JP2020509383A - 検体の定量化のための方法およびデバイス - Google Patents

Abstract

試料中の検体の定量化のための、各種方法およびデバイスを提供する。一実施例は、以下の各ステップを有する。試料を、少なくとも１つのテスト分割チャネル（３０６）に注入する。テスト分割チャネル（３０６）は、テスト反応部（３０６ａ）を備えている。試料中の検体（４１０）は、前記反応部において、供給される捕捉試薬（４０８）と結合する。捕捉試薬（４０８）と結合した検体（４１０）を、反応液と接触させる。反応液は、検体（４１０）と結合させるための、試薬でコーティングした複数の微小粒子（４１２）を含む。非結合微小粒子を含んだ残留反応液を回収する。検体を定量するために、残留反応液を分析する。

Description

本発明は、試料中の検体の定量化に関し、具体的には、試料中の検体の定量化のための方法およびデバイスに関する。

通常、疾病を診断するための各種テストは、病理研究所で実施される。喀痰、尿、唾液などのような患者試料は、熟練技術者によって標準的なプロトコルを用いて処理される。これは、多くの場合、時間がかかり、熟練した人員と、高価な実験装置とを必要とする。所要時間を短縮し、その結果、医師が種々の臨床意思決定を行うことを可能とする、各種のポイントオブケア（Point of Care; POC）診断方法およびデバイスが開発されている。これらの各種ＰＯＣデバイスは、各種ラテラルフローアッセイ（Lateral Flow Assays; LFA）と、各種マイクロ流体デバイスとを含む。また、患者試料中の検体を検出し、診断し、定量する、各種のラボオンチップ（Lab-on-a-chip）デバイスも開発されてきた。

病理研究所における各種診断テストは、通例、時間がかかり、熟練技術者を必要とし、研究所のインフラストラクチャーを必要とする。研究所の各種診断テストより短時間で結果を提供する、各種のポイントオブケア（Point-of-care; POC）デバイスおよび方法が開発されてきた。各種のＰＯＣデバイスおよび方法は、各種ラテラルフローアッセイ（Lateral Flow Assay; LFA）デバイスと、マイクロ流体を基礎とする、ラボオンチップベースの各種システムとを含む。

ＬＦＡは成功を収めているものの、概して、各種診断テストに基づいて研究所がもたらすような感度および特異度には及ばない。マイクロ流体を基礎とする、ラボオンチップベースの各種システムは、従来のＬＦＡよりも高い感度および特異度を提供する。感度および特異度を改善する、各種方法が開発されてきた。しかし、これらの各種方法には、一般に電子リーダーが必要とされ、それによりＬＦＡや、マイクロ流体を基礎とする、ラボオンチップベースのシステムの費用および複雑さが増大する。公共部門の医療提供者は、概して、かかる電子リーダーの費用を負担することができず、それゆえ、臨床試料はより大規模な研究所に送られて、所要時間（turnaround time; TAT）および診断を増加することになる。

光反射や電流測定などのような各種従来技術を利用した、各種臨床試料中の検体濃度を検出し、測定する、各種ラボオンチップシステムが開発されてきた。各種従来技術を使用すると実験装置の使用量は低減するが、定量化のためには、手のひらサイズまたは台上に設置可能な各種器械を使用することはできるものの、それによって費用が増加する。

最近の研究は、コストも維持しつつ、改善された感度、より小さなアッセイ時間、およびより良好なＳＮ比を有する、各種アッセイを開発することを目的としてきた。かかるアッセイ技術の１つは、タンパク質の分離および検出のために、抗体でコーティングした微小粒子を用いることを含む。抗体でコーティングした微小粒子は各種標的タンパク質と結合するため、結合微小粒子の濃度は、標的タンパク質の濃度と正比例し、標的タンパク質の定量に用いることができる。通例、結合ビーズを視覚的に検出するために、各種蛍光色素もマイクロビーズ上にコーティングされている。顕微鏡や、デジタル式または手動式のセルカウンターなどの使用を含む、別の各種方法も、結合マイクロビーズをカウントするために用いられてきた。これらの技術は、アッセイの複雑さを増大させる、研究所の環境や高価な各種器械を必要とする。

本主題に従って、本主題は、試料中の検体を定量するための方法を提供する。試料は、少なくとも１つのテスト分割チャネルに注入される。テスト分割チャネルは、テスト反応部を備える。試料中の検体は、反応部において、供給される捕捉試薬と結合する。捕捉試薬と結合した検体を、反応液と接触させる。反応液は、検体を結合させるための、試薬でコーティングした複数の微小粒子を含む。非結合微小粒子を含んだ残留反応液を回収する。検体を定量するために、残留反応液を分析する。

一実施例では、試薬でコーティングした微小粒子の当初の数と、非結合微小粒子の数との差を決定するために、残留反応液を分析する。この差と、検体濃度との相関を求め、この相関に基づいて、検体を定量する。

別の実施例では、少なくとも１つのコントロール分割チャネルに試料を注入する。少なくとも１つのテスト分割チャネルと、少なくとも１つのコントロール分割チャネルとに、反応液を注入する。少なくとも１つのテスト分割チャネルのテスト検出部と、少なくとも１つのコントロール分割チャネルのコントロール検出部とによって、残留反応液を回収する。テスト検出部と、コントロール検出部とによって回収された残留反応液の体積の差を決定する。この体積の差と、試薬でコーティングした微小粒子の当初の数と非結合微小粒子の数との差との相関を求める。この差と、検体濃度との相関を求め、この相関に基づいて、検体を定量する。

