CN112940134A - 针对PD-1和TGF-β的双功能蛋白 - Google Patents

Abstract

本申请提供了针对PD‑1和TGF‑β的双功能蛋白，以及该双功能蛋白的医学用途和制备方法。

Description

针对PD-1和TGF-β的双功能蛋白

技术领域

本申请大体涉及抗体药物领域，特别是恶性肿瘤的治疗。具体而言，本申请提供了能够结合PD-1（程序性死亡受体-1）和TGF-β（转化生长因子-β）的双功能蛋白，以及该双功能蛋白的医学用途。

背景技术

T细胞表达许多重要的膜蛋白免疫分子，其中PD-1（Programmed Death-1，程序性死亡受体-1，也称为CD279）蛋白，属于免疫球蛋白超家族中CD28家族，其配体（PD-L1、PD-L2）属于B7家族。PD-L1与PD-1结合后负调控T细胞免疫功能，是重要的外周T细胞抑制性免疫检查点。正常人体组织中低表达PD-L1，以维持免疫耐受、避免自身免疫反应。但肿瘤细胞通过高表达PD-L1（或释放PD-L1可溶性变体、外泌体）抑制T细胞免疫功能，形成免疫抑制型肿瘤免疫微环境。通过阻断PD-1/PD-L1信号通路，可以恢复T细胞免疫功能，对肿瘤细胞进行识别和杀伤。

TGF-β（transforming growth factor-β，转化生长因子-β）是一类具有多功能生物活性的细胞因子，能够通过调节细胞的增殖、分化、凋亡、粘附、侵袭和微环境来调节机体的生理过程。典型的TGF-β信号通路首先是TGF-β与Ⅱ型TGF-β受体（TGF-βRII）结合，然后与Ⅰ型TGF-β受体（TGFβRI）形成复合物使之激活，TGFβRI磷酸化激活R-Smad（Smad1、2、3、5、8）成员，R-Smad再与Co-Smad（Smad4）结合形成复合物转入细胞核内调控靶基因的转录。

在肿瘤微环境中，TGF-β的高表达往往与侵袭、转移、免疫逃逸、治疗抵抗和较差的预后相关联（David Charles J et al,. TGF-β Tumor Suppression through a LethalEMT.[J]. Cell,2016,164(5)）。还有研究表明，TGF-β很可能通过诱导Treg细胞和抑制效应T细胞破坏肿瘤微环境，加速肿瘤的进展（Shen Yinan et al, TGF-β regulateshepatocellular carcinoma progression by inducing Treg cell polarization.[J].Cellular physiology and biochemistry,2015,35(4)）。还有学者认为，TGF-β信号传导是导致患者产生抗PD-(L)1药物耐药性的原因。

目前，以TGF-β和PD-1/PD-L1作为联合靶点的研究已有报道，但是由于此研究方向具有良好前景，进一步的研究是亟需的。

发明内容

第一方面，本申请提供了双功能蛋白，其包含PD-1（程序性死亡受体-1）结合部和TGF-β（转化生长因子-β）结合部。

在一些实施方案中，PD-1结合部为抗PD-1抗体或抗原结合片段。在一些实施方中，PD-1结合部为针对PD-1的全长抗体、Fab片段、F(ab')₂片段、Fv片段或单链Fv片段(scFv)。

在一些实施方案中，抗PD-1抗体或抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含氨基酸序列为GFAFSSYD（SEQ ID NO：1）的HCDR1，氨基酸序列为ISGGGRYT（SEQ ID NO：2）的HCDR2和氨基酸序列为ANRYGEAWFAY（SEQ ID NO：3）的HCDR3，所述轻链可变区包含氨基酸序列为QDINTY（SEQ ID NO：4）的LCDR1，氨基酸序列为RAN（SEQ IDNO：5）的LCDR2和氨基酸序列为LQYDEFPLT（SEQ ID NO：6）的LCDR3。在一些实施方案中，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示，和/或所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQID NO：8所示。在一些实施方案中，抗PD-1抗体或抗原结合片段还包含重链恒定区和轻链恒定区，所述重链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO：9所示或者为SEQ ID NO：9所示氨基酸序列的变体，例如C末端残基A替换为K的SEQ ID NO：9所示氨基酸序列，和/或所述轻链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO：10所示或者为SEQ ID NO：10所示氨基酸序列的变体。

在另一些实施方案中，抗PD-1抗体或抗原结合片段选自：纳武利尤单抗（Nivolumab）、帕博利珠单抗（Pembrolizumab）、Durvalumab、特瑞普利单抗（JS-001）、信迪利单抗（IBI308）、卡瑞利株单抗（Camrelizumab）、替雷利株单抗（BGB-A317）、AK105（康方生物）、杰诺单抗（GB226）、丽珠单抗（LZM009）、HLX-10、BAT-1306、AK103（HX008）、AK104（康方生物）、CS1003、SCT-I10A、F520、SG001、GLS-010，或以上抗体的抗原结合片段。

在一些实施方案中，TGF-β结合部为TGF-β受体或TGF-β受体的结合结构域。在一些实施方中，TGF-β结合部为TGF-β受体的胞外结构域或胞外结构域的结合片段。在一些具体实施方案中，TGF-β结合部为人TGF-βRII同种型B胞外结构域多肽，其包含SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列。在一些具体实施方案中，TGF-β结合部为人TGF-βRII同种型B胞外结构域多肽的变体，例如是与SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的多肽或肽段，或任何文本所述的片段。

在一些实施方案中，TGF-β结合部为抗TGF-β抗体或抗原结合片段。在一些实施方案中，TGF-β结合部为针对TGF-β的全长抗体、Fab片段、F(ab')₂片段、Fv片段或单链Fv片段(scFv)。

在一些实施方案中，PD-1结合部和TGF-β结合部之间通过柔性连接子连接。在一些实施方中，所述柔性连接子为GGGS型连接子。在一些具体实施方案中，所述柔性连接子为SEQ ID NO：12所示的连接子。

在一些实施方案中，双功能蛋白包含：

(1)两个完全相同的第一多肽，所述第一多肽包含抗PD-1抗体的重链可变区、重链恒定区、柔性连接子和人TGF-βRII同种型B胞外结构域多肽，所述第一多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列具有至少80%的同一性；和

(2)两个完全相同的第二多肽，所述第二多肽包含抗PD-1抗体的轻链可变区和轻链恒定区，所述第二多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列具有至少80%的同一性。

第二方面，本申请提供了编码第一方面的双功能蛋白的核酸分子。

第三方面，本申请提供了药物组合物，其包含第一方面的双功能蛋白，以及药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体。

在一些实施方案中，所述药物组合物用于预防或治疗恶性肿瘤。在一些具体实施方案中，所述恶性肿瘤选自结直肠癌、乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌、胃癌、前列腺癌、肾癌、宫颈癌、骨髓瘤、淋巴瘤、白血病、甲状腺癌、子宫内膜癌、子宫癌、膀胱癌、神经内分泌恶性肿瘤、头颈癌、肝癌、鼻咽癌、睾丸癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、黑色素瘤、基底细胞皮肤癌、鳞状细胞皮肤癌、隆突性皮肤纤维肉瘤、梅克尔细胞癌、成胶质细胞瘤、胶质瘤、肉瘤、间皮瘤和/或骨髓增生异常综合征。在一些具体实施方案中，所述恶性肿瘤是原位的，转移性的，复发性的，和/或难治性的。

第四方面，本申请提供了第一方面的双功能蛋白或第二方面的核酸分子在制备用于预防或治疗恶性肿瘤的药物中的用途。

在一些实施方案中，所述恶性肿瘤选自结直肠癌、乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌、胃癌、前列腺癌、肾癌、宫颈癌、骨髓瘤、淋巴瘤、白血病、甲状腺癌、子宫内膜癌、子宫癌、膀胱癌、神经内分泌恶性肿瘤、头颈癌、肝癌、鼻咽癌、睾丸癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、黑色素瘤、基底细胞皮肤癌、鳞状细胞皮肤癌、隆突性皮肤纤维肉瘤、梅克尔细胞癌、成胶质细胞瘤、胶质瘤、肉瘤、间皮瘤和/或骨髓增生异常综合征。在一些具体实施方案中，所述恶性肿瘤是原位的，转移性的，复发性的，和/或难治性的。

