CN112964865A - 一种通道形貌控制流体混合的超快速免疫检测芯片及其制备方法和应用 - Google Patents

一种通道形貌控制流体混合的超快速免疫检测芯片及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种通道形貌控制流体混合的超快速免疫检测芯片及其制备方法和应用。本发明的超快速免疫检测芯片，包括由上至下依次叠设的模块层、芯片顶板、芯片通道和芯片底板；模块层包括若干个PDMS微孔模块，芯片通道内设有若干个斜向凹槽；芯片顶板上设有进样腔和排液腔；所述进样腔、芯片通道和排液腔依次相连通；所述芯片顶板朝向芯片通道的下表面固定有抗体或抗原。本发明提供的免疫检测芯片可实现超快速的免疫反应，不仅可超越目前最快的免疫结合方法的免疫反应速度，并且有望在数十秒内完成加样、反应、检测、信号响应的全检测流程，实现目前最快的免疫检测速度；同时还具有良好的样品兼容性和技术兼容性。

Description

一种通道形貌控制流体混合的超快速免疫检测芯片及其制备 方法和应用
技术领域
本发明属于生物医学分析技术领域，更具体地，涉及一种通道形貌控制流体混合的超快速免疫检测芯片及其制备方法和应用。
背景技术
免疫检测因其特异性捕获的能力，在疾病诊断技术，特别是快速检测技术(POCT)方面发挥着重要作用。在免疫检测过程中，抗原-抗体的特异性结合是最关键的步骤。特异性结合所需的时间尺度往往决定了免疫检测所需时长，这一时间尺度是否足够短，是一种免疫检测方法能否实现疾病定点高效筛查的重要因素。
目前，常规医院检验科对疾病特征免疫组分的检测，通常基于酶标板采用标准化的酶联免疫(ELISA)程序。一套完整的间接法ELISA程序必须连续完成用于捕获样品的免疫成分的包被孵育、多余包被位点的封闭孵育、待检样本的结合孵育、探针偶联抗体的结合孵育，共计通常需要4小时以上。因此，在医院或诊所中，通常需要确诊患者等待数小时或隔天领取检验报告才能告知阳性结果。对于传播性较强的呼吸道传染病，如COVID-19，等待检测结果期间的人员流动将大幅增加传染病的传播范围，不利于防疫工作的有效开展。其根本原因在于，在这种传统ELISA中，抗原-抗体的特异性结合主要依赖自由扩散。然而，相对于传统ELISA程序中提供的、以毫米或厘米尺度为标准的扩散空间，纳米尺度的抗原-抗体分子仅依靠自由扩散难以在短时间内充分接触，进而难以实现快速免疫反应。
诚然，近年来兴起的微流控芯片与各类流式免疫检测方法，通过将扩散空间尺度缩小至微米及以下的方式，提高了抗原-抗体结合的效率。然而，在此基础上，抗原-抗体的接触与结合本质上仍然依赖于自由扩散。另外，目前还有一些报道，通过利用推动力并配合阀门控制来实现主动式微流控(例如专利CN208302805U)，以控制流体流动速率，加快免疫反应，但结合微流控芯片形貌，这类策略的流体控制可以进一步优化。
因此，结合微流控技术，进一步开发一种使流体加速混合、进而加速免疫反应的策略，能够为疾病的现场快速筛查提供更高效的技术基础。
发明内容
本发明的目的在于克服上述不足，提供一种通道形貌控制流体混合的超快速免疫检测芯片。本发明提供的免疫检测芯片通过带有斜向凹槽的芯片通道的设计，使得流体在流经芯片通道时由自由扩散转变为螺旋流状态流动，扩散速度大幅提高，当流体中存在抗体(或抗原)样本、芯片顶板表面(朝向芯片通道的下表面)上固定有对应的特异性抗原(或抗体)时，固定化抗原(或抗体)周围的样本物质将被快速补充，从而实现超快速的免疫反应。
