学(2013).(2)金米聪；陈晓红；蔡美强.一种利用离子液体高效提取雷公藤生物碱的方法[Patent]CN104817565A.(3)吴伟建；欧阳小琨；杨立业,et al.一种利用离子液体萃取/HPLC检测昆明山海棠根茎中雷公藤次碱含量的方法[Patent]CN106153750A.(3)吴志军；方冬梅；蒋艳,et al.一种雷公藤中未知的倍半萜吡啶生物碱的快速分析方法[Patent]CN104849382A.(4)蔡美强；金米聪；陈晓红.一种高含量倍半萜类雷公藤生物碱的制备方法[Patent]CN101974005A.；倍半萜多元醇酯：(1)Wang,C；Li,C-J； Yang,J-Z,et al.；Anti-inflammatory Sesquiterpene Derivatives from the Leaves of Tripterygiumwilfordii,2013, Journal of Natural Products,76:85-90.(2)Wang,C；Li,CJ；Ma,J,etal.；Bioactive sesquiterpene polyol esters from the leaves of Tripterygiumwilfordii,2014,Fitoterapia,96:103-108.)
所述包括雷公藤去皮根部的乙醇提取加三氯甲烷或三氯甲烷-乙醇萃取以及硅胶柱层析后经减压干燥的提取物，具体方法为现有技术中记载的方法。
所述以雷公藤红素分子为基础的衍生物，如在括A/B环的醌甲基、C－3位羟基和C－29位羧基上的引入乙酰基、酰胺基、氨基、磺酸基、吲哚类基团、甲氧基、氨基酸酯类。A/B环C-6位的有磺化、硫化作用、酯化反应等。所述雷公藤红素及以雷公藤红素分子为基础的衍生物可以是人工制备得到，也可以是从雷公藤植物提取得到，制备或提取方法为现有技术内容，不是本发明保护的主题。(以下为雷公藤红素及雷公藤红素分子为基础的衍生物制备方法示例，本发明的发明点在于利用雷公藤红素及雷公藤红素分子为基础的衍生物作为UL36抑制剂抑制MDV复制，并不在于制备方法本身，因此本发明的保护范围并不限于以下方法：1.陈海兰；许少华；徐伟,et al.；雷公藤红素药理活性与结构修饰研究进展,2020,药学研究,39:722-732.2.梁柳春；杨亚玺；郭夫江；雷公藤红素药理作用及结构修饰研究进展,2020,中国药物化学杂志,30:622-635.3.张国瑞(导师:全哲山).雷公藤红素衍生物的合成及其抗肿瘤活性研究(Thesis)延边大学(2018).4.朱怡(导师:张晓坤,曾志平).以核受体Nur77为靶点的雷公藤红素衍生物的设计、合成及生物学活性评价(Thesis)厦门大学(2017).)
所述单一纯化产物，可以是人工合成或制备得到，也可以是从雷公藤植物提取得到，制备或提取方法为现有技术内容，不是本发明保护的主题。
雷公藤提取物抑制去泛素化酶UL36活性UL36是疱疹病毒编码的N端具有去泛素化酶结构域的大被膜蛋白，其功能还未见详细的阐明。本发明对5000余个蛋白酶抑制剂进行高通量筛选，幸运的发现，所述雷公藤提取物具有抑制去泛素化酶UL36活性的作用。经过本发明的研究，所述雷公藤提取物通过抑制去泛素化酶UL36实现了细胞水平抑制MDV复制，而对鸡细胞本身的信号通路和蛋白没有产生显著的抑制作用。
雷公藤红素是一种天然三萜类化合物，作为一种天然的蛋白酶体抑制剂，可影响细胞内多种信号通路和蛋白的作用。经过本发明的研究表明，雷公藤红素特异性的抑制去泛素化酶UL36的活性，
优选的，所述雷公藤提取物抑制细胞内MDV的复制。通过向感染MDV的鸡细胞的培养体系中添加所述雷公藤提取物，MDV复制受到显著的抑制。所述雷公藤提取物是在感染了MDV的CEF细胞(鸡胚成纤维细胞)或者DF-1细胞(鸡胚成纤维细胞系)水平上抑制病毒的复制。
上述任一项优选的是，所述雷公藤提取物在细胞水平的作用浓度为0.02～410μM。所述细胞水平优选的细胞为CEF细胞或DF-1细胞。优选的，所述雷公藤提取物为雷公藤红素，雷公藤红素细胞水平的作用浓度优选为0.02～0.22μM，进一步优选的是，0.02μM的雷公藤红素在CEF细胞水平抑制MDV的复制，优选的，0.03μM、0.05μM、0.07μM、0.11μM、0.13μM、0.17μM、0.19μM、0.21μM的雷公藤红素均有效抑制感染MDV的细胞内MDV的复制，同时对细胞本身没有毒副作用。雷公藤红素的浓度大于0.02μM 时可显著减少病毒的复制。当浓度达到0.22μM时，基本上可以完全抑制病毒在细胞内的复制和对细胞的感染，并且在此浓度范围药物对细胞没有造成显著伤害。
上述任一项优选的是，所述雷公藤提取物为倍半萜生物碱类，进一步优选为雷公藤定碱、雷公藤吉碱、雷公藤次碱、雷公藤春碱、雷公藤新碱中的至少一种。
上述任一项优选的是，所述雷公藤提取物为雷公藤定碱，雷公藤定碱细胞水平的作用浓度优选为0.1～94μM，浓度进一步优选为0.1、0.5、1.1、2.1、5.1、10.1、15.1、20.1、25.1、30.1、35.1、45.1、55.1、65.1、 75.1、85.1、88、94μM。
上述任一项优选的是，所述雷公藤提取物为雷公藤吉碱，雷公藤吉碱细胞水平的作用浓度优选为 0.001～30μM，浓度进一步优选为0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1.1、2.1、5.1、10.1、15.1、20、25.1μM。上述任一项优选的是，所述雷公藤提取物为雷公藤次碱，雷公藤次碱细胞水平的作用浓度优选为 0.01～130μM，浓度进一步优选为0.01、0.05、0.1、0.5、1.1、2.1、5.1、10.1、15.1、20、25.1、35.1、45.1、 55.1、65.1、75.1、85.1、95.1、100.1、110.1、120、130μM。