第五方面，本申请提供了预防或治疗恶性肿瘤的方法，包括向患有恶性肿瘤的个体给予第一方面的双功能蛋白或第三方面的药物组合物。

在一些实施方案中，所述恶性肿瘤选自结直肠癌、乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌、胃癌、前列腺癌、肾癌、宫颈癌、骨髓瘤、淋巴瘤、白血病、甲状腺癌、子宫内膜癌、子宫癌、膀胱癌、神经内分泌恶性肿瘤、头颈癌、肝癌、鼻咽癌、睾丸癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、黑色素瘤、基底细胞皮肤癌、鳞状细胞皮肤癌、隆突性皮肤纤维肉瘤、梅克尔细胞癌、成胶质细胞瘤、胶质瘤、肉瘤、间皮瘤和/或骨髓增生异常综合征。在一些具体实施方案中，所述恶性肿瘤是原位的，转移性的，复发性的，和/或难治性的。

第六方面，本申请提供了制备双功能蛋白的方法，所述双功能蛋白包含PD-1（程序性死亡受体-1）结合部和TGF-β（转化生长因子-β）结合部，并且包括第一方面所述的双功能蛋白，所述方法包括以下步骤：

将包含编码所述双功能蛋白的核酸分子的表达载体引入宿主细胞，并在允许蛋白表达的条件下，培养所述宿主细胞；以及

收集细胞培养物和/或上清，并分离和纯化所述双功能蛋白。

附图说明

图1显示了本申请的示例性PD-1/TGFβ双功能蛋白的结构示意图。

图2显示了报告基因法检测本申请的示例性PD-1/TGFβ双功能蛋白的PD-1端的生物学活性的结果，其中以纳武利尤单抗（Nivolumab）作为对照样品。

图3显示了酶联免疫吸附测定方法检测本申请的示例性PD-1/TGFβ双功能蛋白的TGFβ结合活性的结果。

具体实施方式

序列说明。

SEQ ID NO:1-3为本申请的示例性PD-1/TGFβ双功能蛋白的抗PD-1抗体部分的重链可变区的CDR1-CDR3的序列。

SEQ ID NO:4-6为本申请的示例性PD-1/TGFβ双功能蛋白的抗PD-1抗体部分的轻链可变区的CDR1-CDR3的序列。

SEQ ID NO:7和8分别为本申请的示例性PD-1/TGFβ双功能蛋白的抗PD-1抗体部分的重链可变区和轻链可变区的序列。

SEQ ID NO:9和10分别为本申请的示例性PD-1/TGFβ双功能蛋白的抗PD-1抗体部分的重链恒定区和轻链恒定区的序列。

SEQ ID NO:11为本申请的示例性PD-1/TGFβ双功能蛋白的TGF-β结合部，即，人TGF-βRII同种型B胞外结构域多肽。

SEQ ID NO:12为本申请的示例性PD-1/TGFβ双功能蛋白的抗PD-1抗体部分和TGF-β结合部之间的柔性连接子。

SEQ ID NO:13为本申请的示例性PD-1/TGFβ双功能蛋白的重链部分序列，重链部分由抗PD-1抗体部分的重链、柔性连接子（SEQ ID NO:12）和人TGF-βRII同种型B胞外结构域多肽（SEQ ID NO:11）组成。

SEQ ID NO:14为本申请的示例性PD-1/TGFβ双功能蛋白的轻链部分序列，轻链部分由抗PD-1抗体部分的轻链组成。

SEQ ID NO:15为SEQ ID NO:13的编码核酸序列（不包含信号肽的编码序列）。

SEQ ID NO:16为SEQ ID NO:14的编码核酸序列（不包含信号肽的编码序列）。

SEQ ID NO:17和18分别为对照PD1单抗纳武利尤单抗（Nivolumab）的重链和轻链的序列。

SEQ ID NO:19和14分别为另一对照PD1单抗（来自中国专利申请201610705763.5号（CN106977602））的重链和轻链的序列。

SEQ ID NO:20和18为作为双功能蛋白对照物的纳武利尤单抗/TGF-βRII双功能蛋白的重链部分序列和轻链部分序列，重链部分由纳武利尤单抗的重链（SEQ ID NO:17的C末端氨基酸残基由K突变为A）、柔性连接子（SEQ ID NO:12）和人TGF-βRII同种型B胞外结构域多肽（SEQ ID NO:11）组成，轻链部分由纳武利尤单抗的轻链组成。

SEQ ID NO:21和22为实验对照物IgG1蛋白的重链和轻链的序列。

术语定义。

提供以下定义和方法用以更好地界定本申请以及在本申请实践中指导本领域普通技术人员。除非另外指明，本申请中所用的术语具有本领域技术人员通常所理解的含义。本文所引用的所有专利文献、学术论文及其他公开出版物，其中的全部内容整体并入本文作为参考。

如本文所用术语“抗体”，是指能够经由至少一个位于免疫球蛋白分子的可变区中的抗原识别位点特异性结合到靶标的免疫球蛋白分子。靶标包括但不限于碳水化合物、多聚核苷酸、脂质、多肽等。本文所使用的“抗体”不仅包括完整的(即全长的)抗体，而且还包括其抗原结合片段(例如Fab、Fab'、F(ab')₂、Fv)、其变异体、包含抗体部分的融合蛋白、人源化抗体、嵌合抗体、双抗体、线性抗体、单链抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)及任何其他包含所需特异性的抗原识别位点的免疫球蛋白分子的修改配置，包括抗体的糖基化变体、抗体的氨基酸序列变体及共价修饰的抗体。

通常，完整或全长的抗体包含两个重链和两个轻链。每个重链含有重链可变区(VH)和第一、第二及第三恒定区(CH1、CH2及CH3)。每个轻链含有轻链可变区(VL)和恒定区(CL)。全长的抗体可以是任何种类的抗体，例如IgD、IgE、IgG、IgA或IgM(或上述的子类)，但抗体不需要属于任何特定的类别。根据重链的恒定区的抗体氨基酸序列，可以将免疫球蛋白指定为不同的类别。通常，免疫球蛋白有五种主要的类别：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，而且这些类别中有几个可以再被进一步区分成子类(同型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2。对应于不同免疫球蛋白类别的重链恒定域分别称为α、δ、ε、γ以及μ。不同类别的免疫球蛋白的子单元结构和三维结构是公知的。

本文所用术语“抗原结合片段”是指抗体结构中决定抗原结合能力的部分。本领域技术人员能够理解，抗体结构中决定抗原结合能力的主要部分是CDR，因此CDR也是抗原结合片段的核心组成部分。抗原结合域可以包含重链可变区(VH)、轻链可变区(VL)或上述两者。VH和VL中的每个通常含有三个互补决定区CDR1、CDR2及CDR3。

本领域技术人员公知，互补决定区(CDR，通常有CDR1、CDR2及CDR3)是可变区中对抗体的亲和力和特异性影响最大的区域。VH或VL的CDR序列有两种常见的定义方式，即Chothia定义和kabat定义。(参阅例如Kabat, “Sequences of Proteins ofImmunological Interest”，National Institutes of Health, Bethesda，Md. (1991)；A1-Lazikani等人，J. Mol. Biol. 273:927-948 (1997)；以及Martin等人，Proc. Natl.Acad. Sci.USA86:9268-9272 (1989)。对于给定抗体的可变区序列，可以根据Chothia定义或者Kabat定义来确定VH和VL序列中的CDR序列。

