CN112955541A - 由多能干细胞制作肠细胞的方法 - Google Patents
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Abstract
作为制作显示与实际的肠细胞接近的功能的多能干细胞来源的肠细胞的方法，提供肠细胞的制作方法，其中，使用以包含GSK3抑制剂、和选自肝细胞生长因子受体的激活剂、肾上腺皮质激素、钙三醇、和二甲基亚砜中的至少1种为特征的肠细胞分化用培养基。
Description
技术领域
本发明涉及肠细胞分化用培养基、由多能干细胞制作肠细胞的方法、和通过该方法制作的肠细胞。
背景技术
肠是对于营养素、水和药物的吸收重要的组织，药物的吸收和代谢决定药物的生物学利用率，因此对于药物开发也是重要的。为了药物开发，人结肠癌细胞株Caco-2作为用于试验吸收和代谢功能的肠上皮的模型被广泛使用。然而，大肠来源的Caco-2细胞代谢酶的活性低、而且其代谢酶的活性与小肠的不类似(Hubatsch et al.(2007).Nat.Protoc.2,2111-2119；Sun et al.(2002).Pharm.Res.19,4-6)。进而，Caco-2细胞在细胞株间存在特性的差异。因此，需要确立与人小肠类似、在药物试验中能够替换Caco-2细胞的人体外(invitro)模型。
人胚胎干细胞(hESCs)和人诱导多能干细胞(hiPSCs)(Takahashi et al.(2007).Cell 131,861-72)具有分化成所有源自三个胚层的细胞、通过暴露于合适的生长因子而分化成特定细胞的能力。最近的研究显示，胚胎干细胞(ES)、诱导多能干细胞(iPS)分化成胚胎内胚层、由其诱导的器官例如胰脏、肝脏、肠。
在肠道上皮，由肠干细胞(ISC)生成吸收性的细胞、分泌细胞(例如，杯状细胞、肠内分泌细胞、Paneth细胞)这样的分化的细胞(Nakamura et al.(2007).J.Gastroenterol.42,705-10；Sato,T.and Clevers,H.(2013).Science 340,190-194)。通过突变小鼠的研究搞清楚了，Wnt/β-联蛋白和Notch信号转导这样的参与肠干细胞的增殖以及分化的维持和调节的多个基因和因子(Buczacki et al.(2013).Nature 495,65-9；Chiba,(2006).Stem Cells 24,2437-47；Fre et al.(2005).Nature 435,964-8；Fre etal.(2009).Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.106,6309-14；Gerbe et al.(2011).J.CellBiol.192,767-80；Gregorieff et al.,(2015).Nature)。ISC表达LGR5(Barker et al.(2007).Nature 449,1003-7)。LGR5是在结合R-spondin 1时介导Wnt/β-联蛋白信号转导的Wnt信号转导受体。组织培养中通过维持ISC的因子的筛选，将表皮生长因子(EGF)、头蛋白(Noggin)和R-spondin 1定义为在培养中维持ISC的微环境(niche)因子(Sato et al.(2009).Nature 459,262-5)。已知细胞外基质对于ISC的维持是重要的，所以使用基质胶(matrigel)，为了支持ISC的增殖而补充增殖因子。然后，根据分子化合物筛选，通过补充作为微环境(niche)因子的Wnt3a、EGF、头蛋白(Noggin)、R-spondin 1、烟酰胺、A83-01(也称为TGF-βI型受体激酶的抑制剂、激活素样激酶5(ALK5))，从而确立了由成人人小肠原代细胞或结肠上皮组织的长期类器官培养法(Sato et al.(2011)Gastroenterology 141,1762-1772)。
已知利用ISC的类器官培养系统，通过激活素使hiPSC分化成胚胎内胚层后，用补充了高浓度的FGF和Wnt的基质胶(matrigel)培养，从而分化成肠细胞(Spence et al.(2011).Nature 470,105-9)。但是，这些hiPSC来源的细胞由于表达Lgr5的细胞数少，因而被认为是未成熟的细胞。报告了将这些iPSC来源肠细胞长期培养，移植到小鼠肾小囊下，从而进一步成熟，在移植6周后生成了分化的细胞(Watson et al.(2014).Nat.Med.20)。
类器官培养是3维培养系统。另一方面，也研究了2维单层培养中的肠上皮细胞的诱导的尝试。以前报告了FGF4和Wnt3A使内胚层分化成CDX2阳性肠细胞(Ameri et al.(2010).Stem Cells 28,45-56；Hansson et al.,(2009).Dev.Biol.330,286-304)。本发明者的课题组报告了由小鼠和人胚胎干(ES)细胞分化肠上皮的2维培养。在胚胎内胚层分化之后，作为糖原合酶激酶(GSK)-3β抑制剂的6-溴靛玉红-3’-肟(BIO)和作为γ-分泌酶抑制剂的DAPT协同地诱导表达CDX2的后期胚胎内胚层细胞。该胚胎内胚层细胞然后分化成4种成熟的肠细胞，即，肠细胞、杯状细胞、肠内分泌细胞和Paneth细胞(Ogaki et al.(2013).Stem Cells 31,1086-96)。通过16天的分化迅速方案(Ogaki et al.(2015)Sci.Rep.5,17297)，得到了肠的成熟细胞。
以前报告了使用模拟类器官培养系统的几个低分子化合物由人iPSC分化肠细胞样细胞，人iPSC向肠细胞的分化被促进。该肠细胞样细胞显示与成人的肠相当的PEPT1或BCRP的表达(Iwao et al.,(2015).Drug Metab.Dispos.43,603-610；Kodama et al.(2016).Drug Metab.Dispos.44)。在hiPSC来源肠细胞中，对于由PEPT1或BCRP介导的主动转运活性，分别通过作它们的底物的甘氨酰肌氨酸或Hoechst 33342的摄入来评价，分别确认由作为特异性抑制剂的布洛芬或Ko-143产生的特异性。最近搞清楚了，通过对BIO和DAPT的暴露而生成的hiPSC来源肠细胞，表达几个主要的转运体、CYP3A4及其转录控制因子(非专利文献1和2)。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献1:Ozawa,T.et al.(2015).Sci.Rep.,5:16479
非专利文献2:Negoro,R.et al.(2016).Res.Commun.472,631-6
发明内容
发明要解决的课题
为了进行药代动力学研究，需要能够同时评价药物吸收和药物代谢的肠的模型细胞。到目前为止，作为这样的模型细胞，一直使用Caco-2细胞，但存在代谢酶的表达不充分这样的问题。另外，也考虑过以人原代培养小肠上皮细胞作为模型细胞，但从获得和培养的困难性考虑是不现实的。本发明的目的是在这样的背景下，提供由多能干细胞制作显示与实际的肠细胞接近的功能的肠细胞的手段。
用于解决课题的手段
本发明者为了解决上述课题而反复深入研究，结果发现，通过在使多能干细胞分化成肠细胞的培养方法中，将其后期阶段的培养在Collagen Vitrigel(注册商标)膜(CVM)上进行，能获得显示高的成熟度、与实际的肠细胞接近肠细胞。另外，本发明者还发现，通过将肠细胞的成熟阶段(例如，从分化开始第15天以后)的培养在包含BIO、HGF、地塞米松、和钙三醇的培养基、或包含BIO、二甲基亚砜、地塞米松、和钙三醇的培养基中进行，能获得高的成熟度的肠细胞。本发明是基于以上见解完成的。
即，本发明提供以下〔1〕～〔10〕。
〔1〕肠细胞分化用培养基，其特征在于，包含GSK3抑制剂、和选自肝细胞生长因子受体的激活剂、肾上腺皮质激素、钙三醇和二甲基亚砜中的至少1种。
〔2〕根据〔1〕所述的肠细胞分化用培养基，其特征在于，GSK3抑制剂是BIO。
〔3〕根据〔1〕或〔2〕所述的肠细胞分化用培养基，其特征在于，肝细胞生长因子受体的激活剂是HGF。
〔4〕根据〔1〕～〔3〕的任一项所述的肠细胞分化用培养基，其特征在于，肾上腺皮质激素是地塞米松。
〔5〕肠细胞的制作方法，其特征在于，包括以下工序(1)～(3)：
工序(1)，将多能干细胞在包含激活素受体样激酶-4,7的激活剂的培养基中培养的工序，
工序(2)，将工序(1)中得到的细胞在包含GSK3抑制剂和γ-分泌酶抑制剂的培养基中培养的工序，
工序(3)，将工序(2)中得到的细胞在〔1〕～〔4〕的任一项所述的肠细胞分化用培养基中、在高密度胶原蛋白凝胶膜上培养，得到肠细胞的工序。
〔6〕根据〔5〕所述的肠细胞的制作方法，其特征在于，在工序(2)中，将工序(1)中得到的细胞在高密度胶原蛋白凝胶膜上培养。
