CN112920965A - 基于微生物组学技术筛选青枯病生防菌剂的方法及所得青枯病生防菌剂 - Google Patents

基于微生物组学技术筛选青枯病生防菌剂的方法及所得青枯病生防菌剂 Download PDF

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Abstract

本发明提出一种基于微生物组学技术筛选青枯病生防菌剂的方法及所得青枯病生防菌剂，属于微生物技术领域。该青枯病生防菌剂由Pseudomonas lurida FGD5‑2、Pseudomonas koreensis HCH2‑3和Pseudomonas rhodesiae MTD4‑1按体积比1:1:1构成，其中，P.lurida FGD5‑2具有如SEQ ID NO.1所示序列，P.koreensis HCH2‑3具有如SEQ ID NO.2所示序列，P.rhodesiae MTD4‑1具有如SEQ ID NO.3所示序列。本发明利用微生物组学技术筛选青枯病生防菌尚属首次，本次利用该方法筛选得到3株具有抗青枯病能力的菌株，通过对3株假单胞菌的溶磷活性、产生长素以及铁载体能力测试发现，3株假单胞菌均具有良好的效果；进一步还对3株假单胞菌的防病效果进行了分析，发现3株菌株无论单独或复配使用均具有良好的抗青枯病能力，可有效用于烟草青枯病防治中。