对于给定抗体的可变区序列，可以通过多种方式分析可变区序列中的CDR序列，例如可以利用在线软件Abysis确定(http://www.abysis.org/)。

抗原结合片段的实例包括但不限于：(1)Fab片段，其可以是具有VL-CL链和VH-CH1链的单价片段；(2)F(ab')₂片段，其可以是具有两个Fab'片段的二价片段，该两个Fab'片段由铰链区的二硫桥(即Fab'的二聚物)连接；(3)具有抗体的单臂的VL和VH域的Fv片段；(4)单链Fv(scFv)，其可以是由VH域和VL域经由胜肽连接符组成的单一多胜肽链；以及(5)(scFv)₂，其可以包含两个由胜肽连接符连接的VH域和两个VL域，该两个VL域是经由二硫桥与该两个VH域组合。

本文所用术语“Fab片段”、“Fab部分”或类似的术语是指完整的抗体用木瓜蛋白酶处理后产生的能够与抗原结合的抗体片段，包括完整的轻链(VL-CL)、重链可变区和CH1片段(VH-CH1)。

本文所用术语“单链抗体(scfv, single chain fragment variable)”是指一般利用基因工程技术构建的单链结构的抗体，包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的一条多肽链。在重链可变区和轻链可变区之间通常会设计一段柔性的连接肽(linker)以便重链可变区和轻链可变区可以折叠成为能够结合抗原的正确构象。

如本文所用术语“Fc片段”、“Fc结构域”、“Fc部分”或类似的术语是指抗体重链恒定区的一部分，包括铰链区(hinge)、恒定区的CH2片段和CH3片段。

如本文所用术语“特异性结合”，是指两个分子之间的非随机结合反应，例如抗体至抗原表位的结合。

如本文所用术语“单克隆抗体”指由基本同质的抗体群体获得的抗体，即，除了可能在少量个体中存在自然发生的突变以外，组成群体的各个抗体是相同的。本文所述单克隆抗体特别包括“嵌合”抗体，其中重链和/或轻链的一部分与来源于具体物种或属于具体抗体类或亚类的抗体中的对应序列相同或同源，而重链和/或轻链的余下部分与来源于另一物种或属于另一抗体类或亚类的抗体中的对应序列相同或同源，并且还包括这样的抗体的片段，只要它们能表现出所期望的生物学活性。

如本文所用的术语“同一性”是指两个多核酸序列之间或两个多肽序列之间的序列相似性。两个序列之间的序列比较和同一性百分比测定可以通过national center forbiotechnology institute网站上可得的BLASTN/BLASTP算法的默认设置来进行。

如本文所用的术语“治疗”包括治疗性治疗以及防范性治疗或预防性措施，通过给予受试者治疗剂来减少所述疾病、紊乱，或病症（例如，癌症或肿瘤）的至少一种症状或缓解症状的发展。

如本文所用的术语“EC₅₀”，又称半数有效浓度，是指在规定暴露时间后，能达到50%最大效应的浓度。

第一方面，本申请提供了双功能蛋白，其包含PD-1（程序性死亡受体-1）结合部和TGF-β（转化生长因子-β）结合部。

在一些实施方案中，PD-1结合部为抗PD-1抗体或抗原结合片段。在一些实施方中，PD-1结合部为针对PD-1的全长抗体、Fab片段、F(ab')₂片段、Fv片段或单链Fv片段(scFv)。

在一些实施方案中，抗PD-1抗体或抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含氨基酸序列为GFAFSSYD（SEQ ID NO：1）的HCDR1，氨基酸序列为ISGGGRYT（SEQ ID NO：2）的HCDR2和氨基酸序列为ANRYGEAWFAY（SEQ ID NO：3）的HCDR3，所述轻链可变区包含氨基酸序列为QDINTY（SEQ ID NO：4）的LCDR1，氨基酸序列为RAN（SEQ IDNO：5）的LCDR2和氨基酸序列为LQYDEFPLT（SEQ ID NO：6）的LCDR3。在一些实施方案中，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示，和/或所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQID NO：8所示。在一些实施方案中，抗PD-1抗体或抗原结合片段还包含重链恒定区和轻链恒定区，所述重链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO：9所示，和/或所述轻链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO：10所示。

在一些实施方案中，重链恒定区的氨基酸序列为SEQ ID NO：9的变体，和/或所述轻链恒定区的氨基酸序列为SEQ ID NO：10的变体。在一些具体实施方案中，重链恒定区的氨基酸序列为C末端残基A替换为K的SEQ ID NO：9所示氨基酸序列。对于抗体恒定区的改造是本领域技术人员知晓的。在一些实施方案中，重链恒定区可以选择IgG1、IgG2、IgG3和IgG4或其他类别，尽管IgG1是优选的。在一些实施方案中，抗体恒定区可包含修饰，例如氨基酸的插入、缺失、取代或化学修饰。在一些实施方案中，所述恒定区的任意氨基酸残基可用任意同种异型（allotype）的氨基酸残基取代，优选地，用G1m(3)和/或nG1m(1)的氨基酸残基取代。在一些实施方案中，恒定区包含改变效应功能的突变，例如，将抗体重链恒定区C末端的赖氨酸残基（K）（常见于野生型IgG1型抗体）突变为疏水性氨基酸，如丙氨酸（A）或亮氨酸（L），减少蛋白酶的水解切割，增加血清半衰期，这种改造也特别适合于抗体重链C端进一步融合其他部分的情形。本申请的示例性PD-1/TGFβ双功能蛋白中抗PD-1抗体部分的重链恒定区的C端残基进行了相应处理。

在一些实施方案中，TGF-β结合部为TGF-β受体或TGF-β受体的结合结构域。在一些实施方中，TGF-β结合部为TGF-β受体的胞外结构域或胞外结构域的结合片段。在一些具体实施方案中，TGF-β结合部为人TGF-βRII同种型B胞外结构域多肽，其包含SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列。在一些具体实施方案中，TGF-β结合部为人TGF-βRII同种型B胞外结构域多肽的变体，例如是与SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的多肽或肽段，或任何文本所述的片段。

在一些实施方案中，TGF-β结合部为抗TGF-β抗体或抗原结合片段。在一些实施方案中，TGF-β结合部为针对TGF-β的全长抗体、Fab片段、F(ab')₂片段、Fv片段或单链Fv片段(scFv)。

在一些实施方案中，PD-1结合部和TGF-β结合部之间通过柔性连接子连接。在一些实施方中，所述柔性连接子为GGGS型连接子。在一些具体实施方案中，所述柔性连接子为SEQ ID NO：12所示的连接子。

在某些实施方案中，所述双功能蛋白包含：(1)两个完全相同的第一多肽，所述第一多肽包含抗PD-1抗体的重链可变区、重链恒定区、柔性连接子和人TGF-βRII同种型B胞外结构域多肽，所述第一多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列具有至少80%（例如81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%）的同一性；和(2)两个完全相同的第二多肽，所述第二多肽包含抗PD-1抗体的轻链可变区和轻链恒定区，所述第二多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列具有至少80%（例如81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%）的同一性。

作为非限制性实例，本申请的双功能蛋白（即，PD-1/TGFβ双功能蛋白，后文中又称为“PD1/TGFβRII融合蛋白”或“PD1/TGFβRII”）可以由抗PD-1抗体（其重链可变区、轻链可变区、重链恒定区、轻链恒定区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：7、8、9、10所示）、柔性连接子（SEQ ID NO：12）和人TGF-βRII同种型B胞外结构域多肽（SEQ ID NO：11）组成，其分子结构示意图可参见图1。如图1所示，PD1/TGFβRII以天然抗PD-1抗体为基础，在重链恒定区的CH3末端依次延伸出柔性连接子和人TGF-βRII同种型B胞外结构域多肽。

PD1/TGFβRII是本申请的示例性双功能蛋白，其相对于已报道的纳武利尤单抗/TGF-βRII融合蛋白具有更高的TGFβ结合活性和PD-1端生物学活性，甚至更优的肿瘤抑制效果。此外，其相对于现有的PD-1抗体（例如纳武利尤单抗（Nivolumab））的具有更低的细胞毒性和副作用。鉴于现有的PD-1抗体的细胞毒性和副作用较大，PD1/TGFβRII更低的细胞毒性和副作用使得以更高的剂量施用从而更好地抑制和消耗TGFβ成为可能，剂量安全窗更为理想，有利于高剂量施用和临床应用。