〔7〕根据〔5〕或〔6〕所述的肠细胞的制作方法，其特征在于，在工序(1)中，将多能干细胞在M15细胞上培养。
〔8〕根据〔5〕～〔7〕的任一项所述的肠细胞的制作方法，其特征在于，在工序(1)中，激活素受体样激酶-4,7的激活剂是激活素A。
〔9〕根据〔5〕～〔8〕的任一项所述的肠细胞的制作方法，其特征在于，在工序(2)中，GSK3抑制剂是BIO，γ-分泌酶抑制剂是DAPT。
〔10〕通过〔5〕～〔9〕的任一项所述的方法而制作的肠细胞。
本说明书包含作为本申请的优先权基础的日本专利申请(日本特愿2018-168957和日本特愿2019-117748)的说明书和/或附图中记载的内容。
发明的效果
本发明提供成熟度高的肠细胞、以及用于制作该肠细胞的培养基和方法。这样的成熟度的高的肠细胞能够作为用于药代动力学研究的模型细胞利用。
附图说明
图1：Collagen Vitrigel支持向人iPSC的肠细胞的分化。ChiPS18或RPChiPS771人iPS细胞分化成以膜形成和CVM细胞培养插件(以下简称为CVM插件)的肠标志物表达为特征的肠细胞。(A)用于诱导向肠细胞的分化的hiPSC的分化步骤的示意图。将hiPSC在M15饲养细胞上使用M1培养基培养到第3天(D3)，然后将胚胎内胚层(DE)进一步在第3天至第10天(D10)或第15天(D15)使用M2培养基使继续培养，从而进行向肠前体细胞的分化。使第3天(D3)的DE、第10天(D10)或第15天(D15)的肠前体细胞解离并冷冻，命名为D3(a)、D10(b)或D15(c)原种。使用时，将低温保存的细胞原种冻融，在CVM上铺板，继续分化。在CVM上培养，将培养基在第3天切换成M2，培养到第15天，进而在第15天切换成M3培养基，培养到第20天或第40天。(B)第4天(Day 4)的内胚层标志物SOX17(红色)、和第10天(Day 10)的肠标志物CDX2(绿色)的表达。DAPI(蓝色)显示核计数染色。(C)Caco-2细胞(左)、或来自第3天、第10天或者第15天的原种的iPSC来源肠(右)的TEER(经上皮电阻)值随着天数增加，在特定天的培养之后达到平台。(D)iPSC来源肠细胞的ZO1(绿色)表达(图中day 30指第30天)。(E)观察到VILLIN(红色)表达局部存在于hiPSC-肠细胞的顶端侧(图中day 30指第30天)。将I(绿色的线)与II(红色的线)的面中的、沿Z轴方向扫描而得的图像的Z-Stack(Z协议栈)表示在盒形区域中显示的剖面上。
图2：hiPSC来源肠细胞中的转运体和P450酶的时间依赖性表达。人iPSC分化，显示肠的标志物、转运体、和CYP酶的表达这样的肠细胞的特征。(A)将hiPSC向第3天的DE分化，接着在CVM上重复铺板，培养到第40天的分化步骤的示意图。(B)CDX2(肠前体细胞标志物)、VILLIN1(肠细胞标志物)、和LGR5(肠干细胞标志物)的时间依赖性表达。LGR5在初期暂时地上调，但在观察到CDX2和VILLIN1表达的增加的分化的后期下调。(C)ABCB1、ABCG2和SLC15A1的转运体表达从分化的第10天或第15天开始上调，其水平与成人的肠的水平(＝1)相当。(D)CYP2C9、CYP2C19和CYP3A4从第20天开始上调。
图3：肠前体细胞在CVM插件上分化成成熟肠细胞。(A)实验设计的示意图。将第3天(D3)、第10天(D10)和第15天(D15)的hiPSC来源冷冻保存细胞原种在CVM插件上铺板，培养到第35天或第40天。(B)第10天或第15天的原种分化，以高于由第3天DE冷冻保存细胞原种产生的肠细胞株的水平表达CDX2和VILLIN。LGR5的表达在全部样品中都低。(C)全部冷冻保存的细胞原种产生表达ABCB1、ABCG2和SLC15A1的分化细胞。(D)第10天或第15天的冷冻保存的细胞原种产生以高于由第3天DE冷冻保存细胞原种产生的肠细胞的水平表达CYP2C9或CYP2C19的肠细胞。全部冷冻保存的细胞原种产生表达CYP3A4的肠细胞。由第10天的细胞原种产生的肠细胞的CYP3A4表达水平与由第3天的细胞原产生的肠细胞的CYP3A4表达水平是同样的，但由第15天的细胞原种产生的肠细胞的CYP3A4表达水平低于由第3天的细胞原种产生的肠细胞的CYP3A4表达水平。数据作为平均±SEM表示。N＝3。对于第3天的冷冻保存细胞原种来源的肠细胞与第10天的冷冻保存细胞原种来源的肠细胞之间的差异、或第3天的冷冻保存细胞原种来源的肠细胞与第15天的冷冻保存细胞原种来源的肠细胞之间的差异，通过学生t检验进行分析。显著性作为*P<0.05或**P<0.01显示。
图4：hiPSC来源的肠细显示高于Caco-2细胞的转运体表达或CYP酶表达。(A)实验设计的示意图。使用Caco-2细胞作为对照。使RPChiPS771或ChiPS18 hiPSC的第3天的DE冷冻保存细胞原种分化至21天，将分子标志物的表达水平与Caco-2细胞的表达水平进行比较。(B)hiPSC来源的肠细胞与Caco-2的水平相比，以高的水平表达CDX2和VILLIN，但LGR5的表达水平低。(C)hiPSC来源的肠细胞以与Caco-2细胞的水平比较高的水平表达ABCB1、ABCG2和SLC15A1。(D)hiPSC来源的肠细胞表达CYP2C9、CYP2C19和CYP3A4。CYP3A4在Caco-2细胞中不表达。对于RPChiPS771和ChiPS18 hiPSC来源的肠细胞之间的差异，通过学生t检验进行分析。显著性作为*P<0.05或**P<0.01显示。
图5：hiPSC来源的肠细胞显示外排性转运体功能。使用人iPSC来源肠细胞调查外排性转运体(P-gp、BCRP)的活性。(A)对于P-gp和BCRP的转运活性，使用它们的底物和抑制剂进行试验。(左侧面板)维拉帕米(P-gp抑制剂)不存在下或存在下的地高辛(P-gp选择性底物)的方向性跨细胞转运(从B向A的转运和从A向B的转运)。(中央面板)Elacridar(P-gp和BCRP双重抑制剂)不存在下或存在下的哌唑嗪(BCRP和P-gp底物)的方向性跨细胞转运(从B向A的转运和从A向B的转运)。(右侧面板)实验的示意图。通过在上部或下部室中添加底物来试验底物的方向性转运，在最初的药物应用的相反侧测定药物浓度。接着，评价穿过细胞单层的底物的吸收性(从A向B)或分泌性(从B向A)转运。(B)调查穿过细胞单层的普萘洛尔的转运。普萘洛尔不使用主动转运系统，主要介由细胞内途径被转运。(C)调查甘露糖醇的转运。甘露糖醇介由细胞旁途径被转运。
图6：在代替分化方案下生成的hiPSC来源肠细胞。(A)用于使hiPS RPChiPS771分化成肠细胞的实验步骤的示意图。将在M15上分化后的RPChiPS771细胞来源的第3天DE冷冻保存细胞冻融，在Collagen Vitrigel膜(CVM)上铺板，在M2中培养至第15天，接下来交换成M3-1或M3-2(a)。或者，在iMatrix包覆板上将第3天的DE冷冻保存细胞培养至第10天，从而制备第10天的肠前体原种，接下来制备第10天的冷冻保存细胞原种。使用时，将D10冷冻保存细胞原种冻融，然后在CVM上铺板，然后在M2培养基中培养。在第15天将培养基交换成M3-1或M3-2，继续培养至第21～30天。(B)从第15天开始，在M3-1或M3-2中培养的iPSC来源肠的TEER(经上皮电阻)值随着天数增加，在特定天数期间的培养之后达到平台。肠是从第3天(左)或第10天(右)的冷冻保存细胞原种分化的。
图7：hiPSC来源肠细胞中的分化标志物、转运体和P450酶的时间依赖性表达。人iPSC分化，显示肠标志物、以及肠细胞所特有的转运体和CYP酶的表达。(A)hiPSC的分化步骤的示意图。使用了RPChiPS771细胞。使用了第3天的DE冷冻保存细胞原种。将第3天的DE冻融，在Collagen Vitrigel膜(CVM)上铺板，然后在M2培养基中培养到第15天，接下来交换成M3-2培养基，培养到第30天。(B)CDX2(肠标志物)、VILLIN1(肠细胞标志物)、和LGR5(肠干细胞标志物)的时间依赖性表达。LGR5在初期暂时地上调，但在CDX2和VILLIN1表达增加的分化的后期下调。(C)ABCB1、ABCG2和SLC15A1的表达从分化的第10天或第15天开始上调，其水平与成人的肠的水平相当(＝1)。(D)CYP2C9、CYP2C19和CYP3A4的表达从第15天开始上调。
图8：冷冻保存的第3天内胚层或第10天肠前体细胞在CVM插件上分化成成熟肠细胞。(A)实验计划的示意图。使用第3天(D3)DE或第10天肠前体细胞的冷冻保存细胞原种。将冷冻保存的细胞冻融，在Collagen Vitrigel膜(CVM)上铺板，在M2中培养到分化第15天。然后，将培养基交换成M3-1或M3-2。将细胞在CVM插件上培养到第30天。(B、C)调查第21天(B)或第30天(C)的分化标志物、转运体和代谢酶的表达。(B、C)第3天的DE冷冻保存细胞分化，产生表达CDX2和VILLIN、ABCB1、ABCG2或者SLC15A1转运体、或代谢酶CYP2C9、CYP2C19或者CYP3A4的细胞。所调查的标志物的表达水平在培养基M3-1和M3-2中中培养的细胞之间不同。冷冻保存的第10天的肠前体细胞原种也分化成另外表达分化标志物的细胞。LGR5表达在全部样品中都低。数据作为平均±SEM表示。N＝3。
