CN116510793A - 一种基于微通道板的三维数字免疫分析检测微流控芯片 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于微通道板的三维数字免疫分析检测微流控芯片。微流控芯片的MCP微通道板嵌在PDMS中层空腔板的中间，两层PDMS外层空腔板层叠键合在PDMS中层空腔板的上下两侧。制备方法包括：将聚二甲基硅氧烷PDMS溶液和固化剂混合后抽真空去气泡，倒入模具中加热固化，超声清洗再用氮气吹干，获得PDMS空腔板；将MCP微通道板进行荧光增强和外部修饰处理，然后嵌入PDMS中层空腔板；进行等离子清洗并键合后获得微流控芯片。本发明微流控芯片为3D结构，样品流过及检测速度快，检测浓度极低，相对高灵敏度，检测范围广，制作简单，适应于多种使用方式。
Description
技术领域
本发明涉及了一种微流控芯片，具体涉及一种基于微通道板的三维数字免疫分析检测微流控芯片。
背景技术
常用的免疫检测方法有：酶联免疫吸附法(ELISA)、放射免疫法、荧光免疫法、化学发光法等。虽然免疫分析已经成为一种常用的分析方法，但传统的免疫分析需要复杂的操作步骤和庞大的实验设备，影响了体外床旁诊断POCT中免疫分析的推广。然而，将免疫分析与微流控技术相结合可以大大改善传统免疫分析的不足。微流控免疫分析系统用于疾病诊断、环境监测、食品和药物筛选。其中免疫荧光技术是利用荧光素标记的抗体检测组织、细胞或血清中的相应抗原的方法。由于荧光抗体具有安全、灵敏的特点，因此已广泛应用在免疫荧光检测和流式细胞计数领域。酶联免疫吸附试验(ELISA)酶联免疫检测是目前应用最广泛的免疫检测方法。该方法是将二抗标记上酶，抗原抗体反应的特异性与酶催化底物的作用结合起来，根据酶作用底物后的显色颜色变化来判断试验结果，其敏感度可达ng水平。
微流控免疫分析技术的发展和创新正在迅速变化。例如：侧向流动免疫层析检测是床旁诊断(POCT)的一种主要形式，其本质是抗体抗原的免疫反应。液体样本从样品垫加入，向吸水纸一侧流动。经过结合垫时，结合垫上的免疫探针被释放，在流动过程中与样本中的待测物发生免疫反应，再被固定在NC膜上的检测线抗体捕获聚集，形成光学信号。这种方法需要样品中待测标志物扩散到抗体表面，捕获效率低，准确性差，样品所需量较大，反应时间较长。免疫磁珠技术相对侧向层析免疫技术，主要是在微生物检测领域方面使用，再结合其他的检测机制下亦能完成免疫分析，其效率高、有选择性的分离出微生物，能够有效减少背景干扰；但是由于国产的磁珠技术有待加强，仍然需要通过进口，价格昂贵，并且磁珠免疫检测，几乎都需要辅助其他的方法，例如分离平板，PCR和发酵实验等，以此来避免杂菌交叉反应。再如离心微流控免疫分析平台，离心管、光盘等、将朝着自动化、集成化、小型化的方向发展。但操作步骤复杂、设备量大、外部设备复杂，都是此类平台进一步推广的障碍。
发明内容
为了解决背景技术中存在的问题，本发明所提供一种基于微通道板的三维数字免疫分析检测微流控芯片。
本发明采用的技术方案是：
一、一种基于微通道板的三维数字免疫分析检测微流控芯片：
微流控芯片包括两层PDMS外层空腔板、PDMS中层空腔板和MCP微通道板，MCP微通道板嵌在PDMS中层空腔板的中间，两层PDMS外层空腔板层叠键合在PDMS中层空腔板的上下两侧板面上。MCP微通道板具体为单边金纳米柱微通道板。