上述任一项优选的是，所述雷公藤提取物为雷公藤春碱，雷公藤春碱细胞水平的作用浓度优选为 0.01～320μM，浓度进一步优选为0.01、0.05、0.1、0.5、1.1、2.1、5.1、10.1、15.1、20、25.1、35.1、45.1、 55.1、65.1、75.1、85.1、95.1、100.1、110.1、120、130、150.1、180.1、210.1、240.1、270.1、290.1、300、 310.1、320μM。
上述任一项优选的是，所述雷公藤提取物为雷公藤新碱，雷公藤新碱细胞水平的作用浓度优选为 0.001～220μM，浓度进一步优选为0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1.1、2.1、5.1、10.1、15.1、20、 25.1、45.1、65.1、85.1、95.1、105.1、120、1401.、160.1、180.1、200.1、210、220μM。
上述任一项优选的是，所述雷公藤提取物为二萜类化合物，进一步优选为雷公藤甲素、雷公藤乙素、 (5R)-5-羟基雷公藤内酯醇(又称“雷滕舒”)、雷公藤对醌B、雷公藤内酯甲、雷公藤内酯酮中的至少一种。
上述任一项优选的是，所述雷公藤提取物为雷公藤甲素，雷公藤甲素细胞水平的作用浓度优选为 0.01～100μM，浓度进一步优选为0.01、0.05、0.1、0.5、1.1、2.1、5.1、10.1、15.1、20、25.1、45.1、65.1、 87、95.1、100μM。
上述任一项优选的是，所述雷公藤提取物为雷公藤乙素，雷公藤乙素细胞水平的作用浓度优选为 0.02～110μM，浓度进一步优选为0.02、0.05、0.1、0.5、1.1、2.1、5.1、10.1、15.1、20、25.1、45.1、65.1、 87、95.1、100、110μM。
上述任一项优选的是，所述雷公藤提取物为雷滕舒，雷滕舒细胞水平的作用浓度优选为0.03～120μM，浓度进一步优选为0.03、0.05、0.1、0.5、1.1、2.1、5.1、10.1、15.1、20、25.1、45.1、65.1、87、95.1、 100.1、105、110.1、120μM。
上述任一项优选的是，所述雷公藤提取物为雷公藤对醌B，雷公藤对醌B细胞水平的作用浓度优选为 0.01～102μM，浓度进一步优选为0.01、0.05、0.1、0.5、1.1、2.1、5.1、10.1、15.1、20、25.1、45.1、65.1、 87、95.1、98、100.1、102μM。
上述任一项优选的是，所述雷公藤提取物为雷公藤内酯甲，雷公藤内酯甲细胞水平的作用浓度优选为 0.01～120μM，浓度进一步优选为0.01、0.05、0.1、0.5、1.1、2.1、5.1、10.1、15.1、20、25.1、45.1、65.1、 87、95.1、100、110.1、120μM。
上述任一项优选的是，所述雷公藤提取物为雷公藤内酯酮，雷公藤内酯酮细胞水平的作用浓度优选为 0.001～410μM，浓度进一步优选为0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1.1、2.1、5.1、10.1、15.1、20、 25.1、45.1、65.1、87、95.1、100、140.1、180.1、260.1、320.1、380.1、410μM。
上述任一项优选的是，所述MDV为血清I型MDV。
本发明还提供了一种预防或抗马立克氏病药物，包括上述任一项所述的抑制MDV复制的药物。
优选的，本发明提供的预防或抗马立克氏病药物，所述雷公藤提取物为雷公藤提取混合物和/或雷公藤提取纯化产物，所述雷公藤提取物动物体内使用剂量为0.01～220mg/(kg·d)。所述动物体内使用剂量为在鸡体内的使用剂量。所述雷公藤提取物作为去泛素化酶UL36抑制剂。本发明首次发现所述雷公藤提取物在马立克氏病动物模型体内抑制去泛素化酶UL36酶活，而对鸡体内自身的泛素化酶没有抑制作用，对鸡没有产生毒副作用。所述剂量可抑制去泛素化酶UL36活性，可显著抑制感染MDV的鸡的内出血和肿瘤等症状的出现，并且抑制MDV在鸡T细胞内的复制，即抑制鸡马立克氏病的发生。
优选的是，所述雷公藤提取物为雷公藤红素，所述雷公藤红素动物体内使用剂量不低于0.1mg/(kg·d)。雷公藤红素的用量在大于0.1mg/(kg·d)时，可显著抑制感染MDV的鸡的内出血和肿瘤等症状的出现，并且抑制MDV在鸡T细胞内的复制，也即雷公藤红素可抑制鸡马立克氏病的发生。
上述任一项优选的是，所述预防或抗马立克氏病药物的给药方式包括口服、腹腔注射或肌肉注射。
上述任一项优选的是，所述雷公藤提取物为雷公藤红素，当口服时雷公藤红素剂量为1.2～50mg/(kg·d)，优选的，雷公藤红素效果最佳的口服剂量为45mg/(kg·d)，其他优选的雷公藤红素口服剂量为1.2、1.3、1.6、 1.9、2.3、3.2、4.7、5.9、7.2、8.9、9.8、11、13、17、21、27、29、30、37、42、46、49、50mg/(kg·d)；当腹腔注射时雷公藤红素剂量为0.1～4.0mg/(kg·d)，优选的，雷公藤红素效果最佳的腹腔注射剂量为 3.5mg/(kg·d)，其他优选的雷公藤红素腹腔注射剂量为0.1、0.3、0.7、0.9、1.1、1.3、1.8、2.1、2.3、2.5、 3.2、3.6、3.9、4.0mg/(kg·d)；当肌肉注射时雷公藤红素剂量为0.3～10mg/(kg·d)，优选的，雷公藤红素效果最佳的肌肉注射剂量为8.0mg/(kg·d)，其他优选的雷公藤红素肌肉注射剂量为0.3、0.7、1.2、1.9、2.6、3.8、 4.2、4.8、5.2、5.7、6.3、7.4、8.4、8.9、9.3、9.8、10.0mg/(kg·d)。