图9：冷冻保存的第3天的内胚层细胞或第10天的肠前体细胞分化成显示高于Caco2细胞的转运体表达或CYP酶表达的成熟肠细胞。(A)实验计划的示意图。使用Caco2细胞作为对照。使RPChiPS771的第3天的冷冻保存细胞原种分化到第21天，将分子标志物的表达水平与Caco2细胞的表达水平进行比较。(B)Caco2细胞显示随着天数增加的TEER，其值在第12天为约60Ωcm2，达到平台。(C)hiPSC来源肠细胞与Caco2的水平相比，表达更高的水平的CDX2和VILLIN，另一方面，表达更低的水平的LGR5。(D)hiPSC来源肠细胞表达ABCB1、ABCG2和SLC15A1。表达水平与Caco2细胞的水平相比没有大变化。(E)hiPSC来源肠细胞以与Caco2同样的水平表达CYP2C9、CYP2C19。CYP3A4的表达在hiPSC来源肠细胞中可见，在Caco2细胞中不表达。
图10：hiPSC来源肠细胞显示外排性转运体的功能。第26天的罗丹明123通量分析表明，将作为特异性底物的罗丹明123从基底方向向顶端方向转运时的P-gp转运体活性在hiPS来源细胞中有活性。(A)使用M3-1代替M3培养基使人RPChiPS771 iPSC来源肠细胞分化。使用了冷冻保存的第3天DE细胞原种(左侧面板)或第10天肠细胞原种(右侧面板)。罗丹明123(P-gp选择性底物)的指向性跨细胞转运(A到B和B到A)在分化的第21天(上面板)或第30天(下面板)被观察到。(B)使用M3-2代替M3培养基使人RPChiPS771 iPSC来源肠细胞分化。罗丹明123的指向性跨细胞转运在第26天被观察到。渗透率的值在各柱状图下的表中显示。
图11：第23～25天中的M3-2培养基中的培养诱导CYP3A4的表达。在第23～25天在M3-2培养基中培养的肠细胞，与在第15～25天在M3-2培养基中培养的肠细胞显示同等水平的CYP3A4表达。
图12：钙三醇在CYP3A4的表达诱导中发挥重要的作用。在除去了钙三醇的培养基中培养的肠细胞基本不表达CYP3A4。
具体实施方式
以下，详细地说明本发明。
(A)肠细胞分化用培养基
本发明的肠细胞分化用培养基以包含GSK3抑制剂、和选自肝细胞生长因子受体的激活剂、肾上腺皮质激素、钙三醇、和二甲基亚砜中的至少1种作为特征。
本发明中，“肠细胞分化用培养基”是用于使未分化成肠细胞的细胞分化成肠细胞的培养基。“未分化成肠细胞的细胞”为例如，后述的本发明的肠细胞的制作方法中的工序(2)中得到的细胞，更具体为肠前体细胞。
作为本发明的肠细胞分化用培养基所包含的培养基成分，可以列举GSK3抑制剂、肝细胞生长因子受体的激活剂、肾上腺皮质激素、钙三醇、二甲基亚砜。其中，GSK3抑制剂为必须成分，但对于肝细胞生长因子受体的激活剂、肾上腺皮质激素、钙三醇、和二甲基亚砜，只要选自它们之后的至少1种在培养基中包含即可。另外，肝细胞生长因子受体的激活剂和二甲基亚砜通常只要任意一方在培养基中包含即可。进而，在诱导CYP3A4的表达时，优选培养基中包含钙三醇。作为优选的培养基成分的组合，可列举GSK3抑制剂与肾上腺皮质激素与钙三醇与二甲基亚砜的组合、GSK3抑制剂与肾上腺皮质激素与钙三醇与肝细胞生长因子受体的激活剂的组合等。
GSK3抑制剂从具有GSK3α抑制活性的物质、具有GSK3β抑制活性的物质、和同时具有GSK3α抑制活性和GSK3β抑制活性的物质中选择。作为GSK3抑制剂，优选具有GSK3β抑制活性的物质或同时具有GSK3α抑制活性和GSK3β抑制活性的物质。作为上述GSK3抑制剂，具体可例示CHIR98014、CHIR99021、肯保隆(Kenpaullone)、AR-AO144-18、TDZD-8、SB216763、BIO、TWS-119和SB415286等。这些可以作为市售品购买。另外，在不能作为市售品获得的情况下，只要是本领域技术人员就也能够按照已知文献制备。另外，针对GSK3的mRNA的反义寡核苷酸、siRNA等也可以作为GSK3抑制剂使用。这些均可以商业获得，或者可以按照已知文献合成。所使用的GSK3抑制剂优选为BIO。培养基中的GSK3抑制剂的浓度可以根据所使用的GSK3抑制剂的种类适当设定，但在作为GSK3抑制剂使用BIO时的浓度优选为0.1～5μM，更优选为0.5～3μM。
肝细胞生长因子受体的激活剂只要能够激活肝细胞生长因子受体就不特别限定，例如，可列举HGF。培养基中的肝细胞生长因子受体的激活剂的浓度可以根据所使用的肝细胞生长因子受体的激活剂的种类适当设定，作为肝细胞生长因子受体的激活剂使用HGF时的浓度优选为1～50ng/mL，更优选为5～30ng/mL。
肾上腺皮质激素可以是化学合成的，也可以是天然的。作为肾上腺皮质激素的具体例，可列举地塞米松、氢化可的松等。优选的肾上腺皮质激素是地塞米松。培养基中的肾上腺皮质激素的浓度可以根据所使用的肾上腺皮质激素的种类而适当设定，在作为肾上腺皮质激素使用地塞米松时的的浓度优选为0.01～1μM，更优选为0.05～0.3μM。
培养基中的钙三醇的浓度不特别限定，优选为0.1～5μM，更优选为0.5～3μM。
培养基中的二甲基亚砜的浓度不特别限定，优选为0.1～1％，更优选为0.3～0.8％。
本发明的肠细胞分化用培养基可以包含除了GSK3抑制剂、肝细胞生长因子受体的激活剂、肾上腺皮质激素、钙三醇、二甲基亚砜以外的成分。例如，可以包含抗坏血酸、牛血清白蛋白(优选不饱和脂肪酸的)、运铁蛋白、胰岛素、L-谷氨酰胺等。
本发明的肠细胞分化用培养基可以以公知的基础培养基为基础来制作。作为这样的公知的基础培养基，可以列举例如，BME培养基、BGjB培养基、CMRL 1066培养基、GlasgowMEM培养基、Improved MEM培养基、IMDM培养基、Medium 199培养基、Eagles MEM培养基、αMEM培养基、DMEM培养基、Ham’s培养基、RPMI 1640培养基、Fischer’s培养基、William’s E培养基、以及它们的混合培养基等，只要是能够在动物细胞培养中使用的培养基，就没有特别限定。
本发明的肠细胞分化用培养基可以包含血清代替物。作为血清代替物，例如可以举出白蛋白、运铁蛋白、脂肪酸、胶原蛋白前体、微量元素(例如硒)、B-27补充剂、E5补充剂、E6补充剂、N2补充剂、KnockOut血清替代物(KSR)、2-巯基乙醇、3’-巯基甘油、或它们的等同物。这些血清代替物有市售。可以优选举出Xeno-Free B-27补充剂或Xeno-Free KnockOut血清替代物(KSR)，例如可以以0.01～30重量％、优选为0.1～20重量％的浓度添加到培养基中。另外，该培养基还可以含有其他添加物，例如脂质、氨基酸(例如非必需氨基酸)、维生素、生长因子、细胞因子、抗氧化剂、2-巯基乙醇、丙酮酸、缓冲剂、无机盐类、抗生素(例如青霉素、链霉素)或抗菌剂(例如两性霉素B)等。
(B)肠细胞的制作方法
本发明的肠细胞的制作方法以包括下述工序(1)～(3)作为特征。
在工序(1)中，将多能干细胞在包含激活素受体样激酶-4,7的激活剂的培养基中进行培养。
“多能干细胞”，是指具有自我复制能力，能够在体外(in vitro)进行培养，并且具有能够分化成构成个体的细胞的多分化能力的细胞。具体而言，可以举出胚胎干细胞(ES细胞)、胎儿的原始生殖细胞来源的多能干细胞(GS细胞)、体细胞来源的诱导多能干细胞(iPS细胞)、成体干细胞等，本发明中优选使用的是iPS细胞或ES细胞，特别优选为人iPS细胞和人ES细胞。
ES细胞优选为哺乳类动物来源的ES细胞。作为哺乳动物，可列举例如，小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠、兔、猫、狗、绵羊、牛、马、山羊、猴或人等，优选为小鼠或人，进一步优选为人。
一般来说，ES细胞可以将胚泡期的受精卵与饲养细胞一起培养，将增殖的内部细胞团块来源的细胞分散，进一步重复继续接种的操作，最终作为细胞株建立。
