CN112939971A - 一种香豆素类化合物及其制备方法和应用 - Google Patents
一种香豆素类化合物及其制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了具有不同通式结构的香豆素类化合物及其药学上可接受的盐、溶剂化物、多晶型物、互变异构体、代谢产物或前药。本发明还公开了上述化合物作为NEDD8激活酶抑制剂的作用以及在制备用于治疗与NEDD8激活酶异常有关的疾病的药物中的用途。本发明还公开了用于制备上述香豆素类化合物的中间体及其制备方法。药理结果显示，该化合物具有良好的NEDD8抑制活性、抗肿瘤细胞增殖作用、促进肿瘤细胞凋亡作用。
Description
技术领域
本发明属于医药领域，具体涉及一种香豆素类化合物及其制备方法和应用。
背景技术
恶性肿瘤是一大类严重危害人类健康的常见多发疾病，其致死率高，仅次于心脑血管疾病。据世 界卫生组织统计，2012年全世界约有820万人死于癌症，预计2030年因癌症死亡的人数将超过1100 万。中国是癌症发病率和病死率较高的国家，每年因此造成的经济损失高达数千亿元，并且随着人口 老龄化、生态及生活环境的恶化，这种趋势更有可能加剧。因此，寻找治疗肿瘤的有效药物备受关注。
在真核细胞中，泛素蛋白酶体系统(UPS)负责蛋白质的降解，并在维持细胞内蛋白质动态平衡 中担当重要角色。UPS的底物蛋白参与诸如细胞周期调节、细胞生长及增殖、信号传导、DNA修复 及细胞凋亡信号传导过程。因此，UPS失调则会导致一些信号通路的异常激活或抑制，进而可能发展 成为肿瘤或其他相关疾病。在UPS中，泛素首先由泛素激活酶(E1)ATP依赖性激活；其次通过转 硫醇作用转移至泛素结合酶(E2)上，形成泛素-E2复合物；然后在泛素连接酶(E3)的作用下转移 至待降解底物的赖氨酸残基上；最后底物蛋白被多个泛素修饰后，经蛋白酶体26S识别并降解。
泛素化过程的3个酶中，E3具有严格的底物特异性。目前已知RING-finger E3s(CRLs)是UPS E3 中最大的一个蛋白家族。它的底物蛋白包括很多与肿瘤相关的细胞调控蛋白,如Cdt-1,p27,pIκBα, NRF2,HIF-1α,Cyclin E,c-Jun,J-catenin,Cdc25A,Emi1,c-Myc,mTOR,BimEL等(Genes&Cancer. 2012,1:708–716)。经研究发现只有当CRLs被一个类泛素NEDD8修饰后才具有催化活性(Mol Cell Biol 2000,20:2326–2333)。
NEDD8是由81个氨基酸残基组成的蛋白质，与泛素有60％的一致性和80％同源性。它通过级 联酶促反应特异性与待修饰蛋白结合的过程被称为Neddylation。该过程与UPS类似：首先，成熟的 NEDD8在NEDD8激活酶(E1)催化下，ATP依赖性激活；然后被转移至NEDD8结合酶(E2)； 最后在NEDD8连接酶(E3)作用下，共价连接于被修饰蛋白上。NEDD8激活酶为NEDD8通路中 的限速酶，因此可以通过调节NEDD8激活酶的活性，来调节NEDD8通路以及泛素蛋白酶体通路活 性，从而达到治疗肿瘤的目的。由于NEDD8通路处于泛素蛋白酶体通路的上游，通过抑制NEDD8 激活酶，降低Neddylation活性，特异性下调泛素蛋白酶体通路中相关E3(CRLs)的活性，从而特 异性减少细胞内与肿瘤相关蛋白的降解。
WO2007092213A2公开了第一个NEDD8激活酶抑制剂MLN4924的结构、制备方法及其作为 抗肿瘤药物的应用。MLN4924目前正处于一期临床研究。MLN4924在NEDD8激活酶催化下，与NEDD8形成NEDD8-MLN4924复合物，并由该复合物选择性抑制NEDD8激活酶活性，从而抑制 NEDD8通路(Mol.Cell,2010,37:102-111)。除MLN4924以外，目前没有其他NEDD8激活酶抑制 剂进入临床实验，更无NEDD8激活酶抑制剂药物上市，因此寻找及开发新型NEDD8激活酶抑制剂 将对癌症治疗具有十分重要的意义。
发明内容
发明目的：本发明要解决的技术问题在于提出一种香豆素类化合物及其制备方法。
本发明还要解决的技术问题在于提供上述香豆素类化合物作为新的NEDD8激活酶抑制剂的应用。
本发明还要解决的技术问题在于提出用于制备香豆素类化合物的一种中间体及其制备方法。
为实现上述目的，本发明的技术方案如下：
除非另有定义，否则本文所有科技术语具有的涵义与权利要求主题所属领域技术人员通常理解的 涵义相同。除非另有说明，本文全文引用的所有专利、专利申请、公开材料通过引用方式整体并入本 文。应理解，上述简述和下文的详述为示例性且仅用于解释，而不对本发明主题作任何限制。在本申 请中，除非另有具体说明，否则使用单数时也包括复数。必须注意，除非文中另有清楚的说明，否则 在本说明书和权利要求书中所用的单数形式包括所指事物的复数形式。还应注意，除非另有说明，否 则所用"或"、"或者"表示"和/或"。此外，所用术语"包括"以及其它形式，例如"包含"、"含"和"含有" 并非限制性。
在本申请中，术语"卤素"是指氟、氯、溴或碘。
“醛基”是指-CHO基团。
在本申请中，作为基团或是其它基团的一部分(例如用在卤素取代的烷基等基团中)，术语“烷基” 意指仅由碳原子和氢原子组成、不含不饱和键、具有例如l至12个(优选为1至8个，更优选为1 至6个)碳原子且通过单键与分子的其余部分连接的直链或支链的烃链基团。烷基的实例包括但不限 于甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、2-甲基丁基、2.2- 二甲基丙基、正己基、庚基、2-甲基己基、3-甲基己基、辛基、主基和类基等。
在本申请中，术语“烷氧基”是指式-ORa基团，其中Ra为如上文所定义的烷基。烷氧基的实例 包括但不限于甲氧基、乙氧基、异丙氧基、正丁氧基、异丁氧基、仲丁氧基和叔丁氧基等。
在本申请中“任选的”或“任选地”表示随后描述的事件或状况可能发生也可能不发生，且该描 述同时包括该事件或状况发生和不发生的情况。例如“任选地被取代的芳基”表示芳基被取代或未被 取代，且该描述同时包括被取代的芳基与未被取代的芳基。
本文所用术语“部分”、“结构部分”、“化学部分”、“基团”、“化学基团”是指分子中的特定片段 或官能团。化学部分通常被认为是嵌入或附加到分子上的化学实体。
“互变异构体”是指质子从分子的一个原子转移至相同分子的另一个原子而形成的异构体。本发 明的化合物的所有互变异构形式也将包含在本发明的范围内。
在本申请中，术语"药学上可接受的盐"包括药学上可接受的酸加成盐。“药学上可接受的酸加成 盐”是指能够保留游离碱的生物有效性而无其它副作用的，与无机酸或有机酸所形成的盐。无机酸盐 包括但不限于盐酸盐、氢溴酸盐、硫酸盐、硝酸盐、磷酸盐等；有机酸盐包括但不限于甲酸盐、乙酸 盐、2.2-二氯乙酸盐、三氟乙酸盐、丙酸盐、己酸盐、辛酸盐、癸酸盐、十一碳烯酸盐、乙醇酸盐、 葡糖酸盐、乳酸盐、癸二酸盐、己二酸盐、戊二酸盐、丙二酸盐、草酸盐、马来酸盐、琥珀酸盐、富 马酸盐、酒石酸盐、柠檬酸盐、棕榈酸盐、硬脂酸盐、油酸盐、肉桂酸盐、月桂酸盐、苹果酸盐、谷 氨酸盐、焦谷氨酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、甲磺酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐、海藻酸盐、抗 坏血酸盐、水杨酸盐、4-氨基水杨酸盐、荼二磺酸盐等。这些盐可通过本专业己知的方法制备。