本主題は、また、試料中の検体の定量化のためのマイクロ流体デバイスを提供する。マイクロ流体デバイスは、第１のチャネルと、マイクロチャネル分配器とを備える。マイクロチャネル分配器の第１の端部は、第１のチャネルに接続されており、マイクロチャネル分配器の第２の端部は、複数の分割チャネルに接続されている。マイクロチャネル分配器は、複数の分割チャネルのそれぞれに、反応液を分配する。複数の分割チャネルは、反応液の第１の量を回収するテスト分割チャネルを備える。テスト分割チャネルは、テスト反応部を有する。テスト反応部は、複数の微小粒子と結合し、検体の存在下で反応液の第１の量を減少させる。テスト検出部は、反応液の減少量を回収する。第１の量の減少を、検体濃度を定量するために用いる。

本主題は、電子リーダーのような周辺機器を、その機能を補助するために使用しない、軽便な各種アッセイを実施するための方法およびデバイスを提供する。また、本主題は、計量可能な各種結果を提供する。この方法およびデバイスはマイクロ流体デバイスに基づいているため、当該デバイスをポケットサイズにすることができる。本主題の方法およびデバイスを使用することにより、検体は、従来の研究所の各種診断技術と比較して、短時間で定量される。さらに、この方法およびデバイスは、いかなる研究所のインフラストラクチャーも必要とせず、農村部や家庭のような、リソースが限られた各種環境で使用することができる。そして、この方法は簡単で、またデバイスも使いやすいため、非熟練者でも同様に実行し、使用することができる。

試料中の検体を定量するための方法を、本主題の実施に従って示すフローチャートである。 残留反応液を分析するための方法を、本主題の実施に従って示すフローチャートである。 残留反応液を分析するための別の方法を、本主題の実施に従って示すフローチャートである。 試料中の検体を定量するためのさらに別の方法を、本主題の実施に従って示すフローチャートである。 検体を定量するためのデバイスの概略を、本主題の実施に従って示す図である。 検体の定量化を、本主題の実施に従って模式的に示す図である。 試料流量の最適化の結果を、本主題の実施に従って示すグラフである。 反応液流量の最適化の結果を、本主題の実施に従って示すグラフである。 試料体積の最適化の結果を、本主題の実施に従って示すグラフである。 非結合微小粒子の数について作成された標準曲線を、本主題の実施に従って示すグラフである。 検出チャネル中のシグナルについて作成された標準曲線を、本主題の実施に従って示すグラフである。

詳細な説明は、添付した各図を参照しつつ提供される。各図において、参照番号の左端の数字は、当該参照番号が初出となる図を示している。類似の特徴や構成要素に言及するのに、図面を通して同じ数字が使用される。

上記の各実施は、添付した各図を参照しつつ、本明細書でさらに詳しく説明する。当該説明および各図は、例示的な各実施に関連して言及されるものであり、本主題に対する限定として解釈されるものではない。また、本明細書に明確に説明または図示されていないが、本主題の各原理を具体化する種々の変形が考案され得ることも理解されたい。さらに、本主題の各原理、各態様、および各実施例や、特定の実施例を詳述する本明細書のすべての記述は、それらの各等価物を包含するものである。

本主題は、試料中の検体の定量化のための方法およびデバイスに関する。

図１は、試料中の検体を定量するための方法１００を、本主題の実施形態に従って示している。検体は、抗原および抗体の、いずれか１つであってよい。検体は、タンパク質、タンパク質断片、各種細胞、各種核酸、各種殺菌作用物、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される。ブロック１０２では、試料を、少なくとも１つのテスト分割チャネルに注入する。このテスト分割チャネルについては、図３を参照しつつ、後で説明する。実施例では、当該試料は、第１のチャネルの注入口に注入された後、テスト分割チャネルに注入される。テスト分割チャネルは、テスト反応部を備えている。捕捉試薬は、テスト反応部に供給される。例えば、捕捉試薬は、テスト反応部において、コーティングされてもよい。試料中の検体は、テスト反応部において、捕捉試薬と結合する。

ブロック１０４では、各種捕捉試薬と結合した検体を、反応液と接触させる。この反応液は、検体を結合させるための、試薬でコーティングした複数の微小粒子を含む。実施例では、この接触は、試薬でコーティングした複数の微小粒子を緩衝液で水和することを含む。別の実施例では、この接触は、試薬でコーティングした複数の微小粒子が反応部に収容されている場合に、試薬でコーティングした複数の微小粒子を試料で水和することを含む。試薬は、検体と相補的な、抗原または抗体であってよい。反応液を検体と接触させると、試薬が検体と相補的である場合、試薬でコーティングした複数の微小粒子が検体と結合する。試薬は、タンパク質、タンパク質断片、各種細胞、各種核酸、各種殺菌作用物、およびそれらの組み合わせからなる群から選択され、テスト対象の検体と相補的である。

ブロック１０６では、非結合微小粒子を含んだ残留反応液を回収する。実施例では、残留反応液は、テスト検出部で回収される。別の実施例では、残留反応液を、例えば、手動カウンター、スライド、ノイバウエルチャンバーなどの、別個の器具に回収する。

ブロック１０８では、検体を定量するために、残留反応液を分析する。図１ｂは、残留反応液を分析するための方法１０８ａを、本主題の実施形態に従って示している。ステップ１１０では、試薬でコーティングした微小粒子の当初の数と、非結合微小粒子の数との差を決定する。ステップ１１２では、この差と、検体濃度との相関を求める。ステップ１１４では、上記相関に基づいて、検体を定量する。