第二方面，本申请提供了编码第一方面的双功能蛋白的核酸分子。

第三方面，本申请提供了药物组合物，其包含第一方面的双功能蛋白，以及药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体。

在一些实施方案中，所述药物组合物用于预防或治疗恶性肿瘤。在一些具体实施方案中，所述恶性肿瘤选自结直肠癌、乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌、胃癌、前列腺癌、肾癌、宫颈癌、骨髓瘤、淋巴瘤、白血病、甲状腺癌、子宫内膜癌、子宫癌、膀胱癌、神经内分泌恶性肿瘤、头颈癌、肝癌、鼻咽癌、睾丸癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、黑色素瘤、基底细胞皮肤癌、鳞状细胞皮肤癌、隆突性皮肤纤维肉瘤、梅克尔细胞癌、成胶质细胞瘤、胶质瘤、肉瘤、间皮瘤和/或骨髓增生异常综合征。在一些具体实施方案中，所述恶性肿瘤是原位的，转移性的，复发性的，和/或难治性的。

在一些实施方案中，药物组合物还可包含润滑剂，如滑石粉、硬脂酸镁和矿物油；润湿剂；乳化剂；悬浮剂；防腐剂，如苯甲酸、山梨酸和丙酸钙；增甜剂和/或调味剂等。

在一些实施方案中，可将本申请中的药物组合物配制为片剂、丸剂、粉剂、锭剂、酏剂、悬液、乳剂、溶液、糖浆、栓剂或胶囊等形式。

在一些实施方案中，可以利用任何生理上可接受的给药方式递送本申请的药物组合物，这些给药方式包括但不限于：口服给药、肠胃外给药、经鼻给药、直肠给药、腹膜内给药、血管内注射、皮下给药、经皮给药、吸入给药等。

在一些实施方案中，可以通过混合具有所需纯度的试剂与视情况的药学上可接受的载体、赋形剂等，以冻干制剂或水溶液的形式配制用于治疗用途的药物组合物用于存储。

第四方面，本申请提供了第一方面的双功能蛋白或第二方面的核酸分子在制备用于预防或治疗恶性肿瘤的药物中的用途。

在一些实施方案中，所述恶性肿瘤选自结直肠癌、乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌、胃癌、前列腺癌、肾癌、宫颈癌、骨髓瘤、淋巴瘤、白血病、甲状腺癌、子宫内膜癌、子宫癌、膀胱癌、神经内分泌恶性肿瘤、头颈癌、肝癌、鼻咽癌、睾丸癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、黑色素瘤、基底细胞皮肤癌、鳞状细胞皮肤癌、隆突性皮肤纤维肉瘤、梅克尔细胞癌、成胶质细胞瘤、胶质瘤、肉瘤、间皮瘤和/或骨髓增生异常综合征。在一些具体实施方案中，所述恶性肿瘤是原位的，转移性的，复发性的，和/或难治性的。

第五方面，本申请提供了预防或治疗恶性肿瘤的方法，包括向患有恶性肿瘤的个体给予第一方面的双功能蛋白或第三方面的药物组合物。

在一些实施方案中，所述恶性肿瘤选自结直肠癌、乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌、胃癌、前列腺癌、肾癌、宫颈癌、骨髓瘤、淋巴瘤、白血病、甲状腺癌、子宫内膜癌、子宫癌、膀胱癌、神经内分泌恶性肿瘤、头颈癌、肝癌、鼻咽癌、睾丸癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、黑色素瘤、基底细胞皮肤癌、鳞状细胞皮肤癌、隆突性皮肤纤维肉瘤、梅克尔细胞癌、成胶质细胞瘤、胶质瘤、肉瘤、间皮瘤和/或骨髓增生异常综合征。在一些具体实施方案中，所述恶性肿瘤是原位的，转移性的，复发性的，和/或难治性的。

第六方面，本申请提供了制备双功能蛋白的方法，所述双功能蛋白包含PD-1（程序性死亡受体-1）结合部和TGF-β（转化生长因子-β）结合部，所述方法包括以下步骤：

将包含编码所述双功能蛋白的核酸分子的表达载体引入宿主细胞，并在允许蛋白表达的条件下，培养所述宿主细胞；以及

收集细胞培养物和/或上清，并分离和纯化所述双功能蛋白。

在不矛盾的情况下，第一方面所述的实施方案和技术特征也适用于第六方面。

在一些实施方案中，所述宿主细胞为哺乳动物细胞，例如CHO细胞。

在一些实施方案中，收集细胞培养物的离心后上清液。

在一些实施方案中，纯化双功能蛋白包括使用亲和层析、阴离子交换层析、阳离子交换层析中的一种或多种。在亲和层析的一些实施方案中，洗脱液中包含蔗糖或甘油。本申请的发明人发现，添加蔗糖或甘油的洗脱液有利于减少融合蛋白的降解。

以下实施例仅用于说明而非限制本申请范围的目的。

实施例1：PD1/TGFβRII融合蛋白的表达。

构建本申请的PD1/TGFβRII融合蛋白，结构示意图如图1所示。将编码本申请的PD1/TGFβRII融合蛋白的重链部分（SEQ ID NO：13）和轻链部分（SEQ ID NO：14）的核苷酸序列合成后克隆到pcDNA3.1表达载体中。采用瞬时或稳定转染的标准方案将PD1/TGFβRII融合蛋白的表达载体共转染到CHO细胞中，将转染后的细胞放置在含有8%CO₂的37℃培养箱中进行培养。

人TGF-βRII同种型B胞外结构域多肽（SEQ ID NO:11），包含于SEQ ID NO:13中：

IPPHVQKSVNNDMIVTDNNGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPD（SEQ IDNO:11）。

连接子的氨基酸序列（SEQ ID NO:12），包含于SEQ ID NO:13中：

GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSG（SEQ ID NO:12）。

PD1/TGFβRII融合蛋白重链的氨基酸序列（SEQ ID NO:13）：

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFAFSSYDMSWVRQAPGKGLDWVATISGGGRYTYYPDSVKGRFTISRDNSKNNLYLQMNSLRAEDTALYYCANRYGEAWFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGAGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGIPPHVQKSVNNDMIVTDNNGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPD（SEQ ID NO:13）。

PD1/TGFβRII融合蛋白轻链的氨基酸序列（SEQ ID NO:14）：

DIQMTQSPSSMSASVGDRVTFTCRASQDINTYLSWFQQKPGKSPKTLIYRANRLVSGVPSRFSGSGSGQDYTLTISSLQPEDMATYYCLQYDEFPLTFGAGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC（SEQ IDNO:14）。

实施例2：PD1/TGFβRII融合蛋白的纯化。

将实施例1获得的细胞培养液经离心后收集上清液，采用Protein A亲和层析进行第一步纯化。平衡缓冲液为10mmol/L磷酸盐缓冲液，pH 6.0。平衡缓冲液冲洗层析柱3~5个柱体积后，将细胞上清液进行上样。上样结束后，用平衡缓冲液冲洗层析柱。然后用淋洗缓冲液（0.5mol/L氯化钠+25mmol/L磷酸盐缓冲液，pH 7.0）进行淋洗，再采用平衡缓冲液平衡3~5个柱体积。最后用洗脱缓冲液（20mmol/L柠檬酸盐缓冲液+5%蔗糖，pH 3.6）冲洗层析柱，收集洗脱样品，样品用2M Tris-盐酸缓冲液（pH 9.5）中和。

将上述中和后的洗脱样品（pH 6.0）进行阴离子交换层析，平衡缓冲液为10mmol/L柠檬酸盐缓冲液+10mmol/L磷酸盐缓冲液+10mmol/L Tris，pH 6.0。平衡缓冲液冲洗层析柱3~5个柱体积后，将上述中和后的洗脱样品进行上样，收集流穿样品，上样结束后用平衡缓冲液冲洗层析柱。