上述任一项优选的是，所述雷公藤提取物为雷公藤定碱，当口服时雷公藤定碱使用剂量为0.1～28 mg/(kg·d)，进一步优选为0.1、0.4、0.8、1.1、5.1、10.1、16.1、20.1、25、28mg/(kg·d)；当腹腔注射时雷公藤定碱使用剂量为0.05～14mg/(kg·d)，优选为0.05、0.09、1.1、3.1、5.1、8.1、10.1、11、12.1、13.1、 14mg/(kg·d)；当肌肉注射时雷公藤定碱使用剂量为0.01～21mg/(kg·d)，优选为，0.01、0.05、0.09、1.1、 3.1、5.1、8.1、10.1、11、12.1、13.1、14、15、19.1、21mg/(kg·d)。
上述任一项优选的是，所述雷公藤提取物为雷公藤吉碱，当口服时雷公藤吉碱使用剂量为 0.01～2mg/(kg·d)，优选为0.01、0.05、1.1、1.5、2mg/(kg·d)；当腹腔注射时雷公藤吉碱使用剂量为 0.003～1.1mg/(kg·d)，优选为0.003、0.006、0.009、0.014、0.05、0.11、0.31、0.51、0.8、0.91、1.1mg/(kg·d)；当肌肉注射时雷公藤吉碱使用剂量为0.02～1.4mg/(kg·d)，优选为0.02、0.06、0.09、1.1、1.21、1.31、1.4 mg/(kg·d)。
上述任一项优选的是，所述雷公藤提取物为雷公藤次碱，当口服时雷公藤次碱使用剂量为0.01～48 mg/(kg·d)，优选的，0.01、0.05、1.1、1.5、2、3.1、5.1、8.1、10.1、11、12.1、13.1、14、15、19.1、21、 31、41、45、48mg/(kg·d)；当腹腔注射时雷公藤次碱使用剂量为0.005～22mg/(kg·d)，优选为0.005、0.007、 0.01、0.05、1.1、1.5、2、3.1、5.1、8.1、10.1、11、12.1、13.1、14、15、19.1、20、22mg/(kg·d)；当肌肉注射时雷公藤次碱使用剂量为0.001～30mg/(kg·d)，优选为0.001、0.003、0.005、0.007、0.01、0.05、 1.1、1.5、2、3.1、5.1、8.1、10.1、11、12.1、13.1、14、15、19.1、20、22、24、26.1、27.1、29.1、30mg/(kg·d)。
上述任一项优选的是，所述雷公藤提取物为雷公藤春碱，当口服时雷公藤春碱使用剂量为0.3～150 mg/(kg·d)，优选为0.03、0.05、0.1、0.5、1.1、1.5、2、3.1、5.1、8.1、10.1、19.1、29.1、49.1、69.1、 89.1、100.1、120.1、140、150mg/(kg·d)；当腹腔注射时雷公藤春碱使用剂量为0.2～78mg/(kg·d)，优选为0.2、0.5、1.1、1.5、2、3.1、5.1、8.1、10.1、19.1、29.1、49.1、70、78mg/(kg·d)；当肌肉注射时雷公藤春碱使用剂量为0.1～98mg/(kg·d)，优选为0.1、0.2、0.5、1.1、1.5、2、3.1、5.1、8.1、10.1、19.1、 29.1、49.1、70、78、86、98mg/(kg·d)。
上述任一项优选的是，述雷公藤提取物为雷公藤新碱，当口服时雷公藤新碱使用剂量为0.02～130 mg/(kg·d)，优选为0.02、0.06、0.1、0.2、0.5、1.1、1.5、2、3.1、5.1、8.1、10.1、19.1、29.1、49.1、70、 78、86、98、120、130mg/(kg·d)；当腹腔注射时雷公藤新碱使用剂量为0.01～60mg/(kg·d)，优选为0.01、 0.02、0.06、0.1、0.2、0.5、1.1、1.5、2、3.1、5.1、8.1、10.1、19.1、29.1、49.1、56、60mg/(kg·d)；当肌肉注射时雷公藤新碱使用剂量为0.02～84mg/(kg·d)，优选为0.02、0.06、0.1、0.2、0.5、1.1、1.5、2、 3.1、5.1、8.1、10.1、19.1、29.1、49.1、56、60、70.1、80、84mg/(kg·d)。
上述任一项优选的是，所述雷公藤提取物为雷公藤甲素，当口服时雷公藤甲素使用剂量为0.2～48 mg/(kg·d)，优选为0.2、0.5、1.1、1.5、2、3.1、5.1、8.1、10.1、19.1、29.1、40.1、44、48mg/(kg·d)；当腹腔注射时雷公藤甲素使用剂量为0.05～10mg/(kg·d)，优选为0.05、0.1、0.2、0.5、1.1、1.5、2、3.1、 5.1、8、10mg/(kg·d)；当肌肉注射时雷公藤甲素使用剂量为0.1～25mg/(kg·d)，优选为0.1、0.2、0.5、 1.1、1.5、2、3.1、5.1、8、10.1、15.1、20.1、22、25mg/(kg·d)。
上述任一项优选的是，所述雷公藤提取物为雷公藤乙素，当口服时雷公藤乙素使用剂量为 0.5～45mg/(kg·d)，优选为0.5、1.1、1.5、2、3.1、5.1、8.1、10.1、19.1、29.1、40、44、45mg/(kg·d)；当腹腔注射时雷公藤乙素使用剂量为0.1～8mg/(kg·d)，优选为0.1、0.3、0.5、1.1、1.5、2、3.1、5.1、7、 8mg/(kg·d)；当肌肉注射时雷公藤乙素使用剂量为0.2～20mg/(kg·d)，优选为0.2、0.5、1.1、1.5、2、3.1、 5.1、8.1、10.1、16、19.1、20mg/(kg·d)。