另外，iPS细胞是获得了分化多能性的细胞，是通过对体细胞(例如成纤维细胞等)转入赋予分化多能性的几种转录因子(分化多能性因子)基因而获得了与ES细胞同等的分化多能性的细胞。作为“分化多能性因子”，报告了许多因子，没有特别限定，例如可以举出Oct家族(例如Oct3/4)、Sox家族(例如Sox2、Sox1、Sox3、Sox15和Sox17等)、Klf家族(例如Klf4、Klf2等)、Myc家族(例如c-Myc、N-Myc、L-Myc等)、Nanog、LIN28等。对于iPS细胞的建立方法，有许多的报告，可以以它们为参考(例如Takahashi et al.,Cell,2006,126:663-676；Okita et al.,Nature,2007,448:313-317：Wernig et al.,Nature,2007,448:318-324；Maherali et al.,Cell Stem Cell,2007,1:55-70；Park et al.,Nature,2007,451:141-146；Nakagawa et al.,Nat Biotechnol 2008,26:101-106；Wernig et al.,CellStem Cell,2008,10:10-12；Yu et al.,Science,2007,318:1917-1920；Takahashi etal.,Cell,2007,131:861-872；Stadtfeld et al.,Science,2008,322:945-949等)。
所使用的多能干细胞可以采用该领域中通常使用的方法培养和维持。ES细胞的培养方法可以通过常规方法进行。例如可以使用小鼠胚胎成纤维细胞(MEF细胞)作为饲养细胞，用加入有白血病抑制因子、KSR(KnockOut血清代替物)、胎牛血清(FBS)、非必需氨基酸、L-谷氨酰胺、丙酮酸、青霉素、链霉素、β-巯基乙醇的培养基、例如DMEM培养基来维持。iPSS细胞的培养也可以通过常规方法进行。例如可以使用MEF细胞作为饲养细胞，用加入有bFGF、KSR(KnockOut血清代替物)、非必需氨基酸、L-谷氨酰胺、青霉素、链霉素、β-巯基乙醇的培养基、例如DMEM/F12培养基来维持。
多能干细胞可以在工序(1)中的培养之前，按照公知的方法(WO2015/125662)，在不包含甲硫氨酸的未分化维持培养基中培养。由此，能够促进多能干细胞的分化效率。这里，“不包含甲硫氨酸”除了培养基中完全不包含甲硫氨酸的情况以外，也指含有甲硫氨酸10μM以下、优选为5μM以下、更优选为1μM以下、进一步优选为0.1μM以下的情况。在不包含甲硫氨酸的培养基中的培养时间不特别限定，优选为3～24小时，更优选为至少5～24小时，进一步优选为至少5～10小时。
激活蛋白受体样激酶(ALK)-4,7的激活剂从对ALK-4和/或ALK-7具有激活作用的物质中选择。作为使用的激活蛋白受体样激酶-4,7的激活剂的例子，可以举出激活蛋白、Nodal、肌生成抑制蛋白(Myostatin)，优选为激活蛋白。激活蛋白已知激活蛋白A、B、C、D和AB，可以使用其中的任意激活蛋白。作为使用的激活蛋白，特别优选为激活蛋白A。此外，作为使用的激活蛋白，也可以使用人、小鼠等任何哺乳动物来源的激活蛋白，但优选使用与分化中使用的干细胞同一动物种来源的激活蛋白，例如以人来源的多能干细胞为起始原料的情况下，优选使用人来源的激活蛋白、特别是人来源的激活蛋白A。这些激活蛋白可以商业获得。培养基中的激活蛋白受体样激酶-4,7的激活剂的浓度根据所使用的种类而适当设定，在使用人激活蛋白A的情况下，优选为3～500ng/mL，更优选为5～200ng/mL。
培养基中除了激活素受体样激酶-4,7的激活剂之外，还可以包含GSK3抑制剂。另外，可以将培养分成2阶段，在前半的培养中使用包含激活素受体样激酶-4,7的激活剂和GSK3抑制剂的培养基，在后半的培养中使用包含激活素受体样激酶-4,7的激活剂、不包含GSK3抑制剂的培养基。
GSK3抑制剂可以使用与本发明的肠细胞分化用培养基中所使用的同样的抑制剂，工序(1)中使用的适合的GSK3抑制剂从CHIR99021(6-[[2-[[4-(2,4-二氯苯基)-5-(4-甲基-1H-咪唑-2-基)-2-嘧啶基]氨基]乙基]氨基]烟腈)、SB216763(3-(2,3-二氯苯基)-4-(1-甲基-1H-吲哚-3-基)-1H-吡咯-2,5-二酮)、和SB415286(3-[(3-氯-4-羟基苯基)氨基]-4-(2-硝基苯基)-1H-吡咯-2,5-二酮)中选择，特别优选为CHIR99021。培养基中的GSK3抑制剂的浓度可以根据所使用的GSK3抑制剂的种类而适当设定，在作为GSK3抑制剂使用CHIR99021时的浓度优选为1～10μM，更优选为2～5μM。
工序(1)中使用的培养基可以以公知的基础培养基为基础来制作。基础培养基可以使用与本发明的肠细胞分化用培养基中所使用的同样的培养基。另外，工序(1)中使用的培养基可以包含血清代替物。血清代替物可以使用与本发明的肠细胞分化用培养基中所使用的同样的血清代替物。进而，工序(1)中使用的培养基可以包含与本发明的肠细胞分化用培养基中使用的培养基同样的添加物。
工序(1)的培养优选在M15饲养细胞上进行。由此能够有效地将多能干细胞诱导成内胚层细胞(Shiraki et al.,2008,Stem Cells 26,874-85)。
工序(1)的培养在适于培养细胞的培养温度(通常30～40℃，优选37℃左右)下、通常在CO2培养箱内进行。培养时间通常为1天～5天，优选为3天～4天。另外，也可以确认培养中的多能干细胞分化成了胚胎内胚层细胞，由此来决定培养时间。多能干细胞分化成内胚层细胞的确认可以通过评价内胚层细胞特异性表达的蛋白质、基因(内胚层标志物)的表达变化来进行。内胚层标志物的表达变化的评价例如可以通过利用抗原抗体反应的蛋白质的表达评价方法、利用定量RT-PCR的基因表达评价方法等进行。作为内胚层标志物的例子，可以举出SOX17、FOXA2。
工序(2)中，将工序(1)中得到的细胞在包含GSK3抑制剂和γ-分泌酶抑制剂的培养基中培养。
工序(2)的培养可以在工序(1)的培养之后立即进行，也可以在工序(1)结束之后将细胞冷冻保存，在保存一定时间之后将细胞解冻，进行工序(2)的培养。
GSK3抑制剂可以使用与在本发明的肠细胞分化用培养基中使用的同样的抑制剂，作为适合的GSK3抑制剂，可以使用BIO。培养基中的GSK3抑制剂的浓度可以根据所使用的GSK3抑制剂的种类而适当设定，在作为GSK3抑制剂使用BIO时的浓度优选为0.5～20μM，更优选为1～10μM。
作为γ-分泌酶抑制剂，可列举例如，芳基磺酰胺、二苯并氮卓(dibenzazepine)、苯并二氮卓(benzodiazepine)、DAPT、L-685458、或MK0752。这些可以作为市售品购买。另外，即使是在不能作为市售品获得的情况下，只要是本领域技术人员，也能够按照已知文献制备。作为适合的γ-分泌酶抑制剂，可列举DAPT。培养基中的γ-分泌酶抑制剂的浓度可以根据所使用的γ-分泌酶抑制剂的种类而适当设定，在作为γ-分泌酶抑制剂使用DAPT时的浓度优选为1～30μM，更优选为5～20μM。
工序(2)的培养优选在M15饲养细胞或高密度胶原蛋白凝胶膜上进行。另外，也可以将工序(2)的培养的前段在M15饲养细胞上进行，将后段在高密度胶原蛋白凝胶膜上进行。
“高密度胶原蛋白凝胶”，是由与生物体内的结缔组织相当的高密度胶原蛋白纤维构成的胶原蛋白凝胶，强度和透明性优秀。作为高密度胶原蛋白凝胶，可以举出CollagenVitrigel(国立研究开发法人农业食品产业技术综合研究机构的注册商标)(竹泽俊明:生物工学学会誌.91:214-217,2013，WO2012/026531，日本特开2012-115262)。高密度胶原蛋白凝胶例如可以将胶原蛋白的溶胶进行凝胶化，使该胶原蛋白凝胶干燥并玻璃化，其后再水合而制作。高密度胶原蛋白凝胶中的胶原蛋白纤维密度优选为21～45(W/V)％，更优选为26～40(W/V)％，进一步优选为31～35(W/V)％。
在高密度胶原蛋白凝胶膜上的培养可以采用任何方法进行，但优选在筒状框体的底面部分设有高密度胶原蛋白凝胶膜，在该膜上培养细胞。
工序(2)中使用的培养基可以以公知的基础培养基为基础来制作。基础培养基可以使用与本发明的肠细胞分化用培养基中所使用的同样的培养基。另外，工序(2)中使用的培养基可以包含血清代替物。血清代替物可以使用与本发明的肠细胞分化用培养基中所使用的同样的血清代替物。培养基中的血清代替物的浓度不特别限定，可以为例如0.01～30重量％、优选为0.1～20重量％的浓度。进而，工序(2)中使用的培养基可以包含与本发明的肠细胞分化用培养基中使用的培养基同样的添加物。
工序(2)的培养在适合培养细胞的培养温度(通常为30～40℃、优选为37℃左右)下、通常在CO2培养箱内进行。培养时间通常为8天～20天，优选为10天～15天。另外，可以确认培养中的细胞分化成了肠前体细胞，由此来决定培养时间。分化成了肠前体细胞的确认可以通过评价肠前体细胞中特异性地表达的蛋白质、基因(肠前体细胞标志物)的表达变化来进行。肠前体细胞标志物的表达变化的评价可以通过例如，利用了抗原抗体反应的蛋白质的表达评价方法、利用了定量RT-PCR的基因表达评价方法等来进行。作为肠前体细胞标志物的例子，可列举CDX2和IFABP。