将上述阴离子交换层析的流穿样品进行阳离子交换层析。平衡缓冲液为10mmol/L柠檬酸+10mmol/L磷酸二氢钠+10mmol/L Tris缓冲液，pH 5.0。将上述阴离子层析的流穿样品调节pH至5.0后进行上样，上样完成后用平衡液冲洗层析柱3~5个柱体积。然后用洗脱缓冲液（10mmol/L柠檬酸盐+10mmol/L磷酸盐+10mmol/L Tris缓冲液，pH 9.0）进行洗脱，收集洗脱液。

实施例3：分子排阻色谱法检测PD1/TGFβRII融合蛋白样品。

采用凝胶色谱柱对实施例2纯化得到的PD1/TGFβRII融合蛋白样品的各组分进行分离。用中性pH的缓冲液作为流动相进行洗脱，各分子量组分按照分子量由大到小的顺序依次被洗出。色谱柱为Thermo MabPac^TM SEC-1，5µm 300A，7.8×300mm 规格的凝胶色谱柱，流动相为（20mmol/L磷酸氢二钠+300mmol/L氯化钠+2%异丙醇溶液，pH=7.4）。用流动相将样品稀释至1mg/mL作为供试品溶液，精密量取供试品溶液50μL注入液相色谱仪，在280nm波长处进行检测。流速为0.5 mL/分钟，等度洗脱35分钟。

采用面积归一化法对结果进行定量分析。分别计算高分子量杂质、免疫球蛋白单体和低分子量杂质的峰面积百分比。经检测，PD1/TGFβRII融合蛋白样品高分子量杂质为0.19%，免疫球蛋白单体为99.81%，未检测出低分子量杂质。

以下实施例用到的对照双功能蛋白（纳武利尤单抗/TGF-βRII融合蛋白）按照相同的流程制备，其中纳武利尤单抗的原有重链恒定区的C末端氨基酸残基由K改变为A，与本申请的示例性PD1/TGFβRII融合蛋白保持一致。

实施例4：报告基因法检测PD1/TGFβRII融合蛋白的PD-1端生物学活性。

检测流程描述如下：取对数生长期的CHO-PDL1-CD3L细胞（购买自中国食品药品检定研究院），用DMED/F12完全培养基调整活细胞密度至5×10⁵细胞/mL，按100μL/孔加入到96孔全白板中，置于37℃，含5% CO₂的细胞培养箱中培养，孵育16~20小时。第二天制备Jurkat-PD-1-NFAT细胞（购买自中国食品药品检定研究院）悬液，用含2%FBS的1640基础培养基调整活细胞密度至2×10⁶细胞/mL。将加入CHO-PDL1-CD3L细胞的96孔全白板从培养箱中取出，吸弃上清，以50μL/孔加入Jurkat-PD-1-NFAT细胞悬液，然后将参考PD-1抗体（纳武利尤单抗，SEQ ID NO:17和18分别为重链和轻链的序列）、本申请实施例1-3制备的PD1/TGFβRII融合蛋白的梯度稀释液（初始浓度为200000ng/mL，3倍梯度稀释，共11个稀释梯度）以50μL/孔加入到上述96孔全白板中，置于37℃，含5% CO₂的细胞培养箱中培养，孵育4~6小时。在孵育期间，取出Bio-Lite荧光素酶试剂（Vazyme，DD1201-03），室温融化，待孵育结束后，以100μL/孔加入到上述96孔全白板中，室温避光孵育2~3分钟，使用多功能读板仪（Thermo，Varioskan Flash）读取RLU值。利用Prism软件分析实验数据，绘制参比品和测试品的剂量反应曲线，得到参比品和测试品的EC₅₀值，并计算测试品的生物学活性。

本申请实施例的PD1/TGFβRII融合蛋白的PD-1端生物学活性结果如表1和图2所示，结果显示保留了与人源PD-1的结合能力。

表1 PD1/TGFβRII融合蛋白的PD-1端生物学活性

实施例5：酶联免疫吸附测定方法检测PD1/TGFβRII融合蛋白的TGFβ结合活性。

检测流程如下：

1）以2μg/mL的人源TGFβ1蛋白（Sinobiological，10804-H08H）为抗原，按100μL/孔包被于高吸附96孔板，2~8℃孵育过夜；

2）以250μL/孔PBST20（含0.05% Tween 20的PBS溶液）清洗96孔板3次后，加入250μL/孔封闭液（含3% BSA的PBS溶液），25℃孵育2小时；

3）以250μL/孔PBST20清洗96孔板3次后，以100μL/孔加入梯度稀释的本申请实施例1-3制备的PD1/TGFβRII融合蛋白（初始浓度为4000ng/mL，4倍梯度稀释，共7个稀释度），25℃孵育2小时；

6）以250μL/孔PBST20清洗96孔板3次后，每孔加入100μL 用稀释液1:3500稀释的HRP-羊抗人IgG抗体（PE，NEF802001EA），25℃孵育1小时；

7）以250μL/孔PBST20清洗96孔板5次后，以100μL/孔加入TMB溶液，25℃避光孵育5分钟；

10）以100μL/孔加入1mol/L H₂SO₄终止反应，室温放置5分钟；并通过酶标仪（Thermo Scientific，Varioskan Flash）检测450nm/650nm波长处OD值，Graphpad Prism分析数据。

本申请实施例的PD1/TGFβRII融合蛋白体外结合TGFβ1的结果如表2和图3所示，ELISA结果显示其保留了与TGFβ的结合活性。

表2 PD1/TGFβRII融合蛋白的TGFβ结合活性

实施例6：PD1/TGFβRII融合蛋白对结肠癌细胞MC38/hPD-L1小鼠皮下移植瘤的疗效。

C57/PD-1转基因小鼠（购买于江苏集萃药康生物科技有限公司）作为实验小鼠，每只小鼠皮下接种3×10⁵ 个MC38/hPD-L1细胞，待肿瘤长到40~70mm³，根据肿瘤体积分组，腹腔注射（ip）药物，每2天1次，共6次，注射体积为0.1 mL/10g体重，给药方案见表3，给药的当天为D0。每周两次用游标卡尺测量肿瘤直径，通过下列公式计算所得的T/C%或抑瘤率TGI（%）考察药物对肿瘤生长的影响。实验结束、达到实验终点、或肿瘤体积达到1500mm³，CO₂麻醉处死动物，随后解剖取瘤并拍照。

肿瘤体积（V）计算公式为：

，其中a、b分别表示长、宽；

，其中T、C为实验结束时的治疗组小鼠、阴性对照组小鼠的肿瘤体积，T₀、C₀为实验开始时的治疗组小鼠、阴性对照组小鼠的肿瘤体积，根据治疗组小鼠、阴性对照组小鼠的T/C值分别计算治疗组、阴性对照组的T/C值；抑瘤率

。结果如表4所示，本申请实施例1-3制备的PD1/TGFβRII(3.7 mg/kg，IP，每天2次，共6次)在D19对MC38/hPD-L1小鼠皮下移植瘤的抑瘤率为74%，优于对照PD-1单抗；荷瘤小鼠对药物能够较好耐受，没有明显体重下降等症状发生。

表3 给药方案

表4 PD1/TGFβRII对结肠癌细胞MC38/hPD-L1皮下移植瘤的疗效

注：hIgG4（Sino Biological Inc，HG4K）为阴性对照。对照PD1单抗为中国专利申请201610705763.5号（CN106977602）中的抗体14C12H1L1，重链和轻链氨的基酸序列分别如本申请SEQ ID NO:19和14所示。