上述任一项优选的是，所述雷公藤提取物为雷滕舒，当口服时雷滕舒使用剂量为0.1～50mg/(kg·d)，优选为，0.1、0.5、1.1、1.5、2、3.1、5.1、8.1、10.1、19.1、29.1、40、44、45、50mg/(kg·d)；当腹腔注射时雷滕舒使用剂量为0.05～7mg/(kg·d)，0.05、0.1、0.2、0.5、1.1、1.5、2、3.1、5.1、6、7mg/(kg·d)；当肌肉注射时雷滕舒使用剂量为0.1～24mg/(kg·d)，优选为0.1、0.5、1.1、1.5、2、3.1、5.1、8.1、10.1、 18、19.1、29.1mg/(kg·d)。
上述任一项优选的是，所述雷公藤提取物为雷公藤对醌B，当口服时雷公藤对醌B使用剂量为0.3～56 mg/(kg·d)，0.3、0.5、1.1、1.5、2、3.1、5.1、8.1、10.1、19.1、29.1、40、44、45、50、56mg/(kg·d)；当腹腔注射时雷公藤对醌B使用剂量为0.03～21mg/(kg·d)，优选为0.03、0.07、0.1、0.5、1.1、1.5、2、 3.1、5.1、8.1、10.1、17、18、19.1、21mg/(kg·d)；当肌肉注射时雷公藤对醌B使用剂量为0.1～30mg/(kg·d)，优选为0.1、0.5、1.1、1.5、2、3.1、5.1、8.1、10.1、17、18、19.1、21.1、26、28、30mg/(kg·d)。
上述任一项优选的是，所述雷公藤提取物为雷公藤内酯甲，当口服时雷公藤内酯甲使用剂量为0.1～52 mg/(kg·d)，优选为0.1、0.3、0.5、1.1、1.5、2、3.1、5.1、8.1、10.1、19.1、29.1、40、44、45、50、52mg/(kg·d)；当腹腔注射时雷公藤内酯甲使用剂量为0.02～15mg/(kg·d)，优选为0.03、0.07、0.1、0.5、1.1、1.5、2、 3.1、5.1、8、10.1、15mg/(kg·d)；当肌肉注射时雷公藤内酯甲使用剂量为0.1～29mg/(kg·d)，优选为0.1、 0.3、0.5、1.1、1.5、2、3.1、5.1、8.1、10.1、19.1、26、29mg/(kg·d)。
上述任一项优选的是，所述雷公藤提取物为雷公藤内酯酮，当口服时雷公藤内酯酮使用剂量为 0.03～220mg/(kg·d)，优选为0.03、0.07、0.1、0.5、1.1、1.5、2、3.1、5.1、8.1、10.1、19.1、29.1、40.1、 80.1、110.1、160.1、190.1、200、220mg/(kg·d)；当腹腔注射时雷公藤内酯酮使用剂量为0.002～120mg/(kg·d)，优选为0.02、0.07、0.1、0.5、1.1、1.5、2、3.1、5.1、8.1、10.1、19.1、29.1、40.1、80.1、110.1、120mg/(kg·d)；当肌肉注射时雷公藤内酯酮使用剂量为0.01～168mg/(kg·d)，优选为0.01、0.07、0.1、0.5、1.1、1.5、2、 3.1、5.1、8.1、10.1、19.1、29.1、40.1、80.1、110.1、120、140.1、168mg/(kg·d)。
上述任一项优选的是，所述雷公藤提取物抑制感染MDV鸡MD肿瘤生成。
上述任一项优选的是，雷公藤红素抑制感染MDV鸡MD肿瘤生成。
本发明的有益处效果是：本发明首次筛选出包括雷公藤红素在内的雷公藤提取物，不仅能够在酶水平上抑制UL36的活性，在细胞水平上抑制MDV的复制，还可在动物水平上抑制MD肿瘤生长和内脏出血，且具有效果极强。优选的，本发明中雷公藤红素作为去泛素化酶UL36抑制剂的使用剂量远低于雷公藤红素在常规使用中的有效剂量，具有剂量小的优点，可作为抗MD药物广泛用于养禽业防御MD的生产实践中，具有良好经济价值及研究意义。
目前，MDV的毒力不断增强，接种了疫苗的鸡群仍然有可能暴发马立克氏病。在此现状下，本发明找到了一个控制马立克氏病的新途径，并能增强MD疫苗的效果，而且应用前景广泛。
附图说明
图1为本发明优选实施例1的雷公藤红素抑制MDV编码的UL36酶活性的结果。
图2为本发明实施例2的雷公藤红素浓度与细胞死亡率关系示意图。
图3为本发明实施例2在MDV或MDV+药物处理三天后细胞病变(cytopathiceffect，CPE)图。
图4为本发明实验例2的雷公藤红素浓度与MDV的CPE面积关系图。
图5为本发明实施例2中代表CT值和标准质粒拷贝之间线性关系的标准曲线图。
图6为本发明实施例2的CEF细胞中MDV基因组拷贝数与雷公藤红素浓度关系图。
图7为本发明实施例3的MD模型鸡T细胞中MDV基因组拷贝数与雷公藤红素浓度关系图。
图8为本发明实施例3的MD模型鸡MD发病率与雷公藤红素浓度关系图。
图9为本发明实施例3的雷公藤红素浓度与MD模型鸡的肿瘤数量关系示意图。
具体实施方式
本发明通过以下实施例进行更加清晰、完整的描述，但所描述的实例仅是本发明一部分实施例，并非全部。所述实施例为帮助理解本发明，不应依此来局限本发明的保护范围。
实施例1
雷公藤红素抑制MDV编码的UL36的酶活性。
酶反应体系：在100μL反应体系中含1.5nM UL36酶，1×反应缓冲液(50mM HEPESpH7.8，0.1mg/mL BSA，0.5mM EDTA，1mM DTT)，添加反应荧光底物Ub-AMC,37℃孵育，在荧光分光光度计上测量荧光强度变化。添加2μM雷公藤红素的反应体系作为“抑制剂组”，未加雷公藤红素但添加了等量溶剂DMSO 的反应体系作为“无抑制剂组”。结果如图1，“无抑制剂组”中UL36正常水解Ub-AMC并产生荧光信号，而“抑制剂组”中的UL36的活性受到抑制，荧光信号未增加。此结果说明雷公藤红素抑制了MDV编码的 UL36的酶活性。
实施例2
CEF细胞的制备及MDV的感染：
1、取9～11日龄SPF鸡胚，用酒精棉擦拭鸡胚，由气室向四周擦拭消毒。然后将鸡胚放入超净工作台，将气室部位朝上。小心地用高压灭菌后的镊子敲破气室，并夹掉蛋壳。