工序(3)中，将工序(2)中得到的细胞在本发明的肠细胞分化用培养基中、在高密度胶原蛋白凝胶膜上培养，得到肠细胞。
工序(3)的培养可以在工序(2)的培养之后立即进行，也可以在工序(2)之后将细胞冷冻保存，在保存一定时间之后将细胞解冻，进行工序(3)的培养。
高密度胶原蛋白凝胶膜上的培养可以与工序(2)中的培养同样地进行。
工序(3)中使用本发明的肠细胞分化用培养基，但只要是能够得到肠细胞的培养基，也可以使用其他培养基。作为这样的其他培养基，可列举例如，包含Cellartis(注册商标)肝细胞维持培养基的培养基。
在制作以高水平表达CYP3A4的肠细胞时，工序(3)的后半优选在包含钙三醇的培养基中培养。另一方面，工序(3)的前半未必在包含钙三醇的培养基中培养。因此，可以工序(3)的前半和后半使用不同的培养基。即，可以工序(3)的前半使用不包含钙三醇的本发明的肠细胞分化用培养基，后半使用包含钙三醇的本发明的肠细胞分化用培养基。
工序(3)的培养在适合培养细胞的培养温度(通常为30～40℃、优选为37℃左右)下、通常在CO2培养箱内进行。培养时间通常为3天～40天，优选为5天～30天。另外，可以确认培养中的细胞分化成了肠细胞，由此来决定培养时间。分化成了肠细胞的确认可以通过评价肠细胞中特异性地表达的蛋白质、基因(肠细胞标志物)的表达变化来进行。肠细胞标志物的表达变化的评价可以通过例如，利用了抗原抗体反应的蛋白质的表达评价方法、利用了定量RT-PCR的基因表达评价方法等来进行。作为肠细胞标志物的例子，可列举VILLIN。
通过上述的肠细胞的制作方法制作的肠细胞也是本发明的对象。此外，该肠细胞不是通过结构、特性、而是通过制造方法特定的，但这是因为，肠细胞是生物体的一部分，因而其结构、特性极为复杂，进行特定它们的操作需要显著过大的经济支出、时间。
本发明的肠细胞具有例如如下的性质。
a)在细胞接合部表达作为紧密连接相关蛋白质的ZO1。
b)形成单层膜。通过TEER值的测定确认了该单层膜具有充分的屏障功能。
c)摄取性转运体基因(例如，SLC15A1)和外排性转运体基因(例如，ABCB1和ABCG2)以与成体小肠同等的水平表达。
d)观察到地高辛和哌唑嗪从基底侧向顶端侧的跨细胞方向性转运。
e)CYP酶(例如，CYP2C9、CYP2C19、CYP3A4)基因表达量为接近正常成体水平的表达量的水平。
f)表达VILLIN，其表达局部存在于顶端侧。
实施例
以下，通过实施例进一步详细地说明本发明，但本发明不限定于这些实施例。
(A)结果
(1)Collagen Vitrigel支持人iPSC向以膜形成和肠的标志物表达为特征的肠细胞分化。
在诱导人iPS细胞向成熟肠细胞的分化的尝试中，本发明者最初在M15细胞上由人iPSC诱导胚胎内胚层(DE)细胞。使第3天(D3)的DE细胞解离，置换到CVM插件上，用M2培养基培养到第15天。然后，将培养基交换成成熟培养基(M3、M3-1、或M3-2)，培养到第40天(图1A、图6A)。或者，将第3天DE细胞在iMatrix511预涂板上重复铺板，在M2培养基中培养到第10天，接下来作为第10天的肠前体细胞原种冷冻保存。使用时将冷冻保存的第10天细胞原种冻融，接种在CVM插件上，在M2中培养到第15天，接下来交换成M3-1或M3-2培养基。第3天DE也可以作为冷冻细胞原种保存。在本发明者的实验中，使用第3天DE细胞原种或第10天肠前体细胞原种的任一者。免疫细胞化学分析的结果表明，在CVM上铺板的第4天的DE细胞显示SOX17表达，然后在第10天CDX2表达上升(图1B)。
接着，为了检查膜的完整性，测定经上皮电阻(TEER)值。将作为结肠癌来源的细胞株的Caco-2细胞以5.0×10 4细胞/孔的浓度接种。TEER值随时间增加，在第14天达到35Ωcm2。将冷冻保存的第3天(D3)的DE细胞以8.0×10 4细胞/孔的浓度接种，形成单层。该细胞随时间而显示TEER值的增加，其值在第14天为约40Ωcm2达到平台。将冷冻保存的第10天和第15天的肠前体细胞以1.6×105细胞/孔的浓度接种，形成单层。这些细胞随时间而显示TEER值的增加，其值在铺板11天后为约50Ωcm2的水平，达到平台(图1C)。
肠细胞在细胞接合部表达作为紧密连接相关蛋白质的ZO1。该结果提示形成了细胞的屏障功能(图1D)。观察到肠细胞特异性标志物的VILLIN的表达。VILLIN的表达与人iPSC来源肠细胞的基底侧相比在顶端侧高表达，显示极性化的局部存在化。这在分化第30天通过共聚焦显微镜的检查而明确(图1E)。
以上结果表示，hiPSC来源的肠细胞显示标志物表达、膜的完整性、和极性化的顶端-基底结构(这些均是肠细胞的特征)。
调查细胞的TEER值(图6)。分化的细胞在冻融时显示TEER的增加，在第14天，第3天的冷冻保存细胞原种(图6左)和第10天的冷冻保存细胞原种(图6右)双方均达到40Ωcm2的平台。因此，可以将M3培养基置换成M3-1或M3-2培养基。
(2)hiPSC来源的肠细胞表达肠细胞特征性的转运体和P450酶。
接着，通过定量的PCR分析来分析肠的标志物、转运体和代谢酶的表达。在这一系列的实验中，使用冷冻保存的第3天的DE细胞。将冷冻保存的第3天的DE细胞在CVM插件上铺板，最初在M2培养基中培养，接下来交换成M3培养基，培养到分化的第40天，从而诱导肠分化(图2A)。
通过Q-PCR分析表明，作为隐窝基底柱状细胞的标志物的LGR5暂时地上调，在第5天达到峰值，然后下调。通过LGR5表达的减少，作为肠前体细胞标志物的CDX2和作为肠细胞标志物的VILLIN的表达，与LGR5表达相互排斥地上调。CDX2或VILLIN表达分别在第10天或第15天达到平台(图2A、B)，它们的表达水平维持在充分的水平。标志物的表达水平相对于成人的肠的表达水平(成人的肠＝1)归一化。
由ABCG2(ATP结合盒家族G成员2，ATP-binding cassette family G member 2)编码的BCRP(乳癌抗性蛋白，breast cancer resistance protein)、由ABCB1(ATP结合盒家族B成员1，ATP-binding cassette family B member 1)编码的P-gp/MDR1(P-糖蛋白/多耐药性1，P-glycoprotein/multidrug resistance 1)等在肠内表达的药物外排性转运体被认为是对肠中的药物吸收的限制壁垒(Estudante et al.(2013).Adv.Drug Deliv.Rev.65,1340-1356)。由SLC15A1(溶质载体家族15成员1，solute carrier family 15member 1)编码的PEPT1(多肽转运体1，peptide transporter 1)参与寡肽和肽模拟药的肠内摄入。这些转运体对于决定经口施与的药物的肠内利用能力是重要的，因此调查从hiPSC的分化中的它们的培养时间依赖性的表达图谱。ABCG2的mRNA表达从分化的第10天开始上调，在第15天达到峰值，然后维持在某个水平。ABCB1在第15天上调，在第30天达到峰值。SLC15A1从第15天开始被检测到，然后缓缓上调，在第30天达到平台。整体来看，转运体的表达在第21天以后以某个水平被检测到(图2C)。
药物代谢也是用于生物体异物的解毒的肠细胞的重要功能。细胞色素P450(CYP)异构体之中，CYP3A4也是小肠中的主要的药物代谢酶。观察到CYP3A4、CYP2C9和CYP2C19的mRNA表达在hiPSC来源肠细胞中，从第20天开始上调，然后增加(图2D)。hiPSC来源的肠中的CYP酶的表达水平作为相对于成人的肠内中的表达水平的倍数显示。因此，结果显示CYP2C9和CYP2C19为成人的肠内的内在的酶的约0.1～0.3倍。CYP3A4在分化的第30天至第40天，以成人的肠中的CYP3A4的约0.08～0.15倍表达。在将M3培养基交换成M3-1或M3-2培养基的情况下也得到同样的结果(图7、9)。
(3)CVM支持分化成成熟肠细胞的肠前体细胞。
接着，试验hiPSC来源肠前体细胞的分化能力。该实验中，使用冷冻保存的第3天DE细胞、第10天和第15天的hiPSC来源肠前体细胞。将这些细胞接种在CVM插件上，培养到35天或40天，然后回收，通过实时PCR分析肠标志物、转运体和CYP酶(图3A)。hiPSC来源第10天和第15天的肠前体细胞分化，显示低水平的LGR5表达。第3天DE细胞和第10天肠前体细胞在第35天产生以同样的水平表达CDX2和VILLIN的肠细胞。但是，第15天的肠前体细胞来源的第40天的肠细胞与第3天的DE细胞来源的相比，以更高的水平表达CDX2或VILLIN(图3B)。该结果提示，第10天和第15天的hiPSC来源肠前体细胞的冷冻保存的细胞原种能够在CVM上分化成肠细胞。