优选地，文中所述药学上可接受的盐是所述化合物与盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、甲磺酸、对甲 苯磺酸、柠檬酸、酒石酸、乳酸、丙酮酸、乙酸、马来酸、琥珀酸、富马酸、水杨酸、苯基乙酸或杏 仁酸等形成的酸加成盐。
“多晶型物”是指本发明的某些化合物在固体状态下由于存在两种或两种以上不同分子排列而产 生的不同固体结晶相。本发明的某些化合物可以存在多于一种晶型，本发明旨在包括各种晶型及其混 合物。
通常，结晶化作用会产生本发明化合物的溶剂化物。本发明中使用的术语“溶剂化物”是指包含 一个或多个本发明化合物分子与一个或多个溶剂分子的聚集体。溶剂可以是水，该情况下的溶剂化物 为水合物。或者，溶剂可以是有机溶剂。因此，本发明的化合物可以以水合物存在，包括单水合物、 二水合物、半水合物、倍半水合物、三水合物、四水合物等，以及相应的溶剂化形式。本发明化合物 可形成真实的溶剂化物，但在某些情况下，也可以仅保留不定的水或者水加上部分不定溶剂的混合物。 本发明的化合物可以在溶剂中反应或者从溶剂中沉淀析出或结晶出来。本发明化合物的溶剂化物也包 含在本发明的范围之内。
本申请中“代谢产物”是指药物被机体吸收后，在酶的作用下经过体内的官能团化反应(I相生 物转化反应，包括氧化、还原、水解等)和结合反应(II相生物转化反应)等生物转化而产生的化合物。
本发明还包括上述化合物的前药。在本申请中，术语“前药”表示可在生理学条件下或通过溶剂 分解而被转化成本发明的生物活性化合物的化合物。因此，术语“前药”是指本发明的化合物的药学 上可接受的代谢前体。当被给予有需要的个体时，前药可以不具有活性，但在体内被转化成本发明的 活性化合物。前药通常在体内迅速转化，而产生本发明的母体化合物，例如通过在血液中水解来实现。 前药化合物通常在哺乳动物生物体内提供溶解度、组织相容性或缓释的优点。前药包括己知的氨基保 护基和羧基保护基。具体的前药制备方法可参照Saulnier,M.G.,et a1.,Bioorg.Med.Chem.Lett.1994, 4,1985-1990；Greenwald.R.B.,et a1.,J Med.Chem.2000.43.475。
在本申请中“药物组合物”是指本发明化合物与本领域通常接受的用于将生物活性化合物输送至 哺乳动物(例如人)的介质的制剂。该介质包括药学上可接受的载体。药物组合物的目的是促进生物 体的给药，利于活性成分的吸收进而发挥生物活性。
本文所用术语“药学上可接受的”是指不影响本发明化合物的生物活性或性质的物质(如载体或 稀释剂)，并且相对无毒，即该物质可施用于个体而不造成不良的生物反应或以不良方式与组合物中 包含的任意组分相互作用。
在本申请中“药学上可接受的载体”包括但不限于任何被相关的政府管理部门许可为可接受供人 类或家畜使用的佐剂、载体、赋形剂、助流剂、增甜剂、稀释剂、防腐剂、染料、着色剂、矫昧剂、 表面活性剂、润湿剂、分散剂、助悬剂、稳定剂、等渗剂、溶剂或乳化剂。
本文所用的术语“治疗”和其它类似的同义词包括以下含义：
1.预防疾病或病症在哺乳动物中出现，特别是当这类哺乳动物易患有该疾病或病症，但尚未被 诊断为己患有该疾病或病症时；
2.抑制疾病或病症，即遏制其发展；
3.缓解疾病或病症，即，使该疾病或病症的状态消退；或者
4.减轻该疾病或病症所造成的症状。
本文所使用术语“有效量”、“治疗有效量”或“药学有效量”是指服用后足以在某种程度上缓解 所治疗的疾病或病症的一个或多个症状的至少一种药剂或化合物的量。其结果可以为迹象、症状或病 因的消减和/或缓解，或生物系统的任何其它所需变化。例如，用于治疗的“有效量”是在临床上提 供显著的病症缓解效果所需的包含本文公开化合物的组合物的量。可使用诸如剂量递增试验的技术测 定适合于任意个体病例中的有效量。
本文所使用术语“药物组合”、“药物联用”、“联合用药”、“施用其它治疗”、“施用其它治疗剂” 等是指通过混合或组合不止一种活性成分而获得的药物治疗，其包括活性成分的固定和不固定组合。 术语“固定组合”是指以单个实体或单个剂型的形式向患者同时施用至少一种本文所述的化合物和至 少一种协同药剂。术语“不固定组合”是指以单独实体的形式向患者同时施用、合用或以可变的间隔 时间顺次施用至少一种本文所述的化合物和至少一种协同制剂。这些也应用到鸡尾酒疗法中，例如施 用三种或更多种活性成分。
本发明提供了具有通式I的香豆素类化合物，及其药学上可接受的盐、溶剂化物、多晶型物、互 变异构体、代谢产物或前药，
其中：
n为取代基R的数目，n为1或2；
R独立地选自烷基、环烷基、烷氧基、醛基、芳香基或芳香氧基，且R任选地被一个或多个 选自卤素取代。
在本发明的一些实施方案中，所述化合物为叔丁基(1-(8-环戊基-6-(3,4-二甲基苯基)-7- 氧代-7,8-二氢吡啶并[2,3-d]嘧啶-2-基)哌啶-4-基)(苯乙基)氨基甲酸酯、8-环戊基-2-(4-(苯乙 基氨基)哌啶-1-基)-6-苯基吡啶并[2,3-d]嘧啶-7-酮、-环戊基-6-(4-氟-3-甲基苯基)-2-(4-(苯 乙基氨基)哌啶-1-基)吡啶并[2,3-d]嘧啶-7-酮、8-环戊基-6-(3-氟-4-甲基苯基)-2-(4-(苯乙基 氨基)哌啶-1-基)吡啶并[2,3-d]嘧啶-7-酮、5-(8-环戊基-7-氧代-2-(4-(苯乙基氨基)哌啶-1-基) -7,8-二氢吡啶并[2,3-d]嘧啶-6-基)-2-氟苯甲醛、3-(8-环戊基-7-氧代-2-(4-(苯乙基氨基)哌啶 -1-基)-7,8-二氢吡啶并[2,3-d]嘧啶-6-基)苯甲醛、8-环戊基-2-(4-(苯乙基氨基)哌啶-1-基)-6- (2-(三氟甲基)苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶-7-酮、8-环戊基-2-(4-(苯乙基氨基)哌啶-1-基)-6- (4-(三氟甲基)苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶-7-酮、8-环戊基-2-(4-(苯乙基氨基)哌啶-1-基)-6- (3-(三氟甲基)苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶-7-酮、8-环戊基-6-(2-甲氧基苯基)-2-(4-(苯乙基氨 基)哌啶-1-基)吡啶并[2,3-d]嘧啶-7-酮、8-环戊基-6-(4-甲氧基苯基)-2-(4-(苯乙基氨基)哌 啶-1-基)吡啶并[2,3-d]嘧啶-7-酮、8-环戊基-6-(3-甲氧基苯基)-2-(4-(苯乙基氨基)哌啶-1-基) 吡啶并[2,3-d]嘧啶-7-酮、6-([1,1'-联苯]-4-基)-8-环戊基-2-(4-(苯乙基氨基)哌啶-1-基)吡啶 并[2,3-d]嘧啶-7-酮或8-环戊基-2-(4-(苯乙基氨基)哌啶-1-基)-6-(4-苯氧基苯基)吡啶并[2,3-d] 嘧啶-7-酮。
本发明还提供了具有通式II的香豆素类化合物，及其药学上可接受的盐、溶剂化物、多晶型 物、互变异构体、代谢产物或前药，
其中：
R’独立地选自苯基或吡啶基，且R’任选地被一个或多个选自卤素或甲基取代。
在本发明的一些实施方式中，所述化合物为(1-(8-环戊基-7-氧代-6-(苯基乙炔基)-7,8-二 氢吡啶并[2,3-d]嘧啶-2-基)哌啶-4-基)(苯乙基)氨基甲酸叔丁酯、8-环戊基-2-(4-(苯乙基氨基) 哌啶-1-基)-6-(间甲苯基乙炔)吡啶并[2,3-d]嘧啶-7-酮、8-环戊基-2-(4-(苯乙基氨基)哌啶-1- 基)-6-(吡啶-3-乙炔基)吡啶并[2,3-d]嘧啶-7-酮或6-((4-氯苯基)乙炔基)-8-环戊基-2-(4-(苯 乙基氨基)哌啶-1-基)吡啶并[2,3-d]嘧啶-7-酮。