所述的PDMS外层空腔板的一侧板面的中心朝竖直方向上开设有中间宽两侧窄的轴对称的凹槽，凹槽的中间部分为矩形凹槽，凹槽的两端对称开设有贯通PDMS外层空腔板的通孔；位于PDMS中层空腔板上侧的PDMS外层空腔板的凹槽朝下，位于PDMS中层空腔板下侧的PDMS外层空腔板的凹槽朝上，两层PDMS中层空腔板的凹槽中心对称于PDMS中层空腔板。
PDMS中层空腔板的板面中心朝竖直方向上开设有贯通PDMS中层空腔板的矩形通槽，矩形通槽正对PDMS外层空腔板的矩形凹槽，MCP微通道板嵌在PDMS中层空腔板的中间的矩形通槽中。
所述的PDMS外层空腔板的凹槽的深度略小于PDMS外层空腔板的厚度；所述的MCP微通道板为矩形板状，MCP微通道板的尺寸和PDMS中层空腔板的矩形通槽相同。PDMS外层空腔板的矩形凹槽和PDMS中层空腔板的矩形通槽的正对的矩形面尺寸相同或略有不同。
二、一种三维数字免疫分析检测微流控芯片的制备方法：
方法包括如下步骤：
步骤1)制备两层PDMS外层空腔板和PDMS中层空腔板：制备每层PDMS外层空腔板和PDMS中层空腔板的步骤均相同，具体为将聚二甲基硅氧烷PDMS溶液和固化剂混合搅拌均匀后抽真空去除气泡，获得PDMS固化混合溶液，将PDMS固化混合溶液倒入预先准备的各自的模具中，在热板上加热固化后获得PDMS固化板，将PDMS固化板从模具上取出，依次使用丙酮超声清洗、异丙醇超声清洗和DI water超声清洗后再使用氮气吹干，获得PDMS外层空腔板或PDMS中层空腔板。
步骤2)将MCP微通道板依次进行荧光增强处理和外部修饰处理，然后嵌入PDMS中层空腔板中间的矩形通槽中。
步骤3)将两层PDMS外层空腔板和嵌入MCP微通道板的PDMS中层空腔板进行等离子清洗并键合后获得微流控芯片。
所述的步骤1)中，将20g-30g的聚二甲基硅氧烷PDMS溶液和固化剂混合搅拌均匀后抽真空去除气泡，获得PDMS固化混合溶液，聚二甲基硅氧烷PDMS溶液和固化剂的质量比为1/10。
所述的步骤1)中，将PDMS固化混合溶液倒入预先准备的模具中，在75℃-85℃热板上加热1.5-2.5h固化后获得PDMS固化板，将PDMS固化板从模具上取出，依次使用丙酮超声清洗5-10min、异丙醇超声清洗5-10min和DI water超声清洗5-10min后再使用氮气吹干。
所述的步骤2)中，荧光增强处理具体为首先在玻璃皿内放置金属颗粒，然后将MCP微通道板置于玻璃皿中，使用玻璃片将玻璃皿的顶部密封盖住，将MCP微通道板紧贴在玻璃片的底面，加热玻璃皿直至金属颗粒融化后对MCP微通道板进行倒蒸，使得融化后的金属颗粒生成的准直的蒸气原子均匀真空蒸镀蚀刻在MCP微通道板内壁，完成荧光增强处理。
由于MCP微通道板当中的孔洞时具有一定倾斜角的孔洞，在准直的蒸气原子和局部表面法线之间提供一个大的入射角(>70°)，由此来诱导阴影效应，从而实现了局部斜角沉积，通过标准光刻和硅干蚀刻在表面微腔陡峭的侧壁上选择性地形成纳米棒结构。
所述的步骤2)中，外部修饰处理具体为将MCP微通道板浸没在交联剂DSP中2-2.5h，随后使用磷酸盐缓冲液PBST进行清洗，随后浸没在0.1ng/ml的山羊免疫球蛋白GOAT-IgG或者0.1ng/ml的BGAL-Streptavidinβ-半乳糖苷酶标记链霉亲和素SβG中2h，随后使用磷酸盐缓冲液PBST进行清洗，然后浸没在牛血清白蛋白BSA中1h进行空白处的填补，最后进行使用磷酸盐缓冲液PBST清洗掉多余的牛血清白蛋白BSA，完成外部修饰处理。
所述的步骤3)中，将两层PDMS外层空腔板和嵌入MCP微通道板的PDMS中层空腔板在60W的等离子清洗机下进行等离子清洗50-60s并依次键合后获得微流控芯片。
三、一种三维数字免疫分析检测微流控芯片的应用：
微流控芯片在荧光免疫检测和荧光酶联免疫检测中的应用。
本发明的有益效果是：
1、检测时高速、高灵敏度、便于观测：发明中由于存在百万量级的孔充当捕获通道，打破2D传统以3D的方式进行免疫分析，再按照泊松分布公式推导可以检测极低浓度的抗原蛋白，检测浓度低、灵敏度高，样品流过速度快。通道壁上的的金纳米柱结构，无论是荧光酶联免疫分析，还是直接的荧光免疫分析都能够起到荧光增强放大的效果，便于观测。
2、检测范围广：除了能够检测实验中使用的抗原抗体之外，还能够检测其他ELISA原理反应的样品。由于微通道的体积在pL-nL量级，孔的密度很高，利于高浓度的检测，所以检测范围广。
3、制作简易：主要结构使用的标记的MCP可大规模制造，通道内壁的金纳米柱，真空蒸镀过程也很容易，器件的全部材料和设备只需要聚二甲基硅氧烷PDMS和等离子清洗机，最后将三者相互结合成最终芯片。
4、多重使用方式：不仅可作为双向通道使用，还可以通过使用高密度重油对底部进行油封，从而变成一个反应容器。
本发明的微流控芯片为3D结构，样品流过及检测速度快，检测浓度极低，相对高灵敏度，检测范围广，制作简单，适应于多种使用方式。
附图说明
图1的(a)为本发明的微通道板MCP截面结构示意图；
图1的(b)为本发明的微通道板MCP立体结构示意图；
图2为本发明的单边金纳米柱微通道板结构扫描电镜SEM图；
图3的(a)为本发明的微流控芯片的剖视图；
图3的(b)为本发明的微流控芯片的俯视图；
图3的(c)为本发明的微流控芯片的3D视图；
图4的(a)为本发明的微流控芯片在微通道板MCP的孔隙中的蛋白捕获荧光反应的流程示意图；
图4的(b)为本发明的微流控芯片将底部密封后做为一种容器进行反应的流程示意图；
图5为本发明的微流控芯片的通孔示意图；
图6为本发明的微流控芯片的手动气阀操作方式示意图；
图7的(a)为本发明的微流控芯片的上和下层结构示意图；
图7的(b)为本发明的中层结构示意图。
具体实施方式
下面结合附图及具体实施例对本发明作进一步详细说明。
如图1的(a)和图1的(b)所示，MCP微通道板以玻璃薄片为基地，在基片上以数微米到十几微米的空间周期以六角形周期排布孔径比空间周期略小的圆柱体微通道，通常应用到光量子放大领域。一块MCP上约有上百万微通道，同一块MCP上面的通道的体积一致，因型号不同微通道体积在10pL-10nL范围内不等。同时又由于微通道板之间的间距及其小(1um左右)，在一个视野中存在大量的反应孔。具体可在图1的(b)的MCP微通道棒上切割一层矩形板作为MCP微通道板。
本微流控芯片使用的微通道板为“单边金纳米柱微通道板”Single-sided goldnanopillar microchannel plate，如图2所示，为该结构扫描电镜SEM图。
具有周期性分布的金属纳米结构在特定激发条件下可以产生表面等离极化激元(surface plasmon polariton，SPP)在衬底表面形成局域增强电场，该局域场能够有效调控位于金属衬底表面附近的荧光分子的电子跃迁行为，从而获得调控荧光的效果。纳米金属结构有助于荧光增强，这样对于荧光免疫分析，荧光酶免疫分析等ELISA反应都能起到荧光增强至肉眼可见的效果。
图3的(a)为本发明的微流控芯片的剖面图，其由PDMS聚二甲基硅氧烷和MCP微通道板结合而成的上、中、下三层，上下四个功能复用的进液腔/排液腔，中间层镶嵌MCP微通道板。图3的(b)是俯视图。图3的(c)是大致的3D结构示意图。上层的上空腔为反应处，下层也具有下空腔。空腔内灌满液体容积大约为30ul。随后根据反应实验的需要，适当的选择堵住孔，加入反应液。反应区就在MCP的孔洞之中，由于PDMS聚二甲基硅氧烷是透明的因此可以直接观察到孔洞中的反应荧光效果。如图5所示，上层的a通孔和b通孔已经下层的c通孔和d通孔均为排液口/进样口。
具体实施时可使用堵头来根据需要的液体流向堵住相应的孔。如图4的(a)和图5所示，为微流控芯片直接在MCP的孔隙中的蛋白捕获荧光反应，为了将液体1通过MCP到达底部，则选择堵住b、c、d三个孔，此时流阻最小液体能够灌满整个腔室。当需要释放液体时，将下面两个堵头移除之后，便可以释放浸泡的反应液体。如图4的(b)和图5所示，为微流控芯片将底部进行密封从而做为一种容器反应。首先采用三种不同密度的液体。上端不堵住，从c孔加入密度最大的液体2然后将底部密封，随后堵住b口，从a口加入待测样液(液体3)，待样液进入孔隙之中，最后使用密度小的矿物油(液体4)进行孔隙封口，从a口加入，b口排出多余待测样液，待孔隙中反应完全，达到最后可观测状态。利用矿物油可将多余反应液排出并将相邻微通道分隔成独立的反应腔室。液体1为抗原液、抗体液、缓冲液、链酶或亲和素等，液体2为重油等高目睹液体，液体3为酶底物，液体4为矿物油。
如图6所示，将微流控芯片作为被动式压力微流控系统，在灌入液体时需要通过收放堵头来引出其间内部的空气，从而达到液体的浸泡和密封。将下腔室的两个孔与上腔室的其中一个孔密封，此时若从上腔室灌入溶液则会产生空气阻力。将下腔室其中一个口打开，此时灌入溶液，则溶液会将下腔室的一部分空气排出，这时再次密封整个下腔室，将上腔室堵头取走，继续挤入液体排放上腔室空气。最后将上腔室取走的堵头塞回，把下腔室另一边的堵头去下，再通过挤压上腔室液体排放下腔室另外一部分空气。以此步骤来控制整个器件液体的浸泡与密封。
本发明的具体实施例如下：
实施例1：
三维数字免疫分析检测微流控芯片的制备方法包括如下步骤：
步骤1)制备两层PDMS外层空腔板和PDMS中层空腔板：制备每层PDMS外层空腔板和PDMS中层空腔板的步骤均相同，具体为将20g的聚二甲基硅氧烷PDMS溶液和固化剂混合搅拌均匀后抽真空去除气泡，获得PDMS固化混合溶液，聚二甲基硅氧烷PDMS溶液和固化剂的质量比为1/10；将PDMS固化混合溶液倒入预先准备的模具中，在80℃热板上加热2h固化后获得PDMS固化板，将PDMS固化板从模具上取出，依次使用丙酮超声清洗5min、异丙醇超声清洗10min和DI water超声清洗10min后再使用氮气吹干，获得PDMS外层空腔板或PDMS中层空腔板。
步骤2)将MCP微通道板依次进行荧光增强处理和外部修饰处理，然后嵌入PDMS中层空腔板中间的矩形通槽中。荧光增强处理具体为首先在玻璃皿内放置金属颗粒，然后将MCP微通道板置于玻璃皿中，使用玻璃片将玻璃皿的顶部密封盖住，将MCP微通道板紧贴在玻璃片的底面，加热玻璃皿直至金属颗粒融化后对MCP微通道板进行倒蒸，使得融化后的金属颗粒生成的准直的蒸气原子均匀真空蒸镀蚀刻在MCP微通道板内壁，完成荧光增强处理
由于MCP微通道板当中的孔洞时具有一定倾斜角的孔洞，在准直的蒸气原子和局部表面法线之间提供一个大的入射角(>70°)，由此来诱导阴影效应，从而实现了局部斜角沉积，通过标准光刻和硅干蚀刻在表面微腔陡峭的侧壁上选择性地形成纳米棒结构。
步骤2)中，外部修饰处理具体为将MCP微通道板浸没在交联剂DSP中2h，随后使用磷酸盐缓冲液PBST进行清洗，随后浸没在0.1ng/ml的山羊免疫球蛋白GOAT-IgG或者0.1ng/ml的BGAL-Streptavidinβ-半乳糖苷酶标记链霉亲和素SβG中2h，随后使用磷酸盐缓冲液PBST进行清洗，然后浸没在牛血清白蛋白BSA中1h进行空白处的填补，最后进行使用磷酸盐缓冲液PBST清洗掉多余的牛血清白蛋白BSA，完成外部修饰处理。
步骤3)将两层PDMS外层空腔板和嵌入MCP微通道板的PDMS中层空腔板在60W的等离子清洗机下进行等离子清洗60s并依次键合后获得微流控芯片。
如图7的(a)所示，撕下来的PDMS固化板两边打1mm的小孔，一共做两个这样的PDMS固化板，再用一个中间能够镶嵌微通道板MCP的镂空PDMS模具，制成中间能够镶嵌微通道板MCP的镂空PDMS膜如图7的(b)所示，PDMS固化膜的尺寸具体可为4*4*1mm，微通道板MCP的尺寸具体可为4mm*4mm*1mm，根据微通道板不同的切割尺寸，可以对应改变PDMS膜中间的镂空大小。
制备的微流控芯片可以进行如下实验：
a)酶联免疫分析链霉亲和素实验：
首先将c、d、b孔(1mm)用实心柱体(1.5mm)堵住，将交联剂DSP从a口加入，流过微通道板MCP之后进入下空腔，将其浸泡2h，打开c、d口进行交联剂DSP排放，随后堵住c、d口，从a口加入PBST，清洗多余的DSP，之后打开c、d口对PBST进行排放。
重复上述步骤，同样需要加入浓度为0.1ng/ml的BGAL-Streptavidinβ-半乳糖苷酶标记链霉亲和素(SβG)，室温浸泡2h——排放——用0.1wt％Tween-20和0.1wt％BSA的PBS洗涤3次(PBST)——排放PBST——加入牛血清蛋白BSA浸泡1h——排放——PBST清洗——排放PBST。随后堵住a、b、d孔，将从底部未堵住的孔洞采用针管加入FC40等密度比水大的液体直至灌满底部，对进行底部密封使孔洞成为容器，保证下面两个孔洞和上面其中之一的孔洞都密封之后，加压的方式加入，荧光素底物二(β-d-半乳糖苷)(FDG)，使微通道板MCP孔洞中有荧光素底物二(β-d-半乳糖苷)FDG，最后开放上面两个孔洞，再加入一层比水密度小的矿物油进行排放。具体可以参考图4的(b)的过程。
b)荧光免疫分析实验：
首先将c、d、b孔(1mm)用实心柱体(1.5mm)堵住，将交联剂二硫双(琥珀酰亚胺丙酸酯)DSP从a口加入，流过微通道板MCP之后进入下空腔，将其浸泡2-2.5h，打开c、d口进行交联剂DSP排放，随后堵住c、d口，从a口加入PBST，清洗多余的交联剂DSP，之后打开c、d口对PBST进行排放。
重复上述步骤，同样需要加入浓度为0.1ng/ml的Goat-IgG抗原，室温浸泡2h——排放——用0.1wt％Tween-20和0.1wt％BSA的PBS洗涤3次(PBST)——排放PBST——加入牛血清蛋白BSA浸泡1h——排放——PBST清洗——排放PBST。而后堵住b、c、d口从a口，将anti-goat-IgG抗体，采用加压进入器件，流过孔洞，并且浸泡1h。随后开放底部孔洞，排出多余的抗体溶液，最后采用PBST缓冲液进行清洗3回。观测时可使用缓冲液PBS或者纯净水灌满腔室进行观测。
在荧光免疫分析中，具体为堵住b、c、d口从a口，将anti-goat-IgG抗体，采用加压进入器件，流过孔洞，并且浸泡1h。随后开放底部孔洞，排出多余的抗体溶液，最后采用PBST缓冲液进行清洗2回。观测时可使用缓冲液PBS或者纯净水灌满腔室进行观测。
在荧光酶联免疫分析中，具体为堵住a、b、d孔，将从底部未堵住的孔洞采用针管加入FC40等密度比水大的液体直至灌满底部，对进行底部密封使孔洞成为容器，保证下面两个孔洞和上面其中之一的孔洞都密封之后，加压的方式加入，荧光素底物二(β-d-半乳糖苷)(FDG)，使微通道板MCP孔洞中有FDG，将FDG灌满上腔室，进行观测。
本发明的基于微通道板的3D数字免疫分析器件，体积小，便于携带，采用微流控当中的被动加压模式，待测液体快速流过孔洞，在壁边进行捕获，无需磁珠等辅助材料，由于微通道板有较多的反应腔室、还能够精确、量化待测物，即通量大、同时拥有超低检测浓度，大分子蛋白1pg/ml的待测物经泊松分布公式计算亮暗比约为75％，因此具有更高的灵敏度和效率。本发明利用精准微纳加工制造出大量百万级微米纳米级孔洞，该数量可同超低浓度待检测样液浓度成比例关系。微通道板MCP的每一个通道边壁都可以作为单独的捕获区，再加上通道内部采用简单的蒸镀技术布满纳米金柱，当荧光免疫分析时，可以通过纳米金柱结构的表面等离子共振的原理来使荧光增强，从而能够更清晰的观测到抗原抗体捕获的结果。本发明主要是微通道板的微流控免疫分析芯片，以3D的方式进行蛋白免疫分析，比起2D微通道的捕获，3D魔术下能够从速度、精度方面更有效的提高捕获效率，最后还能以数字的方式量化待测样品，从而检测浓度。
Claims (10)
1.一种基于微通道板的三维数字免疫分析检测微流控芯片，其特征在于：包括两层PDMS外层空腔板、PDMS中层空腔板和MCP微通道板，MCP微通道板嵌在PDMS中层空腔板的中间，两层PDMS外层空腔板层叠键合在PDMS中层空腔板的上下两侧板面上。
2.根据权利要求1所述的一种基于微通道板的三维数字免疫分析检测微流控芯片，其特征在于：所述的PDMS外层空腔板的一侧板面的中心朝竖直方向上开设有中间宽两侧窄的轴对称的凹槽，凹槽的中间部分为矩形凹槽，凹槽的两端对称开设有贯通PDMS外层空腔板的通孔；位于PDMS中层空腔板上侧的PDMS外层空腔板的凹槽朝下，位于PDMS中层空腔板下侧的PDMS外层空腔板的凹槽朝上，两层PDMS中层空腔板的凹槽中心对称于PDMS中层空腔板；
PDMS中层空腔板的板面中心朝竖直方向上开设有贯通PDMS中层空腔板的矩形通槽，矩形通槽正对PDMS外层空腔板的矩形凹槽，MCP微通道板嵌在PDMS中层空腔板的中间的矩形通槽中。
3.根据权利要求2所述的一种基于微通道板的三维数字免疫分析检测微流控芯片，其特征在于：所述的PDMS外层空腔板的凹槽的深度小于PDMS外层空腔板的厚度；所述的MCP微通道板为矩形板状，MCP微通道板的尺寸和PDMS中层空腔板的矩形通槽相同。
4.根据权利要求1-3任一所述的三维数字免疫分析检测微流控芯片的制备方法，其特征在于：方法包括如下步骤：
步骤1)制备两层PDMS外层空腔板和PDMS中层空腔板：制备每层PDMS外层空腔板和PDMS中层空腔板的步骤均相同，具体为将聚二甲基硅氧烷PDMS溶液和固化剂混合搅拌均匀后抽真空去除气泡，获得PDMS固化混合溶液，将PDMS固化混合溶液倒入预先准备的各自的模具中，在热板上加热固化后获得PDMS固化板，将PDMS固化板从模具上取出，依次使用丙酮超声清洗、异丙醇超声清洗和DI water超声清洗后再使用氮气吹干，获得PDMS外层空腔板或PDMS中层空腔板；
步骤2)将MCP微通道板依次进行荧光增强处理和外部修饰处理，然后嵌入PDMS中层空腔板中间的矩形通槽中；
步骤3)将两层PDMS外层空腔板和嵌入MCP微通道板的PDMS中层空腔板进行等离子清洗并键合后获得微流控芯片。
5.根据权利要求4所述的三维数字免疫分析检测微流控芯片的制备方法，其特征在于：所述的步骤1)中，将20g-30g的聚二甲基硅氧烷PDMS溶液和固化剂混合搅拌均匀后抽真空去除气泡，获得PDMS固化混合溶液，聚二甲基硅氧烷PDMS溶液和固化剂的质量比为1/10。
6.根据权利要求4所述的三维数字免疫分析检测微流控芯片的制备方法，其特征在于：所述的步骤1)中，将PDMS固化混合溶液倒入预先准备的模具中，在75℃-85℃热板上加热1.5-2.5h固化后获得PDMS固化板，将PDMS固化板从模具上取出，依次使用丙酮超声清洗5-10min、异丙醇超声清洗5-10min和DI water超声清洗5-10min后再使用氮气吹干。
7.根据权利要求4所述的三维数字免疫分析检测微流控芯片的制备方法，其特征在于：所述的步骤2)中，荧光增强处理具体为首先在玻璃皿内放置金属颗粒，然后将MCP微通道板置于玻璃皿中，使用玻璃片将玻璃皿的顶部密封盖住，将MCP微通道板紧贴在玻璃片的底面，加热玻璃皿直至金属颗粒融化后对MCP微通道板进行倒蒸，使得融化后的金属颗粒生成的准直的蒸气原子均匀真空蒸镀蚀刻在MCP微通道板内壁，完成荧光增强处理。
8.根据权利要求4所述的三维数字免疫分析检测微流控芯片的制备方法，其特征在于：所述的步骤2)中，外部修饰处理具体为将MCP微通道板浸没在交联剂DSP中2-2.5h，随后使用磷酸盐缓冲液PBST进行清洗，随后浸没在0.1ng/ml的山羊免疫球蛋白GOAT-IgG或者0.1ng/ml的BGAL-Streptavidinβ-半乳糖苷酶标记链霉亲和素SβG中2h，随后使用磷酸盐缓冲液PBST进行清洗，然后浸没在牛血清白蛋白BSA中1h，最后进行使用磷酸盐缓冲液PBST清洗掉多余的牛血清白蛋白BSA，完成外部修饰处理。
9.根据权利要求4所述的三维数字免疫分析检测微流控芯片的制备方法，其特征在于：所述的步骤3)中，将两层PDMS外层空腔板和嵌入MCP微通道板的PDMS中层空腔板在60W的等离子清洗机下进行等离子清洗50-60s并依次键合后获得微流控芯片。
10.根据权利要求1-3任一所述的三维数字免疫分析检测微流控芯片或权利要求4-9任一所述的制备方法制备获得的三维数字免疫分析检测微流控芯片的应用，其特征在于：所述的微流控芯片在荧光免疫检测和荧光酶联免疫检测中的应用。
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