实施例7：PD1/TGFβRII融合蛋白的体外活性检测。

参照实施例1-3的方法同批次制备本申请的示例性PD1/TGFβRII融合蛋白和纳武利尤单抗/TGF-βRII融合蛋白。参照实施例4的报告基因法检测PD1/TGFβRII融合蛋白的PD-1端生物学活性，并进行比较，结果表明：本申请的PD1/TGFβRII融合蛋白的PD-1端生物学活性优于纳武利尤单抗/TGF-βRII融合蛋白，结果如表5所示。参照实施例5的酶联免疫吸附测定方法检测PD1/TGFβRII融合蛋白的TGFβ结合活性，并进行比较，结果表明：本申请的PD1/TGFβRII融合蛋白的TGFβ结合活性优于纳武利尤单抗/TGF-βRII融合蛋白，结果如表6所示。本实施例和以下实施例中的纳武利尤单抗/TGF-βRII融合蛋白为内部制备，具有SEQ IDNO:20和18所示的重链和轻链序列。

表5 PD1/TGFβRII融合蛋白的PD-1端生物学活性

表6 PD1/TGFβRII融合蛋白的TGFβ结合活性

实施例8：PD1/TGFβRII融合蛋白对MC38/hPD-L1小鼠移植瘤的疗效。

人源化PD-1小鼠（购买于百奥赛图公司）作为实验小鼠，每只小鼠右侧腋窝下接种4×10⁵个MC38/hPD-L1细胞，待肿瘤长到100~300mm³，随机分成3组，通过腹腔注射（ip）药物，共给药8次，给药方案见表7，给药的当天为D0。每周测2-3次瘤体积，并记录小鼠体重。用游标卡尺测量肿瘤直径，通过下列公式计算T/C（%）或肿瘤体积抑制率（1-T/C）考察药物对肿瘤生长的影响。实验结束时，CO₂麻醉处死动物，随后解剖取瘤并拍照。

肿瘤体积（TV）计算公式为：

，其中a、b分别表示长、宽；相对肿瘤体积（RTV）计算公式为：

，其中TV₀表示D0时小鼠肿瘤体积，TV_t表示每一次测量时小鼠肿瘤体积；相对肿瘤增殖率T/C（%）计算公式为：

，其中T_RTV表示治疗组RTV，C_RTV表示PBS组RTV。

结果如表8和9所示，PD1/TGFβRII和纳武利尤单抗/TGF-βRII（如实施例7所示同批次制备）在D23对MC38/hPD-L1移植瘤小鼠的肿瘤体积抑制率分别为46.8%和32.3%，说明本申请实施例的PD1/TGFβRII的肿瘤抑制效果优于纳武利尤单抗/TGF-βRII。此外，PD1/TGFβRII组和纳武利尤单抗/TGF-βRII组小鼠的体重呈波动上升，说明两种融合蛋白均未引起明显毒性反应。

表7 给药方案

表8 PD1/TGFβRII对MC38/hPD-L1移植瘤小鼠肿瘤体积（TV）的影响

表9 PD1/TGFβRII对MC38/hPD-L1移植瘤小鼠的肿瘤体积抑制率

实施例9：电化学发光方法检测PD1/TGFβRII融合蛋白刺激细胞因子分泌。

用RPMI1640完全培养基调整PBMC细胞浓度至约2×10⁶细胞/mL，按100μL/孔加入到96孔细胞培养板中。用RPMI1640完全培养基分别稀释IgG1蛋白（SEQ ID NO:21和SEQ IDNO:22分别为重链和轻链的序列，内部制备）、LPS（SIGMA，L4391-1MG）、本申请实施例的PD1/TGFβRII融合蛋白，配制成900 μg/mL的IgG1蛋白；1 μg/mL的LPS；10μg/mL、100μg/mL、900μg/mL的PD1/TGFβRII融合蛋白，将RPMI1640完全培养基作为阴性对照。将上述配制好的溶液分别取100μL加入到96孔细胞培养板中，充分混匀，于37℃、5% CO₂细胞培养箱内培养。48小时取出96孔板中的细胞上清，采用V-PLEX Proinflammatory Panel 1 (human)试剂盒（MSD，K15049D-2）检测细胞因子IL-2、IL-6、IL-8、IL-10、TNF-α和IFN-γ的含量，并通过超敏多因子电化学发光仪进行检测（MSD，QuickPlexSQ120），结果如表10所示。

表10 电化学发光方法检测各测试样品刺激细胞因子分泌的结果

由上表结果可以看出，本申请的PD1/TGFβRII融合蛋白表现出引起细胞因子风暴的低可能性，因此，当向受试者给予时基本上不会存在过度激活免疫系统而引发全身性炎症的风险。

实施例10：PD1/TGFβRII融合蛋白对食蟹猴的毒性试验。

单次给药毒性：本试验共4只食蟹猴，每组2只，雌雄各半，设2个组，分别单次静脉注射200、500mg/kg 本申请实施例的PD1/TGFβRII融合蛋白，观察14天。试验期间对一般观察和体重、摄食量、体温、II导联心电图及血压、血液学、血液生化、尿液等指标进行检测，试验结束时进行大体解剖观察。

给药后，各组雄猴可见摄食量一过性降低，至试验第8~9天可恢复。试验第14天，各组雄猴可见RBC、HGB、HCT降低。除此之外，其余指标均未见明显异常改变。在单次给药毒性试验中，食蟹猴单次静脉注射200、500mg/kg 本申请实施例的PD1/TGFβRII融合蛋白，MTD为500 mg/kg。

重复给药毒性：本试验共使用40只食蟹猴，分为4组，每组10只，雌雄各半，分别为空白对照组和15、50、150 mg/kg本申请实施例的PD1/TGFβRII融合蛋白组。每周1次、连续给药4周（共5次），停药恢复观察4周。

给药第15天和给药结束时，50 mg/kg组的雄猴以及150 mg/kg组的雄、雌猴均可见RBC、HGB、HCT降低，RET、RET%代偿性升高；给药第15天，50 mg/kg组的雌猴也可见上述改变。

给药结束时，50 mg/kg组的1只雄猴大体解剖可见心脏心包粘连。组织病理学检查：150 mg/kg组食蟹猴可见轻微~轻度大脑脑膜及脉络丛、小脑脑膜及脉络丛、脊髓脊膜、甲状腺、心脏、垂体单核细胞浸润，轻微~中度心脏、肝脏、膀胱、附睾、精囊腺血管/血管周围炎；50 mg/kg组食蟹猴可见轻微~中度大脑脑膜、坐骨神经、甲状腺、心脏、垂体单核细胞浸润，轻微~中度心脏、膀胱、十二指肠、回肠、直肠、输卵管、阴道、子宫血管/血管周围炎；15mg/kg组食蟹猴可见轻微~轻度大脑脑膜及脉络丛、小脑脉络丛、坐骨神经、甲状腺、心脏单核细胞浸润，轻度心脏血管/血管周围炎。另外，50、150 mg/kg组分别有1只食蟹猴可见轻度股骨坏死、骺板增厚，轻微~轻度股骨干骺端骨小梁、破骨细胞增多。

此外，未见死亡或濒死动物，各组食蟹猴一般状态良好，体重、摄食量、体温、II导联心电图、呼吸频率、血生化、眼科检查、尿液检查、骨髓涂片、脏器重量及系数、IgA、IgM、IgG、C3、C4、CIC、淋巴细胞亚群等免疫相关指标、TSH、T3、T4、脏器重量及系数均未见明显异常改变。

在重复给药毒性试验中，食蟹猴静脉注射15、50、150 mg/kg本申请实施例的PD1/TGFβRII融合蛋白（每周给药1次、连续4周，共给药5次），HNSTD为150 mg/kg。根据EuropeanMedicines Agency中纳武利尤单抗（Nivolumab）的Assessment report披露信息推理认为纳武利尤单抗的HNSTD应当为50 mg/kg，远低于本申请的PD1/TGFβRII融合蛋白的HNSTD。由此可见，本申请的PD1/TGFβRII融合蛋白表现出低的毒性，因此可以预期所述融合蛋白能够在临床上表现出良好的安全性。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 正大天晴药业集团南京顺欣制药有限公司