図１ｃは、残留反応液を分析するための別の方法１０８ｂを示している。ブロック１１６では、少なくとも１つのコントロール分割チャネルに試料を注入する。試料は、第１のチャネルの注入口に注入することができる。この実施例では、試料は、その後、第１のチャネルから、少なくとも１つのテスト分割チャネルと、少なくとも１つの分割チャネルとに分配される。一実施例では、試料の注入口への注入に、マイクロポンプを使用する。別の実施例では、マイクロインジェクターなどを用いて試料を注入することができる。実施例では、試料は、理解のため、喀痰や尿などの、処理され得る各種臨床試料であってよい。実施例では、試料は、注入口に注入される前に希釈され、処理される。この実施例では、注入口に注入される、処理される試料の体積は、１μＬ〜２００μＬで変動してもよい。別の実施例では、処理または希釈を行わずに、試料を注入口に注入する。この実施例では、使用される試料の種類に応じて、試料体積が変化してもよい。一実施例では、試料の流量は、１μＬ／分〜２００μＬ／分である。一実施例では、反応液の流量は、１μＬ／分〜２００μＬ／分である。しかし、理解されるように、別の試料体積や流量を使用してもよい。

一実施例では、コントロール分割チャネルはコントロール反応部も備える。この実施例では、コントロール反応部における検体の結合を抑制するために、コントロール反応部に捕捉試薬を供給しなくてもよい。別の実施例では、コントロール反応部中の捕捉試薬は、検体の類似体でブロックすることができる。別の実施例では、検体は、コントロール反応部において複数の捕捉試薬と結合することが可能であり、結合した検体は、後で説明するように、その後、複数の微小粒子の結合を阻害するためにブロックされる。

ステップ１１８では、少なくとも１つのテスト分割チャネルと、少なくとも１つのコントロール分割チャネルとから、試料を洗浄する。一実施例では、この洗浄を、洗浄緩衝液を用いて実施する。実施例では、少なくとも１つのテスト分割チャネルと、少なくとも１つのコントロール分割チャネルとに対して、異種の緩衝液を用いて洗浄を実施する。例えば、コントロール反応部において、結合した検体をブロックするために、コントロール分割チャネルの洗浄にブロッキング緩衝液を使用してもよい。

洗浄後、ステップ１２０では、少なくとも１つのテスト分割チャネルと、少なくとも１つのコントロール分割チャネルとに、反応液を注入する。試薬でコーティングした複数の微小粒子は、テスト反応部において、検体と結合する。一実施例では、反応液は、第１のチャネルの注入口に注入され、少なくとも１つのテスト分割チャネルと、少なくとも１つのコントロール分割チャネルとに分配される。一実施例では、複数の微小粒子は、乾燥状態で注入口の上流に収容されていてもよい。この実施例では、複数の微小粒子は、反応液を調製するために、緩衝液で水和されてもよい。別の実施例では、複数の微小粒子は、乾燥状態で注入口の下流に収容されていてもよく、試料の通過によって水和されてもよい。

ステップ１２２では、少なくとも１つのテスト分割チャネルのテスト検出部と、少なくとも１つのコントロール分割チャネルのコントロール検出部が、少なくとも１つのテスト分割チャネルと、少なくとも１つのコントロール分割チャネルとから、残留反応液を回収する。残留反応液は、非結合微小粒子を含む。一実施例では、少なくとも１つのテスト分割チャネルと、少なくとも１つのコントロール分割チャネルとを、緩衝液で洗浄することができる。この実施例では、残留反応液は、非結合微小粒子と、緩衝液とを含む。

コントロール反応部においては、試薬でコーティングした複数の微小粒子が結合しないため、コントロール検出部が回収する残留反応液は、注入した反応液と実質的に同じ体積である。しかし、テスト反応部においては、複数の微小粒子が検体と結合するため、テスト検出部が回収する残留反応液の体積は減少する。例えば、少なくとも１つのテスト分割チャネルと、少なくとも１つのコントロール分割チャネルとにそれぞれ注入する反応液の当初の体積がＶ_０である場合、コントロール検出部が回収する残留反応液はＶ_０と実質的に等しくなり、テスト検出部Ｖ_１が回収する残留反応液の体積は、テスト反応部において複数の微小粒子が結合することにより、Ｖ_０未満となる。ステップ１２４では、テスト検出部とコントロール検出部との体積の差を決定する。

上記の体積の差は、微小粒子の数の差に正比例する。例えば、少なくとも１つのテスト分割チャネルと、少なくとも１つのコントロール分割チャネルとにそれぞれ注入する反応液の当初の体積にＮ_０個の微小粒子が含まれている場合、コントロール検出部が回収する残留反応液は、Ｎ_０と実質的に等しい微小粒子を有することとなり、テスト検出部が回収する残留反応液Ｎ_１中の微小粒子の数は、テスト反応部において複数の微小粒子が結合することにより、Ｎ_０未満となる。この体積の減少Ｖ_０−Ｖ_１は、テスト検出チャネルおよびコントロール検出チャネルにおける、マイクロビーズの数の変化Ｎ_０−Ｎ_１と対応している。Ｎ_０−Ｎ_１は、さらに、テスト反応部における検体濃度と対応している。