本发明的另一目的在于提供上述通道形貌控制流体混合的超快速免疫检测芯片的制备方法。
本发明的另一目的在于提供上述通道形貌控制流体混合的超快速免疫检测芯片在制备免疫检测产品中的应用。
为实现上述发明目的，本发明采用如下技术方案：
一种通道形貌控制流体混合的超快速免疫检测芯片，包括由上至下依次叠设的模块层、芯片顶板、芯片通道和芯片底板；模块层包括若干个PDMS微孔模块，芯片通道内设有若干个斜向凹槽结构，芯片顶板上设有进样腔、排液腔，所述进样腔、芯片通道和排液腔依次相连通，所述芯片顶板朝向芯片通道的下表面固定有抗体或抗原
本发明通过在芯片通道内部设计一组斜向凹槽结构(又称为“斜向脊”结构)，来改变流体流动方向。具体地，斜向凹槽类似于枪管中的膛线，对低雷诺数的层流流动具有各向异性的阻力，即：相对于正交方向，在平行于脊峰和脊转折的方向上，流动阻力较小。由于这种各向异性，轴向压力梯度在流动方向上产生一个平均横向分量，该分量起源于结构表面，并随着流体循环回到芯片通道顶部。因此，当流体流过芯片通道时，流动方向前方的流体沿斜向凹槽排列方向依次改变流动方向，并与后续流体发生碰撞后形成螺旋流。在带有斜向凹槽的芯片通道中，流体将以螺旋流状态持续向前流动。
在这种由通道结构形貌导致的流体被动混合过程中，流体中组分的传质行为将不再仅由自由扩散控制，扩散速度大幅提高。当流体中存在抗体(或抗原)样本、芯片顶板表面(朝向芯片通道的下表面)上固定有对应的特异性抗原(或抗体)时，固定化抗原(或抗体)周围的样本物质将被快速补充，从而实现超快速的免疫反应(5～20s)。
利用本发明的免疫检测芯片进行免疫检测时，免疫反应速度，即抗原-抗体免疫复合物的生成速度进一步跃升，可能超越目前最快的免疫结合方法(目前最快的免疫结合方法在57秒内达到结合平衡(索引号10.1016/j.bios.2020.112920)；有望在数十秒内完成加样、反应、检测、信号响应的全检测流程，实现目前最快的免疫检测速度。
另外，本发明的免疫检测芯片在使用时具有良好的样品兼容性，适用包括缓冲溶液、血清、全血等多种介质样品。
除此之外，本发明的免疫检测芯片在使用时还具有良好的技术兼容性，适用包括但不限于基于三明治免疫反应体系的探针放大型免疫检测、基于一步免疫反应体系的直接检测型免疫检测等多种免疫检测技术。
应该说明的是，本发明的斜向凹槽结构中的斜向是指凹槽的走向与流体的流动方向存在夹角。
优选地，所述所述PDMS微孔模块安装在芯片顶板上表面，PDMS微孔模块的安装位置与芯片排液腔、进样腔一一对应。
优选地，所述PDMS微孔模块与芯片顶板上表面键合，其键合位置分别与芯片顶板上进样腔出口、排液腔出口一一对应。
PDMS微孔模块中的微孔的形式可根据实际需要灵活变动，并不局限于圆孔、方孔等。
优选地，所述斜向凹槽结构平行等距分布。
优选地，所述斜向凹槽设于芯片通道的底部。
优选地，所述斜向凹槽为单向斜向凹槽、交错人字形斜向凹槽或鲱鱼骨形斜向凹槽中的一种或几种。
更为优选地，所述斜向凹槽的样式及分布保持整齐一致。
斜向凹槽的尺寸(长宽高)及芯片通道的尺寸可根据实际需要进行选取。
超快速免疫检测芯片的形状可根据实际需要灵活变动，并不局限于圆形或多边形，其尺寸可参考现有的芯片，也可根据实际需要设计。
上述超快速免疫检测芯片的制备方法，包括如下步骤：
S1、芯片通道的制备：