本发明进一步提出了上述两种香豆素类化合物中的任意一种作为NEDD8激活酶抑制剂的用 途。
本发明的另一方面提出了一种药物组合物，所述药物组合物含有治疗有效剂量的上述两种香 豆素类化合物中的任意一种或其立体异构体或药学上可接受的盐、以及药学上可接受的载体和赋 形剂。
本发明还提出了上述两种香豆素类化合物中的任意一种、以及上述药物组合物在制备用于治 疗与NEDD8激活酶异常有关的疾病的药物中的用途。
其中，所述的与NEDD8激活酶异常有关的疾病为肿瘤。
具体地，所述的肿瘤为白血病、卵巢癌、结肠癌、肺癌、胃癌或前列腺癌 本发明提出了两种通式结构的香豆素类化合物的药理结果显示具有良好的NEDD8抑制活性、抗肿瘤细 胞增殖作用、促进肿瘤细胞凋亡作用。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。给出了详细的实施方式和具体的操作过程，实 施例将有助于理解本发明，但是本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1：8-环戊基-2-(4-(苯乙基氨基)哌啶-1-基)-6-(3,4-二甲基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶-7-酮 (化合物1)的合成。
合成路线：
步骤1化合物1-1的合成：500mL圆底烧瓶中加入原料4-氯-2-甲硫基嘧啶-5-羧酸乙酯(36.5g， 156.9mmol)，用300mLTHF溶解，再依次加入环戊胺(20.0g，235.3mmol)和三乙胺(31.8g，313.8 mmol)，室温搅拌1h后，反应完毕。过滤，滤液减压蒸馏除去THF，加入300mL乙酸乙酯溶解， 用饱和NH4Cl溶液洗涤(200mL*3)，再用饱和食盐水洗涤(200mL*3)，有机相用无水Na2SO4干燥，过滤，滤液减压蒸馏除去溶剂，再加入20mL甲苯并浓缩除去甲苯，得黄色油状液体产品42.7 g，Yield＝96.1％。1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ:8.52(d,J＝1.8Hz,1H),8.18(d,J＝6.6Hz,1H),4.40 (q,J＝6.6Hz,1H),4.27(q,J＝7.2Hz,2H),2.50(d,J＝8.4Hz,3H),2.01(t,J＝5.1Hz,2H),1.58-1.72(m, 4H),1.47-1.55(m,2H),1.29(q,J＝6.9Hz,3H).ESI-MS(m/z):282.1[M+H]+.
步骤2化合物1-2的合成：250mL圆底烧瓶中加入80mL无水THF，冰浴搅拌至0℃，加入氢 化铝锂(2.7g，71.1mmol)，N2保护下冰浴搅拌30min。冰浴条件下用恒压滴液漏斗缓慢滴加化合物 1-1(10.0g，35.4mmol)的无水THF溶液(40mL)，滴加完毕后室温搅拌反应3h。反应结束，冰 浴降温，慢慢依次滴加2.7mL H2O,5.4mL 15％NaOH水溶液，2.7mL H2O，过滤，滤饼用乙酸乙酯 洗涤，合并滤液，浓缩，加入300mL乙酸乙酯溶解，用饱和食盐水洗涤(100mL*3)，有机相用无 水Na2SO4干燥，过滤，滤液浓缩得黄色固体粗品。加入40mL正己烷/乙酸乙酯混合溶液(100:1) 打浆，过滤，滤饼用正己烷洗涤，收集滤饼，烘干得6.97g淡黄色粉末状固体产品，Yield＝81.9％， m.p.124-125℃。1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ:7.80(s,1H),6.47(d,J＝6.3Hz,1H),5.12(t,J＝5.4Hz, 1H),4.32(t,J＝8.2Hz,3H),2.45(d,J＝26.4Hz,3H),1.93(q,J＝4.8Hz,2H),1.44-1.68(m,6H).ESI-MS (m/z):240.1[M+H]+.
步骤3化合物1-3的合成：250mL圆底烧瓶中加入化合物1-2(10.0g，41.8mmol)及120mL二 氯甲烷，搅拌溶解，12h内分三批加入活性MnO2(43.6g，501.4mmol)，室温搅拌。TLC监测反应， 反应完毕后用硅藻土过滤，滤饼用DCM洗涤，滤液浓缩得粗品。柱层析纯化(PE:EA＝15:1)得 9.0g淡黄色油状液体产品，Yield＝90.8％。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ:9.74(s,1H),8.56(d,J＝6Hz, 1H),8.52(s,1H),4.44(q,J＝7Hz,1H),2.51(s,3H),1.99-2.05(m,2H),1.70(t,J＝5.2Hz,2H),1.61(t,J ＝5.5Hz,2H),1.49-1.55(m,2H).ESI-MS(m/z):238.1[M+H]+.
步骤4化合物1-4的合成：250ml圆底烧瓶中加入100mL无水THF，冰浴15min后加入NaH (0.56g，23.2mmol)继续冰浴搅拌，0-5℃加入磷酰基乙酸三乙酯(5.20g，23.2mmol)，N2保护 下，0℃搅拌反应1h，加入化合物1-3(5.00g，21.1mmol)的THF(40mL)溶液，N2保护下冰浴 搅拌1h。反应完成后，加入125mL饱和NH4Cl水溶液，减压蒸馏除去THF，用乙酸乙酯萃取(150 mL*3)，合并有机相，用饱和食盐水洗涤(100mL*3)，有机相用无水Na2SO4干燥，过滤，滤液浓 缩，粗品经柱层析纯化分离(PE:EA＝15:1)得黄色固体产品5.74g，Yield＝88.6％，m.p.95-96℃。
1H NMR(500MHz,CDCl3)δ:8.13(s,1H),7.48(d,J＝15.5Hz,1H),6.25(d,J＝16Hz,1H),5.04(d, J＝5Hz,1H),4.48(q,J＝7Hz,1H),4.26(q,J＝7Hz,2H),2.53(s,3H),2.09-2.15(m,2H),1.69-1.79(m, 2H),1.66(q,J＝4.5Hz,2H),1.46-1.52(m,2H),1.34(d,J＝7Hz,3H).ESI-MS(m/z):308.1[M+H]+.
步骤5化合物1-5的合成：250mL圆底烧瓶中加入化合物1-4(5.1g，16.6mmol)和80mL无水 乙醇，搅拌溶解后，加入DBU(7.6g，49.8mmol)，N2保护下80℃加热回流22h。反应结束，自 然降温，加入1mol/L盐酸调pH至中性，减压蒸馏除去乙醇，用乙酸乙酯萃取(100mL*3)，合并 有机相，用饱和食盐水洗涤(100mL*3)，有机相用无水Na2SO4干燥，过滤，滤液浓缩得4.46g米 白色固体粗品，柱层析纯化(PE:EA＝10:1)得白色固体纯品3.8g，Yield＝87.5％，m.p.99-100℃。
1H NMR(300MHz,CDCl3)δ:8.58(s,1H),7.52(d,J＝9.3Hz,1H),6.59(d,J＝9.3Hz,1H),5.93(m, 1H),2.63(s,3H),2.29-2.42(m,2H),2.01-2.13(m,2H),1.83-1.95(m,2H),1.67-1.77(m,2H).ESI-MS (m/z):262.0[M+H]+.