ステップ１２６では、テスト検出部とコントロール検出部との体積の差と、検体濃度との相関を求める。この体積の差と、テスト検出部およびコントロール検出部における非結合微小粒子の数の差との相関を求める。この非結合微小粒子の数の差と、検体濃度との相関を求める。この相関に基づいて、検体を定量する。したがって、本主題が提供する方法は、試料中の検体を定量するために、体積測定法を用いる。

図２は、試料中の検体を定量するためのさらに別の方法２００を、本主題の実施形態に従って示している。ブロック２０２では、検体と、検体でコーティングした微小粒子とを含む試料を、少なくとも１つのテスト分割チャネルに注入する。検体と、検体でコーティングした微小粒子とは、反応部において、供給される捕捉試薬と競合的に結合する。

ブロック２０４では、残留反応液を回収する。残留反応液は、遊離検体と、検体でコーティングした非結合微小粒子とを含む。特定の検体濃度について、残留反応液中の、検体でコーティングした非結合微小粒子の数は実質的に同一となる。それゆえ、検体でコーティングした微小粒子の当初の数と、検体でコーティングした非結合微小粒子の数との差は、特定の検体濃度について同一となる。

ブロック２０６では、検体でコーティングした微小粒子の当初の数と、検体でコーティングした非結合微小粒子の数との差を決定する。ブロック２０８では、この差と、検体濃度との相関を求める。ブロック２１０では、この相関に基づいて、検体を定量する。

本主題は、さらに、検体の定量化のためのマイクロ流体デバイスを提供する。図３は、マイクロ流体デバイス３００を、本主題の実施形態に従って示している。マイクロ流体デバイス３００は、第１のチャネル３０２と、マイクロチャネル分配器３０４とを備える。マイクロチャネル分配器３０４の第１の端部は、第１のチャネル３０２に接続されており、マイクロチャネル分配器３０４の第２の端部は、複数の分割チャネルに接続されている。

図３は、２つの分割チャネル、すなわちテスト分割チャネル３０６とコントロール分割チャネル３０８とを示している。しかし、任意の数の分割チャネル（テストまたはコントロール）を提供してもよいことが理解されよう。マイクロチャネル分配器３０４は、複数の分割チャネルのそれぞれに、反応液を分配する。実施例では、マイクロチャネル分配器３０４は、複数の分割チャネルのそれぞれへ確実に反応液の均等な分配を行う、流量検出器のような各種コンポーネントを備えていてもよい。

複数の分割チャネルは、テスト分割チャネル３０６と、コントロール分割チャネル３０８とを備える。定量する検体の数などの要因に基づいて、多数のテスト分割チャネルおよびコントロール分割チャネルを供給し得ることを理解されたい。テスト分割チャネル３０６は、マイクロチャネル分配器３０４から第１の量の反応液を回収する。テスト分割チャネル３０６は、テスト反応部３０６ａを備える。実施例では、テスト分割チャネル３０６は、また、テスト検出部３０６ｂを備える。テスト反応部３０６ａは、試薬でコーティングした複数の微小粒子と結合し、検体の存在下で反応液の第１の量を減少させる。

前述したように、テスト反応部３０６ａは、検体を捕捉すべくその内部にコーティングされた捕捉試薬を含み、試薬でコーティングした複数の微小粒子とさらに結合する。試薬でコーティングした複数の微小粒子の結合は、第１の量を減少させる。この第１の量は、反応液の第１の体積、または試薬でコーティングした微小粒子の当初の数であってよい。テスト分割チャネル３０６は、また、反応液の減少量を回収する、テスト検出部３０６ｂを備える。

テスト分割チャネル３０６と同様に、コントロール分割チャネル３０８もまた、コントロール反応部３０８ａと、コントロール検出部３０８ｂとを備える。コントロール検出部３０８ｂは、マイクロチャネル分配器３０４、またはコントロール反応部３０８ａから、第２の量の反応液を回収することができる。第１の量と、第２の量とは、実質的に等しい。減少量と、検体濃度との相関があきらかにされ、この相関に基づいて、検体を定量する。

テスト分割チャネル３０６およびコントロール分割チャネル３０８は、異なる形状および断面を有していてもよい。例えば、テスト分割チャネル３０６およびコントロール分割チャネル３０８は、蛇行したチャネル、まっすぐなチャネル、環状のチャネル、湾曲したチャネルなどであってよい。一実施例では、テスト反応部３０６ａは、検体と、捕捉試薬との最大限の接触を確保する、テスト検出部３０６ｂより直径の小さい横断面を有する。別の実施例では、テスト分割チャネル３０６およびコントロール分割チャネル３０８の異なる部分が、異なる横断面を有していてもよい。例えば、テスト分割チャネル３０６およびコントロール分割チャネル３０８は、漸増する、または段階的に増加する横断面を有していてもよい。

一実施例では、テスト分割チャネル３０６およびコントロール分割チャネル２０８の固有の横断面の大きさは、２０μｍ〜２０００μｍの範囲とすることができる。特異性を高め、交差反応を抑制するために、テスト分割チャネル３０６およびコントロール分割チャネル３０８の内表面を、ウシ血清アルブミン（Bovine Serum Albumin; BSA）のような不活性タンパク質でコーティングしてもよい。阻害剤の選択は、定量する検体によって異なる。

一実施例では、反応液は、緩衝液中に浮遊している複数の微小粒子を含む。複数の微小粒子は、定量する検体と相補的な試薬でコーティングされている。一実施例では、複数の微小粒子の大きさは、０．２μｍ〜２０μｍの範囲である。実施例では、複数の微小粒子は、ラテックス、各種ポリマー、各種金属、各種セラミック、各種有機化合物、各種生体分子、およびそれらの組み合わせから作製されている。