S101：制备芯片通道模具，所述芯片通道模具上对应设有斜向凹槽结构的对应结构；
S102：向芯片通道模具中灌注PDMS混合液，固化成型，剥离，得芯片通道；
S2、芯片顶板的制备及抗原或抗体的固定化：
S201：制备带有双通的微孔的PDMS模具，双通微孔与芯片通道相对应；
S202：选一平整基底板，在平整基底板上设计与进样腔、排液腔相对应的双通的微孔；
S203：将PDMS模具和平整基底板压合；
S204：向PDMS模具的微孔中加入固定化抗体溶液或固定化抗原溶液，孵育，封闭、清洗、干燥，移除PDMS模具，即得抗体或抗原固定化的带孔通道的芯片顶板；
S3、芯片的组装：
S301：制备若干个PDMS微孔模块；
S302：按固定有抗体或抗原的芯片顶板朝下、芯片通道中通道朝上的方式将芯片顶板和芯片通道键合；
S303：将芯片通道与芯片底板键合；
S304：将PDMS微孔模块与芯片顶板上表面键合，其键合位置分别与芯片顶板上进样腔出口、排液腔出口一一对应，即得所述超快速免疫检测芯片。
优选地，S101中利用光刻法、3D打印、激光切割或手工制作的方式制备得到芯片通道模具；进一步优选为光刻法(例如配合利用SU-8光刻胶来制作)。
优选地，S102在制备得到芯片通道后还包括在芯片通道的表面覆盖功能化物质的步骤，以使得当芯片通道结构表面功能化。
更为优选地，利用喷镀、悬涂、化学处理中的至少一种方式在芯片通道的表面覆盖功能化物质。
更为优选地，所述功能化物质为聚乙烯醇或氧化白蛋白中的一种或两种。
在芯片通道表面修饰聚乙烯醇或氧化白蛋白，可以降低微通道非特异性吸附造成的干扰背景。
优选地，S201中平整基底板进行利用激光切割，得到双通的微孔。
S201中平整基底板的材质可为玻璃、聚碳酸酯、聚甲基丙烯酸甲酯等。
优选地，S204的具体过程为：向PDMS模具的微孔中加入固定化抗体或固定化抗原溶液，37℃环境下恒温孵育，随后进行封闭、清洗、干燥，移除PDMS模具后即可获得完成抗体或抗原固定化的带孔通道顶板。
更为优选地，清洗时选用PBST作为清洗液。
优选地，S302在键合前还包括将芯片通道暴露在氧气等离子体环境中的步骤(例如暴露1分钟)。
优选地，S304在键合前还包括将PDMS微孔模块暴露在氧气等离子体环境中的步骤(例如暴露1分钟)。
上述超快速免疫检测芯片在制备免疫检测产品中的应用也在本发明的保护范围内。
具体地，用于免疫检测时，其免疫检测过程如下：
将待测抗原(或抗体)溶液从芯片加样腔中注入，操作预先注满清洗液(例如PBST)的调节模块(例如注射器、手动、半自动或自动化的其它调节模块等)将溶液推入通道，直至溶液完全转移至芯片排液腔，此时即完成所需免疫反应。后续的操作根据免疫检测方案不同灵活变动。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明提供的免疫检测芯片可实现超快速的免疫反应，不仅可超越目前最快的免疫结合方法的免疫反应速度，并且有望在1分钟内完成加样、反应、检测、信号响应的全检测流程，实现目前最快的免疫检测速度；同时还具有良好的样品兼容性和技术兼容性。
附图说明
图1为本发明实施例1提供的一种通道内部斜向脊结构为单向斜向脊型的微流控芯片结构及螺旋流方式透视示意图；
图2是实施例1中的单向斜向脊型微流控芯片实施局域表面等离子体共振一步免疫检测技术，检测人血清中SARS-CoV-2核壳蛋白抗体的示意图；