2、换用新的无菌镊子揭开尿囊绒毛膜，弃去卵壳和卵黄膜。用灭菌镊子夹住鸡胚的头部，轻轻将其移动至平皿。
3、用灭菌镊子固定好头部，用灭菌剪刀剪去头部，四肢，脏器，用灭菌PBS反复冲洗至无色。
4、用灭菌剪刀将组织块剪碎至无大颗粒组织，加入8mL灭菌PBS清洗，静置1min，用移液枪弃去混有红细胞及组织碎片的悬液。
5、按组织块体积的3～5倍加入0.25％胰蛋白酶，置于37℃水浴锅中消化15min，期间不断摇晃，待组织变白色且松散后，加入终浓度为10％的FBS终止消化，并将细胞反复吹打使分散为单个细胞。
6、用灭菌纱布过滤细胞悬液后，将滤液加入到离心管中，1000r/min室温下离心8min，弃去上清。
7、用含有10％FBS的DMEM培养基重悬细胞，稀释至合适浓度后加至细胞培养瓶中，放置于37℃， 5％CO2培养箱内培养，直至细胞长成单层细胞并且达到80％丰度。
8、从液氮中取出病毒，用培养基稀释。
9、将病毒加入铺好的单层CEF细胞中。
CCK-8法检测雷公藤红素对CEF的细胞毒性：
1、CEF细胞的雷公藤红素处理，具体操作为：在96孔板中每孔铺入20000个CEF细胞，用培养基将雷公藤红素稀释成浓度梯度，将含有雷公藤红素浓度梯度的培养基加入96孔板，每孔体积为100μL，于37℃，5％CO2培养箱内培养72h。
2、CCK-8法检测细胞活力，具体操作为：在上述96孔板中每孔加入10μL CCK-8溶液，随后将培养板放入37℃，5％CO2培养箱内孵育3h，用酶标仪测定在波长450nm处的吸光值(OD值)，各平行孔的 OD值取平均数。抑制率％＝(对照细胞OD450-加药细胞OD450)/(对照细胞OD450-空白OD450)x100％，用Graph Pad Prism 8作图。横坐标为药物浓度，纵坐标为细胞死亡率，如图2所示。实验进行三次重复。以此确定雷公藤红素对CEF细胞的安全浓度。
雷公藤红素在CEF细胞水平上抑制MDV复制：
1、形态学观察，具体为：在6孔板中每孔铺入200000个细胞，待其贴壁长成单层细胞后，将其培养基分别更换为含有等体积的DMSO、终浓度为0.02μM、0.1μM的抑制剂药物的培养基，并以200PFU每孔接毒，三天后在显微镜下观察MDV病毒所致的CPE，如图3所示，并记录CPE面积，用Graph Pad Prism 8作图，横坐标为药物浓度，纵坐标为CPE面积，如图4所示，实验进行三次重复。
2、拷贝数变化
a、标准曲线的绘制
根据MDV基因组基因序列，构建了荧光定量PCR标准品质粒，质粒包含MDV基因组特异序列，并以标准质粒序列为基础设计了一对实时荧光定量PCR引物，上游引物如Seq IDNO：1所示，上下游引物如Seq ID NO：2所示。通过对标准质粒进行Q-PCR，应用CT值和标准质粒拷贝数绘制了具有良好的线性关系的标准曲线，如图5所示，实验进行三次重复。
b、病毒拷贝数的测定
在6孔板中每孔铺入200000个细胞，待其贴壁长成单层细胞后，将其培养基分别更换为含有等体积的DMSO、终浓度为0.02μM、0.1μM的抑制剂药物的培养基，以200PFU每孔接毒。以每孔为单位提取基因组。用上述引物进行Q-PCR。根据结果进行定量分析。将每组得到的CT值代入标准曲线得到拷贝数。用Graph Pad Prism 8作图。横坐标为药物浓度，纵坐标为拷贝数，如图6所示。实验进行三次重复。
实施例3
雷公藤红素在鸡MD病模型水平上抑制MDV复制和MD的发生：
具体操作为：取1日龄SPF鸡，按MDV滴度为1000PFU，攻毒方式为腹腔接种，这些攻毒鸡按每天给予腹腔注射雷公藤红素处理，实验分为0.01、0.05、0.1、0.15、0.2、0.3和0.5共7组，未给药处理，只注射等量DMSO的组作为对照组。每组10只鸡。攻毒后20天翅下血管取血，分离T淋巴细胞，按200000 个细胞数量进行MDV基因拷贝数的定量分析，如图7。统计攻毒后50天内各组鸡的MD发病率，如图8。攻毒后50天或在此期间濒临死亡时，进行剖检，记录内脏肿瘤数量，其中统计肝脏和脾脏的肿瘤数量做图。如图9。与对照组相比，随着给药量增加，MDV攻毒鸡的MD发病率显著下降，甚至在高剂量组未见显著发病表现；T细胞内MDV基因组拷贝数显著下降；内脏肿瘤数量显著减少，高剂量组个别个体无显著肿瘤出现。说明雷公藤红素可抑制MDV在鸡体内的复制，可抑制鸡MD的发生。
实施例4
将雷公藤红素通过口服、腹腔注射、肌肉注射方式作用于鸡MD病模型，实验表明三种给药方式均能够有效的抑制MDV在鸡体内的复制，抑制鸡MD的发生。表1为三种给药方式，及细胞水平实验中，雷公藤红素的安全范围、有效范围和最佳剂量。
表1:
Figure BDA0002994216620000131
实施例5
验证雷公藤红素对去泛素化酶UL36特异性的抑制作用。实验表明，雷公藤红素对鸡的USP1、USP7、 USP8、USP2、USP5、USP10、USP13、USP15、USP16、USP20、USP33、USP18、USP19、USP28、USP37、 USP46、USP47、USP51、CYLD、UCH-L1、UCH-L5、OTU1、OTU4、OTU7等去泛素化酶没有抑制作用 (>114μM)。
实验方法同UL36酶学抑制实验。USP1、USP7、USP8等酶使用1～3nM酶浓度，抑制剂浓度>114μM 对上述酶活性无显著抑制作用。
参考文献：实验方法及鉴定标准参考：Chen,J.,et al.,Selective and cell-active inhibitors of the USP1/ UAF1 deubiquitinase complex reverse cisplatinresistance in non-small cell lung cancer cells.Chem Biol,2011. 18(11):p.1390-400.