一実施例では、複数の微小粒子を含んだ反応液を、マイクロチャネル分配器３０４に注入する。別の実施例では、複数の微小粒子は、乾燥状態で、収容部品３１０に収容されてもよい。一実施例では、収容部品３１０は、図３に示したように、第１のチャネル３０２の上流にある。しかし、収容部品３１０が下流に設けられてもよいことがわかるだろう。一実施例では、試薬でコーティングした複数の微小粒子は、試料注入口の上流に収容される。別の実施例では、試薬でコーティングした複数の微小粒子は、テスト反応部３０６ａに収容される。緩衝液または試料が、試薬でコーティングした複数の微小粒子を再び水和するまで、それらは、乾燥されて、収容される。

一実施例では、試薬でコーティングした複数の微小粒子は、マイクロチャネル分配器３０４の下流に収容される。この実施例では、複数の微小粒子を、試料で水和してもよい。複数の微小粒子を再び水和するための緩衝液は、収容部品３１０の上流に収容される。緩衝液は、２種類、すなわち、反応緩衝液および洗浄緩衝液であってよい。反応緩衝液は、洗浄緩衝液に対して下流に配置され、その結果、洗浄緩衝液は、テスト検出部３０６ｂと、コントロール検出部３０８ｂとの中に、非結合微小粒子を洗い流すことができる。緩衝液を流動させるために、スイッチング素子３１２を使用してもよい。スイッチング素子３１２は、電気式でなくてもよく、マイクロ流体デバイス３００全体にわたり圧力勾配を生成するのを補助する。圧力勾配は、正の圧力勾配であっても負の圧力勾配であってもよい。

一実施例では、テスト検出部３０６ｂおよびコントロール検出部３０８ｂの全長は、１ｍｍ〜３００ｍｍの範囲にある。テスト検出部３０６ｂと、コントロール検出部３０８ｂとは、まっすぐなチャネル、蛇行したチャネル、湾曲したチャネルなどの、いずれか１つである。テスト検出部３０６ｂと、コントロール検出部３０８ｂとは、第２の体積と減少した体積との差を決定するために付された目盛を備える。

一実施例では、マイクロ流体デバイス３００は、また、検体を含んだ試料の注入のための、第１のチャネルに接続された注入口を備える。別の実施例では、注入口は、第１のチャネル３０２に設けられている。マイクロ流体デバイス３００は、また、第１のチャネル３０２に緩衝液を送液するポンプを備えていてもよい。マイクロ流体デバイス３００は、また、ポンプを作動させるアクチュエーターを備えていてもよい。デバイスの動作は、図１〜図３を参照しつつ、さらに説明する。

図４は、マイクロ流体デバイス３００の動作例を、本主題の実施形態に従って図示している。ステップ４００は、テスト反応部３０６ａの内表面をコーティングしている捕捉試薬４０８を示している。ステップ４００は、捕捉試薬４０８を、抗体として示している。しかし、捕捉試薬４０８は、抗原であってもよいことを理解されたい。

前述のように、注入口は、マイクロ流体デバイス３００に試料を注入するために使用されてもよい。一実施例では、試料の注入に、吸収パッドを使用してもよい。テスト反応部３０６ａにおいて、試料中の検体４１０は、ステップ４０２に示したように、捕捉試薬４０８と結合する。

作動すると、緩衝液は、収容部品３１０を通って流動を開始する。反応緩衝液は、検体を結合させるために、乾燥した、試薬でコーティングした複数の微小粒子４１２を再水和する。試薬でコーティングした複数の微小粒子４１２と、緩衝液とを含む反応液は、マイクロチャネル分配器３０４を通過し、テスト分割チャネル３０６と、コントロール分割チャネル３０８とに分配される。

テスト分割チャネル３０６では、ステップ４０４に示したように、複数の微小粒子が検体と結合する。しかし、コントロール分割チャネル３０８が検体の結合を抑制するため、試薬でコーティングした複数の微小粒子は、コントロール検出部３０８ｂに吸着することなく、コントロール反応部３０８ａを通過する。テスト検出部３０６ａと、コントロール検出部３０８ｂとのいずれも洗浄される。残留反応液および未反応液は、テスト反応部３０６ａと、コントロール反応部３０８ｂとから、テスト検出部３０６ｂと、コントロール検出部３０８ｂとに回収される。ステップ４０６は、テスト検出部３０６ｂと、コントロール検出部３０８ｂとを示している。コントロール検出部３０８ｂとテスト検出部３０６ｂとの体積の差は、視覚により決定されてもよく、この差と、試料中の検体濃度との相関を求めてもよい。

＜実施例＞
ここで、本主題は、実施例を用いて説明されているが、これは本開示の作用を例示しつつ説明することを意図しており、本開示の範囲に対するなんらかの限定を示唆するために限定的に用いられることを意図するものではない。別の定義がなされない限り、本明細書で使用されるすべての技術的および科学的用語は、本開示が属する技術分野における通常の知識を有する者に一般に理解されているのと同一の意味を有する。かかる方法および条件は、当業者に容易に理解されるように、使用するプロセスおよび入力により変更し得るため、本開示は、記載した特定の方法および実験条件に限定されるものではないことを理解されたい。