图3是实施例2提供的一种通道内部斜向脊结构为鲱鱼骨型的微流控芯片结构及螺旋流方式透视示意图；
图4是实施例2中的鲱鱼骨型斜向脊型微流控芯片实施荧光探针放大的三明治型免疫检测技术，检测人血清中SARS-CoV-2核壳蛋白抗体的示意图；
图5为各实施例中的微流控芯片与不同免疫检测形式结合的示意图。
具体实施方式
下面结合实施例和对照例对本发明做进一步的描述。这些实施例仅是对本发明的典型描述，但本发明不限于此。下述实施例和对比例中所用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法，所使用的原料，试剂等，如无特殊说明，均为可从常规市购等商业途径得到的原料和试剂。
实施例1：基于单向斜向脊型微流控芯片实施局域表面等离子体共振一步免疫检测技术，检测人血清中SARS-CoV-2核壳蛋白抗体
芯片结构如图1，包括由上至下依次叠设的模块层、芯片顶板、芯片通道和芯片底板；模块层包括若干个PDMS微孔模块(14个)，芯片通道内设有若干个斜向凹槽(单向斜向脊)，芯片顶板上设有进样腔、排液腔，进样腔、排液腔和PDMS微孔模块的正投影形成两排阵列，均与斜向凹槽的位置相对应。芯片顶板朝向芯片通道的下表面一侧固定有抗体或抗原，抗体或抗原固定的位置与芯片通道的中部一一对应。
该芯片通过如下过程制备及应用：
S1、功能化芯片通道结构的制作：
1)利用SU-8光刻胶，采用两步软光刻法制作芯片制作模具，以定义两层芯片通道的主结构，其中通道长度为1.5厘米，通道高度为0.025厘米，通道宽度为0.2厘米，斜向脊样式为45°于通道侧沿的笔直凹槽结构，深度为0.01厘米，斜向脊间隔为0.15厘米，共8个；
2)向模具中灌注PDMS混合液(PDMS与固化剂按10:1的比例共混制得)，固化成型，将PDMS层从模具上剥离后获得制作好的芯片通道结构；
3)将芯片通道结构表面修饰一层纳米金锥阵列，获得纳米金锥阵列功能化的芯片通道结构。
S2、抗原的固定化：
1)制备一种带有多组双通圆孔的PDMS模具，微孔位置与芯片通道结构一一对应；
2)采用激光切割制作一种带多组双通圆孔的平整聚碳酸酯板，微孔位置与芯片进样腔、排液腔一一对应；
3)将PDMS模具与平整基底按指定样式紧密贴合，封闭基底表面；
4)向PDMS模具的微孔中加入固定化抗原溶液，37℃环境下恒温孵育1h，排出残液后采用含2％脱脂奶粉的封闭液进行封闭，排出封闭液后采用PBST清洗微孔3遍，干燥并移除PDMS模具后即可获得完成抗原固定化的带孔通道顶板。
S3、芯片的组装：
1)制备一系列带有双通微孔的PDMS微孔模块；
2)将制作好的芯片通道结构暴露在氧气等离子体环境下1分钟后，立即将带孔通道顶板按抗原固定化表面朝下，将芯片通道层按通道朝上，按顶板微孔与芯片通道层两端一一对应的方式紧密地贴合，完成芯片通道的封闭；
3)将芯片通道层底部与另一片平整的固定基底紧密结合，完成芯片通道层的夹心固定；
4)将制作好的PDMS微孔模块暴露在氧气等离子体环境下1分钟后，立即与带孔通道顶板的微孔位置一一对应地贴合，完成芯片进样腔和排液腔的组装，从而完成芯片的组装。
S4、芯片的免疫反应应用，如图2：
1)对抗原包被位点进行第一次局域等离子体共振扫描，获得基线Int1；
2)将待测抗体溶液从芯片加样腔中注入，操作预先注满PBST的注射器将溶液推入通道，直至芯片排液腔中液体被填满；
3)抽拉注射器将所有液体返回注射器，使通道内部充满空气；此时抗原与抗体结合，免疫反应完成；
4)对抗原包被位点进行第二次局域等离子共振扫描，获得待测样本的信号响应曲线Int2，完成检测。
本实施例的检测为一步检测，5～20s即可完成免疫反应和整个检测。
实施例2：鲱鱼骨型斜向脊型微流控芯片实施荧光探针放大的三明治型免疫检测技术，检测人血清中SARS-CoV-2核壳蛋白抗体
芯片结构如图3所示，包括由上至下依次叠设的模块层、芯片顶板、芯片通道和芯片底板；模块层包括若干个PDMS微孔模块(14个)，芯片通道内设有若干个斜向凹槽(鲱鱼骨型斜向脊)，芯片顶板上设有进样腔和排液腔，进样腔、排液腔和PDMS微孔模块的正投影形成两排阵列，均与斜向凹槽的位置相对应。芯片顶板朝向芯片通道的下表面一侧固定有抗体或抗原，抗体或抗原固定的位置与芯片通道的中部一一对应。
具体实施方式为：
S1、芯片通道结构的制作：
1)利用SU-8光刻胶，采用两步软光刻法制作芯片制作模具，以定义两层芯片通道的主结构，其中通道长度为1.5厘米，通道高度为0.025厘米，通道宽度为0.2厘米，斜向脊样式为45°于通道侧沿的鲱鱼骨型凹槽结构，深度为0.01厘米，五个斜向脊为一组，每组斜向脊间隔为0.15厘米；
2)向模具中灌注PDMS混合液，固化成型，将PDMS层从模具上剥离后获得制作好的芯片通道结构。
S2、抗原的固定化：
1)制备一种带有多组双通圆孔的PDMS模具，微孔位置与芯片通道结构一一对应；
2)采用激光切割制作一种带多组双通圆孔的平整聚碳酸酯板，微孔位置与芯片进样腔、排液腔一一对应；
3)将PDMS模具与平整基底按指定样式紧密贴合，封闭基底表面；
4)向PDMS模具的微孔中加入固定化抗原溶液，37℃环境下恒温孵育1h，排出残液后采用含2％脱脂奶粉的封闭液进行封闭，排出封闭液后采用PBST清洗微孔3遍，干燥并移除PDMS模具后即可获得完成抗原固定化的带孔通道顶板。
S3、芯片的组装：
1)制备一系列带有双通微孔的PDMS微孔模块；
2)将制作好的芯片通道结构暴露在氧气等离子体环境下1分钟后，立即将带孔通道顶板按抗原固定化表面朝下，将芯片通道层按通道朝上，按顶板微孔与芯片通道层两端一一对应的方式紧密地贴合，完成芯片通道的封闭；
3)将芯片通道层底部与另一片平整的固定基底紧密结合，完成芯片通道层的夹心固定；
4)将制作好的PDMS微孔模块暴露在氧气等离子体环境下1分钟后，立即与带孔通道顶板的微孔位置一一对应地贴合，完成芯片进样腔和排液腔的组装，从而完成芯片的组装。
S4、芯片的免疫反应应用，如图4：
1)对抗原包被位点进行第一次激发光扫描，获得荧光基线Int1；
2)将待测抗体溶液从芯片加样腔中注入，操作预先注满PBST的注射器将溶液推入通道，直至注射器内的PBST溶液完全排空；此时待测抗体与固定化抗原结合，完成第一次免疫反应；
3)将荧光二抗溶液从芯片加样腔中注入，操作预先注满PBST的注射器将溶液推入通道，直至注射器内的PBST溶液完全排空；此时荧光二抗与待测抗体结合，完成第二次免疫反应；
4)对抗原包被位点进行第二次激发光扫描，获得待测样本的荧光信号响应曲线Int2，完成检测。
本实施例的检测为两步检测，5～20s可完成一次免疫反应，10～40s可完成整个检测。
本发明实施例1～2中的超快速免疫检测芯片还可与本领域其它的免疫检测形式结合实现免疫反应和检测，如图5。