步骤6化合物1-6的合成：100mL圆底烧瓶中加入化合物1-5(3.23g，12.4mmol)和30mL乙 腈，溶解后加入NBS(3.30g，18.5mmol)，N2保护下82℃加热回流20h。反应结束后直接加入12 g200-300目硅胶制砂，经柱层析纯化(PE:EA＝20:1)得白色固体纯品2.8g，Yield＝66.7％，m.p. 136-137℃。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ:8.58(s,1H),7.99(s,1H),6.03(m,J＝8.8Hz,1H),2.62(s,3H), 2.26-2.34(m,2H),2.08-2.14(m,2H),1.87-1.94(m,2H),1.69(q,J＝5Hz,2H).ESI-MS(m/z):362.1[M+ Na]+.
步骤7化合物1-7的合成：50mL圆底烧瓶中加入化合物1-6(0.50g，1.47mmol)，加入20mL 二氯甲烷溶解后再加入间氯过氧苯甲酸(0.56g，3.23mmol)，室温搅拌1h后，反应完毕。加入10mL 饱和Na2SO3溶液淬灭，用DCM萃取(30mL*3)，合并有机相，用饱和Na2CO3溶液洗涤(30mL* 3)，再用饱和食盐水洗涤(30mL*3)，有机相用无水Na2SO4干燥，过滤，滤液浓缩得粗品，加入5 mL乙醚打浆得米白色固体纯品0.45g，Yield＝82.4％，m.p.173-174℃。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ: 8.92(s,1H),8.18(s,1H),6.01(m,J＝8.6Hz,1H),3.38(s,3H),2.21-2.30(m,2H),2.13-1.19(m,2H), 1.94-2.02(m,2H),1.72-1.77(m,2H).ESI-MS(m/z):394.0[M+Na]+.
步骤8化合物1-8的合成：100mL圆底烧瓶中依次加入20mL无水甲醇，冰醋酸(0.50g，8.25mmol)， 氰基硼氢化钠(1.56g，24.76mmol)及1-苄基哌啶-4-酮(1.56g，8.25mmol)，冰盐浴条件下搅拌， 待温度降至-5℃后，滴加苯乙胺(1.00g，8.25mmol)，继续冰盐浴搅拌3h。TLC监测反应，反应完 毕后，冰浴条件下滴加2mol/LNaOH水溶液，调节pH至碱性，用乙酸乙酯萃取(40mL*3)，合并 有机相，用饱和食盐水洗涤(40mL*3)，无水Na2SO4干燥，过滤，浓缩，得黄色油状液体产品2.50 g，Yield＝98.2％。
步骤9化合物1-9的合成：100mL圆底烧瓶中加入化合物1-8(2.50g，8.49mmol)和30mL叔 丁醇，搅拌溶解后再加入20mL水及碳酸氢钠(1.43g，17.0mmol)，冰浴条件下滴加Boc2O(2.78g， 12.74mmol)。滴加完毕后，撤去冰浴，自然升温至室温，室温搅拌过夜。反应完毕后加入50mL水， 减压蒸馏除去大部分叔丁醇，用乙酸乙酯萃取(80mL*3)，合并有机相，用饱和食盐水洗涤(80mL*3)， 有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩。所得粗品用柱层析纯化分离(PE:EA＝10:1)得淡黄色油状 液体产品2.00g，Yield＝74.7％。
步骤10化合物1-10的合成：100mL圆底烧瓶中加入化合物1-9(2.00g，5.07mmol)及40mL 甲醇，搅拌溶解后，加入10％Pd/C(0.60g，5.07mmol)。瓶内先用N2置换3次，再通入氢气，40℃ 搅拌过夜。反应完毕后，先加入15mL甲醇搅拌使产品尽量溶于甲醇中，趁热过滤，滤饼用甲醇洗涤， 合并滤液，浓缩得黄色油状液体产品1.20g，Yield＝78.5％。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ:7.25-7.32(m, 2H),7.20(q,J＝8.2Hz,4H),2.80(q,J＝7.8Hz,3H),1.67(d,J＝10.5Hz,2H),1.56-1.63(m,4H),1.51(s, 9H),1.43(s,4H).HRMS(ESI)(m/z):305.2228[M+H]+.
步骤11化合物1-11的合成：100mL圆底烧瓶中加入化合物1-7(2.90g，7.79mmol)及30mL 甲苯，溶解后加入化合物1-10(2.60g，8.57mmol)，在N2保护下112℃加热回流3h。减压蒸馏除 去溶剂，加入20mL二氯甲烷复溶后加入10g硅胶制砂，柱层析纯化(PE:EA＝10:1)得3.4g淡黄色 固体产品，Yield＝73.2％，m.p.197-198℃。
1H NMR(300MHz,CDCl3)δ:8.40(s,1H),7.83(s,1H),7.14-7.29(m,5H),5.91(m,J＝8.8Hz,1H),4.95 (d,J＝12.9Hz,2H),3.24(s,2H),2.96(t,J＝12.6Hz,2H),2.81(t,J＝7.8Hz,2H),2.33(q,J＝6.4Hz,2H), 2.05(d,J＝7.8Hz,2H),1.83(q,J＝9.4Hz,4H),1.67(m,J＝9.1Hz,5H),1.52(s,9H).ESI-MS(m/z): 596.3[M+H]+
步骤12化合物1-12的合成：25mL圆底烧瓶中加入化合物1-11(0.20g，0.34mmol)及10mL 1,4- 二氧六环，溶解后依次加入碳酸铯(0.22g，0.68mmol)，四(三苯基膦)钯(0.020g，0.017mmol)， 3,4-二甲基苯硼酸(0.076g，0.51mmol)。氮气保护条件下102℃加热回流搅拌3h，TLC检测反应完 毕后，冷却至室温，过滤，滤饼用1,4-二氧六环洗涤。合并滤液，浓缩，柱层析(PE:EA＝30:1)，得 0.18g黄色油状产品，Yield＝85.6％。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ:8.45(s,1H),7.49(s,1H),7.39(s,1H), 7.34(d,J＝7.5Hz,1H),7.26(q,J＝4.8Hz,3H),7.18(q,J＝7.7Hz,3H),5.93(t,J＝9Hz,1H),4.97(d,J ＝13Hz,2H),3.25(s,1H),2.97(t,J＝11.8Hz,2H),2.82(t,J＝7.8Hz,2H),2.39-2.45(m,2H),2.29(d,J＝ 11Hz,6H),2.03-2.09(m,2H),1.88(q,J＝6.8Hz,2H),1.81(t,J＝12Hz,2H),1.64-1.71(m,4H),1.52(s, 9H),1.24-1.29(m,2H).ESI-MS(m/z):622.4[M+H]+.
步骤13化合物1的合成：25mL圆底烧瓶中加入化合物1-12(0.16g，0.257mmol)和10mL二 氯甲烷，搅拌溶解后加入三氟乙酸(2mL，27.2mmol)，室温搅拌1h。反应完毕后，加入5mL甲 苯，减压蒸馏除去二氯甲烷，再加入5mL甲苯并浓缩除去甲苯。加入10mL乙醚打浆，过滤，滤饼 用乙醚洗涤，干燥，得90mg白色固体产品，Yield＝67.2％，HPLC Purity＝96.51％，m.p.202-203℃。
1H NMR(500MHz,CDCl3)δ:9.72(s,1H),8.41(s,1H),7.46(s,1H),7.38(s,1H),7.27-7.34(m,1H), 7.25(s,2H),7.23(d,J＝7.5Hz,1H),7.16(t,J＝7.7Hz,3H),5.84-5.92(m,1H),4.97(d,J＝14Hz,2H), 3.30(s,1H),3.20(s,2H),3.04(t,J＝8.2Hz,2H),2.97(t,J＝12.2Hz,2H),2.37(q,J＝6.7Hz,2H),2.29 (d,J＝10Hz,6H),2.21(d,J＝11.5Hz,2H),1.99(t,J＝6.5Hz,2H),1.76-1.86(m,4H),1.64(d,J＝5.5Hz, 2H).