接下来，试验MDR1、BCRP或PEPT1的转运体分子或CYP2C9、CYP2C19或CYP3A4的CYP酶分子的表达水平。作为结果，第10天的hiPSC来源肠前体细胞的冷冻保存细胞原种分化成以与第3天的DE细胞来源的同样的水平表达ABCB1和ABCG2的细胞。另一方面，第15天的hiPSC来源肠前体细胞产生肠细胞，但该肠细胞中的ABCB1和ABCG2的表达比第3天的DE来源细胞的表达低(图3C)。但是，SLC15A1的表达在这些hiPSC来源细胞中显示不同的倾向。第10天的冷冻保存细胞产生比第3天的DE细胞SLC15A1的表达更高的肠细胞，但第15天的冷冻保存细胞显示与第3天的DE细胞同样的分化能力。关于CYP酶表达，hiPSC来源的第10天的肠前体细胞分化，以与第3天的DE来源细胞同样的水平表达CYP3A4。hiPSC来源的第15天的肠前体细胞产生表达更低的CYP3A4的肠细胞。但是，hiPSC来源的第10天和第15天的肠前体细胞产生以与第3天的DE来源细胞的水平相比更高的水平表达CYP2C9或CYP2C19的肠细胞。因为表达水平以成人的肠中的水平作为1进行了归一化，所以该结果提示，分化的肠细胞以适当的水平表达在肠中表达的CYP分子。使用M3-1或M3-2培养基代替M3培养基的情况下也得到了同样的结果(图9)。使用iMatrix由第3天的原种制作的冷冻保存第10天细胞原种也可以使用。
(4)hiPSC来源肠细胞显示与Caco-2细胞的表达同等的转运体的mRNA表达、和在Caco2细胞中不表达的CYP3A4酶表达。
结果显示，hiPSC来源的肠细胞表达与肠细胞类似的肠标志物、转运体和CYP酶。接着，将hiPSC来源肠细胞的标志物的表达水平与Caco-2细胞的表达水平进行了比较。Caco-2细胞是在药剂开发工艺中用于评价药物的肠内吸收特性最一般被使用的人肠细胞模型。将Caco-2细胞在CVM24孔插件上铺板，培养21天。将2种不同的hiPSC细胞株(RPChiPS771和ChiPS18)来源的第3天的DE细胞在CVM上铺板，分别培养18天(分化天数为21天)，调查分子标志物的表达(图4A)。
结果显示，Caco-2表达在hiPSC来源的肠细胞中观察不到的相当量的LGR5。CDX2和VILLIN的表达水平与在Caco-2细胞中表达的水平相比，在hiPSC来源肠细胞中更高(图4B)。因此，结果提示，Caco-2细胞与肠的未成熟细胞相似。
培养了21天的Caco-2表达与成人肠细胞的水平相比更高水平的ABCB1(图9D)。分化第21天的hiPSC来源肠细胞以与成人的肠的水平相当的水平表达ABCB1、ABCG2和SLC15A1(图9D)。本发明者确认了Caco-2细胞不表达CYP3A4。相对地，CYP3A4表达在hiPSC来源肠细胞中开始被检测到(图4D)(也参照图2D、图7D、图8C、图9E)。CYP2C9和CYP2C19表达也另外被检测(图4D)(图7D、8C、9E)。
因此，本发明者的结果显示，在CVM插件上培养的hiPSC分化，能够生成肠细胞。生成的肠细胞以比Caco-2细胞中表达的水平更高的水平显示成熟的肠的标志物、转运体和CYP酶的表达。在使用M3-1培养基或M3-2培养基代替M3培养基的情况下也得到了同样的结果。使用iMatrix由第3天的原种制作的冷冻保存第10天细胞原种也可以使用。
(5)hiPSC来源的肠细胞被观察到主动的外排性转运和药物的介由CYP3A4的代谢能力。
因为ABCG2和ABCB1 mRNA在hiPSC来源的肠细胞高度表达，所以为了调查细胞培养插件上的肠细胞中的外排性转运体(P-gp、BCRP)的转运活性而进行双方向的跨细胞转运测定(图5A、右)。作为P-gp的典型底物的地高辛的从基底侧向顶端侧的方向性转运(从B向A的转运)，时间依赖性地以比从顶端侧向基底侧的转运(从A向B的转运)更高的水平被观察到(图5A、左侧面板)。另一方面，在作为P-gp的典型抑制剂的维拉帕米存在下，地高辛的从B向A的转运与从A向B的转运几乎相同。同样地判明了，作为BCRP和P-gp的底物的哌唑嗪的从B向A的转运，高于从A向B的转运。在作为BCRP和P-gp两种转运体的抑制剂的Elacridar存在下，哌唑嗪的从B向A的转运减少，但从A向B的转运增加。因此，这些结果提示，hiPSC来源的肠细胞显示作为肠道外排性转运体的P-gp和BCRP的转运活性(图5A、中央面板)。
本发明者也试验了普萘洛尔的转运和甘露糖醇的转运。普萘洛尔的转运被认为是通过由其高疏水性引起的被动的膜渗透而介导的。另外，甘露糖醇的转运被认为是通过由其低分子量和高亲水性引起的细胞旁途径介导的。其结果是，未观察到穿过细胞单层的普萘洛尔和甘露糖醇的方向性的转运(图5B、5C)，没有确认主动转运的参与。进而，普萘洛尔的转运远高于甘露糖醇的转运。这可以通过它们不同的物理化学特性来合理地说明。
本发明者还通过观察咪达唑仑羟基化而形成1’-OH咪达唑仑，从而评价了CYP3A4代谢活性。已知该咪达唑仑的羟基化通过CYP3A4而选择性地发生。作为结果，1’-OH咪达唑仑的形成利用LC-MS/MS的评价结果是以0.773μL/分钟/mg细胞蛋白质的清除率发生。总结来说，本发明者的结果显示，肠细胞具有P-gp和BCRP双方的外排性转运活性和CYP3A4代谢活性。
(6)用于生成hiPS来源肠细胞的代替分化法
在上述的分化法中，本发明者发现，hiPS来源肠细胞在第15天以一定水平表达转运体ABCB1(图2C)，在第15天以后使ABCG2和SLC15A1的表达增加。这些hiPS来源肠细胞在M3中培养之后，从第15天药物代谢酶也开始表达(图2D)。为了搞清楚对于将前体细胞的成熟引导到表达转运体和代谢酶的成熟肠细胞重要的分子，本发明者调查了将M3培养基用M3-1或M3-2培养基置换的效果(图6-10)。其结果搞清楚了，在将BIO、DMSO、地塞米松、钙三醇(M3-2)添加到细胞的情况下，hiPS来源肠细胞以与在现有的M3培养基中的培养下生成的hiPS来源肠细胞同等的水平表达转运体和代谢酶CYP3A4，另外，其水平比通过M3-1培养基得到的结果更高(图8、9)。
综上所述，本发明者的结果显示，M3-2中的BIO、DMSO、地塞米松、钙三醇的存在对于用于代谢酶CYP3A4表达的肠细胞的成熟是重要的(图8B、C)。所得的hiPS-肠细胞显示介由P-gp的外排性转运活性，排出罗丹明123底物。
(7)利用钙三醇的CYP3A4的表达诱导
使用从M3-2培养基除去了钙三醇的培养基代替M3-2培养基，调查CYP3A4的表达。在除去了钙三醇的培养基中培养的hiPSC来源肠细胞在分化第21天基本不表达CYP3A4(图12)。
在第15～22天，在从M3-2培养基中除去了钙三醇的培养基中培养，接着，在第23～25天调查在M3-2培养基中培养的hiPSC来源肠细胞中的CYP3A4的表达。该hiPSC来源肠细胞的CYP3A4表达水平在第15～25天与在M3-2培养基中培养的细胞的表达水平为同等，比在M3培养基中培养的细胞更高(图11)。
以上结果显示，在肠细胞分化的最终阶段(分化第23～25天)在包含钙三醇的培养基中的培养对于CYP3A4的表达诱导是重要的。
(B)考察
这里，建立了通过将hiPSC来源的内胚层或肠前体细胞在CVM上培养，而由hiPSC生成功能性肠细胞。本发明者发现，CVM是用于肠的成熟细胞的诱导和维持的良好的基材。本发明者以前报告了，通过在M15细胞上培养hiPSC，添加作为Wnt信号激活剂的BIO和作为Notch信号抑制剂的DAPT，从而能够得到CDX2阳性肠细胞。在CVM上培养的hiPSC来源肠前体细胞能够形成局部存在于顶端膜的表达VILLIN的单层。分化的细胞为ZO1阳性，显示通过TEER测定而明确的屏障功能。这些特征显示生成了功能性肠细胞。
通过基因表达分析搞清楚了，所诱导的肠细胞显示摄取性转运体(SLC15A1)和外排性转运体(ABCB1和ABCG2)的高的mRNA表达水平。这些转运体在第21天以相当的水平表达，维持到第40天。本发明者在hiPSC来源肠细胞中，明确观察到地高辛和哌唑嗪的从B向A的有方向性的跨细胞转运，其方向性转运被维拉帕米和Elacridar抑制。地高辛是P-gp的选择性底物，维拉帕米以8.1-17.3μM的Ki/IC50值强烈地抑制P-gp。另一方面，哌唑嗪是BCRP和P-gp的良好的底物，Elacridar抑制BCRP(Ki/IC50值：0.31μM)和P-gp(Ki/IC50值：0.027-0.44μM)双方。因此，本发明者的转运实验的结果显示，hiPSC来源肠细胞中的P-gp和BCRP对从A向B方向的吸收方向的膜渗透抑制性地发挥功能。