实施例6
本发明对去泛素化酶UL36抑制剂的筛选。
我们使用APExBio公司包括的所有5000余个蛋白酶抑制剂进行高通量筛选。其中人的USP1抑制剂 ML-323(Cas No.1572414-83-5)、PR-619(Cas No.2645-32-1)、SJB3-019A(Catalog No.B1307)、Pimozide (Cas No.2062-78-4)、GW7647(Cas No.265129-71-3)、Flupenthixol(Cas No.51529-01-2)、Trifluoperazine (Cas No.440-17-5)、Rottlerin(Cas No.82-08-6)等；以及USP7/8抑制剂HBX19818(Cas No.1426944-49-1)、 P 22077(CasNo.1247819-59-5)、GNE-6640(Cas No.2009273-67-8)、GNE-6776(Cas No.2009273-71-4)、NSC 632839(Cas No.157654-67-6)、BAY 11-7082(Cas No.19542-67-7)、USP7-IN-1(CasNo.1381291-36-6)、 C598-0466(Catalog No.A8740)、NSC 632839(Cas No.157654-67-6)等对UL36无抑制作用(>114μM)。
实施例7
利用表1中各种给药方式下，雷公藤红素的最佳剂量，对健康鸡进行给药，对健康鸡进行马立克氏病的预防。结果表明，雷公藤红素作为马立克氏病的预防药物，有效降低了鸡MDV感染率，降低MD的发病率。并且证明口服、肌肉注射、腹腔注射都是预防有效的给药方式。
通过预防给药后的鸡进行MDV感染，再检测鸡MDV感染率和MD的发病率，以及机体内病毒水平等可以验证上述结果。
本发明中雷公藤红素作为去泛素化酶UL36的抑制剂，在马立克氏病的治疗中主要是抗病毒，也就是其对于马立克氏病的治疗时间为病毒感染而未发生肿瘤的阶段，通过去泛素化酶UL36的酶活抑制病毒复制，抑制肿瘤细胞的产生，从而起到治疗作用。
实施例8
实施例8与实施例1-7相似，不同的是采用雷公藤定碱在酶水平上抑制UL36的活性，在细胞水平上抑制MDV的复制，在动物水平上抑制MD肿瘤生长和内脏出血、抑制MD肿瘤生成。
具体用药方式及相应的使用剂量如表2所示。
实施例9
实施例9与实施例1-7相似，不同的是采用雷公藤吉碱在酶水平上抑制UL36的活性，在细胞水平上抑制MDV的复制，在动物水平上抑制MD肿瘤生长和内脏出血、抑制MD肿瘤生成。
具体用药方式及相应的使用剂量如表2所示。
实施例10
实施例10与实施例1-7相似，不同的是采用雷公藤次碱在酶水平上抑制UL36的活性，在细胞水平上抑制MDV的复制，在动物水平上抑制MD肿瘤生长和内脏出血、抑制MD肿瘤生成。
具体用药方式及相应的使用剂量如表2所示。
实施例11
实施例11与实施例1-7相似，不同的是采用雷公藤春碱在酶水平上抑制UL36的活性，在细胞水平上抑制MDV的复制，在动物水平上抑制MD肿瘤生长和内脏出血、抑制MD肿瘤生成。
具体用药方式及相应的使用剂量如表2所示。
实施例12
实施例12与实施例1-7相似，不同的是采用雷公藤新碱在酶水平上抑制UL36的活性，在细胞水平上抑制MDV的复制，在动物水平上抑制MD肿瘤生长和内脏出血、抑制MD肿瘤生成。
具体用药方式及相应的使用剂量如表2所示。
实施例13
实施例13与实施例1-7相似，不同的是采用雷公藤甲素在酶水平上抑制UL36的活性，在细胞水平上抑制MDV的复制，在动物水平上抑制MD肿瘤生长和内脏出血、抑制MD肿瘤生成。
具体用药方式及相应的使用剂量如表2所示。
实施例14
实施例14与实施例1-7相似，不同的是采用雷公藤乙素在酶水平上抑制UL36的活性，在细胞水平上抑制MDV的复制，在动物水平上抑制MD肿瘤生长和内脏出血、抑制MD肿瘤生成。
具体用药方式及相应的使用剂量如表2所示。
实施例15
实施例15与实施例1-7相似，不同的是采用(5R)-5-羟基雷公藤内酯醇(又称“雷滕舒”)在酶水平上抑制UL36的活性，在细胞水平上抑制MDV的复制，在动物水平上抑制MD肿瘤生长和内脏出血、抑制 MD肿瘤生成。
具体用药方式及相应的使用剂量如表2所示。
实施例16
实施例16与实施例1-7相似，不同的是采用雷公藤对醌B在酶水平上抑制UL36的活性，在细胞水平上抑制MDV的复制，在动物水平上抑制MD肿瘤生长和内脏出血、抑制MD肿瘤生成。
具体用药方式及相应的使用剂量如表2所示。
实施例17
实施例17与实施例1-7相似，不同的是采用雷公藤内酯甲在酶水平上抑制UL36的活性，在细胞水平上抑制MDV的复制，在动物水平上抑制MD肿瘤生长和内脏出血、抑制MD肿瘤生成。
具体用药方式及相应的使用剂量如表2所示。
实施例18
实施例18与实施例1-7相似，不同的是采用雷公藤内酯酮在酶水平上抑制UL36的活性，在细胞水平上抑制MDV的复制，在动物水平上抑制MD肿瘤生长和内脏出血、抑制MD肿瘤生成。
具体用药方式及相应的使用剂量如表2所示。
表2
Figure BDA0002994216620000161
Figure BDA0002994216620000171
Figure BDA0002994216620000181
实施例19
雷公藤提取物制备：
制剂标准：雷公藤多苷片30mg/kg；雷公藤多苷片中总三萜含量为4.81～8.90mg/片，而雷公藤片中含量为8.84mg/片
制剂方法：本发明所采用的雷公藤提取物的制备方法，包括：1、通过购买商业化制剂，直接制备。2、根据国家标准进行提取。3、参照现有技术中已报道的各种方法，使用雷公藤提取物或商品化制剂如雷公藤片(国家食品药品监督管理总局国家药品标准(修订)颁布件批件号:ZGB2015-12.(2016)中国药品标准 17,370-372.)、雷公藤多苷片(张玉梅(导师:穆淑珍).雷公藤多苷提取工艺的研究(Thesis)贵州大学 (2018).)、雷公藤总萜片、雷公藤双层片(聂诗明,张红.雷公藤双层片的制备工艺研究.(2006)中国医院药学杂志,812-814.)等提取方法及标准参照国家标准(国家食品药品监督管理总局国家药品标准(修订)颁布件批件号:ZGB2015-12.(2016)中国药品标准17,370-372.)以及(秦万章主编.雷公藤研究(2019).)。标准：总生物碱不少于1.2mg/片，雷公藤甲素不低于10μg/片，雷公藤多苷片中总三萜含量不低于4.0mg/ 片(检测方法参照文献(薛璟,贾晓斌,谭晓斌,贾东升,蒋俊,王慕旸,张陆勇.雷公藤制剂中雷公藤红素及雷公藤总三萜的测定.(2010)中华中医药杂志25,1105-1108.))