Description

基于微生物组学技术筛选青枯病生防菌剂的方法及所得青枯 病生防菌剂
技术领域
本发明属于微生物技术领域，尤其涉及一种基于微生物组学技术筛选青枯病生防菌剂的方法及所得青枯病生防菌剂。
背景技术
由青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)引起的青枯病是最具破坏性的植物土传病害之一。化学药剂虽对烟草青枯病有一定的防治效果，但长期使用大量的化学药品不仅污染环境，还会使病原菌产生抗药性。
随着生态农业需求的增加，防治土传病害不应完全依赖于化学肥料和农药的使用。近年来，生防菌已被应用于青枯病的防治中，虽然取得了一定的成效，但目前使用的微生物菌剂并不是土著微生物，在植物根际的定殖能力较弱，田间的应用效果不稳定。
据报道，重组根系微生物群落是未来农业的发展方向之一，因此提出微生物组的概念，来描述特定栖息环境下所有微生物，科研人员已开始探索开发利用有益微生物群落。最新研究表明，真正发挥微生物群落功能的可能是少数关键微生物，被称为“核心微生物组”。因此，定向调控土壤核心微生物组，有望缓解生态环境、农业生产和当前微生物制剂存在的问题。随着生物信息技术和分子生物学的发展，使人工合成微生物群落成为可能。如果能够基于微生物组学技术寻找到青枯病的防治菌剂那将对烟草青枯病的防治具有重要意义。
发明内容
本发明提供了一种基于微生物组学技术筛选青枯病生防菌剂的方法及所得青枯病生防菌剂，该方法筛选得到3株具有抗青枯病能力的菌株，3株菌株单独或复配使用均具有良好的抗青枯病能力，可有效用于烟草青枯病防治中。
为了达到上述目的，本发明提供了一种青枯病生防菌剂，由Pseudomonas luridaFGD5-2、Pseudomonas koreensis HCH2-3和Pseudomonas rhodesiae MTD4-1按体积比1:1:1构成，其中，P.lurida FGD5-2具有如SEQ ID NO.1所示序列，P.koreensis HCH2-3具有如SEQ ID NO.2所示序列，P.rhodesiae MTD4-1具有如SEQ ID NO.3所示序列。
作为优选，所述P.lurida FGD5-2于2020年6月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号分别为CGMCC NO.20077；
所述P.koreensis HCH2-3于2020年6月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号分别为CGMCC NO.20078；
所述P.rhodesiae MTD4-1于2020年6月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号分别为CGMCC NO.20079。
本发明还提供了一种根据上述技术方案所述的青枯病生防菌剂在烟草青枯病防治中的应用。
本发明还提供了一种根据上述技术方案所述的青枯病生防菌剂中的P.luridaFGD5-2、P.koreensis HCH2-3或P.rhodesiae MTD4-1在烟草青枯病防治中的应用。
作为优选，OD600为0.3的浓度下，接种5μL培养24h，P.lurida FGD5-2产生的抑菌圈直径为3.7±0.10cm、P.koreensis HCH2-3的抑菌圈直径为4.2±0.15cm、P.rhodesiaeMTD4-1的抑菌圈直径为2.9±0.08cm。
作为优选，OD600为0.3的浓度下，接种5μL培养14天，P.lurida FGD5-2的溶磷指数为3.6、P.koreensis HCH2-3的溶磷指数为1.8。
作为优选，接种106cfu/ml培养72h，P.lurida FGD5-2、P.koreensis HCH2-3、P.rhodesiae MTD4-1分别可以产生4.9μg/mL、20.1μg/mL和8.4μg/mL生长素。
本发明还提供了一种青枯病生防菌剂，以上述技术方案所述的青枯病生防菌剂中的P.lurida FGD5-2、P.koreensis HCH2-3或P.rhodesiae MTD4-1为主要有效成分。
本发明还提供了一种根据上述技术方案所述的青枯病生防菌剂的基于微生物组学技术的开发方法，包括以下步骤：
选择常年种植烟草不发病田块和易感病田块，分别采集烟草根系样品及其根际土壤，提取所有样品中的DNA，利用引物进行扩增子测序；
将所得所有序列在97％相似度水平上划分操作分类单元，利用属水平相对丰度生成物种相关性矩阵，进而利用所得矩阵输出边和节点文件，构建微生物网络；
基于微生物在微生物网络中所占的地位，判断得到关键微生物种群；
从根系和根际土中分离培养微生物，将分离得到的微生物与网络构建得到的关键微生物种群基于16S rRNA基因序列构建系统进化树，最终筛选得到与关键微生物种群聚集在一起的高相似微生物作为青枯病生防菌剂。
与现有技术相比，本发明的优点和积极效果在于：
本发明提供了一种基于微生物组学技术筛选青枯病生防菌剂的方法，利用微生物组学技术筛选青枯病生防菌尚属首次，本次利用该方法筛选得到3株具有抗青枯病能力的菌株，通过对3株假单胞菌的溶磷活性、产生长素以及铁载体能力测试发现，3株假单胞菌均具有良好的效果；进一步还对3株假单胞菌的防病效果进行了分析，发现3株菌株无论单独或复配使用均具有良好的抗青枯病能力，可有效用于烟草青枯病防治中。
附图说明
图1为本发明实施例提供的细菌群落的共发生网络，其中A、B和C为土壤样品；D，E和F为烟草根系样品；
图2为本发明实施例提供的关键微生物类群丰度之和与青枯菌丰度之间的相关性；
图3为本发明实施例提供的关键微生物OTU与可培养微生物的进化关系；
图4为本发明实施例提供的三株细菌对青枯雷尔氏菌RS10的抑制效果；
图5为本发明实施例提供的关键微生物种群的溶磷活性(上图)和产铁载体能力(下图)，其中FGD5-2:P.lurida；HCH2-3:P.koreensis；MTD4-1:P.rhodesiae；
图6为本发明实施例提供的关键微生物种群对青枯病的防治效果，其中FGD5-2:P.lurida；HCH2-3:P.koreensis；MTD4-1:P.rhodesiae；MIX:三种假单胞菌混合施用
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1样品采集
2018年8月从贵州遵义烟区选择常年种植烟草不发病田块和易感病田块，采集烟草根系样品及其根际土壤，共设置8个采样点，每个点采集3棵植株。
实施例2数据分析
利用PowerSoil试剂盒(MOBIO)提取所有样品中的DNA，以16S rRNA基因V5-V7区引物799F(5′-AACMGGATTAGATACCCKG-3′)和1193R(5′-ACGTCATCCCCACCTTCC-3′)进行扩增子测序。原始数据经质控后得到优化数据，对所有序列在97％相似度水平上划分OTU。
采用RDP classifier贝叶斯算法对OTU代表序列进行分类学分析，所使用的数据库为Silva(release 132)。统计各分类学水平上各样本的群落组成：Domain(域)、Kingdom(界)、Phylum(门)、Class(纲)、Order(目)、Family(科)、Genus(属)和Species(种)。
2.1差异物种分析
通过比较各样本中的微生物群落组成，发现含有青枯病病原菌的劳尔氏菌属(Ralstonia)的相对丰度在感病土(12.8％)中远高于抑病土(0.3％)；在发病根系(39.0％)中的相对丰度也显著高于健康根(0.6％)。