hiPSC来源肠细胞中的地高辛的转运活性与在Caco-2细胞(Djuv and Nilsen,(2008).Phytother.Res.22,1623-1628)中测定的为同等，哌唑嗪的从B到A/从A到B的转运活性的比也与以前报告的Caco-2细胞中的(Wright et al.,(2011).Eur.J.Pharmacol.672,70-76)为同等。关于细胞旁转运，报告了穿过Caco-2细胞单层的甘露糖醇的转运清除率为3％/cm2/小时(Cogburn JN et al.(1991).Pharm Res.8,210-216)。在hiPSC来源的肠细胞中，推定甘露糖醇的转运清除率为8.6％/cm2/小时。可以认为这是因为，由于Caco-2细胞的更牢固的紧密连接，与完全的肠道上皮细胞相比，细胞旁转运在Caco-2细胞中被进一步限制。关于跨细胞转运，报告了普萘洛尔在Caco-2细胞(Artursson,(1990).J.Pharm.Sci.79,476-482)中显示41.9×10-6cm/秒(这相当于约99.4μL/120分钟/孔)。这与现在的结果(48μL/120分钟/孔)相当。考虑全部结果，本发明者确认了利用iPSC来源肠细胞的单层的静态和主动的屏障形成与Caco-2细胞的屏障形成是同样的。
综上所述，本发明者的结果显示，可以为了促进向肠细胞的分化、维持转运体和CYP酶的表达水平约3周而使用CVM。
别的重要见解是可以将第10天或第15天的hiPSC来源内胚层或肠前体细胞冷冻保存。如果将冷冻保存的细胞解冻、接种在CVM上，则这些细胞形成单层，在2周以内显示膜的完整性，进而成熟为功能性肠细胞。冷冻保存的第10天的肠前体细胞能够分化成以与第3天的DE细胞来源的同样的水平表达转运体和代谢酶的肠细胞。虽然转运体和CYP酶的表达水平比hiPSC来源的第3天的DE细胞来源的低，但冷冻保存的第15天的肠前体细胞也分化成肠细胞。本发明者的结果显示，冷冻保存的第10天或第15天的肠前体细胞原种的使用提供向肠细胞的迅速分化。
本发明者的方案还显示能够应用于不同的hiPSC株。本发明者使用2种hiPSC系统，发现任一细胞系统来源的肠细胞关于ABCB1表达和CYP酶表达都显示类似的水平。但是，在ChiPS18细胞来源肠细胞中观察到更高的ABCG2和SLC15A1表达。
作为结论，通过使用CVM，成功地制作了观察到介由转运体的有方向性的药物的渗透、显示与Caco-2细胞同样的渗透性的功能性肠细胞。hiPSC来源肠细胞显示CYP3A4代谢活性。综合起来，本发明者的结果显示，该hiPSC来源肠细胞模型在药物吸收、药物间相互作用、和其他药理学的研究中有用。
(C)材料与方法
(1)人iPS细胞株
使用ChiPS18(Asplund et al.,2015)(TakaraBio)和RPChiPS771(ReproCell)的两种人iPS细胞株。将未分化的细胞在用Synthemax II(Corning Cat No.3535)预先涂布的细胞培养皿(Invitrogen)上的AK02StemFit培养基(Ajinomoto)中维持。为了除去甲硫氨酸，将ChiPS18细胞和RPChiPS771细胞用完全StemFit培养基(Ajinomoto)或Met除去KA01培养基(Ajinomoto)培养。
(2)CVM插件的制备
胶原蛋白干凝胶(xerogel)膜由关东化学株式会社(Tokyo，Japan)制造。简单地说明一下，CVM如以前所报告那样(Oshikata-Miyazaki and Takezawa,2016,Cytotechnology68,1801-1811；Yamaguchi et al.,2013,Toxicol.Sci.135,347-355；Yamaguchi et al.,2016,J.Appl.Toxicol.36,1025-1037)通过以下3个工序制备：1)由0.2mL的0.25％Ⅰ型胶原蛋白溶胶，在直径为35mm的培养皿中形成不透明的软质凝胶的凝胶化工序；2)经充分干燥而凝胶形成硬质材料的玻璃化工序；3)通过补充水分将玻璃化材料转换成凝胶强度被增强的薄而透明的凝胶膜的再水合工序。接着，通过在能够分离的片材上将Collagen Vitrigel膜再玻璃化，从而制备定义成不含游离水的干燥CVM的胶原蛋白干凝胶膜。将胶原蛋白干凝胶膜贴在内外径为11～13mm、长度为15mm的塑料筒的底端，在筒的上端连接两根吊臂。由此，如以前所报告那样(Oshikata-Miyazaki and Takezawa,2016,Cytotechnology 68,1801-1811；Yamaguchi et al.,2013,Toxicol.Sci.135,347-355；Yamaguchi et al.,2016,J.Appl.Toxicol.36,1025-1037)通过用培养基再水合而制作能够容易地转换成CVM室的胶原蛋白干凝胶膜室。
(3)iPS细胞向肠细胞的分化
首先用M15细胞使未分化ChiPS18或RPChiPS771细胞分化成内胚层。简单来说，在直径为100mm的板上将经丝裂霉素处理过的冷冻M15饲养细胞以5×106细胞/盘的密度进行预涂。为了内胚层分化，将未分化ChiPS18或RPChiPS771细胞在M15细胞包覆的直径为100mm的板上以5×105细胞/盘的密度铺板，用补充了3μM CHIR99021(Wako,Tokyo)的、作为内胚层分化培养基的M1培养基培养1天，接着变成M1培养基(不含CHIR99021)，进一步培养2天。M1培养基由DMEM(Thermo Fisher)、4,500mg/L葡萄糖、NEAA(ThermoFisher)、L-Gln(Nacalai Tesque)、PS(Nacalai Tesque)、0.1mMβ-ME(Sigma)、无血清B27补充剂(#12587001,ThermoFisher)、100ng/mL重组人激活素A(Cell Guidance Systems,Cambridge,UK)构成。在第3天(D3)收集ChiPS18或RPChiPS771来源内胚层细胞，用Bambanker hRM(NIPPON Genetics Co Ltd,CS-07-001)以2.0×106细胞/mL冷冻，在液氮中储存直到其后的使用。
代替制作冷冻保存的第3天的DE原种，为了制备第10天或第15天的肠前体冷冻保存细胞，将分化培养在M15细胞上继续，在第3天将培养基更换为M2培养基。M2培养基由补充了NEAA、L-Gln、PS、0.1mMβ-ME、D-葡萄糖1mg/ml、10％KnockOut(注册商标)血清替代物(Gibco,10828028)、5μM 6-溴靛玉红-3’-肟(WAKO,029-16241)、和10μM DAPT(WAKO,049-33583)的DMEM(Gibco,11885-084,low glucose)构成。
为了冷冻保存细胞的肠分化，将第3天的DE细胞冻融，以8×10 4细胞/孔的浓度在再水合的CVM24孔插件(ad-MED VitrigelTM 2,KANTO KAGAKU,culture area:0.33cm2/insert)上铺板。培养基的量在插件的上层为200μL、下层为500μL。分化中使用的培养基在第3～15天为M2培养基，在第15～21天或第15～40天为M3培养基。M3培养基由Cellartis(注册商标)肝细胞维持培养基(Takara Bio Y30051)构成。将上层和下层双方的培养基每隔2天用新鲜的培养基和增殖因子交换。为了使用第10天或第15天的冷冻保存的细胞原种进行肠的分化，将细胞解冻，在CVM24孔插件上以1.6×105细胞/孔的浓度铺板。对于第10天的细胞，将M2培养基使用到第15天，接下来更换为M3培养基，培养到第40天。对于第15天的细胞，使用M3培养基，将细胞培养到第40天。
(4)用于制备第10天的肠前体冷冻保存细胞的修订方案
为了制备第10天的肠前体冷冻保存细胞，将第3天的DE细胞以4×10 6细胞/皿的密度在用iMatrix-551(FUJIFILM WAKO,380-13041)预涂后的直径100mm的正常组织培养板(或CellSeed,CS3005)上铺板，用M2培养基培养到第10天(D10)。培养基每隔2天交换成新鲜的M2培养基。然后，收集细胞，作为第10天的肠前体冷冻保存细胞原种冷冻。
为了进行肠道分化，将第10天的肠前体细胞原种冻融，在M2培养基中的再水合Vitrigel膜(CVM)24孔插件(ad-MED VitrigelTM2,KANTO KAGAKU,培养面积：0.33cm2/插件)上，以1.6×105细胞/孔的浓度铺板。最初2天的铺板时，在培养基中添加Y-27632(WAKO：251-00514)。将细胞在M2中培养到第15天。培养基的量对于细胞培养插件的上层为200μL、对于下层为700μL。将培养基在第15天至第21天之间、或到第30天，更换成M3-1或M3-2。培养基每隔2天交换成新的培养基。
M3-1培养基：补充了L-谷氨酰胺、HCM SingleQuots(不含GA1000和人EGF)(Lonza,CC-4182)、1％的PS(Nacalai)、10ng/ml的重组人HGF(PeproTech 100-39)、1μM的地塞米松(Dex，Sigma-Aldrich,D8893)、1.4μM的BIO和1μM的钙三醇(Sigma-Aldrich、D1530)的William’s Medium E。