雷公藤有效成分：
已从雷公藤植物中分离得到450多种成分，其中约90％为萜类化合物。主要为二萜类118个、三萜类130个、倍半萜吡啶生物碱类77个、倍半萜多元醇酯类78个，其他类成分53个。
以上所述雷公藤提取物成分，包括雷公藤提取物总混合物、雷公藤成分大类提取物(二萜类、三萜类、倍半萜吡啶生物碱类、倍半萜多元醇酯类等)以及各单体化合物，均具有抗MDV和MD的有效成分。
实施例20
实施例20与实施例1-7相似，不同的是采用雷公藤粗提物在酶水平上抑制UL36的活性，在细胞水平上抑制MDV的复制，在动物水平上抑制MD肿瘤生长和内脏出血、抑制MD肿瘤生成。
雷公藤粗提物口服剂量为0.01～20mg/(kg·d)，通过饮水或进食摄入。
实施例21
实施例21与实施例1-7相似，不同的是采用抑制UL36的活性的雷公藤提取物优选为雷公藤红素、雷公藤定碱、雷公藤吉碱、雷公藤次碱、雷公藤春碱、雷公藤新碱、雷公藤甲素、雷公藤乙素、雷滕舒、雷公藤对醌B、雷公藤内酯甲、雷公藤内酯酮至少两种形成的混合物。所述混合物在细胞水平上抑制MDV 的复制，在动物水平上抑制MD肿瘤生长和内脏出血、抑制MD肿瘤生成。其中混合物总的口服剂量优选为0.01～220mg/(kg·d)，腹腔注射剂量为0.002～120mg/(kg·d)，肌肉注射剂量为0.01～168mg/(kg·d)。
实施例22
实施例22与实施例1-7相似，不同的是采用雷公藤二萜类大类提取物在酶水平上抑制UL36的活性，在细胞水平上抑制MDV的复制，在动物水平上抑制MD肿瘤生长和内脏出血、抑制MD肿瘤生成。其中口服剂量优选为0.03～220mg/(kg·d)，腹腔注射剂量为0.002～120mg/(kg·d)，肌肉注射剂量为0.01～ 168mg/(kg·d)。
实施例23
实施例23与实施例1-7相似，不同的是采用雷公藤三萜类大类提取物在酶水平上抑制UL36的活性，在细胞水平上抑制MDV的复制，在动物水平上抑制MD肿瘤生长和内脏出血、抑制MD肿瘤生成。其中口服剂量优选为0.01～220mg/(kg·d)，腹腔注射剂量为0.002～120mg/(kg·d)，肌肉注射剂量为0.01～168 mg/(kg·d)。
实施例24
实施例24与实施例1-7相似，不同的是采用雷公藤倍半萜吡啶生物碱类大类提取物在酶水平上抑制 UL36的活性，在细胞水平上抑制MDV的复制，在动物水平上抑制MD肿瘤生长和内脏出血、抑制MD 肿瘤生成，其中口服剂量优选为0.01～150mg/(kg·d)，腹腔注射剂量为0.003～78mg/(kg·d)，肌肉注射剂量为0.01～98mg/(kg·d)。
实施例25
实施例25与实施例1-7相似，不同的是采用雷公藤倍半萜多元醇酯类大类提取物在酶水平上抑制UL36 的活性，在细胞水平上抑制MDV的复制，在动物水平上抑制MD肿瘤生长和内脏出血、抑制MD肿瘤生成。其中，口服剂量优选为0.01～220mg/(kg·d)，腹腔注射剂量为0.002～120mg/(kg·d)，肌肉注射剂量为 0.01～168mg/(kg·d)。
序列表
<110> 吉林大学
<120> 一种利用雷公藤提取物抑制马立克氏病病毒复制、预防或抗马立克氏病的药物
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
agtcctgcgt cttcagtt 18
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cagaagtcgc tattgtcc 18

Claims (2)

1.雷公藤红素在制备抑制马立克氏病病毒复制的药物中的应用。
2.如权利要求1所述的雷公藤红素在制备抑制马立克氏病病毒复制的药物中的应用，其特征在于，所述药物用于预防或抗鸡马立克氏病、抑制感染马立克氏病病毒鸡的马立克氏病肿瘤生成。
CN202110324973.0A 2021-03-26 2021-03-26 雷公藤红素在制备抑制马立克氏病病毒复制的药物中的应用 Active CN113648337B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110324973.0A CN113648337B (zh) 2021-03-26 2021-03-26 雷公藤红素在制备抑制马立克氏病病毒复制的药物中的应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110324973.0A CN113648337B (zh) 2021-03-26 2021-03-26 雷公藤红素在制备抑制马立克氏病病毒复制的药物中的应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN113648337A CN113648337A (zh) 2021-11-16
CN113648337B true CN113648337B (zh) 2022-04-29

Family

ID=78476873

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110324973.0A Active CN113648337B (zh) 2021-03-26 2021-03-26 雷公藤红素在制备抑制马立克氏病病毒复制的药物中的应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN113648337B (zh)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114470160B (zh) * 2022-03-18 2023-08-25 山东农业大学 病毒复制抑制剂及其应用
CN117581721B (zh) * 2024-01-19 2024-05-07 三亚市国家耐盐碱水稻技术创新中心 一种利用雷公藤福定提高水稻苗期耐盐性的方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105727036A (zh) * 2016-03-31 2016-07-06 李佃场 一种用于防治鸡马立克氏病的中药组合物及其制备方法