（実施例１：最適化研究）
この実施例では、試料は、リン酸緩衝生理食塩水（Phosphate Buffer Saline; PBS）（ｐＨ＝７．４）を添加した、ヒト甲状腺刺激ホルモン（Thyroid Stimulating Hormone; TSH）（１ｍｇ＝７ＩＵ）を示す。別に明記されない限り、すべての実験で、濃度を約１ｍＩＵ／Ｌで一定に維持した。反応液は、抗ＴＳＨ抗体でコーティングした、ＰＢＳ中に浮遊しているカルボキシル官能化ポリスチレン微小粒子を含む。洗浄緩衝液は、ＰＢＳで希釈した、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０溶液を使用した。また、以下で使用する「シグナル」という用語は、コントロール検出部２０８ｂとテスト検出部２０８ａとの非結合微小粒子の数の差を示す。

アッセイに先立ち、テスト反応部２０６ａを捕捉抗体でコーティングし、微小粒子を抗ＴＳＨ抗体と共有結合させることにより、複数の微小粒子を調製した。ＰＢＳにヒトＴＳＨ（Sigma-Aldrich USA）ストックを適量添加することにより、試料を調製した。この試料の規定量を、注入口に加えた。シリンジポンプ（New Era Pump Systems USA, NE-1000）を介して付加した、陰圧を利用した流れを持続させた。試料は、コントロール分割チャネルおよびテスト分割チャネルを、完全に通過することができた。反応液をマイクロ流体デバイス３００に加え、管理された流量で通過させることができた。次のステップでは、洗浄緩衝液（２００〜３００μＬ）が、マイクロ流体デバイス３００を通過した。非結合ビーズの数と、検体濃度との相関を求めるために、複数の微小粒子を、コントロール検出部およびテスト検出部から、１．５ｍＬのマイクロ遠心チューブに回収した。

（実施例１．１：試料流量の最適化）
本実施例では、試料流量の最適化を実施した。以下のパラメーターを一定に維持した。
試料体積：５０μＬ
試料濃度：１ｍＩＵ／Ｌ
反応液流量：７５μＬ／分
マイクロ流体デバイス３００に注入された微小粒子の当初の数：１３．８７×１０^７
流量範囲をテストした。２５μＬ／分を下限として設定した。これにより、アッセイのステップが８〜１０分の実用限界内に保たれるためである。７５μＬ／分、および１５０μＬ／分の流量の値も評価した。重複した結果を評価した。

機械加工のプロセスとシステムの欠陥とによるチャネルの形状寸法に基づいて、流量は、２１〜２８μＬ／分の間で変化することがわかった。アッセイのための基準と見なした、コントロール分割チャネルのマイクロチャネルの結果は、非結合微小粒子の数の平均が１２．１７×１０^７であることを示した。予想通り、全般的な傾向として、図５に示したように、試料流量が増加するごとに非結合微小粒子の増加が観察された。本研究の間、より速い流量から遅い流量へと移行すると、４０％程度の変化が見られた。

微小粒子の最大結合は２５μＬ／分で観察され、４．１１×１０^７であった。１５〜２０分の実用的な、または目標とする制限時間内にアッセイを保つ限り、２５μＬ／分が最適な流量であると結論付けた。

（実施例１．２：反応液の流量の最適化）
本実施例では、反応液の流量の最適化を実施した。以下のパラメーターを一定に維持した。
試料体積：５０μＬ
試料濃度：１ｍＩＵ／Ｌ
試料流量：７５μＬ／分
注入された当初の微小粒子の数：１２．３７×１０^７

アッセイのステップを８〜１０分の実用限界内に保つため、２５μＬ／分を下限として設定した。７５μＬ／分および１５０μＬ／分の流量値も評価した。アッセイのための基準と見なした、コントロールマイクロチャネルの結果は、図６に示したように、異なる流量での非結合微小粒子の数の平均が１０．４×１０^７であることを示した。

全般的な傾向として、非結合微小粒子の増加は、予想されるように、試薬流量が増加するごとに観察された。１５０μＬ／分から７５μＬ／分に移行すると、３０％程度の変化が見られ、２５μＬ／分に移行すると、２０％の変化に減少した。２５μＬ／分で観察された微小粒子の最大結合は、２．２×１０^７であった。１５〜２０分の実用的な、または目標とする制限時間内にアッセイを保つ限り、２５μＬ／分が最適な流量であると考えることができる。

（実施例１．３：試料体積の最適化）
本実施例では、試料体積の最適化を実施した。以下のパラメーターを一定に維持した。
試料濃度：１ｍＩＵ／Ｌ
試料流量：２５μＬ／分
反応液流量：２５μＬ／分
注入された当初の微小粒子の数：１８．６９×１０^７

１０μＬを、使用する最小量とした。使用したチャンバの目盛ではこの小さな体積を管理することが困難であるとわかり、そのために、ＰＢＳを用いて３０μＬに希釈した。１滴の血液が２５μＬにおよそ等しいため、２５μＬを研究のための体積と考えた。５０μＬを最大量とした。この範囲外の体積では、指穿刺採血による測定または抽出が困難であるためである。

アッセイのための基準と見なした、コントロールマイクロチャネルの結果は、図７に示したように、非結合微小粒子の数の平均が１６．８７×１０^７であることを示した。全般的な傾向として、非結合微小粒子の減少は、予想通り、試料体積が増加するごとに観察された。この変化は、使用した試料の体積に比例した。例えば、体積を２５μＬから５０μＬに増加させると、微小球の数の変化は倍増した。

５０μＬの体積において観察された微小粒子の最大結合は、３．４７×１０^７であった。シグナルが単位濃度当たり最大であることから、５０μＬを、最適な体積であると考えた。