M3-2培养基：除了使用0.5％的二甲基亚砜(DMSO；Sigma-Aldrich,D2650)代替HGF以外与M3-1培养基为相同成分。
(5)Caco-2细胞培养
将Caco-2细胞在直径10cm的组织培养皿中的补充了10％胎牛血清的DMEM培养基(low glucose)中以5.0×10 5细胞/ml培养，以约80％的汇合度每3～4天传代。将Caco-2细胞重新冻融，在使用前传代一次。为了测定膜的完整性，将Caco-2细胞以1.0×104细胞/孔在CVM24孔插件上传代，继续培养。Caco-2细胞典型地在约7天培养之后形成单层。
(6)TEER测定
使用TEER Measuring System(Kanto kagaku,Inc Tokyo)测定在CVM上培养的人iPSC来源的肠细胞和Caco-2细胞的膜的完整性。
(7)免疫细胞化学
在包含4％多聚甲醛(Nacalai Tesque)的PBS中固定细胞，用0.1％Triton X-100(Nacalai Tesque)进行渗透处理，接着用包含20％Blocking One(Nacalai Tesque，Japan)的PBST(包含0.1％Tween-20的PBS)封闭。用包含20％Blocking One(Nacalai Tesque、Japan)的PBST(包含0.1％Tween-20的PBS)稀释抗体。用4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)(Roche Diagnostics,Switzerland)将细胞对比染色。
抗体使用以下的抗体：抗SOX17(R&D systems,Minneapolis,MN)、抗CDX2(BioGenex,San Ramon,CA)、抗ZO1(R40.76；Santa Cruz sc-33725)、抗VILLIN(BDTransduction Laboratories,San Diego)、Alexa568结合和Alexa 488结合抗体(Invitrogen)。
(8)实时PCR分析
使用RNeasy micro-kit或Qiaxol(Qiagen，Germany)从iPS细胞中提取RNA，接着用DNase(Qiagen)处理。为了进行逆转录反应，使用PrimeScript TM RT Master Mix(Takara,Japan)将2.5μg的RNA逆转录。为了实时PCR分析，使用StepOne Plus(Applied Biosystems，Foster City，CA)，通过SyberGreen定量mRNA表达。PCR条件如下：以在95℃下初始变性30秒、接着在95℃下变性5秒、在60℃下退火及延伸30秒为一个循环，重复40个循环。作为任意单位表示目标mRNA水平，使用ΔΔCT法确定。引物的详细在下表中显示。另外，引物的序列在序列号1～18显示。
表1
(9)跨细胞转运测定
为了选择性地评价P-gp的转运体活性，对于穿过细胞单层的[H]-地高辛(0.1μCi/3mL)的时间依赖性方向性转运(从B向A的转运和从A向B的转运)，在100μM维拉帕米不存在下或存在下进行测定。为了评价BCRP和P-gp活性，在20μM Elacridar不存在下或存在下，测定[3H]-哌唑嗪(0.1μCi/3mL)的时间依赖性方向性转运。为了评价穿过细胞单层的被动膜渗透和由细胞旁转运介导的跨细胞转运，分别试验了[3H]-普萘洛尔(0.1μCi/3mL)和[3H]-甘露糖醇(0.1μCi/3mL)。
在跨细胞转运测定中，除去hiPS来源的肠细胞培养培养基，在37℃置换成转运缓冲液(TB；118mM NaCl、23.8mM Na2CO3、4.8mM KCl、1.0mM KH2PO4、1.2mM MgSO4、12.5mMHEPES、5mM葡萄糖和1.5mM CaCl2、将pH调整为7.4)，进行10分钟预孵育。将TB置换成包含底物+/-抑制剂的TB，从而开始测定。加入的TB的量在CVM插件上层为200μl、下层为500μl。接着，在开始药物孵育30、60和120分钟后，采取最初应用了药物一侧和相反侧的区划的培养基的一部分，用与取样量相同量的新鲜TB(底物+/-抑制剂)置换。为了测定从A向B的转运，从下部区划采取100μl的TB，为了测定从B向A的转运，从上部区划采取50μl的TB。接着，将试样与CLEAR-SOL I(Nacalai Tesque)混合，对其放射性活度用液体液体闪烁计数器(PerkinElmer)进行定量。
或者，在作为P-gp的抑制剂的环孢素A(10μM)(Wako CAS RN59865-13-3)不存在下或存在下，使用罗丹明123(10μM；Dojindo,R233)作为用于评价P-gp的转运体活性的底物。通过光度计(GloMax Microplate Luminometer,Promega)确定罗丹明123的通量。使用显示TEER＞30Ω·cm2的分化细胞。除去hiPS来源肠细胞培养培养基，接着洗涤，交换成补充了5％胎牛血清(FBS)的Hank’s平衡盐类溶液(HBSS)。将含FBS的HBSS缓冲液交换成底物(+/-环孢素)，从而开始测定，在37℃孵育2显示。表观膜渗透系数(Papp)如下计算。Papp＝dQ/dt×1/AC0
在dQ/dt为每单位时间渗透的化合物的量时，A为细胞培养插件膜的表面积(0.33cm2)，并且C0为供体室中的初期化合物浓度。罗丹明123的流出比如下计算。
通量比＝Papp,基底至顶端/Papp,顶端至基底
(10)CYP代谢测定
评价分化第21天的hiPS来源肠细胞中的CYP3A4活性。除去hiPS来源肠细胞培养培养基(M3)，在37℃置换成转运缓冲液(TB)，进行10分钟预孵育。通过在上部(200μl)和下部(500μl)区划双方添加包含咪达唑仑的TB，从而开始测定。120分钟的孵育之后，从上部和下部区划双方采集全部孵育培养基，将样品在-80℃保存直到进行作为咪达唑仑的代谢产物的1’-OH咪达唑仑的LC-MS/MS分析。按照制造商的指示使用Pierce BCA蛋白质测定试剂盒(ThermoFisher,Rockford,IL)，定量每1个孔的蛋白质的量。代谢清除率作为用细胞蛋白质量进行了标准化的值求出。
(11)统计
数据作为平均值±S.D.(n＝3)表示。组间差异通过学生t检验或利用事后比较Dunnett检验的单因素方差分析(One way ANOVA)来分析。在各图的说明中记载了各自的统计分析和P值。由学生t检验得到的*p<0.05或者**p<0.01被认为有显著差异；由利用事后比较Dunnett检验的单因素方差分析(One way ANOVA)得到的§P<0.05或者§§P<0.01被认为有显著差异。
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本说明书中引用的全部出版物、专利和专利申请均直接作为参考而纳入本说明书中。
产业可利用性
本发明涉及肠细胞，所以能够在使用该细胞的产业领域中利用。
Claims (10)
1.肠细胞分化用培养基，其特征在于，包含GSK3抑制剂、和选自肝细胞生长因子受体的激活剂、肾上腺皮质激素、钙三醇和二甲基亚砜中的至少1种。
2.根据权利要求1所述的肠细胞分化用培养基，其特征在于，GSK3抑制剂是BIO。
3.根据权利要求1或2所述的肠细胞分化用培养基，其特征在于，肝细胞生长因子受体的激活剂是HGF。
4.根据权利要求1～3的任一项所述的肠细胞分化用培养基，其特征在于，肾上腺皮质激素是地塞米松。
5.肠细胞的制作方法，其特征在于，包括以下工序(1)～(3)：
工序(1)，将多能干细胞在包含激活素受体样激酶-4,7的激活剂的培养基中培养的工序，
工序(2)，将工序(1)中得到的细胞在包含GSK3抑制剂和γ-分泌酶抑制剂的培养基中培养的工序，
工序(3)，将工序(2)中得到的细胞在权利要求1～4的任一项所述的肠细胞分化用培养基中、在高密度胶原蛋白凝胶膜上培养，得到肠细胞的工序。
6.根据权利要求5所述的肠细胞的制作方法，其特征在于，在工序(2)中，将工序(1)中得到的细胞在高密度胶原蛋白凝胶膜上培养。
7.根据权利要求5或6所述的肠细胞的制作方法，其特征在于，在工序(1)中，将多能干细胞在M15细胞上培养。
8.根据权利要求5～7的任一项所述的肠细胞的制作方法，其特征在于，在工序(1)中，激活素受体样激酶-4,7的激活剂是激活素A。
9.根据权利要求5～8的任一项所述的肠细胞的制作方法，其特征在于，在工序(2)中，GSK3抑制剂是BIO，γ-分泌酶抑制剂是DAPT。
10.通过权利要求5～9的任一项所述的方法而制作的肠细胞。
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