HRMS(ESI)(m/z):522.3236[M+H]+,calculated for C33H39N5O,521.31630.
实施例2至实施例14中化合物的合成按照实施例1的方法进行，化合物投料的摩尔比皆一致， 仅底物不一致。
实施例2：8-环戊基-2-(4-(苯乙基氨基)哌啶-1-基)-6-苯基吡啶并[2,3-d]嘧啶-7-酮(化合物2) 的合成。
合成路线：
参照实施例1的制备方法，不同的是，将化合物1-11与苯硼酸反应得到化合物2-1，然后将化合 物2-1与三氟醋酸反应得到化合物2。
1H NMR(500MHz,CDCl3)δ:9.73(s,1H),8.42(s,1H),7.60(d,J＝7.5Hz,2H),7.49(s,1H),7.39(t, J＝7.5Hz,2H),7.22-7.34(m,4H),7.17(d,J＝7Hz,2H),5.89(t,J＝8.8Hz,1H),4.98(d,J＝13.5Hz, 2H),3.30(s,1H),3.20(s,2H),2.94-3.05(m,4H),2.37(s,2H),2.20(d,J＝5Hz,2H),2.01(s,2H),1.78(q, J＝13.7Hz,4H),1.64(d,J＝4Hz,2H).
HRMS(ESI)(m/z):494.2911[M+H]+,calculated for C31H35N5O,493.28382.
实施例3：8-环戊基-6-(4-氟-3-甲基苯基)-2-(4-(苯乙基氨基)哌啶-1-基)吡啶并[2,3-d]嘧啶-7- 酮(化合物3)的合成。
合成路线：
参照实施例1的制备方法，不同的是，以化合物1-11与4-氟-3-甲基苯硼酸反应得到化合物3-1。 然后将化合物3-1与三氟醋酸反应得到化合物3。
1H NMR(500MHz,CDCl3)δ:9.73(s,1H),8.42(s,1H),7.44(t,J＝6.5Hz,2H),7.37(d,J＝5Hz,1H), 7.22-7.31(m,3H),7.17(d,J＝7Hz,2H),7.02(t,J＝9Hz,1H),5.88(t,J＝9Hz,1H),4.98(d,J＝13.5Hz, 2H),3.30(s,1H),3.20(s,2H),3.02(q,J＝8.7Hz,2H),2.96(d,J＝12.5Hz,2H),2.36(q,J＝6.2Hz,2H), 2.31(d,J＝10Hz,3H),2.21(d,J＝11.5Hz,2H),2.01(s,2H),1.76-1.84(m,4H),1.64(d,J＝5Hz,2H).
HRMS(ESI)(m/z):526.2981[M+H]+,calculated for C32H36FN5O,525.29083.
实施例4：8-环戊基-6-(3-氟-4-甲基苯基)-2-(4-(苯乙基氨基)哌啶-1-基)吡啶并[2,3-d]嘧啶-7- 酮(化合物4)的合成。
合成路线：
参照实施例1的制备方法，不同的是，以实施例1步骤11得到的化合物1-11与3-氟-4-甲基苯硼 酸反应得到化合物4-1，然后将化合物4-1与三氟醋酸反应得到化合物4。
1H NMR(500MHz,CDCl3)δ:9.74(s,1H),8.42(s,1H),7.49(s,1H),7.22-7.34(m,5H),7.18(q,J＝7 Hz,3H)5.84-5.92(m,1H),4.98(d,J＝13Hz,2H),3.30(s,1H),3.20(s,2H),3.03(t,J＝8.5Hz,2H),2.97 (t,J＝12.5Hz,2H),2.36(q,J＝6.2Hz,2H),2.29(s,3H),2.21(d,J＝11.5Hz,2H),2.01(s,2H),1.74-1.84 (m,4H),1.64(d,J＝4.5Hz,2H).
HRMS(ESI)(m/z):526.2981[M+H]+,calculated for C32H36FN5O,525.29080.
实施例5：5-(8-环戊基-7-氧代-2-(4-(苯乙基氨基)哌啶-1-基)-7,8-二氢吡啶并[2,3-d]嘧啶-6-基) -2-氟苯甲醛(化合物5)的合成。
合成路线：
参照实施例1的制备方法，不同的是，以实施例1步骤11得到的化合物1-11与4-氟-3-甲酰基苯 硼酸反应得到化合物5-1，然后将化合物5-1与三氟醋酸反应得到化合物5。
1H NMR(300MHz,CDCl3)δ:10.38(s,1H),9.67(s,1H),8.42(d,J＝23.1Hz,1H),7.97-8.05(m,2H), 7.57(s,1H),7.15-7.42(m,6H),5.87(q,J＝9Hz,1H),4.99(d,J＝13.2Hz,2H),3.26(d,J＝35.7Hz,3H), 3.00(q,J＝10.5Hz,4H),2.20-2.35(m,4H),2.00(s,2H),1.63-1.84(m,6H).
HRMS(ESI)(m/z):540.2777[M+H]+,calculated for C32H34FN5O2,539.27042.
实施例6：3-(8-环戊基-7-氧代-2-(4-(苯乙基氨基)哌啶-1-基)-7,8-二氢吡啶并[2,3-d]嘧啶-6-基) 苯甲醛(化合物6)的合成。
合成路线：
参照实施例1的制备方法，不同的是，以实施例1步骤11得到的化合物1-11与3-甲酰基苯硼酸 反应得到化合物6-1，然后将化合物6-1与三氟醋酸反应得到化合物6。
1H NMR(300MHz,CDCl3)δ:10.06(s,1H),9.74(s,1H),8.47(s,1H),8.12(s,1H),7.94(d,J＝7.8Hz, 1H),7.85(d,J＝7.8Hz,1H),7.6(t,J＝7.8Hz,2H),7.21-7.33(m,3H),7.17(d,J＝6.6Hz,2H),5.90(t,J ＝8.7Hz,1H),5.00(d,J＝13.5Hz,2H),3.26(d,J＝34.2Hz,3H),3.01(q,J＝11.5Hz,4H),2.33(t,J＝7.6 Hz,2H),2.23(d,J＝11.1Hz,2H),2.01(s,2H),1.81(t,J＝10.2Hz,4H),1.63-1.73(m,2H).
HRMS(ESI)(m/z):522.2863[M+H]+,calculated for C32H35N5O2,521.27901
实施例7：8-环戊基-2-(4-(苯乙基氨基)哌啶-1-基)-6-(2-(三氟甲基)苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶 -7-酮(化合物7)的合成。
合成路线：
参照实施例1的制备方法，不同的是，以化合物1-11与2-三氟甲基苯硼酸反应得到化合物7-1， 然后将化合物7-1与三氟醋酸反应得到化合物7。
1H NMR(500MHz,CDCl3)δ:9.34(s,1H),8.45(s,1H),7.73(d,J＝8Hz,1H),7.57(t,J＝7.5Hz,1H), 7.48(t,J＝7.7Hz,1H),7.38(s,1H),7.34(d,J＝7.5Hz,1H),7.30(t,J＝7.2Hz,2H),7.24(t,J＝5.2Hz, 1H),7.17(d,J＝7Hz,2H),5.86(m,J＝8.7Hz,1H),4.96(d,J＝13.5Hz,2H),3.37(s,1H),3.25(s,2H), 3.02(t,J＝12.2Hz,4H),2.21-2.31(m,4H),1.98(s,2H),1.75-1.86(m,4H),1.62(t,J＝5.2Hz,2H).
HRMS(ESI)(m/z):562.2793[M+H]+,calculated for C32H34F3N5O,561.27205.
实施例8：8-环戊基-2-(4-(苯乙基氨基)哌啶-1-基)-6-(4-(三氟甲基)苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶 -7-酮(化合物8)的合成。
合成路线：
参照实施例1的制备方法，不同的是，以化合物1-11与4-三氟甲基苯硼酸反应得到化合物8-1， 然后将化合物8-1与三氟醋酸反应得到化合物8。
1H NMR(500MHz,CDCl3)δ:9.75(s,1H),8.45(s,1H),7.73(d,J＝8Hz,2H),7.65(d,J＝8.5Hz, 2H),7.55(s,1H),7.29(t,J＝7.2Hz,2H),7.24(t,J＝7.2Hz,1H),7.17(d,J＝7Hz,2H),5.89(m,J＝8.8 Hz,1H),4.99(d,J＝13.5Hz,2H),3.31(s,1H),3.20(s,2H),2.96-3.06(m,4H),2.32-2.39(m,2H),2.22(d, J＝11Hz,2H),1.98-2.03(m,2H),1.74-1.85(m,4H),1.64(q,J＝5.2Hz,2H).
HRMS(ESI)(m/z):562.2792[M+H]+,calculated for C32H34F3N5O,561.27190.
实施例9：8-环戊基-2-(4-(苯乙基氨基)哌啶-1-基)-6-(3-(三氟甲基)苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶 -7-酮(化合物9)的合成。
合成路线：
参照实施例1的制备方法，不同的是，以化合物1-11与3-三氟甲基苯硼酸反应得到化合物9-1， 然后将化合物9-1与三氟醋酸反应得到化合物9。
1H NMR(500MHz,CDCl3)δ:9.75(s,1H),8.46(s,1H),7.84(d,J＝7Hz,2H),7.58(d,J＝7.5Hz, 1H),7.52(q,J＝8.6Hz,1H),7.29(t,J＝7Hz,2H),7.24(t,J＝7Hz,2H),7.17(d,J＝7Hz,2H),5.88(t,J ＝9Hz,1H),4.99(d,J＝13Hz,2H),3.31(s,1H),3.20(s,2H),2.96-3.06(m,4H),2.37(q,J＝6.3Hz,2H), 2.22(d,J＝11.5Hz,2H),2.01(s,2H),1.75-1.85(m,4H),1.65(t,J＝5.2Hz,2H).
HRMS(ESI)(m/z):562.2778[M+H]+,calculated for C32H34F3N5O,561.27054.
实施例10：8-环戊基-6-(2-甲氧基苯基)-2-(4-(苯乙基氨基)哌啶-1-基)吡啶并[2,3-d]嘧啶-7-酮 (化合物10)的合成。
合成路线：
参照实施例1的制备方法，不同的是，以化合物1-11与2-甲氧基苯硼酸反应得到化合物10-1， 然后将化合物10-1与三氟醋酸反应得到化合物10。
1H NMR(500MHz,CDCl3)δ:9.58(s,1H),8.41(s,1H),7.45(s,1H),7.28-7.34(m,4H),7.24(t,J＝7 Hz,1H),7.17(d,J＝7.5Hz,2H),6.94-7.00(m,2H),5.86(t,J＝8.7Hz,1H),4.96(d,J＝13.5Hz,2H), 3.78(s,3H),3.32(s,1H),3.22(s,2H),2.96-3.05(m,4H),2.35(s,2H),2.21(d,J＝11.5Hz,2H),1.99(s, 2H),1.80(q,J＝12Hz,4H),1.63(s,2H).
HRMS(ESI)(m/z):524.3024[M+H]+,calculated for C32H37N5O2,523.29506.
实施例11：8-环戊基-6-(4-甲氧基苯基)-2-(4-(苯乙基氨基)哌啶-1-基)吡啶并[2,3-d]嘧啶-7-酮 (化合物11)的合成。
合成路线：
参照实施例1的制备方法，不同的是，以化合物1-11与4-甲氧基苯硼酸反应得到化合物11-1， 然后将化合物11-1与三氟醋酸反应得到化合物11。
1H NMR(500MHz,CDCl3)δ:9.73(s,1H),8.41(s,1H),7.56(d,J＝7Hz,2H),7.45(s,1H),7.27(t,J ＝8.5Hz,3H),7.17(d,J＝4.5Hz,2H),6.93(d,J＝7Hz,2H),5.88(t,J＝8Hz,1H),4.97(d,J＝12Hz, 2H),3.82(s,3H),3.29(s,1H),3.19(s,2H),3.03(s,2H),2.96(t,J＝12.5Hz,2H),2.36(s,2H),2.20(d,J＝ 10.5Hz,2H),2.01(s,2H),1.78(t,J＝12.7Hz,4H),1.63(s,2H).
HRMS(ESI)(m/z):524.3020[M+H]+,calculated for C32H37N5O2,523.29472.
实施例12：8-环戊基-6-(3-甲氧基苯基)-2-(4-(苯乙基氨基)哌啶-1-基)吡啶并[2,3-d]嘧啶-7-酮 (化合物12)的合成。
合成路线：
参照实施例1的制备方法，不同的是，以化合物1-11与3-甲氧基苯硼酸反应得到化合物12-1， 然后将化合物12-1与三氟醋酸反应得到化合物12。
1H NMR(500MHz,CDCl3)δ:9.74(s,1H),8.42(s,1H),7.50(s,1H),7.30(q,J＝7.7Hz,3H),7.24(t, J＝8.2Hz,1H),7.18(d,J＝7Hz,4H),6.88(d,J＝7.5Hz,1H),5.88(t,J＝9Hz,1H),4.98(d,J＝13Hz, 2H),3.84(s,3H),3.30(s,1H),3.20(s,2H),2.94-3.05(m,4H),2.36(d,J＝8Hz,2H),2.21(d,J＝11.5Hz, 2H),2.01(s,2H),1.8(q,J＝12Hz,4H),1.64(d,J＝4.5Hz,2H).
HRMS(ESI)(m/z):524.3027[M+H]+,calculated for C32H37N5O2,523.29539.
实施例13：6-([1,1'-联苯]-4-基)-8-环戊基-2-(4-(苯乙基氨基)哌啶-1-基)吡啶并[2,3-d]嘧啶-7- 酮(化合物13)的合成。
合成路线：
参照实施例1的制备方法，不同的是，以化合物1-11与4-苯基苯硼酸反应得到化合物13-1，然 后将化合物13-1与三氟醋酸反应得到化合物13。
1H NMR(500MHz,CDCl3)δ:9.28(s,1H),8.51(s,1H),7.58-7.69(m,7H),7.44(t,J＝7.5Hz,2H), 7.35(t,J＝7.2Hz,1H),7.30(t,J＝7.2Hz,2H),7.24(d,J＝11Hz,1H),7.17(d,J＝7Hz,2H),5.87(t,J＝ 8.7Hz,1H),4.92(d,J＝13Hz,2H),3.40(s,1H),3.26(s,2H),3.06(q,J＝11Hz,4H),2.35(q,J＝6.17Hz, 2H),2.24(d,J＝9.5Hz,2H),2.04(s,2H),1.80-1.89(m,4H),1.67(d,J＝4.5Hz,2H).
HRMS(ESI)(m/z):570.3226[M+H]+,calculated for C37H39N5O,569.31530.
实施例14：8-环戊基-2-(4-(苯乙基氨基)哌啶-1-基)-6-(4-苯氧基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶-7-酮 (化合物14)的合成。
合成路线：
参照实施例1的制备方法，不同的是，以化合物1-11与4-苯氧基苯硼酸反应得到化合物14-1.， 然后将化合物14-1与三氟醋酸反应得到化合物14。
1H NMR(500MHz,CDCl3)δ:9.72(s,1H),8.43(s,1H),7.59(d,J＝8.5Hz,2H),7.50(s,1H), 7.27-7.36(m,5H),7.24(t,J＝7.5Hz,1H),7.17(d,J＝7Hz,2H),7.10(t,J＝7.2Hz,1H),7.04(q,J＝4.2 Hz,4H),5.89(m,J＝8.9Hz,1H),4.98(d,J＝13.5Hz,2H),3.31(s,1H),3.21(s,2H),3.05(t,J＝8.2Hz, 2H),2.98(t,J＝12.5Hz,2H),2.37(q,J＝5.8Hz,2H),2.22(d,J＝12Hz,2H),2.02(s,2H),1.75-1.85(m, 4H),1.65(t,J＝5Hz,2H).
HRMS(ESI)(m/z):586.3180[M+H]+,calculated for C37H39N5O2,585.31068.
实施例15：(1-(8-环戊基-7-氧代-6-(苯基乙炔基)-7,8-二氢吡啶并[2,3-d]嘧啶-2-基)哌啶-4-基)(苯 乙基)氨基甲酸叔丁酯(化合物15)的合成。
合成路线：
步骤1化合物15-1的合成：25mL圆底烧瓶中加入化合物1-11(0.50g，0.84mmol)及15mL乙 腈，溶解后依次加入DBU(0.38g，2.52mmol)，碘化亚铜(0.016g，0.084mmol)，四(三苯基膦)钯 (0.048g，0.042mmol)，苯乙炔(0.26g，2.52mmol)。氮气保护条件下82℃加热回流搅拌4h，TLC 检测反应完毕后，趁热过滤，滤饼用乙腈洗涤。合并滤液，浓缩，柱层析(PE:EA＝13:1)，得0.25g 黄色固体产品，Yield＝48.2％。
1H NMR(500MHz,CDCl3)δ:8.44(s,1H),7.71(s,1H),7.56(q,J＝3.2Hz,2H),7.33(q,J＝2.2Hz, 3H),7.27(t,J＝6.5Hz,2H),7.18(q,J＝9Hz,3H),5.88(q,J＝8.8Hz,1H),4.98(d,J＝9.5Hz,2H),3.25 (s,2H),2.99(t,J＝12.2Hz,2H),2.82(t,J＝8Hz,2H),2.38(q,J＝6.5Hz,2H),2.07(q,J＝7.2Hz,2H), 1.81-1.89(m,4H),1.69(q,J＝7.5Hz,4H),1.51(s,10H).ESI-MS(m/z):618.4[M+H]+.
步骤2化合物15的合成：25mL圆底烧瓶中加入中间体15-1(0.21g，0.34mmol)和10mL二 氯甲烷，搅拌溶解后加入三氟乙酸(2mL，27.2mmol)，室温搅拌1h。反应完毕后，加入5mL甲 苯，减压蒸馏除去二氯甲烷，再加入5mL甲苯并浓缩除去甲苯。柱层析纯化(DCM:MeOH＝30:1) 得50.7mg淡黄色色固体产品，Yield＝28.4％，HPLC Purity＝88.85％，m.p.94-95℃。1H NMR(300MHz, CDCl3)δ:8.43(s,1H),7.73(s,1H),7.59(q,J＝3.1Hz,2H),7.33(q,J＝4.7Hz,5H),7.26(q,J＝5Hz,4H), 5.92(t,J＝8.8Hz,1H),4.78(d,J＝13.5Hz,2H),3.13(t,J＝11.4Hz,2H),3.03(t,J＝6.9Hz,2H),2.92(t, J＝3.9Hz,3H),2.21-2.44(m,2H),2.06(d,J＝12.6Hz,2H),1.89(q,J＝6.9Hz,2H),1.67-1.75(m,2H), 1.40-1.53(m,2H),1.23-1.36(q,J＝12.6Hz,2H).
HRMS(ESI)(m/z):518.2917[M+H]+,calculated for C33H35N5O,517.28442.
实施例16至实施例19中化合物的合成按照实施例15的方法进行，化合物投料的摩尔比皆一致， 仅底物不一致。
实施例16：8-环戊基-2-(4-(苯乙基氨基)哌啶-1-基)-6-(间甲苯基乙炔)吡啶并[2,3-d]嘧啶-7-酮 (化合物16)的合成。
合成路线：
参照实施例15的制备方法，不同的是，以化合物1-11与3-甲基苯乙炔反应得到化合物16-1，然 后将化合物16-1与三氟醋酸反应得到化合物16。
1H NMR(500MHz,CDCl3)δ:9.72(s,1H),8.38(s,1H),7.69(s,1H),7.40(s,1H),7.36(d,J＝7.5Hz, 1H),7.29(t,J＝7.2Hz,2H),7.24(t,J＝8.5Hz,2H),7.18(q,J＝7.3Hz,2H),7.13(d,J＝7.5Hz,1H), 5.85(m,J＝8.9Hz,1H),4.97(d,J＝13Hz,2H),3.31(s,1H),3.20(s,2H),3.04(t,J＝8.2Hz,2H),2.98(t, J＝12.5Hz,2H),2.34(d,J＝14.5Hz,5H),2.22(d,J＝11Hz,2H),2.03(s,2H),1.78(q,J＝11Hz,4H), 1.64(t,J＝5.2Hz,2H).
HRMS(ESI)(m/z):532.3072[M+H]+,calculated for C34H37N5O,531.29991.
实施例17：8-环戊基-2-(4-(苯乙基氨基)哌啶-1-基)-6-(吡啶-3-乙炔基)吡啶并[2,3-d]嘧啶-7-酮 (化合物17)的合成。
参照实施例15的制备方法，不同的是，以化合物1-11与3-乙炔基吡啶反应得到化合物17-1， 然后将化合物17-1与三氟醋酸反应得到化合物17。
1H NMR(500MHz,CDCl3)δ:9.72(s,1H),8.64(s,1H),8.10(d,J＝8Hz,1H),7.77(s,1H),7.52(s, 1H),7.23-7.31(m,4H),7.17(d,J＝7Hz,2H),5.84(t,J＝8.7Hz,1H),4.99(d,J＝10.5Hz,2H),3.32(s, 1H),3.21(s,2H),2.97-3.06(m,4H),2.28-2.34(m,2H),2.23(d,J＝12Hz,2H),2.03(s,2H),1.74-1.85(m, 4H),1.65(t,J＝5Hz,2H).
HRMS(ESI)(m/z):519.2862[M+H]+,calculated for C32H34N6O,518.27890.
实施例18：6-((4-氯苯基)乙炔基)-8-环戊基-2-(4-(苯乙基氨基)哌啶-1-基)吡啶并[2,3-d]嘧啶 -7-酮(化合物18)的合成。
参照实施例15的制备方法，不同的是，以化合物1-11与4-氯苯乙炔反应得到化合物18-1，然后 将化合物18-1与三氟醋酸反应得到化合物18。
1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ:9.43(s,1H),8.59(s,1H),7.92(d,J＝11.1Hz,1H),7.47(d,J＝8.1 Hz,2H),7.24-7.38(m,7H),5.88(t,J＝8.5Hz,1H),4.94(d,J＝12.6Hz,2H),3.41(d,J＝8.4Hz,1H), 3.22(d,J＝7.8Hz,2H),3.06(t,J＝10.9Hz,4H),2.26(q,J＝9.7Hz,4H),2.03(s,2H),1.86(d,J＝4.8Hz, 2H),1.68(d,J＝10.2Hz,4H).
HRMS(ESI)(m/z):552.2523[M+H]+,calculated for C33H34ClN5O,551.24496.
实施例19：6-((3-氯苯基)乙炔基)-8-环戊基-2-(4-(苯乙基氨基)哌啶-1-基)吡啶并[2,3-d]嘧啶 -7-酮(化合物19)的合成。
参照实施例15的制备方法，不同的是，以化合物1-11与3-氯苯乙炔反应得到化合物19-1，然后 将化合物19-1与三氟醋酸反应得到化合物19。
1H NMR(300MHz,CDCl3+DMSO-d6)δ:9.56(s,1H),8.56(s,1H),7.88(d,J＝12.9Hz,2H), 7.24-7.50(m,8H),5.88(t,J＝8.7Hz,1H),4.96(d,J＝11.4Hz,2H),3.41(s,2H),3.22(s,2H),3.04(t,J＝ 7.9Hz,3H),2.27(q,J＝9.5Hz,4H),2.04(s,2H),1.85(s,2H),1.70(d,J＝6.9Hz,4H).
HRMS(ESI)(m/z):552.2528[M+H]+,calculated for C33H34ClN5O,551.24547.
试验例1：抗A549肿瘤细胞增殖试验
取生长状态良好的对数生长期的A549细胞(中国科学院细胞库,SCSP-503)，以3×104个细胞/mL 的密度接种于96孔板，每孔接种100μL，放入培养箱中。12h后待细胞贴壁，弃去培养基，每孔加 入含有不同浓度受试化合物的新鲜培养基150μL(高糖DMEM基础培养基+10％FBS(v/v))，设置3 个复孔，6个浓度，继续置于培养箱中培养72h。72h后每孔加入15μLMTT溶液(避光操作)，培养 箱中孵育4h后，弃去培养基，每孔加入150μL DMSO溶解，置于摇床5-10min。用多功能酶标仪在 492nm波长处检测各孔吸光度，计算抑制率，用GraphPadPrism绘制细胞增殖抑制曲线，计算IC50 (见表1)。
实验例2：抗BxPc-3肿瘤细胞增殖试验
取生长状态良好的对数生长期的BxPc-3细胞(Procell,CL-0042)，以3×104个细胞/mL的密度接 种于96孔板，每孔接种100μL，放入培养箱中。12h后待细胞贴壁，弃去培养基，每孔加入含有不 同浓度受试化合物的新鲜培养基150μL(RPMI 1640基础培养基+10％FBS(v/v))，设置3个复孔，6 个浓度，继续置于培养箱中培养72h。72h后每孔加入15μLMTT溶液(避光操作)，培养箱中孵育4 h后，弃去培养基，每孔加入150μL DMSO溶解，置于摇床5-10min。用多功能酶标仪在492nm波 长处检测各孔吸光度，计算抑制率，用GraphPad Prism绘制细胞增殖抑制曲线，计算IC50(见表1)。
实验例3：抗HCT-116肿瘤细胞增殖试验
取生长状态良好的对数生长期的HCT-116细胞(Procell,CL-0096)，以3×104个细胞/mL的密度 接种于96孔板，每孔接种100μL，放入培养箱中。12h后待细胞贴壁，弃去培养基，每孔加入含有 不同浓度受试化合物的新鲜培养基150μL(高糖DMEM基础培养基+10％FBS(v/v))，设置3个复 孔，6个浓度，继续置于培养箱中培养72h。72h后每孔加入15μLMTT溶液(避光操作)，培养箱中 孵育4h后，弃去培养基，每孔加入150μL DMSO溶解，置于摇床5-10min。用多功能酶标仪在492 nm波长处检测各孔吸光度，计算抑制率，用GraphPad Prism绘制细胞增殖抑制曲线，计算IC50(见 表1)。
已上市的化合物为MLN4924，检测的细胞活性为：IC50为100-1000nM。
表1.化合物抗肿瘤细胞增殖试验结果
Claims (9)
1.具有通式I的香豆素类化合物，及其药学上可接受的盐、溶剂化物、多晶型物、互变异构体、代谢产物或前药，
其中：
n为取代基R的数目，n为1或2；
R独立地选自烷基、环烷基、烷氧基、醛基、芳香基或芳香氧基，且R任选地被一个或多个选自卤素取代。
2.根据权利要求1所述的化合物，其特征在于，所述化合物为8-环戊基-2-(4-(苯乙基氨基)哌啶-1-基)-6-(3,4-二甲基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶-7-酮、8-环戊基-2-(4-(苯乙基氨基)哌啶-1-基)-6-苯基吡啶并[2,3-d]嘧啶-7-酮、8-环戊基-6-(4-氟-3-甲基苯基)-2-(4-(苯乙基氨基)哌啶-1-基)吡啶并[2,3-d]嘧啶-7-酮、8-环戊基-6-(3-氟-4-甲基苯基)-2-(4-(苯乙基氨基)哌啶-1-基)吡啶并[2,3-d]嘧啶-7-酮、5-(8-环戊基-7-氧代-2-(4-(苯乙基氨基)哌啶-1-基)-7,8-二氢吡啶并[2,3-d]嘧啶-6-基)-2-氟苯甲醛、3-(8-环戊基-7-氧代-2-(4-(苯乙基氨基)哌啶-1-基)-7,8-二氢吡啶并[2,3-d]嘧啶-6-基)苯甲醛、8-环戊基-2-(4-(苯乙基氨基)哌啶-1-基)-6-(2-(三氟甲基)苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶-7-酮、8-环戊基-2-(4-(苯乙基氨基)哌啶-1-基)-6-(4-(三氟甲基)苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶-7-酮、8-环戊基-2-(4-(苯乙基氨基)哌啶-1-基)-6-(3-(三氟甲基)苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶-7-酮、8-环戊基-6-(2-甲氧基苯基)-2-(4-(苯乙基氨基)哌啶-1-基)吡啶并[2,3-d]嘧啶-7-酮、8-环戊基-6-(4-甲氧基苯基)-2-(4-(苯乙基氨基)哌啶-1-基)吡啶并[2,3-d]嘧啶-7-酮、8-环戊基-6-(3-甲氧基苯基)-2-(4-(苯乙基氨基)哌啶-1-基)吡啶并[2,3-d]嘧啶-7-酮、6-([1,1'-联苯]-4-基)-8-环戊基-2-(4-(苯乙基氨基)哌啶-1-基)吡啶并[2,3-d]嘧啶-7-酮或8-环戊基-2-(4-(苯乙基氨基)哌啶-1-基)-6-(4-苯氧基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶-7-酮。
3.具有通式II的香豆素类化合物，及其药学上可接受的盐、溶剂化物、多晶型物、互变异构体、代谢产物或前药，
其中：
R’独立地选自苯基或吡啶基，且R’任选地被一个或多个选自卤素或甲基取代。
4.根据权利要求3所述的化合物，其特征在于，所述化合物为(1-(8-环戊基-7-氧代-6-(苯基乙炔基)-7,8-二氢吡啶并[2,3-d]嘧啶-2-基)哌啶-4-基)(苯乙基)氨基甲酸叔丁酯、8-环戊基-2-(4-(苯乙基氨基)哌啶-1-基)-6-(间甲苯基乙炔)吡啶并[2,3-d]嘧啶-7-酮、8-环戊基-2-(4-(苯乙基氨基)哌啶-1-基)-6-(吡啶-3-乙炔基)吡啶并[2,3-d]嘧啶-7-酮或6-((4-氯苯基)乙炔基)-8-环戊基-2-(4-(苯乙基氨基)哌啶-1-基)吡啶并[2,3-d]嘧啶-7-酮。
5.权利要求1或3所述的化合物作为NEDD8激活酶抑制剂的用途。
6.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物含有治疗有效剂量的权利要求1或3所述的化合物或其立体异构体或药学上可接受的盐、以及药学上可接受的载体和赋形剂。
7.权利要求1或3所述的化合物或权利要求6所述的药物组合物在制备用于治疗与NEDD8激活酶异常有关的疾病的药物中的用途。
8.根据权利要求7所述的用途，其特征在于，所述的与NEDD8激活酶异常有关的疾病为肿瘤。
9.根据权利要求7所述的用途，其特征在于，所述的肿瘤为白血病、卵巢癌、结肠癌、肺癌、胃癌或前列腺癌。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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