（実施例１．４：標準曲線）
標準曲線を作成するために、以下のパラメーターを一定に維持した。
試料体積：５０μＬ
試料流量：２５μＬ／分
反応液流量：２５μＬ／分
最初に注入した微小粒子の数：６．５×１０^８
反応液の濃度と体積：６〜６．５％，１６０μＬ
図８は、濃度１ｍＩＵ／Ｌの試料につき、約７ｍｍの変化があることを示している。

全般的な傾向として、非結合微小粒子の減少は、予想通り、試料濃度が増加するごとに観察された。尤も、変化の程度は、濃度が１単位変化した直後に、有意に減少した。

このような観察結果となったのは、微小粒子が、設計された反応室にあるすべての結合部位を飽和させるためである。利用できる部位の数が減少するにつれて非結合微小粒子の結合確率も低下し、それゆえに、シグナル強度が低下する。変化度は、それぞれのステップ後に利用できる部位の数に依存する。この限界を克服するためには、マイクロ流体デバイス３００における、利用可能な表面積を増加させなければならない。

本研究を通じて、種々のパラメーターが最適化された。すなわち、以下の通りである。
反応液流量：２５μＬ／分
試料流量：２５μＬ／分
試料体積：５０μＬ
反応液濃度：５〜７％
ただし、結果が同等であったことから、別の濃度も使用可能である。１ｍＩＵ／Ｌの試料のためのシグナルが７ｍｍであるとして、標準曲線をプロットした。この際、試料濃度の増加に伴ってシグナル強度が低下した。

対象とされるアッセイデバイスに対する実用的な制限の下、この範囲を維持した。両ステップのための制限時間はそれぞれ８〜１０分であり、総アッセイ時間は２０分未満である。さらに、同様の条件および試料濃度が、異なる結合変化をもたらす場合があるのが見られた。これは、使用する抗原のそれぞれの凍結融解周期によるものであり、それが抗原の活性に影響を及ぼす。

（実施例１．５：残留反応液の体積と、複数の微小粒子の数の差との相関）
この実施例では、試薬でコーティングした微小粒子の当初の数と、非結合微小粒子の数との差と、テスト検出部およびコントロール検出部の体積の差との相関を調べた。

表１からわかるように、この実験においては、微小粒子の数の差は、体積の変化に比例する。結果は、最も近似する整数値に切り上げた。差は、主として、オペレーターのミスや、異なるチャネルにおける各種製造公差および各種欠陥により発生する。チャネルの横断面積は、約３．２×１０^−２ｍｍ^２であった。
（表１：残留反応液の体積と、複数の微小粒子の数の差との相関）

本主題を、その実施例および実施形態に関して、相当詳細に説明してきたが、他の実施形態もありうる。したがって、本主題の範囲は、そこに掲載されている好ましい実施例および実施形態の説明に限定されるものではない。

Claims (19)