正大天晴药业集团股份有限公司

<120> 针对PD-1和TGF-β的双功能蛋白

<160> 22

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Gly Phe Ala Phe Ser Ser Tyr Asp

1 5

<210> 2

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Ile Ser Gly Gly Gly Arg Tyr Thr

1 5

<210> 3

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Ala Asn Arg Tyr Gly Glu Ala Trp Phe Ala Tyr

1 5 10

<210> 4

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Gln Asp Ile Asn Thr Tyr

1 5

<210> 5

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Arg Ala Asn

1

<210> 6

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Leu Gln Tyr Asp Glu Phe Pro Leu Thr

1 5

<210> 7

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Asp Trp Val

35 40 45

Ala Thr Ile Ser Gly Gly Gly Arg Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Asn Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Asn Arg Tyr Gly Glu Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 8

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Met Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Phe Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Asn Thr Tyr

20 25 30

Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Thr Leu Ile

35 40 45

Tyr Arg Ala Asn Arg Leu Val Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Gln Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Met Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Glu Phe Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys

100 105

<210> 9

<211> 330

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu

225 230 235 240

Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Ala

325 330

<210> 10

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

1 5 10 15

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

20 25 30

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

35 40 45

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

50 55 60

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

65 70 75 80

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

85 90 95

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

100 105

<210> 11

<211> 136

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 11

Ile Pro Pro His Val Gln Lys Ser Val Asn Asn Asp Met Ile Val Thr

1 5 10 15

Asp Asn Asn Gly Ala Val Lys Phe Pro Gln Leu Cys Lys Phe Cys Asp

20 25 30

Val Arg Phe Ser Thr Cys Asp Asn Gln Lys Ser Cys Met Ser Asn Cys

35 40 45

Ser Ile Thr Ser Ile Cys Glu Lys Pro Gln Glu Val Cys Val Ala Val

50 55 60

Trp Arg Lys Asn Asp Glu Asn Ile Thr Leu Glu Thr Val Cys His Asp

65 70 75 80

Pro Lys Leu Pro Tyr His Asp Phe Ile Leu Glu Asp Ala Ala Ser Pro

85 90 95

Lys Cys Ile Met Lys Glu Lys Lys Lys Pro Gly Glu Thr Phe Phe Met

100 105 110

Cys Ser Cys Ser Ser Asp Glu Cys Asn Asp Asn Ile Ile Phe Ser Glu

115 120 125

Glu Tyr Asn Thr Ser Asn Pro Asp

130 135

<210> 12

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

1 5 10 15

Gly Gly Gly Ser Gly

20

<210> 13

<211> 605

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Asp Trp Val

35 40 45

Ala Thr Ile Ser Gly Gly Gly Arg Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Asn Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Asn Arg Tyr Gly Glu Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro

115 120 125

Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly

130 135 140

Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn

145 150 155 160

Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln

165 170 175

Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser

180 185 190

Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser

195 200 205

Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr

210 215 220

His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Ala Pro Ser

225 230 235 240

Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg

245 250 255

Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro

260 265 270

Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala

275 280 285

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val

290 295 300

Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr

305 310 315 320

Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr

325 330 335

Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu

340 345 350

Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys

355 360 365

Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser

370 375 380

Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp

385 390 395 400

Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser

405 410 415

Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala

420 425 430

Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Ala

435 440 445

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

450 455 460

Gly Gly Gly Ser Gly Ile Pro Pro His Val Gln Lys Ser Val Asn Asn

465 470 475 480

Asp Met Ile Val Thr Asp Asn Asn Gly Ala Val Lys Phe Pro Gln Leu

485 490 495

Cys Lys Phe Cys Asp Val Arg Phe Ser Thr Cys Asp Asn Gln Lys Ser

500 505 510

Cys Met Ser Asn Cys Ser Ile Thr Ser Ile Cys Glu Lys Pro Gln Glu

515 520 525

Val Cys Val Ala Val Trp Arg Lys Asn Asp Glu Asn Ile Thr Leu Glu

530 535 540

Thr Val Cys His Asp Pro Lys Leu Pro Tyr His Asp Phe Ile Leu Glu

545 550 555 560

Asp Ala Ala Ser Pro Lys Cys Ile Met Lys Glu Lys Lys Lys Pro Gly

565 570 575

Glu Thr Phe Phe Met Cys Ser Cys Ser Ser Asp Glu Cys Asn Asp Asn

580 585 590

Ile Ile Phe Ser Glu Glu Tyr Asn Thr Ser Asn Pro Asp

595 600 605

<210> 14

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Met Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Phe Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Asn Thr Tyr

20 25 30

Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Thr Leu Ile

35 40 45

Tyr Arg Ala Asn Arg Leu Val Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Gln Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Met Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Glu Phe Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 15