2.2利用微生物网络关系寻找抑病烟田中的关键微生物类群(keystone taxa)
在R语言环境下，根据属水平相对丰度生成物种相关性矩阵，将该矩阵数据导入Gephi(v0.9.2)软件，从而输出边和节点文件。根据以往报道，我们将具有以下特征的微生物认定为样品中的关键微生物类群：具有较高的度(Degree，连接节点的边数)、较高的接近中心度(Closeness centrality；一个节点到所有其它节点距离之和的倒数)和较低的中介中心度(Betweenness centrality；通过该节点的最短路径数量)。
通过微生物网络构建，我们发现不发病田块的微生物网络关系相比于易感病田块更加复杂(图1)。在抑病土和健康烟草根系中分别鉴定出9和13个关键细菌类群。其中，假单胞菌属(Pseudomonas)是丰度最高的类群，其次为链霉菌属(Streptomyces)。当我们将这些关键微生物种群从整体网络中去除，发现没有关键微生物种群的网络变得更简单，更接近于易感病田的细菌网络(图1C和F)。更重要的是，所有关键种群的丰度之和与青枯菌的丰度呈负相关关系(图2)，暗示着这些微生物可能具有潜在的抗青枯病能力。以上结果说明了关键微生物类群在维持土壤微生物群落稳定以及烟草健康方面的重要性。
实施例3菌种选择与定向应用
3.1微生物分离培养
称取抑病烟田土壤1g，加入9ml无菌生理盐水，180r/min震荡30min，静置。称取烟草根系1g，放于灭菌的研钵中充分研磨。吸取土壤悬浮液或者根系匀浆液100μL加到900μL生理盐水中，依次稀释至10-2～10-4，3个稀释度各取100μL，涂布于1/10TSA、R2A和NA平板上。置28℃恒温培养箱培养2-4d后进行菌株分离纯化。
选取菌落数在30-300个的平板，挑选菌落形态各异的单菌落，并依据菌落的颜色、形态、表面光滑度等特征进行粗略归类、编号，在NA培养基上划线纯化2-3次。纯化的细菌转接入NB培养基，180r/min摇床培养48h。将50％甘油与菌液按1：1的比例混合后放于2mL的冻存管中，注明保存时间和样品信息，置于-80℃冰箱保存。
挑取少量菌落于100μL无菌水中，震荡混匀，用作PCR反应模板。选择细菌通用引物27F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)和1492R(5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3')扩增细菌16SrRNA基因序列。PCR反应条件：94℃5min；94℃1min，55℃1min，72℃1.5min，30个循环；72℃10min。用1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物片段大小。PCR产物送至测序公司进行纯化和测序，获得的序列利用Chromas软件剪去质量较差的峰，将序列提交至EzBioCloud(https://www.ezbiocloud.net/)进行比对。
3.2关键微生物种群与可培养微生物的进化关系
利用Mega7.0软件，将分离得到的微生物与网络构建得到的关键微生物种群基于16S rRNA基因序列构建系统进化树，采用邻接法进行1000次自举。
结果发现，3株细菌与关键微生物种群聚集在一起(图3)，相似度高达98.4-100％，分别为浅黄色假单胞菌P.lurida FGD5-2(其序列如SEQ ID NO.1所示)、韩国假单胞菌P.koreensis HCH2-3(其序列如SEQ ID NO.2所示)和霍氏假单胞菌P.rhodesiae MTD4-1(其序列如SEQ ID NO.3所示)。
其中，3株细菌均为革兰氏阴性、杆状并具有运动性。在营养琼脂上菌落为圆形、光滑、白黄色。P.lurida FGD5-2和P.koreensis HCH2-3能够产色素；P.rhodesiae MTD4-1无色素。
目前，3株关键微生物P.lurida FGD5-2、P.koreensis HCH2-3和P.rhodesiaeMTD4-1均已于2020年6月15日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号分别为CGMCC 20077、CGMCC 20078和CGMCC 20079。
3.3关键微生物的抑菌能力和促生指标
将青枯雷尔氏菌RS10和待测菌株接种至NB培养基，28℃、180r/min下摇床培养24h。新鲜的NA培养基冷却至45℃左右，青枯雷尔氏菌RS10以1％的接种量接种至该培养基中，摇匀倒平板。将待测菌株的OD600值调节至0.8，吸取5μL点种至平板上。培养24h后，观察是否有抑菌圈并量取直径。
结果发现，菌株FGD5-2的抑菌圈直径为3.7±0.10cm，HCH2-3为4.2±0.15cm，MTD4-1为2.9±0.08cm(图4)。
利用不同的指示培养基测定了3株假单胞菌的溶磷活性、产生长素以及铁载体的能力。具体测定方法如下：
3.3.1溶磷活性测定：将每个菌株调节OD600为0.3，取5μL接种到PVK琼脂培养基(0.5％磷酸三钙)，30℃培养14天，无机磷酸盐增溶作用会表现为菌落周围具有一个清晰的光环，用增溶指数(SI)评估菌株的增溶作用，计算公式如下：SI＝(晕+菌落直径)/菌落直径。
3.3.2生长素产生能力评价：20μL细菌悬浮液(～106cfu/mL)接种到20mL LB培养基(5mM L-色氨酸)，28℃150r/min震荡培养72h，测定IAA产生量。
3.3.3铁载体产生能力评价：将每个菌株调节OD600为0.3，取5μL接种到CAS琼脂培养基，30℃培养7天，观察细菌菌落周围的颜色变化，颜色从蓝色变为橙色或者深黄色，表明菌株可以产生铁载体。
结果发现，菌株MTD4-1无明显的溶磷活性，而菌株FGD5-2和HCH2-3具有较强的溶磷活性，溶磷指数分别为3.6和1.8(图5)；3株细菌均能产生长素(菌株FGD5-2为4.9μg/mL，HCH2-3为20.1μg/mL，MTD4-1为8.4μg/mL)以及铁载体(菌株FGD5-2、HCH2-3、MTD4-1的晕圈直径分别为2.9±0.1cm、3.4±0.2cm、3.2±0.1cm)(图5)。
实施例4关键微生物的防病效果
烟草种子(小黄金)播入育苗盘，出苗后假植培养一周，挑选大小一致的幼苗移栽至塑料盆中(每盆装150g无菌土)。移栽7天后开始灌根浇菌液，使其终浓度为107cfu/g土。每隔5天浇一次，共浇3次。该实验共设5个处理：空白对照组、仅添加FGD5-2、仅添加HCH2-3、仅添加MTD4-1、三株菌1:1:1混合添加。每个处理三个重复，每个重复有18棵烟苗。施加最后一次菌液5天后，通过灌根的方式接入青枯病菌，使其终浓度为107cfu/g土，15天后调查发病情况。结果发现，菌株FGD5-2、HCH2-3、MTD4-1的病情指数分别为19.4、17.0、9.7；混合使用的病情指数为13.3；而对照组的病情指数为39.5。说明3株细菌无论是单独使用还是混合使用均能降低青枯病菌对烟草的侵染(图6)。
Figure RE-RE-IDA0002991153790000011
Figure RE-RE-IDA0002991153790000021
Figure RE-RE-IDA0002991153790000031
Figure RE-RE-IDA0002991153790000041
Figure RE-RE-IDA0002991153790000051
Figure RE-RE-IDA0002991153790000061