1. 試料中の検体（４１０）を定量するための方法であって、
   前記試料を、テスト反応部（３０６ａ）を備えた少なくとも１つのテスト分割チャネル（３０６）に注入するステップであって、前記試料中の前記検体（４１０）は、前記テスト反応部（３０６ａ）において供給される捕捉試薬（４０８）と結合することとなるステップと、
   前記捕捉試薬（４０８）と結合した前記検体（４１０）を、反応液と接触させるステップであって、前記反応液は、前記検体と結合させるための、試薬でコーティングした複数の微小粒子（４１２）を含んであるステップと、
   非結合微小粒子を含んだ残留反応液を回収するステップと、
   前記検体（４１０）を定量するために、前記残留反応液を分析するステップと、
   を備えている
   方法。
2. 前記分析するステップが、
   試薬でコーティングした微小粒子の当初の数と、非結合微小粒子の数との差を決定するステップと、
   前記差と、前記検体（４１０）の濃度との相関を求めるステップと、
   前記相関を求めるステップに基づいて、前記検体を定量するステップと、
   を備える、請求項１に記載の方法。
3. 少なくとも１つのコントロール分割チャネル（３０８）に、前記試料を注入するステップと、
   前記少なくとも１つのテスト分割チャネル（３０６）と、前記少なくとも１つのコントロール分割チャネル（３０８）とから、洗浄により前記試料を除去するステップと、
   前記少なくとも１つのテスト分割チャネル（３０６）と、前記少なくとも１つのコントロール分割チャネル（３０８）とに、前記反応液を注入するステップと、
   前記少なくとも１つのテスト分割チャネル３０６のテスト検出部（３０６ｂ）と、前記少なくとも１つのコントロール分割チャネル（３０８）のコントロール検出部（３０８ｂ）とによって、残留反応液を回収するステップと、
   前記テスト検出部（３０６ｂ）と、前記コントロール検出部（３０８ｂ）との体積の差を決定するステップと、
   試薬でコーティングした微小粒子の当初の数と、試薬でコーティングした非結合微小粒子の数との差と、前記体積の差との相関を求めるステップと、
   を備える、請求項１に記載の方法。
4. 第１のチャネル（３０２）の注入口に、前記試料を注入するステップと、
   前記第１のチャネル（３０２）から、前記少なくとも１つのテスト分割チャネル（３０６）と、前記少なくとも１つのコントロール分割チャネルとに、前記試料を分配するステップと、
   前記検体（４１０）を、前記反応部において、供給される前記捕捉試薬（４０８）と結合させるステップと、
   を備える、請求項３に記載の方法。
5. 前記反応液を注入するステップが、
   第１のチャネル（３０２）の注入口に、前記反応液を注入するステップと、
   前記少なくとも１つのテスト分割チャネル（３０６）と、前記少なくとも１つのコントロール分割チャネル（３０８）とに、前記反応液を分配するステップと、
   前記試薬でコーティングした複数の微小粒子（４１２）を、前記検体（４１０）と結合させるステップと、
   を備える、請求項３に記載の方法。
6. 前記検体（４１０）は、抗原および抗体のいずれか１つである、請求項１に記載の方法。
7. 前記試薬は、抗原および抗体のいずれか１つである、請求項１に記載の方法。
8. 前記検体および前記試薬は、タンパク質、タンパク質断片、各種細胞、各種核酸、各種殺菌作用物、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
9. 前記接触させるステップが、前記試薬でコーティングした複数の微小粒子（４１２）を緩衝液で水和するステップを備え、前記試薬でコーティングした複数の微小粒子（４１２）は、前記注入口の上流に収容されている、請求項１に記載の方法。
10. 前記接触させるステップが、前記試薬でコーティングした複数の微小粒子（４１２）を前記試料で水和するステップを備え、前記試薬でコーティングした複数の微小粒子（４１２）は、テスト反応部（３０６ｂ）、コントロール反応部（３０８ｂ）、およびそれらの組み合わせに収容されている、請求項１に記載の方法。
11. 試料中の検体を定量するための方法であって、
    前記検体（４１０）と、検体でコーティングした微小粒子とを含む試料を、テスト反応部（３０６ａ）を備えた少なくとも１つのテスト分割チャネル（３０６）に注入するステップであって、前記検体（４１０）と、前記検体でコーティングした微小粒子とは、前記テスト反応部（３０６ａ）において、供給される捕捉試薬と競合的に結合するステップと、
    遊離検体と、検体でコーティングした非結合微小粒子とを含む、残留反応液を回収するステップと、
    検体でコーティングした微小粒子の当初の数と、検体でコーティングした非結合微小粒子の数との差を決定するステップと、
    前記差と、前記検体の濃度との相関を求めるステップと、
    前記相関を求めるステップに基づいて、前記検体を定量するステップと、
    を備えている前記試料を注入するステップにおいて、方法。
12. 検体の定量化のためのマイクロ流体デバイス（３００）であって、
    第１のチャネル（３０２）と、
    マイクロチャネル分配器（３０４）であって、その第１の終端が前記第１のチャネル（３０２）に接続されているとともに、その第２の終端が複数の分割チャネルに接続されており、前記複数の分割チャネルのそれぞれに、試薬でコーティングした複数の微小粒子を含んだ反応液を分配するマイクロチャネル分配器（３０４）と、を備え、
    前記複数の分割チャネルは、前記反応液の第１の量を回収するためのテスト分割チャネル（３０６）を備え、
    前記テスト分割チャネル（３０６）は、前記試薬でコーティングした複数の微小粒子（４１２）と結合し、前記検体（４１０）の存在下で前記第１の量を減少させるテスト反応部（３０６ａ）を有し、
    前記第１の量の前記減少が、前記検体（４１０）の濃度の定量に用いられる、
    マイクロ流体デバイス（３００）。
13. 前記テスト分割チャネル（３０６）が、前記反応液の減少量を回収するテスト検出部（３０６ｂ）を備える、請求項１２に記載のマイクロ流体デバイス（３００）。
14. 前記複数の分割チャネルは前記試薬の第２の量を回収するコントロール分割チャネル（３０８）を備え、前記コントロール分割チャネル（３０８）は少なくともコントロール検出部（３０８ｂ）を備え、前記コントロール検出部（３０８ｂ）は前記試薬の前記第２の量を回収し、前記第１の量は前記第２の量と実質的に等しく、前記減少量と前記検体濃度との相関が求められ、前記相関に基づいて前記検体を定量する、請求項１２に記載のマイクロ流体デバイス（３００）。
15. 前記反応液が、前記検体と相補的な複数の捕捉試薬がコーティングされている、試薬でコーティングされた複数の微小粒子（４１２）を含み、前記微小粒子の大きさが、直径０．２μｍ〜２０μｍの範囲にあり、前記試薬でコーティングした複数の微小粒子（４１２）は、ラテックス、各種ポリマー、各種金属、各種セラミック、各種有機化合物、各種生体分子、およびそれらの組み合わせから作製される、請求項１２に記載のマイクロ流体デバイス（３００）。
16. 前記テスト検出部（３０６ｂ）および前記コントロール検出部（３０８ｂ）の長さが１ｍｍ〜３００ｍｍの範囲にあり、前記テスト検出部（３０６ｂ）と、前記コントロール検出部（３０８ｂ）とが、前記第２の量と前記減少量との差を決定するために付された目盛を備える、請求項１２に記載のマイクロ流体デバイス（３００）。
17. 前記試薬でコーティングした複数の微小粒子（４１２）と、洗浄緩衝液と、反応緩衝液とを収容する収容部品（３１０）を備える、請求項１２に記載のマイクロ流体デバイス（３００）。
18. 前記試薬をコーティングした複数の微小粒子（４１２）は、前記テスト反応部（３０６ａ）に乾燥状態で収容される、請求項１２に記載のマイクロ流体デバイス（３００）。
19. 前記検体を含んだ試料を注入するための、前記第１のチャネルに接続された注入口と、
    前記第１のチャネルに緩衝液を送液するポンプと、
    前記ポンプを作動させるアクチュエーターと、
    を備える、請求項７に記載のマイクロ流体デバイス（３００）。