最后应当指出的是，以上实施例仅是本发明的具有代表性的例子。显然，本发明的技术方案并不限于上述实施例，还可有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明内容直接导出或联想到所有变形，均应认为是本发明的权利要求的保护范围。

Claims (10)

1.一种通道形貌控制流体混合的超快速免疫检测芯片，其特征在于，包括由上至下依次叠设的模块层、芯片顶板、芯片通道和芯片底板；模块层包括若干个PDMS微孔模块，芯片通道内设有若干个斜向凹槽结构，芯片顶板上设有进样腔、排液腔，所述进样腔、芯片通道和排液腔依次相连通，所述芯片顶板朝向芯片通道的下表面固定有抗体或抗原。
2.根据权利要求1所述超快速免疫检测芯片，其特征在于，所述PDMS微孔模块安装在芯片顶板上表面，PDMS微孔模块的安装位置与芯片排液腔、进样腔一一对应。
3.根据权利要求1所述超快速免疫检测芯片，其特征在于，所述斜向凹槽结构为单向斜向凹槽结构、交错人字形斜向凹槽结构或鲱鱼骨形斜向凹槽结构中的一种或几种；所述斜向凹槽结构平行等距分布。
4.权利要求1～3任一所述超快速免疫检测芯片的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、芯片通道的制备：
S101：制备芯片通道模具，所述芯片通道模具上对应设有斜向凹槽结构的对应结构；
S102：向芯片通道模具中灌注PDMS混合液，固化成型，剥离，得芯片通道；
S2、芯片顶板的制备及抗原或抗体的固定化：
S201：制备带有双通的微孔的PDMS模具，双通微孔与芯片通道相对应；
S202：选一平整基底板，在平整基底板上设计与进样腔、排液腔相对应的双通的微孔；
S203：将PDMS模具和平整基底板压合；
S204：向PDMS模具的微孔中加入固定化抗体溶液或固定化抗原溶液，孵育，封闭、清洗、干燥，移除PDMS模具，即得抗体或抗原固定化的带孔通道的芯片顶板；
S3、芯片的组装：
S301：制备若干个PDMS微孔模块；
S302：按固定有抗体或抗原的芯片顶板朝下、芯片通道中通道朝上的方式将芯片顶板和芯片通道键合；
S303：将芯片通道与芯片底板键合；
S304：将PDMS微孔模块与芯片顶板上表面键合，其键合位置分别与芯片顶板上进样腔出口、排液腔出口一一对应，即得所述超快速免疫检测芯片。
5.根据权利要求4所述制备方法，其特征在于，S101中利用光刻法、3D打印、激光切割或手工制作的方式制备得到芯片通道模具。
6.根据权利要求4所述制备方法，其特征在于，S102在制备得到芯片通道后还包括在芯片通道的表面覆盖功能化物质的步骤。
7.根据权利要求4所述制备方法，其特征在于，利用喷镀、悬涂、化学处理中的至少一种方式在芯片通道的表面覆盖功能化物质；所述功能化物质为聚乙烯醇或氧化白蛋白中的一种或两种。
8.权利要求1～3任一所述超快速免疫检测芯片在制备免疫检测产品中的应用。
9.权利要求1～3任一所述超快速免疫检测芯片的免疫检测方法，其特征在于，包括如下步骤：将待测抗原溶液或抗体溶液从芯片加样腔中注入，操作预先注满清洗液的调节模块将溶液推入通道，直至溶液完全转移至芯片排液腔，以完成待测抗原溶液或抗体溶液中抗原或抗体的免疫捕获；然后利用免疫检测进行检测。
10.根据权利要求9所述免疫检测方法，其特征在于，所述调节模块为注射器，手动、半自动或自动化调节模块。
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