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014055624A1 (en) * 2012-10-02 2014-04-10 The General Hospital Corporation D/B/A Massachusetts General Hospital Methods relating to dna-sensing pathway related conditions

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105727036A (zh) * 2016-03-31 2016-07-06 李佃场 一种用于防治鸡马立克氏病的中药组合物及其制备方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Growth inhibitive effect of betulinic acid combined with tripterine on MSB-1 cells and its mechanism;N. An et al;《POULTRY SCIENCE》;20151231;第94卷(第12期);2880-2886 *
中药免疫增强剂在动物生产中的应用;李璐璐等;《兽医导刊》;20090331(第03期);32-35 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN113648337A (zh) 2021-11-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN113648337B (zh) 雷公藤红素在制备抑制马立克氏病病毒复制的药物中的应用
US10130672B2 (en) Antiviral composition
CN107986951B (zh) 新型拓扑异构酶i抑制剂及其药物组合物与其制备方法及应用
KR101021830B1 (ko) 크레이스토카릭스 오페르쿠라투스로부터 얻은 조류, 돼지 인플루엔자 및 신종플루에 대한 항바이러스제
EP0677289A2 (en) Pharmaceutical composition for treating osteoporosis
KR101782532B1 (ko) 백지 추출물 또는 이로부터 분리된 퓨라노쿠마린을 함유하는 조류 인플루엔자, 돼지 인플루엔자 또는 코로나 바이러스의 예방 또는 치료용 조성물
KR101334143B1 (ko) 폴리갈라 카렌시움 추출물 및 이로부터 분리된 잔톤계 화합물을 함유하는 감기, 조류 인플루엔자, 돼지 인플루엔자 또는 신종플루의 예방 또는 치료용 조성물
KR100950445B1 (ko) 감초로부터 얻은 조류, 돼지 인플루엔자 및 신종플루에 대한 항바이러스제
KR20130042990A (ko) 인제난 타입의 디테르펜 화합물 및 이를 포함하는 바이러스 감염 질환의 치료 또는 예방용 약학적 조성물
CN113768917A (zh) 木犀草素在抑制nlrp3炎症小体活化中的应用
Zhang et al. Alpha-terpineol affects synthesis and antitumor activity of triterpenoids from Antrodia cinnamomea mycelia in solid-state culture
CN106038695B (zh) 鳄梨萃取物、鳄梨醇b及(2r,4r)-1,2,4-三羟基十七碳-16-炔的用途，以及包含鳄梨萃取物的保健食品
WO2013062247A2 (ko) 포볼 타입의 디테르펜 화합물 및 이를 포함하는 바이러스 감염 질환의 치료 또는 예방용 약학적 조성물
KR100619498B1 (ko) 간보호 및 간장질환 치료용 의약 조성물
CN105853406B (zh) 原花青素在制备防治猪繁殖与呼吸综合征药物中的用途
CN111317752B (zh) 一种预防或治疗流感病毒感染的药物及用途
CN112972476A (zh) 一种抑制马立克氏病病毒复制、预防或抗马立克氏病的药物
Yang et al. Natural product honokiol exhibits antiviral effects against Micropterus salmoides rhabdovirus (MSRV) both in vitro and in vivo
KR101770395B1 (ko) 코네신을 유효성분으로 포함하는 자식작용 매개 질환 예방 및 치료용 조성물
RU2582282C1 (ru) Способ получения средства, обладающего стресспротективной и антигипоксической активностью
JP7461688B2 (ja) 薬草組成物、その製造方法、およびそれを投与することによるウイルス感染の予防または治療方法
KR20140044223A (ko) 자외선을 처리한 벼 추출물을 유효성분으로 포함하는 대장암 예방 또는 치료용 약학적 조성물
CN114588167B (zh) 过氧麦角甾醇在制备抑制猪δ冠状病毒药物中的应用
KR102311887B1 (ko) 괭생이모자반 추출물을 유효성분으로 포함하는 간질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물
WO2022173246A2 (ko) 구아바(Psidiuma guajava) 추출물 또는 이의 페오피틴화 분획물 또는 이로부터 분리한 메로테르페노이드계 화합물을 유효성분으로 포함하는 신종코로나 바이러스 감염의 예방 또는 치료용 조성물

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant