JP2014530355A - 免疫学的タンパク質、病原性及び微生物因子並びに細胞の検出及び定量化用装置及び方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、液体試料中に分散する磁気応答性マイクロビーズの濃度を検出及び定量化するための方法及び装置を提供する。また、抗原特異的抗体で被覆された磁気応答性マイクロビーズを使用して試料媒体中の分析物の濃度を検出及び定量化するための方法及びマイクロ流体イムノアッセイｐＳｃｒｅｅｎ（商標）装置も提供される。本発明の方法及び装置は、タンパク質、タンパク質断片、抗原、抗体、抗体断片、ペプチド、ＲＮＡ、ＲＮＡ断片、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋細胞に特異的な機能化された磁気マイクロビーズ、マラリア感染赤血球、癌細胞、前立腺特異抗原などの癌バイオマーカー及び他の癌バイオマーカー、ウイルス、細菌、及び他の病原性因子などの多種多様な分析物の定量化を、研究室ベースののベンチトップアッセイの感度、特異度及び精度で可能にすることにより、ポイント・オブ・ケア診断向けの広範な適用を有する。【選択図】図３

Description

本発明は、イムノアッセイ及びマイクロ流体装置の分野に関し、詳細には、液体試料中に分散するタンパク質、細胞及び微生物因子とコンジュゲートした磁気応答性マイクロビーズを検出及び定量化するためのポイント・オブ・ケア診断方法及び装置に関する。

タンパク質を検出及び定量化するための現行のイムノアッセイ技術は、抗原と抗原特異的抗体との間の化学的相互作用の特異性に頼っている。このような検査法は、２つの主なグループ、すなわち研究室ベースの検査とポイント・オブ・ケア（ＰＯＣ）検査とに分類することができる。研究室ベースの検査は感度及び精度が高いが、研究室環境及び熟練した技師が必要である。ＰＯＣ検査は現場で使用するように設計され、且つ限られた訓練しか必要でないが、感度及び精度がはるかに劣り、多くのＰＯＣ検査では二値の陽性／陰性結果又は半定量的結果を提供するのみである。

現行のイムノアッセイ技術は、いずれも抗原抗体複合体の形成が関わる。この複合体の検出が、試料中における標的分析物の存在を示す。抗原抗体複合体は、蛍光標識された抗原特異的抗体を用いるときには、複合体による光の放出及び／又は反射を計測することにより検出され、或いは抗体被覆されたマイクロビーズを使用する場合、光の放出及び／又は反射を計測するか、又は抗原−ビーズ複合体を形成するマイクロビーズの磁気モーメントを計測することにより検出される。いずれの場合にも、光学的又は磁気的検出器及び電子的読取り機が必要である。

例えば、最も単純で最も知られた、且つ広く用いられているＰＯＣ診断アッセイは、イムノクロマト検査としても知られるラテラルフローアッセイである。この検査では、標的分析物が、ラテックス又は金ナノ粒子と結び付いた分析物特異的抗体に結合する。次に、分析物−抗体結合複合体の凝集又は蓄積によって生じる目に見えるバンド、又はラインの形成により、試料中における分析物の存在が明らかになる。バンドは、典型的には巨視的に肉眼で見える。アッセイの感度を増加させる装置が開発されており、これは顕微鏡感度で色の変化を読み取ることができるものである。蛍光標識又は磁気標識された粒子もまた用いられている。しかしながら、その場合、検査結果を評価する電子的読取り機が必要である。従って、アッセイの感度は増加し得るが、アッセイの費用及び複雑さもまた増加する。

近年、タンパク質の分離及び検出に抗体被覆マイクロビーズが使用されることが多くなっている。イムノアッセイ診断の分野では、マイクロビーズの濃度が、試料中における標的タンパク質濃度の代用となる。このような適用では、試料溶液中のマイクロビーズの濃度を同定する必要がある。マイクロビーズは、ポリマービーズに磁気コア又は磁気層を加えることにより磁気応答性にされ得る。次にマイクロビーズは、リガンドと称される、抗体抗原相互作用で標的抗原に結合するという目的に適う様々な分子及びタンパク質によって被覆され得る。加えて、マイクロビーズに蛍光色素を組み込むことで、マイクロビーズを光学的に検出可能にすることができる。最近になって、Ｄｉｔｔｍｅｒ ｅｔ ａｌ．（Ｐｈｉｌｉｐｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｅｕｒｏｐｅ）により磁気マイクロビーズを用いたタンパク質トロポニンの診断検査が提案されている。このアッセイでは、抗トロポニン抗体で被覆されたマイクロビーズが、印加磁場の助けにより、マイクロウェルの表面上により抗体−トロポニン−抗体によって固定化される。ウェルの底面を照射し、且つ固定化されたマイクロビーズによって反射された光を受光器で計測することにより、抗体−トロポニン−抗体の数が計測される。イムノ磁気マイクロビーズを使用して、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の検出方法も開発されている。この場合、時間分解蛍光を検出することによって試料中の細菌が計測される。

マイクロビーズ技術がこの１０年間のうちに成熟した一方で、マイクロビーズ濃度を定量化する技術は後れを取っている。現行の方法としては、手動の顕微鏡及び自動又は半自動の細胞カウンタがある。典型的には、顕微鏡を使用したマイクロビーズの計数には、顕微鏡対物レンズを介した手作業による、多くの場合に手間のかかるビーズ計数が関わる。この方法は、研究室環境での熟練した技師が必要で、時間がかかり、且つ技師の解釈に左右される。細胞カウンタがマイクロビーズの表面に当たるレーザービームの光反射を計測してマイクロビーズを自動的に検出するには、フォトセンサが必要である。細胞カウンタは、精密であるものの、高価で、また高度な研究室環境での熟練した技師も必要である。タンパク質被覆マイクロビーズ濃度の濃度を検出及び計測するラボ・オン・ア・チップ装置もまた開発されている。しかしながら、こうした装置は従来の手法、すなわちマイクロスケールの光センサ及びフォトセンサ並びにマイクロスケールの磁気抵抗磁力計を使用する光の反射及び検出に頼るものである。従って、研究室環境及び機器の必要性は大幅に減るものの、ラボ・オン・ア・チップ装置はなお、電気的読取り機及びトランスデューサを必要とする。加えて、このような装置は典型的にはハンドセット及び消耗部品を含み、そのため作製、校正及びメンテナンス費用が増加する。従って、ＰＯＣイムノアッセイ診断の分野におけるこうした装置の適用は限られていた。

従って、使い易く低価格でありながら研究室ベースのイムノアッセイ検査の感度及び特異度を有するＰＯＣイムノアッセイ装置、並びに試料検体中における磁気応答性マイクロビーズ濃度を検出及び定量化する方法が必要とされている。

本明細書に開示される本発明に基づくｐＳｃｒｅｅｎ（商標）マイクロ流体イムノアッセイ装置は、上述の必要性を単一の装置において全て満たす。液体試料中の未知の分析物濃度の検出及び定量化が、現行の技術のように光学的効果又は磁場検知を用いるのでなく、溶液中にある磁気応答性マイクロビーズの流体力学的特性を利用することにより達成される。標的分析物の未知の濃度は、一方が印加磁場勾配の影響下にある２つのマイクロチャネルにおける試料の流れの流速差を計測することにより導き出される。本発明は、現行の研究室ベースのイムノアッセイ診断検査の費用及び複雑さを大幅に低減し、ラテラルフロー検査の感度を１０００倍に大きく増加させる一方で、研究室ベースの検査の特異度及び精度、並びに所定の範囲にわたる標的抗原濃度の検出能力は維持する。

本発明の実施形態において、流体中の磁気応答性マイクロビーズの濃度を検出及び定量化する方法が提供される。この方法は、磁場勾配に曝露されている少なくとも１つの検査マイクロチャネル（Ｃｍ）における流体の流速（Ｑｍ）を、磁場勾配に曝露されていない校正マイクロチャネル（Ｃｏ）における流体の流速（Ｑｏ）と共に計測するステップ（ここでこれらのマイクロチャネルは等しい一定の圧力に保たれる）と、次に、比Ｑｍ／Ｑｏ、差Ｑｏ−Ｑｍ、及び比（Ｑｏ−Ｑｍ）^ｐ／（Ｑｍ）^ｑを計算するステップ（式中、ｐ及びｑは校正プロセスから求められ、ここでは比Ｑｍ／Ｑｏ及び（Ｑｏ−Ｑｍ）^ｐ／（Ｑｍ）^ｑが、流体中の磁気応答性マイクロビーズ数の代用となる）を含む。磁場勾配に曝露されている少なくとも１つの検査マイクロチャネルにおける磁気応答性マイクロビーズの存在によって流体中で磁気応答性マイクロビーズのフロキュレーションが生じ、それにより少なくとも１つの検査マイクロチャネルを通る流体の流速が低下する。

別の実施形態では、液体試料中における分析物の濃度の検出及び定量化方法が提供される。この方法は、反応チャンバの液体試料入口に液体試料を加えるステップを含む。反応チャンバは、その表面上に、分析物に特異的な複数の固定化された抗原特異的抗体（Ａｂ１）を吸着している。反応チャンバの表面はまた、その上で脱水させた複数の磁気応答性マイクロビーズも有し、ここで複数の磁気応答性マイクロビーズの各々は、分析物に特異的な抗原特異的抗体（Ａｂ２）で被覆されている。この方法は、液体試料を反応チャンバ内でインキュベートさせることで、反応チャンバに液体試料が加わり撹拌されるに従い複数の抗体被覆磁気応答性マイクロビーズの再水和が起こり、この再水和により、抗体被覆磁気応答性マイクロビーズが液体試料中に分散するステップ、再水和した抗体被覆磁気応答性マイクロビーズ並びに反応チャンバの表面に固定化された抗原特異的抗体が液体試料中に存在する任意の分析物と結合して、反応チャンバの表面上にＡｂ１−分析物−Ａｂ２被覆磁気マイクロビーズ複合体を形成するステップ、任意の未結合の抗体被覆磁気応答性マイクロビーズを含有する液体試料を、チャンバ出口を通じて反応チャンバから出し、連続的な流体接続を通じ、分岐して校正マイクロチャネル（Ｃｏ）と少なくとも１つの検査マイクロチャネル（Ｃｍ）とを形成するマイクロチャネル分流部に移動させるステップを含む。少なくとも１つの検査マイクロチャネルと校正マイクロチャネルとは、等しい一定の圧力に保たれる。校正マイクロチャネルは目盛付きカラムに連続的に流体接続し、少なくとも１つの検査マイクロチャネルは少なくとも１つの目盛付きカラムに連続的に流体接続している。目盛付きカラムの各々は、その上に目盛付きスケールを有する。この方法は、磁場勾配に曝露されている少なくとも１つの検査マイクロチャネルにおける液体試料の流速（Ｑｍ）を、磁場勾配に曝露されていない校正マイクロチャネルの流体の流速（Ｑｏ）と共に計測するステップ（ここでは磁場勾配に曝露されている少なくとも１つの検査マイクロチャネルにおける任意の未結合の抗体被覆磁気応答性マイクロビーズの存在によって液体試料中で抗体被覆磁気応答性マイクロビーズのフロキュレーションが生じ、それにより少なくとも１つの検査マイクロチャネルを通る液体試料の流速が低下する）と、次に、比Ｑｍ／Ｑｏ、差Ｑｏ−Ｑｍ、及び比（Ｑｏ−Ｑｍ）^ｐ／（Ｑｍ）^ｑを計算するステップ（式中、ｐ及びｑは校正プロセスから求められ、ここでは比Ｑｍ／Ｑｏ及び（Ｑｏ−Ｑｍ）^ｐ／（Ｑｍ）^ｑが、液体試料中の分析物濃度の代用である液体試料中の磁気応答性マイクロビーズ数の代用となる）とを含む。

本発明のさらなる実施形態では、液体試料中の磁気応答性マイクロビーズ濃度を検出及び定量化するための使い捨て携帯形ラボ・オン・カードマイクロ流体ｐＳｃｒｅｅｎ（商標）磁気応答性マイクロビーズ濃度カウンタ装置が提供される。このマイクロ流体装置は、一定量の磁気応答性マイクロビーズを含有する液体試料を受け入れるための開口によって画成された液体試料入口を含む。液体試料入口は流れ抵抗部に連続的に流体接続し、流れ抵抗部は、分岐して校正マイクロチャネル（Ｃｏ）と少なくとも１つの検査マイクロチャネル（Ｃｍ）とを形成するマイクロチャネル分流部に連続的に流体接続している。校正マイクロチャネルと少なくとも１つの検査マイクロチャネルとは、等しい一定の圧力に保たれる。校正マイクロチャネルは目盛付きカラムに連続的に流体接続し、少なくとも１つの検査マイクロチャネルは少なくとも１つの目盛付きカラムに連続的に流体接続している。少なくとも１つの検査マイクロチャネルは磁場勾配に曝露されており、これにより、少なくとも１つの検査マイクロチャネルにおいて磁気応答性マイクロビーズのフロキュレーションが生じる。フロキュレーションにより、少なくとも１つの検査マイクロチャネルの液体試料の流速（Ｑｍ）が、校正マイクロチャネルの液体試料の流速（Ｑｏ）と比較して低下する。目盛付きカラムの各々は、その上に目盛付きスケールを有して、目盛付きカラムの各々に収集された液体試料の全容積の読取り値を提供し、ここで少なくとも１つの検査マイクロチャネル目盛付きカラムに収集された液体試料の全容積が、液体試料中における磁気応答性マイクロビーズの濃度を示す。

本発明のさらに別の実施形態では、液体試料中の分析物を検出及び計測するための使い捨て携帯形ラボ・オン・カードマイクロ流体ｐＳｃｒｅｅｎ（商標）イムノアッセイ装置が提供される。このマイクロ流体イムノアッセイ装置は、上記に記載されるマイクロ流体ｐＳｃｒｅｅｎ（商標）装置とイムノアッセイ反応チャンバとの組立体である。

詳細には、マイクロ流体ｐＳｃｒｅｅｎ（商標）イムノアッセイ装置は、液体試料を受け入れるための開口によって画成された液体試料入口を含む。液体試料入口は流れ抵抗チャネルに連続的に流体接続し、流れ抵抗チャネルは反応チャンバのアッセイ入口に連続的に流体接続している。反応チャンバは、その表面上に、分析物に特異的な複数の固定化された抗原特異的抗体（Ａｂ１）を吸着しているとともに、その上で脱水させた複数の磁気応答性マイクロビーズも有する。複数の磁気応答性マイクロビーズの各々は、分析物に特異的な抗原特異的抗体（Ａｂ２）で被覆されている。反応チャンバを通る液体試料の流れにより複数の抗体被覆磁気応答性マイクロビーズが再水和し、液体試料中に分散する。液体試料中に存在する任意の分析物が、分散した抗体被覆磁気応答性マイクロビーズ並びに反応チャンバの表面に固定化された抗原特異的抗体と結合して、Ａｂ１−分析物−Ａｂ２被覆磁気応答性マイクロビーズ複合体を形成する。任意の未結合の抗体被覆磁気応答性マイクロビーズがアッセイ出口から反応チャンバを出る。反応チャンバは、分岐して校正マイクロチャネル（Ｃｏ）と少なくとも１つの検査マイクロチャネル（Ｃｍ）とを形成するマイクロチャネル分流部に連続的に流体接続し、マイクロチャネルは等しい一定の圧力に保たれる。校正マイクロチャネルは目盛付きカラムに連続的に流体接続し、少なくとも１つの検査マイクロチャネルは少なくとも１つの目盛付きカラムに連続的に流体接続している。少なくとも１つの検査マイクロチャネルは磁場勾配に曝露されており、これにより少なくとも１つの検査マイクロチャネルにおいて磁気応答性マイクロビーズのフロキュレーションが生じる。このフロキュレーションにより、少なくとも１つの検査マイクロチャネルの液体試料の流速（Ｑｍ）が、校正マイクロチャネルの液体試料の流速（Ｑｏ）と比較して低下する。目盛付きカラムの各々は、その上に目盛付きスケールを有して、目盛付きカラムの各々に収集された全試料容積の読取り値を提供し、ここで少なくとも１つの検査マイクロチャネル目盛付きカラムに収集された全試料容積が、液体試料中における分析物の濃度を示す。

上記に記載したとおり、比Ｑｍ／Ｑｏ及び（Ｑｏ−Ｑｍ）^ｐ／（Ｑｍ）^ｑが、液体試料中の分析物濃度の代用である液体試料中の磁気応答性マイクロビーズ数の代用となる。

本装置は、限定なしに、レーザーエッチングシステムを使用してプラスチック基板上にマイクロチャネルの各々をエッチングし、次にマイクロチャネルの各々の上面を熱的接着によりプラスチックに封止すること、及びプラスチックの射出注型成形（ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ ｍｏｌｄ ｃａｓｔｉｎｇ）によることを含む方法によって作製されてもよい。好適なプラスチック基板、プラスチック封止及び射出注型成形プラスチックとしては、限定なしに、それぞれ、ポリ（エチレンテレフタレート）グリコール、ポリ（乳酸−コ−グリコール酸）及びポリ（メタクリル酸メチル）が挙げられる。

本発明の実施形態においてアッセイすることのできる液体試料としては、限定なしに、水、血漿、血清、緩衝溶液、尿、全血、血液類似物、及び固形の生物学的物質の希釈溶液又は他の生物学的流体が挙げられる。

本発明の実施形態において検出及び定量化することのできる分析物としては、限定なしに、タンパク質、タンパク質断片、抗原、抗体、抗体断片、ペプチド、ＲＮＡ、ＲＮＡ断片、ＣＤ^４＋、ＣＤ^８＋細胞に特異的な機能化された磁気マイクロビーズ、マラリア感染赤血球、癌細胞、前立腺特異抗原などの癌バイオマーカー及び他の癌バイオマーカー、ウイルス、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの細菌又は他の病原性因子が挙げられる。

本発明における磁場勾配は、少なくとも１つの検査マイクロチャネルを磁場勾配に曝露するように少なくとも１つの検査マイクロチャネルと長手方向に、且つ反対の磁極に沿って整列した２つの磁石から発生する。少なくとも１つの検査マイクロチャネルは、磁石の反対の磁極の間に形成される間隙の間に位置する。別の実施形態では、磁場勾配は、１つの磁石と少なくとも１つの検査マイクロチャネルの近傍に位置決めされた磁気応答性構造とにより発生する。

本発明において、発生する磁場は約０．０５テスラ（Ｔ）〜約０．５Ｔの範囲であってよく、且つ発生する磁場勾配は約１０Ｔ／ｍ以上であってよい。

校正マイクロチャネル目盛付きカラムに収集される全試料容積は、試料間の粘度のばらつき、血液試料中のヘマトクリット値、温度及び湿度変動並びに試料容積などのパラメータの対照として働く。

本発明の一実施形態では、マイクロ流体装置のマイクロチャネル分流部は、分岐して１つの検査マイクロチャネルと１つの校正マイクロチャネルとを形成する。

本発明の別の実施形態では、マイクロ流体装置のマイクロチャネル分流部は、分岐して３つの検査マイクロチャネルと１つの校正マイクロチャネルとを形成し、ここで３つの検査マイクロチャネルは各々が１つの目盛付きカラムに連続的に流体接続している。

本発明の別の実施形態では、マイクロ流体装置のマイクロチャネル分流部は、分岐して４つの検査マイクロチャネルと１つの校正マイクロチャネルとを形成し、ここで４つの検査マイクロチャネルは合流して１つの目盛付きカラムに連続的に流体接続している。

本発明は、以下の本発明の説明から、及びそれに添付される図及び特許請求の範囲を参照することにより、さらに完全に理解されるであろう。

以下の説明からは、添付の図面と併せて読むとき、本発明のより完全な理解を得ることができる。

図１は、本発明の実施形態に係る、流体中における磁気応答性マイクロビーズの数の決定方法の概略図であり、この方法においては校正マイクロチャネル（Ｃｏ）と検査マイクロチャネル（Ｃｍ）との流速の比が計測される。 図２は、本発明の実施形態に係る、１つの検査マイクロチャネルと１つの校正マイクロチャネルとを有するマイクロ流体ｐＳｃｒｅｅｎ（商標）磁気応答性マイクロビーズ濃度カウンタ装置の概略図である。 図３は、本発明の実施形態に係る、マイクロ流体ｐＳｃｒｅｅｎ（商標）イムノアッセイ装置のアーティスティックレンダリングである。 図４は、本発明の実施形態に係る、３つの検査マイクロチャネルと１つの校正マイクロチャネルとを有するマイクロ流体ｐＳｃｒｅｅｎ（商標）磁気応答性マイクロビーズ濃度カウンタ装置の概略図である。 図５は、本発明の実施形態に係る、４つの検査マイクロチャネルと１つの校正マイクロチャネルとを有するマイクロ流体ｐＳｃｒｅｅｎ（商標）磁気応答性マイクロビーズ濃度カウンタ装置の概略図である。 図６は、本発明の実施形態に係る、流体中の分析物濃度を決定する方法の概略図であり、この方法においては、試料分析物が、固定化された分析物特異的固定化抗体と分析物特異的被覆磁気応答性マイクロビーズとに結合し、校正マイクロチャネルＣｏにおける流速Ｑｏと、検査マイクロチャネルＣｍにおける流速Ｑｍとの比Ｑｍ／Ｑｏが計測される。 図７は、本発明の実施形態に係る、ｐＳｃｒｅｅｎ（商標）イムノアッセイ装置の概略図である。 図８は、ｐＳｃｒｅｅｎ（商標）イムノアッセイ装置の反応チャンバの３つの異なる図の概略図であり、ここでは（Ａ）が、反応チャンバの表面上にある二次抗体（Ａｂ２）被覆磁気応答性マイクロビーズ及び一次抗体（Ａｂ１）捕捉抗体を示し；（Ｂ）が、チャンバの表面上に固定化されたＡｂ１−抗原−Ａｂ２磁気応答性マイクロビーズ複合体を示し；及び（Ｃ）が、本発明の実施形態に係る、反応チャンバのアッセイ出口に到達している未結合の、すなわち遊離したＡｂ２−磁気応答性マイクロビーズを示す。 図９は、本発明の実施形態に係る、抗原を有する試料が反応チャンバを通って流れ、磁気応答性マイクロビーズを再水和させることに伴う、Ａｂ１−抗原−Ａｂ２磁気応答性マイクロビーズ複合体の形成を示す概略図である。 図１０は、本発明の実施形態に係る、ｐＳｃｒｅｅｎ（商標）イムノアッセイ装置のアーティスティックレンダリングである。 図１１は、フロキュレーション領域における磁気応答性マイクロビーズ数に対する流体流速、すなわち検査マイクロチャネル（磁場あり）と校正マイクロチャネル（磁場なし）との流速の比の低下を示すグラフである。 図１２は、本発明の実施形態に係る、検査マイクロチャネルにおける約２，０００マイクロビーズ／μｌの濃度の磁気応答性マイクロビーズの磁気的に引き起こされたフロキュレーションを示す顕微鏡写真である；挿入図は、３００秒、６００秒及び８００秒でのフロキュレーションの変化を示す。 図１３は、標準的な血球計算により試験したときの基準濃度に対する、ｐＳｃｒｅｅｎ（商標）装置を使用して得られた溶液中の磁気応答性マイクロビーズ濃度を示すグラフである。 図１４は、ｐＳｃｒｅｅｎ（商標）イムノアッセイを使用して得られた溶液中の免疫グロブリン（ＩｇＧ）濃度を示すグラフである。

本明細書で使用されるとき、用語「磁気応答性マイクロビーズ」、「磁気マイクロビーズ」及び「マイクロビーズ」は、同義的であるものと意図される。

本明細書で使用されるとき、用語「分析物」及び「抗原」は、同義的であるものと意図される。

本明細書で使用されるとき、用語「校正マイクロチャネル」及び「対照マイクロチャネル」は、同義的であるものと意図される。

本発明は、流体中における磁気応答性マイクロビーズの濃度、すなわち数を検出及び定量化するための流速に基づく方法を提供する。局在高勾配磁場に曝露されている検査マイクロチャネル（Ｃｍ）の流速（Ｑｍ）と、局在高勾配磁場に曝露されていない校正又は対照マイクロチャネル（Ｃｏ）の摂動を受けない流速（Ｑｏ）との比Ｑｍ／Ｑｏは、検査マイクロチャネルを通って流れるマイクロビーズの数の単調関数である。すなわち：
Ｑｍ（Ｎ_ｍ）／Ｑｃ＝ ｆ（Ｎ_ｍ） 式（１）

式中、Ｎｍは、局在高磁場領域へと流体によって運ばれる磁気応答性マイクロビーズの総数である。双方のマイクロチャネルとも、等しい一定の圧力に保持される。図１に示されるとおり、磁気応答性マイクロビーズ１５が播かれた流体１２は、２つのマイクロチャネル入口１４、１４’に流れ込み、２つのマイクロチャネル出口１６、１６’から出る。右側の検査マイクロチャネル２２は、２つの磁石２４、２４’によって発生する高勾配磁場に曝露されている。磁石は図１及び挿入図に示されるとおり位置決めされる。ある実施形態では、磁場勾配は、１つの磁石と、検査マイクロチャネル２２の近傍に位置決めされた磁気応答性構造（図示せず）とにより発生する。磁気応答性構造は、強磁性、超常磁性又は常磁性特性を備える金属材料で作製されてもよく、従って外部磁場を印加すると、磁気応答性構造が誘起磁場を発生する。この構造は幾何学的形状、例えば円筒形状とされ、それにより検査マイクロチャネルが占有する領域に磁場勾配を発生させる。式１は、約５０マイクロビーズ／μｌ〜約２×１０^６マイクロビーズ／μｌの範囲の、広範囲にわたる磁気応答性マイクロビーズ濃度に適用される。しかしながら、上限及び下限はマイクロチャネルのサイズ及び磁場トポロジーの関数である。従って、上限及び下限のいずれも、これらのパラメータに基づき変わり得る。

ｆ（Ｎｍ）はＮｍの単調関数であるため、以下もまた成り立つ：
Ｎ_ｍ＝ ｆ^−１（Ｑ_ｍ（Ｎ_ｍ）／Ｑｃ） 式（２）。

故に、式２に従うと、所与の流体中における磁気応答性マイクロビーズ数は、比Ｑｍ／Ｑｏの単調関数である。従って、図１に示されるとおり構成された２つのマイクロチャネルにおける比Ｑｍ／Ｑｏを計測することにより、磁気応答性マイクロビーズ数を決定することができる。換言すれば、比Ｑｍ／Ｑｏが、所与の流体中における磁気応答性マイクロビーズ数の特定の代用となる。

関数の解析形式は、幾何学、すなわち２つのマイクロチャネルの長さ及び内径、磁場トポロジー、及び磁気応答性マイクロビーズのサイズに依存する。加えて、差Ｑ_ｏ−Ｑ_ｍ、及び比（Ｑ_ｏ−Ｑ_ｍ）^ｐ／（Ｑ_ｍ）^ｑ（式中、ｐ及びｑは校正プロセスから求められる）が、流体中における磁気応答性マイクロビーズ数の代用となる。パラメータｐ及びｑは、以下のとおり得られる。既知の濃度のマイクロビーズを含有する既知の容積の溶液をマイクロチャネルに通過させ、流速Ｑｍ及びＱｏを計測する。次に、同じ濃度の磁気応答性マイクロビーズを含有する、但し容積がより大きい溶液を、同様にマイクロチャネルに通過させる。このプロセスを数回繰り返す。次に、比（Ｑｏ−Ｑｍ）^ｐ／（Ｑｍ）^ｑを、ｐ及びｑを１として、各試料の容積に対してプロットする。数理最適化法を用いて、試料容積に対する比（Ｑｏ−Ｑｍ）^ｐ／（Ｑｍ）^ｑが水平な直線を形成し、傾きがゼロであるという条件を課すことにより、ｐ及びｑを決定する。

本発明はさらに、液体試料中における磁気応答性マイクロビーズ濃度を検出及び定量化するためのマイクロ流体ｐＳｃｒｅｅｎ（商標）磁気応答性マイクロビーズ濃度カウンタ装置を提供する。この装置は、先述の流速に基づく検出及び定量化方法を利用する。

図２及び図３は、本発明の液体試料中における磁気応答性磁気ビーズを検出及び定量化するためのｐＳｃｒｅｅｎ（商標）マイクロ流体装置５を示す。マイクロ流体装置５は液体試料入口８を含み、ここに未知量の磁気応答性マイクロビーズを含有する液体試料、又は検体が加えられる。毛管作用により自力で進む液体試料は、液体試料入口８から流れ抵抗部３２（図３に図示される）を通り、マイクロチャネル分流部１８に流れ込む。マイクロチャネル分流部１８は２つのより細いマイクロチャネル、すなわち校正マイクロチャネル２０と検査マイクロチャネル２２とに分岐する。２つのマイクロチャネル２０、２２は長さ及び内径が同じである（図２において最も分かり易く図示される）。

本発明の方法及び装置を用いて検出及び定量化することのできる磁気応答性マイクロビーズ濃度は、約５０マイクロビーズ／μｌ〜約２×１０^６マイクロビーズ／μｌであり；且つ磁気応答性マイクロビーズの直径は、約０．２μｍ〜約２０μｍである。ある実施形態では、磁気マイクロビーズの直径は約４．０μｍである。

本発明において、検査マイクロチャネル及び校正マイクロチャネルは毛細管で作製され、ここで毛細管の長さは約０．２ｃｍ〜約２０ｃｍである。ある実施形態では、毛細管の長さは約３．０ｃｍ〜約７．５ｃｍである。別の実施形態では、毛細管の長さは約１．５ｃｍである。

ある実施形態では、校正マイクロチャネル２０及び検査マイクロチャネル２２の長さは、約０．２ｃｍ〜約２０ｃｍである。別の実施形態では、２つのマイクロチャネル２０、２２の長さは約３．０ｃｍ〜約７．５ｃｍである。なお別の実施形態では、２つのマイクロチャネル２０、２２の長さは約１．５ｃｍである。

ある実施形態では、校正マイクロチャネル２０及び検査マイクロチャネル２２の内径は、約５０μｍ〜約５００μｍである。別の実施形態では、２つのマイクロチャネル２０、２２の内径は約５０μｍである。

磁場勾配は検査マイクロチャネル２２のみに印加される。磁場勾配は小型の希土類（例えば、ネオジム）の永久磁石と強磁性（例えば、ニッケル、鉄）の磁極構造（図示せず）とによって発生し、これは磁場を集中させ、ひいては（約１００Ｔ／ｍの）高磁場勾配を作り出すように特別に設計された集磁部５４（図３に図示）として働く。校正チャネル２０では、液体試料は極めて低い速度（レイノルズ数約１）及びずり速度範囲（１〜４００ｓ^−１）で自由に流れる。検査マイクロチャネル２２では、試料中に磁気応答性マイクロビーズが存在する場合、磁場勾配によりマイクロビーズのフロキュレーションが引き起こされる。５０マイクロビーズ／μｌ未満もの低さのごく低い濃度であっても、検査マイクロチャネル２２を通る流速は、磁気的に引き起こされたマイクロビーズフロキュレーションの形成に起因して低下し得る。校正マイクロチャネル２０及び検査マイクロチャネル２２を通って流れた後、一定量の液体試料が、両方ともに等しいサイズ及び容積の２つの目盛付きカラム２６、２６’に収集される。

各目盛付きカラム２６、２６’は、それらの上に目盛付きスケール３０を有し、この目盛付きスケール３０が、各目盛付きカラム２６、２６’に収集された全試料容積の容易に解釈できる読取りシステムを提供する。目盛付きカラム２６、２６’の長さ及び断面、並びにそれらの上のそれぞれのスケール３０は、肉眼で見えるように設計される。現行のＰＯＣ読取り装置と異なり、本発明のマイクロ流体装置の読取りシステムは、電気的なトランスデューサ及び／又はセンサが不要である。図２及び図３に示されるとおり、目盛付きカラム２６、２６’はいずれも明確に見える。図３に示されるとおり、マイクロ流体装置５は、ホルダ５６に嵌装されるカートリッジ５８として構成されてもよい。マイクロ流体装置５によって得られる読取り値は、どの時点であっても、２つの目盛付きカラム２６、２６’の流体を直接比較して決定することができる。

ここで図２を参照すると、このマイクロチャネル構成は、マイクロビーズの濃度が容積Ｖｏ及びＶｍのみの単調関数となることを提供する（Ｖｏ及びＶｍは、それぞれ校正マイクロチャネル２０（Ｃｏ）及び検査マイクロチャネル２２（Ｃｍ）のマイクロチャネル出口１６、１６’で収集された容積である；図１に図示される）。この手法により、使用者は本発明のｐＳｃｒｅｅｎ（商標）マイクロ流体装置により提供される結果を、アッセイの実行中どの時点でも、又はアッセイが完了した後どの時点でも、読み取ることが可能となる。

式（１）の関係を所与とすると、校正マイクロチャネル２０の流速は一定であり、且つ磁気応答性マイクロビーズは試料流体中に一様に分布するため、以下の恒等式がどの時点の場合であっても満たされる：

式中、ρは、試料検体１２中の磁気応答性マイクロビーズ濃度であり、Ｑｏ及びＱｍは、それぞれ校正マイクロチャネル２０及び検査マイクロチャネル２２における流速であり、且つＮｏ及びＮｍは、それぞれ校正マイクロチャネル２０及び検査マイクロチャネル２２を通過する磁気応答性マイクロビーズ数である。

よって以下となる：

従って、本発明のｐＳｃｒｅｅｎ（商標）マイクロ流体装置は、比較による読取りシステムを提供し、ここでは磁気応答性マイクロビーズ濃度ρが、検査マイクロチャネル２２（ここでは磁気的に引き起こされたフロキュレーションが形成される）を通って流れる容積Ｖｍと、磁気的に引き起こされるフロキュレーションのない校正マイクロチャネル２０を通って流れる容積Ｖｏとのみの単調関数である。

本発明のｐＳｃｒｅｅｎ（商標）マイクロ流体装置の比較による読取りシステムは、液体試料中における磁気応答性マイクロビーズ濃度の検出及び定量化を大幅に単純化する。加えて、この比較による読取りシステムは、試料間の粘度のばらつき、血液試料中のヘマトクリット値、検査環境の温度及び湿度変動、並びに試料容積などの、共通モード誤差を（対照として機能する校正目盛付きカラム２６により）事実上除去するという重要な利点を有する。従って本発明のｐＳｃｒｅｅｎ（商標）マイクロ流体装置は、広範囲の濃度及びマイクロビーズサイズにわたり液体試料中の磁気応答性マイクロビーズ濃度を検出及び定量化するためのスタンドアロン装置を提供する。

図４は、本発明のマイクロ流体装置５の代替的実施形態を示す。この実施形態では、検査マイクロチャネル（Ｃｍ）が、互いに平行に延在する３つの検査マイクロチャネル２２、２２’、２２’’に分かれる。３つの検査マイクロチャネル２２、２２’及び２２’’は同じ長さであるが、互いに異なる内径を有する。各検査マイクロチャネル２２、２２’、２２’’は、別個の目盛付きカラム２６に接続している。ある実施形態では、第１の検査マイクロチャネル２２が約５０μｍ〜約５００μｍの内径を有し、第２の検査マイクロチャネル２２’が約１００μｍ〜約２５０μｍの内径を有し、及び第３の検査マイクロチャネル２２’’が約２５０μｍ〜約５ｍｍの内径を有する。別の実施形態では、第１の検査マイクロチャネル２２が約５０μｍの内径を有し、第２の検査マイクロチャネル２２’が約１００μｍの内径を有し、及び第３の検査マイクロチャネル２２’’が約２５０μｍの内径を有する。校正マイクロチャネル２０の内径は、校正マイクロチャネル２０の断面の面積が３つの検査マイクロチャネル２２、２２’、２２’’の断面の面積の合計と同じになるような内径である。

所定量の磁気応答性マイクロビーズが３つの検査マイクロチャネル２２、２２’２２’’の各々に入るとして、第３の最も太い検査マイクロチャネル２２’’が受ける流速の低下が最も小さく、第２の中間サイズの検査マイクロチャネル２２’は第３の最も太い検査マイクロチャネル２２’’が受けるより大きい流速の低下を受け、及び第１の最も細い検査マイクロチャネル２２が受ける流速の低下が最も大きい。加えて、第１の最も細い検査マイクロチャネル２２は、第２の中間サイズの検査マイクロチャネル２２’及び第３の最も太い検査マイクロチャネル２２’’より先に詰まり易く、中間サイズの検査マイクロチャネル２２’は最も太い検査マイクロチャネル２２’’より先に詰まり易い。従って、この実施形態における装置は広範囲にわたる磁気応答性マイクロビーズ濃度の計測が可能であり、ここでは第１の最も細い検査マイクロチャネル２２が低濃度の磁気応答性マイクロビーズの微調整された計測を可能にし、及び第３の最も太い検査マイクロチャネル２２’’が高濃度の磁気応答性マイクロビーズの概略的な計測を可能にする。

図５は、本発明のさらなる代替的実施形態を示す。この実施形態において、検査マイクロチャネル２２（Ｃｍ）は、互いに平行に延在する４つのマイクロチャネルに分かれる。４つの検査マイクロチャネル２２は同じ長さ及び内径を有する。ある実施形態では、４つの検査マイクロチャネルの各々が約１２．５μｍ〜約１２５μｍの内径を有する。別の実施形態では、４つの検査マイクロチャネルの各々が約１２．５μｍの内径を有する。校正マイクロチャネル２０の内径は、校正マイクロチャネル２０の断面の面積が４つの検査マイクロチャネル２２、２２’、２２’’の断面の面積の合計と同じになるような内径である。

４つの検査マイクロチャネル２２は再び合流して１つの目盛付きカラム２６に接続する。４つの検査マイクロチャネル２２及び１つの校正マイクロチャネル２０に流れ込む磁気応答性マイクロビーズがなければ、校正マイクロチャネル２０を通る流体の流速は、検査マイクロチャネルの各々における流速の合計である。式（１）〜（８）はこの実施形態においても適用されるが、しかしながら、１つの検査マイクロチャネルと比べて４つの平行な検査マイクロチャネルがあるため、装置を通ってより短い時間でより大きい流体容積が流れることができ、従って使用者はより短時間でｐＳｃｒｅｅｎ（商標）マイクロ流体装置の結果の読取り値を得ることが可能になる。

本発明はまた、液体試料中における分析物の濃度を検出及び定量化するための流速に基づく方法も提供する。分析物としては、限定なしに、タンパク質、タンパク質断片、抗原、抗体、抗体断片、ペプチド、ＲＮＡ、ＲＮＡ断片、細胞、癌細胞、ウイルス、及び他の病原性因子を挙げることができる。

この実施形態に係る方法は、反応チャンバの液体試料入口に液体試料を加えるステップを含む。反応チャンバは、その表面上に、分析物に特異的な複数の固定化された抗原特異的抗体（Ａｂ１）を吸着している。反応チャンバの表面はまた、その上で脱水させた複数の磁気応答性マイクロビーズも有し、ここで複数の磁気応答性マイクロビーズの各々は、分析物に特異的な抗原特異的抗体（Ａｂ２）で被覆されている。この方法は、液体試料を反応チャンバ内部でインキュベートさせることで、反応チャンバに液体試料が加わり撹拌されるに従い複数の抗体被覆磁気応答性マイクロビーズの再水和が起こり、この再水和により、抗体被覆磁気応答性マイクロビーズが液体試料中に分散するステップ、再水和した抗体被覆磁気応答性マイクロビーズ並びに反応チャンバの表面に固定化された抗原特異的抗体が液体試料中に存在する任意の分析物と結合して、反応チャンバの表面上にＡｂ１−分析物−Ａｂ２被覆磁気マイクロビーズ複合体を形成するステップ、任意の未結合の抗体被覆磁気応答性マイクロビーズを含有する液体試料を、チャンバ出口を通じて反応チャンバから出し、連続的な流体接続を通じ、分岐して校正マイクロチャネル（Ｃｏ）と少なくとも１つの検査マイクロチャネル（Ｃｍ）とを形成するマイクロチャネル分流部に移動させるステップを含む。少なくとも１つの検査マイクロチャネルと校正マイクロチャネルとは、等しい一定の圧力に保たれる。校正マイクロチャネルは目盛付きカラムに連続的に流体接続し、少なくとも１つの検査マイクロチャネルは少なくとも１つの目盛付きカラムに連続的に流体接続している。目盛付きカラムの各々は、その上に目盛付きスケールを有する。この方法は、磁場勾配に曝露されている少なくとも１つの検査マイクロチャネルにおける液体試料の流速（Ｑｍ）を、磁場勾配に曝露されていない校正マイクロチャネルにおける流体の流速（Ｑｏ）と共に計測するステップ（ここでは磁場勾配に曝露されている少なくとも１つの検査マイクロチャネルにおける任意の未結合の抗体被覆磁気応答性マイクロビーズの存在によって液体試料中で抗体被覆磁気応答性マイクロビーズのフロキュレーションが生じ、それにより少なくとも１つの検査マイクロチャネルを通る液体試料の流速が低下する）と、比Ｑｍ／Ｑｏ、差Ｑｏ−Ｑｍ、及び比（Ｑｏ−Ｑｍ）^ｐ／（Ｑｍ）^ｑを計算するステップ（式中、ｐ及びｑは校正プロセスから求められ、ここでは比Ｑｍ／Ｑｏ及び（Ｑｏ−Ｑｍ）^ｐ／（Ｑｍ）^ｑが、液体試料中の分析物濃度の代用である液体試料中の磁気応答性マイクロビーズ数の代用となる）とを含む。

図６に示されるとおり、反応チャンバ３４に液体試料１２が加えられ（ステップ１）、反応チャンバ３４には、その表面上に、複数の固定化された抗原特異的抗体（Ａｂ１）（図示せず）が吸着しており、且つ反応チャンバ３４の表面上で脱水させた抗原特異的抗体（Ａｂ２）で被覆された複数の磁気応答性マイクロビーズ１５が入っている。ステップ１において、液体試料を反応チャンバ３４に加えることにより、抗体被覆磁気応答性マイクロビーズ１５が再水和し、磁気応答性マイクロビーズ１５並びに反応チャンバ３４の表面に固定化された抗原特異的抗体が、液体試料１２中に存在する任意の分析物と結合して、反応チャンバ３４の表面上にＡｂ１−分析物−Ａｂ２被覆磁気応答性マイクロビーズ複合体を形成し、ここではいずれの未結合の磁気応答性マイクロビーズ１５も自由に２つのマイクロチャネル入口１４、１４’へと流れ込み、２つのマイクロチャネル出口１６、１６’から出ることができる（ステップ２）。右側の検査マイクロチャネル２２は、２つの磁石２４によって発生する高勾配磁場に曝露されている。前段に記載されるとおり、２つのマイクロチャネル、すなわち検査マイクロチャネル（Ｃｏ）及び校正又は対照マイクロチャネル（Ｃｍ）を通過する液体試料中の磁気応答性マイクロビーズの数は、局在高勾配磁場に曝露されているマイクロチャネル（Ｃｍ）の流速（Ｑｍ）と、局在高勾配磁場に曝露されていないマイクロチャネル（Ｃｏ）の摂動を受けない流速（Ｑｏ）との比Ｑｍ／Ｑｏに比例する。従って、流速Ｑｍ及びＱｏを計測することにより、液体試料中の分析物濃度を決定することができる。この方法は、約０．０１ｎｇ／ｍｌ〜約１μｇ／ｍｌの広範囲にわたる抗原濃度に適用される。

本発明はさらに、タンパク質、タンパク質断片、抗原、抗体、抗体断片、ＲＮＡ、ＲＮＡ断片、細胞、癌細胞、ウイルス、及び他の病原性因子を検出及び定量化するためのｐＳｃｒｅｅｎ（商標）マイクロ流体イムノアッセイ装置を提供する。この装置は、先述の液体試料中における分析物濃度の検出及び定量化方法を利用する。

動作原理
本発明の一実施形態において、図７に示されるとおり、ｐＳｃｒｅｅｎ（商標）マイクロ流体イムノアッセイ装置１０は、液体試料入口８と、流れ抵抗チャネル３２と、反応チャンバ３４と、マイクロチャネル分流部１８と、検査マイクロチャネル２２と、校正マイクロチャネル２０と、目盛付き読取りカラム２６、２６’とを有する。使用時、未知量の標的分析物を含有し得る液体試料、又は検体が、液体試料入口８に加えられる。試料は毛管作用により自力で進み、液体試料入口８から流れ抵抗チャネル３２を経て反応チャンバ３４へと移動する。液体試料の流速は、流れ抵抗チャネル３２の断面及び長さ並びに装置材料及び試料液体の表面張力により決定されるとともに、反応チャンバ３４内での分析物、すなわち抗原と抗体との間の結合速度論的反応によっても決定される。

図８Ａに示されるとおり、反応チャンバ３４は、反応チャンバ３４の表面上に固定化された抗原特異的抗体（Ａｂ１）４６で被覆される。捕捉抗体と称される抗原特異的抗体（Ａｂ１）４６は、一次抗体であっても、又は二次抗体であってもよい。抗原特異的抗体（Ａｂ１）４６は吸着によって反応チャンバ３４の表面に結合する。反応チャンバ３４の表面はまた、脱水により、磁気応答性マイクロビーズ５０によっても被覆される。磁気応答性マイクロビーズは、装置のなかでＡｂ１抗体４６が結合しているところと同じ領域で脱水させてもよく、又はＡｂ１抗体４６が結合しているところより前にある領域で脱水させてもよい。磁気応答性マイクロビーズは抗原特異的抗体（Ａｂ２）で被覆され、抗原特異的抗体被覆磁気応答性マイクロビーズ５０を形成する。これらの抗原特異的抗体（Ａｂ２）は、一次抗体であっても、又は二次抗体であってもよい。液体試料がアッセイ入口３６から反応チャンバ３４に流れ込むに従い、抗原特異的抗体被覆磁気応答性マイクロビーズ５０が再水和して液体中に分散し、試料中に含まれる任意の抗原分子４８が、反応チャンバの表面に固定化された抗原特異的抗体（Ａｂ１）４６、及び磁気ビーズを被覆している抗原特異的抗体（Ａｂ２）と結合し、Ａｂ１−抗原−Ａｂ２被覆磁気応答性マイクロビーズ複合体５２を形成する（図８Ｂ）。Ａｂ１−抗原−Ａｂ２被覆磁気応答性マイクロビーズ複合体５２の形成により、結合した抗体被覆磁気応答性マイクロビーズ５０が反応チャンバ３４の表面上に定着する。全ての抗原分子４８が反応してＡｂ１−抗原−Ａｂ２被覆磁気応答性マイクロビーズ複合体５２を形成した後、あらゆる未結合の、すなわち遊離している抗体被覆磁気応答性マイクロビーズ５０がアッセイ出口３８から反応チャンバを出て（図８Ｃ）、反応チャンバ３４には、結合した抗体被覆磁気応答性マイクロビーズ５０が残る。図９は、抗原４８を含有する液体試料が反応チャンバ３４を通って流れ、抗体被覆磁気応答性マイクロビーズ５０を再水和することに伴う、Ａｂ１−抗原−Ａｂ２被覆磁気応答性マイクロビーズ複合体５２の形成を示す。

陰性の液体試料、すなわち検出可能な痕跡量の標的分析物を含有しない試料では、Ａｂ１−抗原−Ａｂ２被覆磁気応答性マイクロビーズ複合体を形成することができないため、反応チャンバの表面に定着する抗体被覆磁気応答性マイクロビーズはゼロとなる。他方で、分析物（すなわち抗原）陽性試料では、抗体被覆磁気応答性マイクロビーズがＡｂ１−抗原−Ａｂ２被覆磁気マイクロビーズ複合体を介して反応チャンバの表面に定着する。従って、液体試料中の分析物の濃度が高いほど、反応チャンバの表面に定着する磁気応答性マイクロビーズ数が多くなり、従って反応チャンバアッセイ出口に到達する遊離磁気応答性マイクロビーズ数が少なくなる。分析物濃度が極めて高い極端な例では、反応チャンバの表面に全ての抗体被覆磁気応答性マイクロビーズが定着し、反応チャンバのアッセイ出口から出るものは一つもない。

反応チャンバを通って流れた後、毛管作用により自力で進む液体試料は、装置のｐＳｃｒｅｅｎ（商標）磁気ビーズ濃度カウンタ部分に到達する（この動作原理については既に記載した）。検査マイクロチャネル及び校正マイクロチャネルに流れ込む液体試料が磁気応答性マイクロビーズを含まない場合、検査及び校正マイクロチャネルの双方とも流速は同じであり、従って目盛付きカラムの各々に収集される試料容積は同じになる。使用者は、目盛付きカラムの各々における試料の容積が等しい長さであることを容易に観察できる。他方で、マイクロチャネル分流部から流れてくる試料がゼロでない任意の濃度で磁気応答性マイクロビーズを含有する場合、検査マイクロチャネル中の液体の流れが（磁気的に引き起こされる磁気マイクロビーズのフロキュレーションに起因して）遅れる。従って、検査目盛付きカラムにおける液体容積の長さが、校正目盛付きカラムにおける液体容積の長さと比べて、それらの目盛付きカラムに流れ込む液体容積中における磁気応答性マイクロビーズ濃度に比例した量だけ短くなる。換言すれば、検査及び校正マイクロチャネルに到達する液体中の磁気応答性マイクロビーズ濃度が高いほど、２つの目盛付きカラムで観察される液体容積の長さの差が大きくなる。２つの目盛付きカラムに収集された液体容積間に生じた差は、肉眼で容易に見ることができる。

上記に詳細に記載され、且つ図４に示されるｐＳｃｒｅｅｎ（商標）マイクロ流体イムノアッセイ装置のある実施形態では、検査マイクロチャネル（Ｃｍ）は、互いに平行に延在する３つの検査マイクロチャネル２２、２２’及び２２’’に分かれる。上記に詳細に記載され、且つ図５に示されるｐＳｃｒｅｅｎ（商標）マイクロ流体イムノアッセイ装置の別の実施形態では、検査マイクロチャネル（Ｃｍ）は、互いに平行に延在する４つのマイクロチャネル２２に分かれる。

図１０は、本発明の実施形態に係るｐＳｃｒｅｅｎ（商標）マイクロ流体イムノアッセイ装置１０を示し、ここでは校正カラムが部分的にのみ見える。この実施形態では、校正カラムの見えている部分の色が変わったとき、すなわち液体が充満したときに、読取り値が取られる。

本発明が以下の非限定的な例においてさらに詳細に記載され、これらの例は、数多くの改良例及び変形例が当業者には明らかなとおり、あくまでも例示を目的としている。

実施例１−本発明の科学的根拠及び技術的実現可能性
（Ａ）序論
本明細書に提示するデータは、マイクロチャネルにおける磁気応答性マイクロビーズのフロキュレーションがマイクロチャネル内の液体の流れ抵抗に及ぼす効果を説明する。磁場勾配に曝露されているマイクロチャネル内にある磁気応答性マイクロビーズが播かれた液体は、局在的なマイクロビーズフロキュレーションを生じる。この局在的なマイクロビーズフロキュレーションがマイクロチャネルの断面の局在的な減少をもたらし、ひいてはフロキュレーション領域にわたる流れ抵抗の局在的な増加をもたらす。次には抵抗の増加により、マイクロチャネルの減少した断面を通る流れの維持にエネルギーが失われるため、フロキュレーション領域にわたる圧力降下が増す。マイクロビーズフロキュレーションの形成に関与する外力がマイクロビーズ及びその凝集体に対する流れずり応力より強い場合、マイクロビーズがさらに流れ込んで加わるに従い、マイクロビーズのフロキュレーションは規模が増す。一定の圧力で駆動される流れの場合（本発明に関連する）、圧力降下が増すと、マイクロチャネル流速が低下する。本試験はこの現象を調査及び分析したもので、結果を以下に報告する。これらの実験結果は、ｐＳｃｒｅｅｎ（商標）技術及び本発明が開発された科学的根拠を提供する。

（Ｂ）実験方法
マイクロチャネルにおける流速に対する磁気マイクロビーズフロキュレーションの効果に関する実験データを提示する。図１は、２つのマイクロチャネルから構成される定圧流システムの説明図である。検査マイクロチャネル２２（Ｃｍ）を高磁場勾配に曝露した一方、校正マイクロチャネル２０（Ｃｏ）を対照として供した。マイクロチャネル入口１４、１４’とマイクロチャネル出口１６、１６’との間の流れを駆動する圧力差は、２つのマイクロチャネル２０、２２の間で等しかった。既知の濃度の磁気応答性マイクロビーズが播かれた液体試料１２を両方のマイクロチャネル２０、２２に加え、両マイクロチャネル２０、２２における流速を経時的に記録した。２つの磁石２４、２４’によって発生する局在高勾配磁場を用いてマイクロビーズのフロキュレーションを生じさせた。

実験は、５０μｍ及び１００μｍの内径を有するガラス毛細管で作製したマイクロチャネルを使用して行った。毛細管の長さは３．０ｃｍ〜７．５ｃｍの間で様々であった。磁場は、２つのネオジム−鉄−ホウ素（ＮｄＦｅＢ）永久磁石２４、２４’（２５ｍｍ×６ｍｍ×１．５ｍｍ；最大表面磁場：０．３Ｔ）によって発生させた。磁石２４、２４’は、長手方向に反対の磁極に沿って並べた。磁場に曝露されている検査マイクロチャネル２２毛細管は、ＮｄＦｅＢ磁石２４、２４’の反対の磁極の間に形成された間隙の間に置いた。

両方のマイクロチャネル毛細管２０、２２とも、毛細管の端部が約０．５ｃｍ見える状態で、ガラス製バキュテナー管（図示せず）のゴム栓部分に部分的に挿入した。毛細管入口及び出口をそれぞれ、３６０μｍの内径を有するポリスチレン管材（図示せず）（これは２つのマイクロチャネル毛細管２０、２２の３６０μｍ外径に密嵌する）に挿入した。管材の一方の端部は、磁気マイクロビーズを含む液体試料溶液１２が入ったリザーバに直接通じ、管材の他方の端部はバキュテナー管に通じて、このバキュテナー管が、マイクロチャネル出口１６、１６’を出た流体を収集した。試料リザーバ１２は大気に開放しており、従って大気圧であった。バキュテナー管を密閉し、一定の真空下に置いた。試料リザーバ１２とバキュテナー管との間の圧力差により、リザーバからバキュテナー管への液体試料の流れが引き起こされた。圧力差は毛細管１ｃｍあたり０．６ｍｍＨｇに維持し、異なる長さの毛細管間で等しい流速を提供した。実験は２つの毛細管を使用してタンデムで実行した：１つは校正用、すなわち対照のマイクロチャネル２０；及び１つは磁場勾配に曝露されている検査マイクロチャネル２２であった。両方のマイクロチャネル毛細管２０、２２とも同じ圧力差に保ち、且つ同じ試料リザーバ１２から流体を引き込んだ。校正マイクロチャネル毛細管２０では、試料は自由に流れた。検査マイクロチャネル毛細管２２では、印加磁場勾配によりマイクロビーズフロキュレーションが引き起こされた。校正マイクロチャネル２０及び検査マイクロチャネル２２は同時に実行し、大気圧のばらつき、温度変動による粘度の変化、及びマイクロビーズ濃度のばらつきなどの共通誤差を除去した。懸濁媒体は３５％（重量）グリセロール及び６５％水として、血液と同様の粘度を実現した（約３．６ｃＰ）。懸濁媒体には緑色蛍光色素を添加し、２つのマイクロチャネル毛細管２０、２２を出る溶液の視感度を高めた。また、媒体には、直径が４．７μｍ又は８．３μｍの、滑らかなカルボキシル磁気マイクロビーズ（Ｓｐｈｅｒｏｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．）も添加した。試験は１００マイクロビーズ／μｌ〜５０×１０^３マイクロビーズ／μｌのマイクロビーズ濃度で行った。試料容積は５０μｌ〜２００μｌであり、初期流速は０．０１μｌ／秒であった。試料流体はマイクロチャネル毛細管２０、２２を出ると、小液滴を形成した後、バキュテナーに落ちた。流速の測定値は、液滴容積を液滴間の時間間隔で除すことにより計算した。液滴が落ちる速度はＤＶＤビデオカメラで記録した。ビデオ分析後、時間に対する流速を得た。バキュテナーなしにさらなる実験を行った。マイクロチャネル出口１６、１６’を、目盛付き定規の近傍に置いた長いポリスチレン管材（図示せず）に接続した。管材内側の流体メニスカスの前進を時間の関数として記録することにより、流速を計測した。磁場勾配に曝露されていないガラス製校正マイクロチャネル毛細管２０における流速値を、円管内のニュートン流体の完全発達層流に対する理論的なハーゲン−ポアズイユ流れＱ＝π Ｒ４ ΔＰ（式中、Ｒは管の半径であり、ΔＰは圧力８μＬ差であり、μは流体粘度であり、及びＬは管の長さである）と比較した。図２に示されるとおりの、上述のとおりレーザーエッチングによってポリ（乳酸−コ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）及びポリエチレンテレフタレートに作製されたマイクロチャネル構成を使用して、さらなる実験を行った。

（Ｃ）巨視的実験結果及びデータ分析
図１１は、フロキュレーション領域にある磁気応答性マイクロビーズ数に対する正規化した流速、すなわち検査マイクロチャネル毛細管（磁場勾配に曝露されている）と校正マイクロチャネル毛細管（磁場勾配に曝露されていない）との流速の比を示す。磁気応答性マイクロビーズ数は、流速に試料中の磁気応答性マイクロビーズ濃度を掛けた積により与えられる。データは、正規化した流速がフロキュレーション領域における磁気応答性マイクロビーズの（３桁を超える）数の単調関数であることを示す。フロキュレーションにより生じる圧力降下に起因して流速が低下する大きさは、毛細管全体の長さ及びフロキュレーション域のサイズに依存する。従って、マイクロチャネルに沿った磁場長さとマイクロチャネルの全長との種々のアスペクト比もまた調べた。図１３は、磁場（集中部）の長さとマイクロチャネルの全長とのアスペクト比が異なる３つのデータ曲線を示す［比は、０．１７（三角形）〜０．２４（菱形）〜０．４（正方形）の範囲である］。本研究者らの知る限りでは、マイクロチャネルにおける流体流速に対する磁気応答性マイクロビーズフロキュレーションの効果の直接的な測定値を提供するのは、これらのデータが初めてである。

（Ｄ）データ分析
これらの実験データは、広範囲にわたり、正規化流速Ｑｍ／Ｑｏが毛細管に流入する磁気応答性マイクロビーズ数の単調関数であることを実証している。ここに提示されるのは、本研究者らがこれらの結果を裏付けるために導いたポアズイユの式に基づく現象論的モデルである。このモデルは、流速をフロキュレーションの形成に起因するマイクロチャネル断面の減少と関係付ける。このモデルから、流速と磁気応答性マイクロビーズ数との間に以下の関係が予測される：

式中、

は正規化した流速であり、Ｎはフロキュレーション中のマイクロビーズ数であり、αは毛細管半径であり、Ｒ_ｅｆｆはマイクロビーズフロキュレーションで塞がれていない毛細管のルーメン長さであり、Ｌは毛細管長さであり、及びｒはマイクロビーズの半径である。このモデルは、高い精度（実線、図１１）で、磁場領域長さに対する毛細管長さの変化に伴う曲線のシフトを予測する。本発明の装置の仕様設計では、このモデルにより分析上の指針を得た。

（Ｅ）微視的実験結果
磁気的に引き起こされたフロキュレーションの機構を観察するため、倒立顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ、ＩＸ７０、倍率２０ｘ）を使用して微視的研究を実施した。この現象を、５０μｍ又は１００μｍの直径を有する毛細管において、４μｍ又は８μｍの直径を有するＲＢＣサイズの磁気応答性マイクロビーズが播かれた溶液を使用して視覚化した。図１２は、２，０００マイクロビーズ／μｌ類似物溶液中に形成されたフロキュレーションの例を示す。フロキュレーションは、初めは磁石の前縁（最大磁場勾配に対応する）に形成された。フロキュレーションのサイズは磁場領域の長さ全体にわたり大きくなった。フロキュレーションのサイズが磁場領域の長さに及ぶと、フロキュレーションは流動床として振る舞った。磁気応答性マイクロビーズの下流が放出される一方で、磁気応答性マイクロビーズが入ってくる上流がフロキュレーションに加わった。

実施例２−ｐＳｃｒｅｅｎ（商標）プロトタイプの作製及び試験
（Ａ）作製
２組のｐＳｃｒｅｅｎ（商標）プロトタイプを作製した：（１）様々な試料の同時試験用に複数のマイクロチャネルを備えるベンチトッププロトタイプ；及び（２）使い捨て携帯形ラボ・オン・カード装置。ｐＳｃｒｅｅｎ（商標）ベンチトッププロトタイプについては、前項に記載した。ｐＳｃｒｅｅｎ（商標）ラボ・オン・カードプロトタイプは、標準的なマイクロフルイディクス作製技術を用いて実現した。端的にいえば、レーザーエッチングシステムを用いてポリ（エチレンテレフタレート）グリコール（Ｐｅｔｇ）基板上にマイクロチャネルをエッチングした。次に、ホットプレスを用いた熱的接着により、嵌め合いのポリ（乳酸−コ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）上蓋を使用してチャネルを密閉した。検査チャネルの下に２つの小型磁石をＮ−Ｓ構成で置くことにより磁場勾配を得た。ｐＳｃｒｅｅｎ（商標）ラボ・オン・カードプロトタイプはまた、射出注型成形（ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ ｃａｓｔ ｍｏｌｄｉｎｇ）を用いて作製し、ここではプロトタイプをポリ（メタクリル酸メチル）（ＰＭＭＡ）に作製した。

（Ｂ）磁気マイクロビーズ濃度の検出及び定量化用マイクロ流体装置の実験データ
種々の濃度の界面活性剤を含む様々な流体、例えば限定なしに、血液、血液類似物、又はＰＢＳ緩衝溶液を用いて、２つのｐＳｃｒｅｅｎ（商標）プロトタイプを試験した。試験は、４．１μｍ又は８μｍの直径を有する磁気応答性マイクロビーズを使用して行った。試料濃度１００マイクロビーズ／μｌ〜２００，０００マイクロビーズ／μｌを用いた。校正及び検査目盛付きカラムスケール上の流体レベルを記録することにより、磁気応答性マイクロビーズの濃度を決定した。スケール上の各目盛線が、マイクロチャネルを通って流れた所定量の流体容積に対応した。式８で導かれる関係を適用して、記録された容積を磁気応答性マイクロビーズ濃度に換算した。試験したプロトタイプに特有の容積ＶｏとＶｍとの間の関係の分析的表現を、式（９）〜（１１）により与えられる

を用いて式（５）〜（８）を計算することにより導いた。特に注記すべきは、上記に提供される式が、いずれも変数として時間を含まないことである。従って、任意の特定の時点で装置の結果を観測する／読み取る必要はない。どの時点で装置を読み取っても、同じく読み出される。図１３は、標準的な血球計算器で計測した磁気応答性マイクロビーズ濃度（ｘ軸）に対する、本発明のｐＳｃｒｅｅｎ（商標）装置を使用して計測した磁気応答性マイクロビーズ濃度（ｙ軸）を示すグラフである。

（Ｃ）ｐＳｃｒｅｅｎ（商標）イムノアッセイの実験データ
既知の濃度のＩｇＧ標準からタイトレーションすることにより調製した様々な濃度のマウスＩｇＧ抗体を含有する緩衝溶液を使用して、いくつかのｐＳｃｒｅｅｎ（商標）イムノアッセイプロトタイプを試験した。マウスＩｇＧ抗体の濃度は０．５ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌの範囲であった。試験は、抗マウスＩｇＧ抗体で被覆された磁気応答性マイクロビーズを使用し、且つ反応チャンバの表面を抗マウスＩｇＧ抗体で被覆して行った。試料容積は、３０μｌ〜６０μｌの範囲であった。校正及び検査目盛付きカラムスケール上の流体レベルを記録することにより、ＩｇＧ抗体濃度を決定した。スケール上の各目盛線が、マイクロチャネルを通って流れた所定量の流体容積に対応した。図１４は、既知の濃度のＩｇＧ抗体（ｘ軸）に対する、対照カラムに収集された容積（Ｖｏ）と検査カラムに収集された容積（Ｖｍ）との差（ｙ軸）を示すグラフである。

当業者は、上記に記載される実施形態に対し、その広義の発明概念から逸脱することなく変更を加え得ることを理解するであろう。従って、本発明は開示されている特定の実施形態に限定されるものでなく、添付の特許請求の範囲により定義されるとおりの本発明の趣旨及び範囲内にある変形例を網羅するものと意図されることが理解される。

Claims (73)

1. 流体中の磁気応答性マイクロビーズの濃度を検出及び定量化する方法において、
   磁場勾配に曝露されている少なくとも１つの検査マイクロチャネル（Ｃｍ）における前記流体の流速（Ｑｍ）を、磁場勾配に曝露されていない校正マイクロチャネル（Ｃｏ）における前記流体の流速（Ｑｏ）と共に計測するステップにおいて、前記磁場勾配に曝露されている前記少なくとも１つの検査マイクロチャネルにおける磁気応答性マイクロビーズの存在によって前記流体中で前記磁気応答性マイクロビーズのフロキュレーションが生じ、それにより前記少なくとも１つの検査マイクロチャネルを通る前記流体の流速が低下し、ここで両方のマイクロチャネルは等しい一定の圧力に保たれる、ステップと；
   比Ｑｍ／Ｑｏ、差Ｑｏ−Ｑｍ、及び比（Ｑｏ−Ｑｍ）^ｐ／（Ｑｍ）^ｑを計算するステップにおいて、式中、ｐ及びｑは校正プロセスから求められ、前記比Ｑｍ／Ｑｏ及び（Ｑｏ−Ｑｍ）^ｐ／（Ｑｍ）^ｑが、前記流体中の磁気応答性マイクロビーズ数の代用となる、ステップと
   を含むことを特徴とする方法。
2. 請求項１に記載の方法において、前記磁場勾配が、前記少なくとも１つの検査マイクロチャネルを前記磁場勾配に曝露するように前記少なくとも１つの検査マイクロチャネルと長手方向に、且つ反対の磁極に沿って整列した２つの磁石から発生し、前記少なくとも１つの検査マイクロチャネルが、前記磁石の前記反対の磁極の間に形成される間隙の間に位置するか；又は１つの磁石と前記少なくとも１つの検査マイクロチャネルの近傍に位置決めされた磁気応答性構造とから発生することを特徴とする方法。
3. 請求項２に記載の方法において、前記発生する磁場が約０．０５テスラ（Ｔ）〜約０．５Ｔであり、且つ前記発生する磁場勾配が約１０Ｔ／ｍ以上であることを特徴とする方法。
4. 請求項１に記載の方法において、前記少なくとも１つの検査マイクロチャネル及び前記校正マイクロチャネルが、約０．２ｃｍ〜約２０ｃｍの長さを有する毛細管で作製されることを特徴とする方法。
5. 請求項４に記載の方法において、前記毛細管の前記長さが約１．５ｃｍであることを特徴とする方法。
6. 請求項１に記載の方法において、検出及び定量化することのできる磁気応答性マイクロビーズ濃度が、約５０マイクロビーズ／μｌ〜約２×１０^６マイクロビーズ／μｌであり、且つ前記磁気応答性マイクロビーズの直径が約０．２μｍ〜約２０μｍであることを特徴とする方法。
7. 請求項６に記載の方法において、前記磁気応答性マイクロビーズが約４．０μｍの直径を有することを特徴とする方法。
8. 請求項４に記載の方法において、前記流速が、１つ、３つ又は４つの検査マイクロチャネル及び１つの校正マイクロチャネルにおいて計測されることを特徴とする方法。
9. 請求項８に記載の方法において、前記流速が１つの検査マイクロチャネル及び１つの校正マイクロチャネルにおいて計測され、且つ前記１つの検査マイクロチャネルと前記１つの校正マイクロチャネルとが約５０μｍ〜約５００μｍの同じ内径を有することを特徴とする方法。
10. 請求項９に記載の方法において、前記１つの検査マイクロチャネル及び前記１つの校正マイクロチャネルの前記内径が約５０μｍであることを特徴とする方法。
11. 請求項８に記載の方法において、前記流速が３つの検査マイクロチャネル及び１つの校正マイクロチャネルにおいて計測され、前記３つの検査マイクロチャネルの各々は１つの目盛付きカラムに連続的に流体接続し、前記３つの検査マイクロチャネルは各々異なる内径を有し、前記１つの校正マイクロチャネルは、前記１つの校正マイクロチャネルの断面の面積が前記３つの検査マイクロチャネルの断面の面積の合計と同じになるような内径を有し、及び前記第１の検査マイクロチャネルが約５０μｍ〜約５００μｍの内径を有し、前記第２の検査マイクロチャネルが約１００μｍ〜約２５０μｍの内径を有し、且つ前記第３の検査マイクロチャネルが約２５０μｍ〜約５ｍｍの内径を有することを特徴とする方法。
12. 請求項１１に記載の方法において、前記第１の検査マイクロチャネルが約５０μｍの内径を有し、前記第２の検査マイクロチャネルが約１００μｍの内径を有し、且つ前記第３の検査マイクロチャネルが約２５０μｍの内径を有することを特徴とする方法。
13. 請求項８に記載の方法において、前記流速が４つの検査マイクロチャネル及び１つの校正マイクロチャネルにおいて計測され、前記４つの検査マイクロチャネルは合流して１つの目盛付きカラムに連続的に流体接続し、前記４つの検査マイクロチャネルは約１２．５μｍ〜約１２５μｍの同じ内径を有し、及び前記１つの校正マイクロチャネルは、前記１つの校正マイクロチャネルの断面の面積が前記４つの検査マイクロチャネルの断面の面積の合計と同じになるような内径を有することを特徴とする方法。
14. 請求項１３に記載の方法において、前記４つの検査マイクロチャネルが約１２．５μｍの内径を有することを特徴とする方法。
15. 液体試料中における分析物の濃度の検出及び定量化方法において、
    反応チャンバの液体試料入口に液体試料を加えるステップにおいて、前記液体試料入口は、前記液体試料を受け入れるための開口によって画成され、前記反応チャンバは、その表面上に、分析物に特異的な複数の固定化された抗原特異的抗体（Ａｂ１）を吸着しており、前記反応チャンバの前記表面はまた、その上で脱水させた複数の磁気応答性マイクロビーズも有し、前記複数の磁気応答性マイクロビーズの各々は、前記分析物に特異的な抗原特異的抗体（Ａｂ２）で被覆されている、ステップと；
    前記液体試料を前記反応チャンバを通じて流れさせることで、前記液体試料が前記反応チャンバを通って流れるに従い前記複数の抗体被覆磁気応答性マイクロビーズの再水和が起こり、前記再水和により、前記抗体被覆磁気応答性マイクロビーズが前記液体試料中に分散するステップと；
    前記再水和した抗体被覆磁気応答性マイクロビーズ並びに前記反応チャンバの前記表面に固定化された前記抗原特異的抗体が、前記液体試料中に存在する任意の分析物と結合して、前記反応チャンバの前記表面上にＡｂ１−分析物−Ａｂ２被覆磁気マイクロビーズ複合体を形成するステップと；
    任意の未結合の抗体被覆磁気マイクロビーズを含有する前記液体試料を、反応チャンバ出口を通じて前記反応チャンバから出すステップにおいて、前記アッセイ出口は、分岐して校正マイクロチャネル（Ｃｏ）と少なくとも１つの検査マイクロチャネル（Ｃｍ）とを形成するマイクロチャネル分流部に連続的に流体接続し、前記少なくとも１つの検査マイクロチャネルと前記校正マイクロチャネルとは等しい一定の圧力に保たれ、前記校正マイクロチャネルは目盛付きカラムに連続的に流体接続し、且つ前記少なくとも１つの検査マイクロチャネルは少なくとも１つの目盛付きカラムに連続的に流体接続し、前記目盛付きカラムの各々は、その上に目盛付きスケールを有する、ステップと；
    磁場勾配に曝露されている前記少なくとも１つの検査マイクロチャネルにおける前記液体試料の流速（Ｑｍ）を、磁場勾配に曝露されていない前記校正マイクロチャネルにおける前記流体の流速（Ｑｏ）と共に計測するステップにおいて、前記磁場勾配に曝露されている前記少なくとも１つの検査マイクロチャネルにおける任意の未結合の抗体被覆磁気応答性マイクロビーズの存在によって前記液体試料中で前記抗体被覆磁気応答性マイクロビーズのフロキュレーションが生じ、それにより前記少なくとも１つの検査マイクロチャネルを通る前記液体試料の流速が低下する、ステップと；
    比Ｑｍ／Ｑｏ、差Ｑｏ−Ｑｍ、及び比（Ｑｏ−Ｑｍ）^ｐ／（Ｑｍ）^ｑを計算するステップにおいて、式中、ｐ及びｑは校正プロセスから求められ、前記比Ｑｍ／Ｑｏ及び（Ｑｏ−Ｑｍ）^ｐ／（Ｑｍ）^ｑが、前記液体試料中の分析物濃度の代用である前記液体試料中の磁気応答性マイクロビーズ数の代用となる、ステップと
    を含むことを特徴とする方法。
16. 請求項１５に記載の方法において、前記磁場勾配が、前記少なくとも１つの検査マイクロチャネルを前記磁場勾配に曝露するように前記少なくとも１つの検査マイクロチャネルと長手方向に、且つ反対の磁極に沿って整列した２つの磁石から発生し、前記少なくとも１つの検査マイクロチャネルが、前記磁石の前記反対の磁極の間に形成される間隙の間に位置するか；又は１つの磁石と前記少なくとも１つの検査マイクロチャネルの近傍に位置決めされた磁気応答性構造とから発生することを特徴とする方法。
17. 請求項１６に記載の方法において、前記発生する磁場が約０．０５テスラ（Ｔ）〜約０．５Ｔであり、且つ前記発生する磁場勾配が約１０Ｔ／ｍ以上であることを特徴とする方法。
18. 請求項１５に記載の方法において、前記少なくとも１つの検査マイクロチャネル及び前記校正マイクロチャネルが、約０．２ｃｍ〜約２０ｃｍの長さを有する毛細管で作製されることを特徴とする方法。
19. 請求項１８に記載の方法において、前記毛細管の前記長さが約１．５ｃｍであることを特徴とする方法。
20. 請求項１５に記載の方法において、検出及び定量化することのできる磁気応答性マイクロビーズ濃度が、約５０マイクロビーズ／μｌ〜約２×１０^６マイクロビーズ／μｌであり、且つ前記磁気応答性マイクロビーズの直径が約０．２μｍ〜約２０μｍであることを特徴とする方法。
21. 請求項２０に記載の方法において、前記磁気応答性マイクロビーズが約４．０μｍの直径を有することを特徴とする方法。
22. 請求項１８に記載の方法において、前記マイクロチャネル分流部の分岐が、１つ、３つ又は４つの検査マイクロチャネルと１つの校正マイクロチャネルとを形成することを特徴とする方法。
23. 請求項２２に記載の方法において、前記マイクロチャネル分流部の分岐が１つの検査マイクロチャネルと１つの校正マイクロチャネルとを形成し、且つ前記１つの検査マイクロチャネルと前記１つの校正マイクロチャネルとが約５０μｍ〜約５００μｍの同じ内径を有することを特徴とする方法。
24. 請求項２３に記載の方法において、前記１つの検査マイクロチャネル及び前記１つの校正マイクロチャネルの前記内径が約５０μｍであることを特徴とする方法。
25. 請求項２２に記載の方法において、前記マイクロチャネル分流部の分岐が３つの検査マイクロチャネルと１つの校正マイクロチャネルとを形成し、前記３つの検査マイクロチャネルの各々は１つの目盛付きカラムに連続的に流体接続し、前記３つの検査マイクロチャネルは各々異なる内径を有し、前記１つの校正マイクロチャネルは、前記１つの校正マイクロチャネルの断面の面積が前記３つの検査マイクロチャネルの断面の面積の合計と同じになるような内径を有し、前記第１の検査マイクロチャネルが約５０μｍ〜約５００μｍの内径を有し、前記第２の検査マイクロチャネルが約１００μｍ〜約２５０μｍの内径を有し、且つ前記第３の検査マイクロチャネルが約２５０μｍ〜約５ｍｍの内径を有することを特徴とする方法。
26. 請求項２５に記載の方法において、前記第１の検査マイクロチャネルが約５０μｍの内径を有し、前記第２の検査マイクロチャネルが約１００μｍの内径を有し、且つ前記第３の検査マイクロチャネルが約２５０μｍの内径を有することを特徴とする方法。
27. 請求項２２に記載の方法において、前記マイクロチャネル分流部の分岐が４つの検査マイクロチャネルと１つの校正マイクロチャネルとを形成し、前記４つの検査マイクロチャネルは合流して１つの目盛付きカラムに連続的に流体接続し、前記４つの検査マイクロチャネルは約１２．５μｍ〜約１２５μｍの同じ内径を有し、前記１つの校正マイクロチャネルは、前記１つの校正マイクロチャネルの断面の面積が前記４つの検査マイクロチャネルの断面の面積の合計と同じになるような内径を有することを特徴とする方法。
28. 請求項２７に記載の方法において、前記４つの検査マイクロチャネルが約１２．５μｍの内径を有することを特徴とする方法。
29. 請求項１５に記載の方法において、前記分析物が、タンパク質、タンパク質断片、抗原、抗体、抗体断片、ペプチド、ＲＮＡ、ＲＮＡ断片、ＣＤ^４＋、ＣＤ^８＋細胞に特異的な機能化された磁気マイクロビーズ、マラリア感染赤血球、癌細胞、前立腺特異抗原などの癌バイオマーカー及び他の癌バイオマーカー、ウイルス、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの細菌、及び他の病原性因子からなる群から選択されることを特徴とする方法。
30. 液体試料中の磁気応答性マイクロビーズ濃度を検出及び定量化するためのマイクロ流体装置において、前記マイクロ流体装置が、一定量の磁気応答性マイクロビーズを含有する液体試料を受け入れるための開口によって画成された液体試料入口を含み、前記液体試料入口は流れ抵抗部に連続的に流体接続し、前記流れ抵抗部は、分岐して校正マイクロチャネル（Ｃｏ）と少なくとも１つの検査マイクロチャネル（Ｃｍ）とを形成するマイクロチャネル分流部に連続的に流体接続し、前記校正マイクロチャネル及び前記少なくとも１つの検査マイクロチャネルは等しい一定の圧力に保たれ、前記校正マイクロチャネルは目盛付きカラムに連続的に流体接続し、且つ前記少なくとも１つの検査マイクロチャネルは少なくとも１つの目盛付きカラムに連続的に流体接続し、前記少なくとも１つの検査マイクロチャネルは磁場勾配に曝露されており、前記磁場勾配により前記少なくとも１つの検査マイクロチャネルにおいて前記磁気応答性マイクロビーズのフロキュレーションが生じ、前記フロキュレーションにより、前記少なくとも１つの検査マイクロチャネルの前記液体試料の流速（Ｑｍ）が、前記校正マイクロチャネルの前記液体試料の流速（Ｑｏ）と比較して低下し、各目盛付きカラムは、その上に目盛付きスケールを有して、前記目盛付きカラムの各々に収集された前記液体試料の全容積の読取り値を提供し、前記少なくとも１つの検査マイクロチャネル目盛付きカラムに収集された前記液体試料の前記全容積が、前記液体試料中における磁気応答性マイクロビーズ濃度を示すことを特徴とするマイクロ流体装置。
31. 請求項３０に記載のマイクロ流体装置において、比Ｑｍ／Ｑｏ、差Ｑｏ−Ｑｍ、及び比（Ｑｏ−Ｑｍ）^ｐ／（Ｑｍ）^ｑが計算され、前記比が前記液体試料中の磁気応答性マイクロビーズ数の代用となることを特徴とするマイクロ流体装置。
32. 請求項３０に記載のマイクロ流体装置において、前記磁場勾配が、前記少なくとも１つの検査マイクロチャネルを前記磁場勾配に曝露するように前記少なくとも１つの検査マイクロチャネルと長手方向に、且つ反対の磁極に沿って整列した２つの磁石によって発生し、前記少なくとも１つの検査マイクロチャネルが、前記磁石の前記反対の磁極の間に形成される間隙の間に位置するか；又は１つの磁石と前記少なくとも１つの検査マイクロチャネルの近傍に位置決めされた磁気応答性構造とにより発生することを特徴とするマイクロ流体装置。
33. 請求項３２に記載のマイクロ流体装置において、前記発生する磁場が約０．０５テスラ（Ｔ）〜約０．５Ｔであり、且つ前記発生する磁場勾配が約１０Ｔ／ｍ以上であることを特徴とするマイクロ流体装置。
34. 請求項３０に記載のマイクロ流体装置において、前記目盛付きカラムの各々が、約２０ｍｍ〜約２００ｍｍの長さ、約０．２ｍｍ〜約３．０ｍｍの幅、及び約０．１ｍｍ〜約１．０ｍｍの深さを有し、その上にある前記それぞれの目盛付きスケールが、各々、肉眼で見える長さ及び断面を有し、前記磁気応答性マイクロビーズ濃度の測定値を提供する前記読取り値は、前記校正目盛付きカラムにおいて可視化される全試料容積を前記少なくとも１つの検査目盛付きカラムと直接比較することにより、どの時点であっても得ることができることを特徴とするマイクロ流体装置。
35. 請求項３４に記載のマイクロ流体装置において、前記目盛付きカラムの各々が、約６０ｍｍの長さ、約１．２ｍｍの幅、及び約０．４ｍｍの深さを有することを特徴とするマイクロ流体装置。
36. 請求項３０に記載のマイクロ流体装置において、前記校正マイクロチャネル目盛付きカラムに収集される前記全試料容積が、試料間の粘度のばらつき、血液試料中のヘマトクリット値、温度及び湿度変動並びに試料容積などのパラメータの対照として働くことを特徴とするマイクロ流体装置。
37. 請求項３０に記載のマイクロ流体装置において、使い捨て携帯形ラボ・オン・カード装置であることを特徴とするマイクロ流体装置。
38. 請求項３０に記載のマイクロ流体装置において、レーザーエッチングシステムを使用してプラスチック基板上に前記マイクロチャネルの各々をエッチングし、次に前記マイクロチャネルの各々の上面を熱的接着によりプラスチックに封止すること、及びプラスチックにおける射出注型成形によることからなる群から選択される方法によって作製されることを特徴とするマイクロ流体装置。
39. 請求項３０に記載のマイクロ流体装置において、前記プラスチック基板がポリ（エチレンテレフタレート）グリコールであり、前記プラスチック封止がポリ（乳酸−コ−グリコール酸）であり、及び前記射出注型成形プラスチックがポリ（メタクリル酸メチル）であることを特徴とするマイクロ流体装置。
40. 請求項３０に記載のマイクロ流体装置において、前記少なくとも１つの検査マイクロチャネル及び前記校正マイクロチャネルが、約０．２ｃｍ〜約２０ｃｍの長さを有する毛細管で作製されることを特徴とするマイクロ流体装置。
41. 請求項４０に記載のマイクロ流体装置において、前記毛細管が約１．５ｃｍであることを特徴とするマイクロ流体装置。
42. 請求項３０に記載のマイクロ流体装置において、検出及び定量化することのできる磁気応答性マイクロビーズ濃度が約５０マイクロビーズ／μｌ〜約２×１０^６マイクロビーズ／μｌであり、且つ前記磁気応答性マイクロビーズの直径が約０．２μｍ〜約２０μｍであることを特徴とするマイクロ流体装置。
43. 請求項４２に記載のマイクロ流体装置において、前記磁気応答性マイクロビーズが約４．０μｍの直径を有することを特徴とするマイクロ流体装置。
44. 請求項４０に記載のマイクロ流体装置において、前記流速が、１つ、３つ又は４つの検査マイクロチャネル及び１つの校正マイクロチャネルにおいて計測されることを特徴とするマイクロ流体装置。
45. 請求項４４に記載のマイクロ流体装置において、前記流速が１つの検査マイクロチャネル及び１つの校正マイクロチャネルにおいて計測され、且つ前記１つの検査マイクロチャネルと前記１つの校正マイクロチャネルとが約５０μｍ〜約５００μｍの同じ内径を有することを特徴とするマイクロ流体装置。
46. 請求項４５に記載のマイクロ流体装置において、前記１つの検査マイクロチャネル及び前記１つの校正マイクロチャネルの前記内径が約５０μｍであることを特徴とするマイクロ流体装置。
47. 請求項４４に記載のマイクロ流体装置において、前記流速が３つの検査マイクロチャネル及び１つの校正マイクロチャネルにおいて計測され、前記３つの検査マイクロチャネルの各々は１つの目盛付きカラムに連続的に流体接続し、前記３つの検査マイクロチャネルは各々異なる内径を有し、前記１つの校正マイクロチャネルは、前記１つの校正マイクロチャネルの断面の面積が前記３つの検査マイクロチャネルの断面の面積の合計と同じになるような内径を有し、及び前記第１の検査マイクロチャネルが約５０μｍ〜約５００μｍの内径を有し、前記第２の検査マイクロチャネルが約１００μｍ〜約２５０μｍの内径を有し、且つ前記第３の検査マイクロチャネルが約２５０μｍ〜約５ｍｍの内径を有することを特徴とするマイクロ流体装置。
48. 請求項４７に記載のマイクロ流体装置において、前記第１の検査マイクロチャネルが約５０μｍの内径を有し、前記第２の検査マイクロチャネルが約１００μｍの内径を有し、且つ前記第３の検査マイクロチャネルが約２５０μｍの内径を有することを特徴とするマイクロ流体装置。
49. 請求項４４に記載のマイクロ流体装置において、前記流速が４つの検査マイクロチャネル及び１つの校正マイクロチャネルにおいて計測され、前記４つの検査マイクロチャネルは合流して１つの目盛付きカラムに連続的に流体接続し、前記４つの検査マイクロチャネルは約１２．５μｍ〜約１２５μｍの同じ内径を有し、前記１つの校正マイクロチャネルは、前記１つの校正マイクロチャネルの断面の面積が前記４つの検査マイクロチャネルの断面の面積の合計と同じになるような内径を有することを特徴とするマイクロ流体装置。
50. 請求項４９に記載のマイクロ流体装置において、前記４つの検査マイクロチャネルが約１２．５μｍの内径を有することを特徴とするマイクロ流体装置。
51. 液体試料中の分析物を検出及び計測するためのマイクロ流体イムノアッセイ装置において、前記マイクロ流体イムノアッセイ装置が、前記液体試料を受け入れるための開口によって画成された液体試料入口を含み、前記液体試料入口は流れ抵抗チャネルに連続的に流体接続し、前記流れ抵抗チャネルは反応チャンバのアッセイ入口に連続的に流体接続し、前記反応チャンバは、その表面上に、分析物に特異的な複数の固定化された抗原特異的抗体（Ａｂ１）を吸着しており、前記反応チャンバの前記表面はまた、その上で脱水させた複数の磁気応答性マイクロビーズも有し、前記複数の磁気応答性マイクロビーズの各々は、前記分析物に特異的な抗原特異的抗体（Ａｂ２）で被覆され、前記反応チャンバを通る前記液体試料の流れにより前記複数の抗体被覆磁気応答性マイクロビーズが再水和し、前記液体試料中に分散して、前記液体試料中に存在する任意の分析物と結合し、前記液体試料中に存在する任意の分析物はまた、前記反応チャンバの前記表面に固定化された前記抗原特異的抗体とも結合して、Ａｂ１−分析物−Ａｂ２被覆磁気応答性マイクロビーズ複合体を形成し、任意の未結合の抗体被覆磁気応答性マイクロビーズはアッセイ出口から前記反応チャンバを出て、前記アッセイ出口は、分岐して校正マイクロチャネル（Ｃｏ）と少なくとも１つの検査マイクロチャネル（Ｃｍ）とを形成するマイクロチャネル分流部に連続的に流体接続し、前記少なくとも１つの検査マイクロチャネルと前記校正マイクロチャネルとは等しい一定の圧力に保たれ、前記校正マイクロチャネルは目盛付きカラムに連続的に流体接続し、且つ前記少なくとも１つの検査マイクロチャネルは少なくとも１つの目盛付きカラムに連続的に流体接続し、前記少なくとも１つの検査マイクロチャネルは磁場勾配に曝露されており、前記磁場勾配により前記少なくとも１つの検査マイクロチャネルにおいて前記磁気応答性マイクロビーズのフロキュレーションが生じ、前記フロキュレーションにより、前記少なくとも１つの検査マイクロチャネルの前記液体試料の流速（Ｑｍ）が、前記校正マイクロチャネルの前記液体試料の流速（Ｑｏ）と比較して低下し、前記目盛付きカラムの各々は、その上に目盛付きスケールを有して、前記目盛付きカラムの各々に収集された全試料容積の読取り値を提供し、前記少なくとも１つの検査マイクロチャネル目盛付きカラムに収集された前記全試料容積が、前記液体試料中における分析物濃度を示すことを特徴とするマイクロ流体イムノアッセイ装置。
52. 請求項５１に記載のマイクロ流体イムノアッセイ装置において、比Ｑｍ／Ｑｏ、差Ｑｏ−Ｑｍ、及び比（Ｑｏ−Ｑｍ）^ｐ／（Ｑｍ）^ｑが計算され、前記比が、前記液体試料中の分析物濃度の代用である前記液体試料中の磁気応答性マイクロビーズ数の代用となることを特徴とするマイクロ流体イムノアッセイ装置。
53. 請求項５１に記載のマイクロ流体イムノアッセイ装置において、前記磁場勾配が、前記少なくとも１つの検査マイクロチャネルを前記磁場勾配に曝露するように前記少なくとも１つの検査マイクロチャネルと長手方向に、且つ反対の磁極に沿って整列した２つの磁石によって発生し、前記少なくとも１つの検査マイクロチャネルが、前記磁石の前記反対の磁極の間に形成される間隙の間に位置するか；又は１つの磁石と前記少なくとも１つの検査マイクロチャネルの近傍に位置決めされた磁気応答性構造とにより発生することを特徴とするマイクロ流体イムノアッセイ装置。
54. 請求項５３に記載のマイクロ流体イムノアッセイ装置において、前記発生する磁場が約０．０５テスラ（Ｔ）〜約０．５Ｔであり、且つ前記発生する磁場勾配が約１０Ｔ／ｍ以上であることを特徴とするマイクロ流体イムノアッセイ装置。
55. 請求項５１に記載のマイクロ流体イムノアッセイ装置において、前記校正マイクロチャネル目盛付きカラムに収集される前記全試料容積が、試料間の粘度のばらつき、血液試料中のヘマトクリット値、温度及び湿度変動並びに試料容積などのパラメータの対照として働くことを特徴とするマイクロ流体イムノアッセイ装置。
56. 請求項５１に記載のマイクロ流体イムノアッセイ装置において、前記目盛付きカラムの各々が、約２０ｍｍ〜約２００ｍｍの長さ、約０．２ｍｍ〜約３．０ｍｍの幅、及び約０．１ｍｍ〜約１．０ｍｍの深さを有し、その上にある前記それぞれの目盛付きスケールが、各々、肉眼で見える長さ及び断面を有し、未結合の磁気応答性マイクロビーズの測定値、従って前記液体試料中に存在する分析物の濃度の測定値を提供する前記読取り値は、前記校正目盛付きカラムにおいて可視化される全試料容積を前記少なくとも１つの検査目盛付きカラムと直接比較することにより、どの時点であっても得ることができることを特徴とするマイクロ流体イムノアッセイ装置。
57. 請求項５６に記載のマイクロ流体イムノアッセイ装置において、前記目盛付きカラムの各々が、約６０ｍｍの長さ、約１．２ｍｍの幅、及び約０．４ｍｍの深さを有することを特徴とするマイクロ流体イムノアッセイ装置。
58. 請求項５１に記載のマイクロ流体イムノアッセイ装置において、前記液体試料が、水、血漿、血清、緩衝溶液、尿、全血、血液類似物、固形の生物学的物質の希釈溶液、及び他の生物学的流体からなる群から選択されることを特徴とするマイクロ流体イムノアッセイ装置。
59. 請求項５１に記載のマイクロ流体イムノアッセイ装置において、前記分析物が、タンパク質、タンパク質断片、抗原、抗体、抗体断片、ペプチド、ＲＮＡ、ＲＮＡ断片、ＣＤ^４＋、ＣＤ^８＋細胞に特異的な機能化された磁気マイクロビーズ、マラリア感染赤血球、癌細胞、前立腺特異抗原などの癌バイオマーカー及び他の癌バイオマーカー、ウイルス、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの細菌、及び他の病原性因子からなる群から選択されることを特徴とするマイクロ流体イムノアッセイ装置。
60. 請求項５１に記載のマイクロ流体イムノアッセイ装置において、使い捨て携帯形ラボ・オン・カード装置であることを特徴とするマイクロ流体イムノアッセイ装置。
61. 請求項５１に記載のマイクロ流体イムノアッセイ装置において、レーザーエッチングシステムを使用してプラスチック基板上に前記マイクロチャネルの各々をエッチングし、次に前記マイクロチャネルの各々の上面を熱的接着によりプラスチックに封止すること、及びプラスチックにおける射出注型成形によることからなる群から選択される方法によって作製されることを特徴とするマイクロ流体イムノアッセイ装置。
62. 請求項５１に記載のマイクロ流体イムノアッセイ装置において、前記プラスチック基板がポリ（エチレンテレフタレート）グリコールであり、前記プラスチック封止がポリ（乳酸−コ−グリコール酸）であり、及び前記射出注型成形プラスチックがポリ（メタクリル酸メチル）であることを特徴とするマイクロ流体イムノアッセイ装置。
63. 請求項５１に記載のマイクロ流体イムノアッセイ装置において、検出及び定量化することのできる磁気応答性マイクロビーズ濃度が約５０マイクロビーズ／μｌ〜約２×１０^６マイクロビーズ／μｌであり、且つ前記磁気応答性マイクロビーズの直径が約０．２μｍ〜約２０μｍであることを特徴とするマイクロ流体イムノアッセイ装置。
64. 請求項６３に記載のマイクロ流体イムノアッセイ装置において、前記磁気応答性マイクロビーズが約４．０μｍの直径を有することを特徴とするマイクロ流体イムノアッセイ装置。
65. 請求項５１に記載のマイクロ流体イムノアッセイ装置において、前記少なくとも１つの検査マイクロチャネル及び前記校正マイクロチャネルが、約０．２ｃｍ〜約２０ｃｍの長さを有する毛細管で作製されることを特徴とするマイクロ流体イムノアッセイ装置。
66. 請求項６５に記載のマイクロ流体イムノアッセイ装置において、前記毛細管の前記長さが約１．５ｃｍであることを特徴とするマイクロ流体イムノアッセイ装置。
67. 請求項６５に記載のマイクロ流体イムノアッセイ装置において、前記マイクロチャネル分流部の分岐が、１つ、３つ又は４つの検査マイクロチャネルと１つの校正マイクロチャネルとを形成することを特徴とするマイクロ流体イムノアッセイ装置。
68. 請求項６７に記載のマイクロ流体イムノアッセイ装置において、前記マイクロチャネル分流部の分岐が１つの検査マイクロチャネルと１つの校正マイクロチャネルとを形成し、前記１つの検査マイクロチャネルと前記１つの校正マイクロチャネルとが約５０μｍ〜約５００μｍの同じ内径を有することを特徴とするマイクロ流体イムノアッセイ装置。
69. 請求項６８に記載のマイクロ流体イムノアッセイ装置において、前記１つの検査マイクロチャネル及び前記１つの校正マイクロチャネルの前記内径が約５０μｍであることを特徴とするマイクロ流体イムノアッセイ装置。
70. 請求項６７に記載のマイクロ流体イムノアッセイ装置において、前記マイクロチャネル分流部の分岐が３つの検査マイクロチャネルと１つの校正マイクロチャネルとを形成し、前記３つの検査マイクロチャネルの各々は１つの目盛付きカラムに連続的に流体接続し、前記３つの検査マイクロチャネルは各々異なる内径を有し、前記１つの校正マイクロチャネルは、前記１つの校正マイクロチャネルの断面の面積が前記３つの検査マイクロチャネルの断面の面積の合計と同じになるような内径を有し、前記第１の検査マイクロチャネルが約５０μｍ〜約５００μｍの内径を有し、前記第２の検査マイクロチャネルが約１００μｍ〜約２５０μｍの内径を有し、且つ前記第３の検査マイクロチャネルが約２５０μｍ〜約５ｍｍの内径を有することを特徴とするマイクロ流体イムノアッセイ装置。
71. 請求項７０に記載のマイクロ流体イムノアッセイ装置において、前記第１の検査マイクロチャネルが約５０μｍの内径を有し、前記第２の検査マイクロチャネルが約１００μｍの内径を有し、且つ前記第３の検査マイクロチャネルが約２５０μｍの内径を有することを特徴とするマイクロ流体イムノアッセイ装置。
72. 請求項６７に記載のマイクロ流体イムノアッセイ装置において、前記マイクロチャネル分流部の分岐が４つの検査マイクロチャネルと１つの校正マイクロチャネルとを形成し、前記４つの検査マイクロチャネルは合流して１つの目盛付きカラムに連続的に流体接続し、前記４つの検査マイクロチャネルは約１２．５μｍ〜約１２５μｍの同じ内径を有し、前記１つの校正マイクロチャネルは、前記１つの校正マイクロチャネルの断面の面積が前記４つの検査マイクロチャネルの断面の面積の合計と同じになるような内径を有することを特徴とするマイクロ流体イムノアッセイ装置。
73. 請求項７２に記載のマイクロ流体イムノアッセイ装置において、前記４つの検査マイクロチャネルが約１２．５μｍの内径を有することを特徴とするマイクロ流体イムノアッセイ装置。

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