<211> 1815

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

gaggtacaac tggtggaatc cggtggcggt ctcgtgcagc ctggcggcag cctgagactg 60

agttgtgctg cttctggctt tgccttctcc tcctacgaca tgtcctgggt gcggcaggcc 120

cctggaaagg gcctggattg ggtggccacc atttccggag gcggcagata cacctactac 180

cctgactctg tcaagggccg gttcaccatc tccagagaca actccaagaa caacctgtac 240

ctgcagatga actccctgag agccgaggac accgccctgt actactgcgc caaccggtac 300

ggcgaggctt ggttcgccta ctggggccaa ggcaccctcg tgaccgtatc atccgcctcc 360

acaaagggcc cttctgtgtt ccctctggcc ccttcctcca agtctacaag cggaggcacc 420

gctgctctgg gctgcctggt caaggactac ttccccgaac ccgtgaccgt gtcttggaac 480

tccggcgctc tgacctctgg agtgcatacc ttccctgccg tgctgcagtc ctccggcctg 540

tactctctgt ccagcgtggt caccgtgcct agcagcagtc tgggaaccca gacatacatc 600

tgcaacgtga accacaagcc ctccaataca aaagtggaca agaaggtgga gcctaaatcc 660

tgcgacaaga cccacacctg tcctccttgc cctgctcctg aggccgctgg cgccccttct 720

gtgtttctgt tcccccctaa gcccaaggac accctgatga tctcccggac ccccgaggtg 780

acctgcgtgg tggtggacgt gtcccacgag gaccctgaag tgaagttcaa ctggtacgtg 840

gatggcgtgg aagtgcacaa cgccaagacc aagcctagag aggagcagta caacagcacc 900

tacagagtgg tctccgtgct gaccgttctg caccaggact ggctgaacgg caaggagtac 960

aagtgcaagg tgtccaacaa ggccctgccc gcccctatcg agaagaccat ctctaaggct 1020

aagggccagc ctagagaacc tcaagtgtac accctgcctc catctcggga tgagctgaca 1080

aagaatcagg tgtctctgac ctgtctggtg aagggcttct acccctctga catcgccgtg 1140

gagtgggagt ctaacggcca gcccgagaac aactacaaga ccacccctcc tgtgctggac 1200

tccgacggct ccttcttcct gtactccaag ctgaccgtgg acaagtctag atggcagcag 1260

ggcaacgtgt tctcctgctc cgtgatgcac gaggccctgc acaaccacta cacacagaaa 1320

tccctgtccc tgtcccctgg cgctggaggc ggtggctccg gcggcggcgg ctccggtggc 1380

ggaggctccg gaggcggcgg ctctggcatc ccccctcacg tgcagaagag cgtcaacaac 1440

gatatgatcg tgaccgacaa caacggagct gtgaagtttc ctcaactgtg caagttctgc 1500

gacgtcagat tctctacctg tgataaccag aagtcctgca tgtccaactg cagcatcacc 1560

tccatctgcg agaaacctca agaggtgtgc gtggctgtgt ggcggaagaa cgacgaaaac 1620

atcaccctgg aaaccgtatg tcacgatcct aagctgcctt accacgactt catcctggaa 1680

gatgccgcct ctcccaagtg catcatgaaa gagaagaaga aacccggcga gacctttttc 1740

atgtgctctt gctccagcga cgagtgcaac gacaatatca tcttcagcga ggaatacaac 1800

accagcaacc ctgac 1815

<210> 16

<211> 642

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

gatatccaga tgacccagtc cccctcctcc atgtccgcct ccgtgggcga cagagtgacc 60

ttcacctgca gagcttctca ggacatcaac acctacctgt cctggttcca gcagaagcct 120

ggcaagtctc ctaagaccct gatctacaga gccaaccggc tggtgtccgg cgtgccttct 180

cggttctccg gatctggctc tggccaggat tacaccctga ccatctcctc tctgcagcct 240

gaggacatgg ccacctacta ctgcctgcag tacgacgagt tccctctgac attcggcgct 300

ggcaccaagc tggaactgaa gcggaccgtg gccgctccta gcgtgttcat cttccctcct 360

tccgacgaac aactgaagtc cggcaccgcc tctgtggtgt gcctgctgaa caacttctac 420

cctagagagg ccaaggtgca gtggaaggtg gacaacgccc tgcaaagcgg caactcccaa 480

gagtccgtca ccgagcagga cagcaaggac tccacctact ccctgtcttc tacactgacc 540

ctgtccaagg ccgactacga gaagcacaag gtgtacgcct gcgaggtgac acaccagggc 600

ctgagctccc ctgtgaccaa gtccttcaac agaggcgagt gc 642

<210> 17

<211> 440

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Asp Cys Lys Ala Ser Gly Ile Thr Phe Ser Asn Ser

20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Lys Arg Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Phe

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Thr Asn Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser

100 105 110

Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser

115 120 125

Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp

130 135 140

Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr

145 150 155 160

Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr

165 170 175

Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys

180 185 190

Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp

195 200 205

Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala

210 215 220

Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro

225 230 235 240

Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val

245 250 255

Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val

260 265 270

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln

275 280 285

Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln

290 295 300

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly

305 310 315 320

Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro

325 330 335

Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr

340 345 350

Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser

355 360 365

Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr

370 375 380

Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr

385 390 395 400

Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe

405 410 415

Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys

420 425 430

Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

435 440

<210> 18

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Ser Asn Trp Pro Arg

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 19

<211> 448

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Asp Trp Val

35 40 45

Ala Thr Ile Ser Gly Gly Gly Arg Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Asn Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Asn Arg Tyr Gly Glu Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro

115 120 125

Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly

130 135 140

Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn

145 150 155 160

Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln

165 170 175

Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser

180 185 190

Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser

195 200 205

Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr

210 215 220

His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Ala Pro Ser

225 230 235 240

Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg

245 250 255

Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro

260 265 270

Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala

275 280 285

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val

290 295 300

Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr

305 310 315 320

Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr

325 330 335

Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu

340 345 350

Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys

355 360 365

Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser

370 375 380

Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp

385 390 395 400

Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser

405 410 415

Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala

420 425 430

Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

435 440 445

<210> 20

<211> 597

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Asp Cys Lys Ala Ser Gly Ile Thr Phe Ser Asn Ser

20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Lys Arg Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Phe

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Thr Asn Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser

100 105 110

Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser

115 120 125

Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp

130 135 140

Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr

145 150 155 160

Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr

165 170 175

Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys

180 185 190

Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp

195 200 205

Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala

210 215 220

Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro

225 230 235 240

Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val

245 250 255

Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val

260 265 270

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln

275 280 285

Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln

290 295 300

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly

305 310 315 320

Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro

325 330 335

Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr

340 345 350

Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser

355 360 365

Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr

370 375 380

Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr

385 390 395 400

Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe

405 410 415

Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys

420 425 430

Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

435 440 445

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Ile Pro Pro

450 455 460

His Val Gln Lys Ser Val Asn Asn Asp Met Ile Val Thr Asp Asn Asn

465 470 475 480

Gly Ala Val Lys Phe Pro Gln Leu Cys Lys Phe Cys Asp Val Arg Phe

485 490 495

Ser Thr Cys Asp Asn Gln Lys Ser Cys Met Ser Asn Cys Ser Ile Thr

500 505 510

Ser Ile Cys Glu Lys Pro Gln Glu Val Cys Val Ala Val Trp Arg Lys

515 520 525

Asn Asp Glu Asn Ile Thr Leu Glu Thr Val Cys His Asp Pro Lys Leu

530 535 540

Pro Tyr His Asp Phe Ile Leu Glu Asp Ala Ala Ser Pro Lys Cys Ile

545 550 555 560

Met Lys Glu Lys Lys Lys Pro Gly Glu Thr Phe Phe Met Cys Ser Cys

565 570 575

Ser Ser Asp Glu Cys Asn Asp Asn Ile Ile Phe Ser Glu Glu Tyr Asn

580 585 590

Thr Ser Asn Pro Asp

595

<210> 21

<211> 446

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

Glu Val Gln Leu Glu Gln Ser Gly Ala Glu Leu Met Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Thr Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr

20 25 30

Trp Ile Glu Trp Ile Lys Gln Arg Pro Gly His Ser Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Glu Ile Leu Pro Gly Ser Asp Ser Thr Tyr Tyr Asn Glu Lys Val

50 55 60

Lys Gly Lys Val Thr Phe Thr Ala Asp Ala Ser Ser Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Asp Gly Phe Tyr Val Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu

100 105 110

Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala

115 120 125

Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu

130 135 140

Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly

145 150 155 160

Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser

165 170 175

Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu

180 185 190

Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr

195 200 205

Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr

210 215 220

Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe

225 230 235 240

Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro

245 250 255

Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val

260 265 270

Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr

275 280 285

Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val

290 295 300

Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys

305 310 315 320

Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser

325 330 335

Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro

340 345 350

Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val

355 360 365

Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly

370 375 380

Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp

385 390 395 400

Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp

405 410 415

Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His

420 425 430

Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

435 440 445

<210> 22

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Asp Ser Val Ser Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Asn

20 25 30

Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser His Glu Ser Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Lys Tyr Thr Ser Gln Ser Met Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Thr

65 70 75 80

Glu Asp Phe Gly Val Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Gly Ser Trp Pro Arg

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Asp Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

Claims (7)

1.一种双功能蛋白，其包含PD-1结合部和TGF-β结合部，以及将所述PD-1结合部和所述TGF-β结合部连接的连接子，其中：

所述PD-1结合部为抗PD-1抗体，所述抗PD-1抗体包含如SEQ ID NO：7所示的重链可变区，如SEQ ID NO：8所示的轻链可变区，如SEQ ID NO：9所示的重链恒定区，以及如SEQ IDNO：10所示的轻链恒定区；

所述TGF-β结合部为人TGF-βRII同种型B胞外结构域多肽，所述人TGF-βRII同种型B胞外结构域多肽具有如SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列；

所述连接子是柔性连接子，所述柔性连接子具有如SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列。

2.一种核酸分子，其编码权利要求1所述的双功能蛋白。

3.一种药物组合物，其包含权利要求1所述的双功能蛋白或权利要求2所述的核酸分子，以及药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体。

4.权利要求3所述的药物组合物在制备用于预防或治疗恶性肿瘤的药物中的用途。

5.如权利要求4所述的用途，其中所述恶性肿瘤选自结直肠癌、乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌、胃癌、前列腺癌、肾癌、宫颈癌、骨髓瘤、淋巴瘤、白血病、甲状腺癌、子宫内膜癌、子宫癌、膀胱癌、神经内分泌恶性肿瘤、头颈癌、肝癌、鼻咽癌、睾丸癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、黑色素瘤、基底细胞皮肤癌、鳞状细胞皮肤癌、隆突性皮肤纤维肉瘤、梅克尔细胞癌、成胶质细胞瘤、胶质瘤、肉瘤、间皮瘤和/或骨髓增生异常综合征。

6.如权利要求5所述的用途，其中所述恶性肿瘤是原位的，转移性的，复发性的，和/或难治性的。

7.一种制备权利要求1所述的双功能蛋白的方法，所述方法包括以下步骤：

将包含编码所述双功能蛋白的核酸分子的表达载体引入宿主细胞，并在允许蛋白表达的条件下，培养所述宿主细胞；以及

收集细胞培养物和/或上清，并分离和纯化所述双功能蛋白。

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