Claims (9)

1.青枯病生防菌剂，其特征在于，由Pseudomonas lurida FGD5-2、Pseudomonaskoreensis HCH2-3和Pseudomonas rhodesiae MTD4-1按体积比1:1:1构成，其中，P.luridaFGD5-2具有如SEQ ID NO.1所示序列，P.koreensis HCH2-3具有如SEQ ID NO.2所示序列，P.rhodesiae MTD4-1具有如SEQ ID NO.3所示序列。
2.根据权利要求1所述的青枯病生防菌剂，其特征在于，所述P.lurida FGD5-2于2020年6月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号分别为CGMCCNO.20077；
所述P.koreensis HCH2-3于2020年6月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号分别为CGMCC NO.20078；
所述P.rhodesiae MTD4-1于2020年6月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号分别为CGMCC NO.20079。
3.根据权利要求1或2所述的青枯病生防菌剂在烟草青枯病防治中的应用。
4.根据权利要求1所述的青枯病生防菌剂中的P.lurida FGD5-2、P.koreensis HCH2-3或P.rhodesiae MTD4-1在烟草青枯病防治中的应用。
5.根据权利要求3或4所述的应用，其特征在于，OD600为0.3的浓度下，接种5μL培养24h，P.lurida FGD5-2产生的抑菌圈直径为3.7±0.10cm、P.koreensis HCH2-3的抑菌圈直径为4.2±0.15cm、P.rhodesiae MTD4-1的抑菌圈直径为2.9±0.08cm。
6.根据权利要求3或4所述的应用，其特征在于，OD600为0.3的浓度下，接种5μL培养14天，P.lurida FGD5-2的溶磷指数为3.6、P.koreensis HCH2-3的溶磷指数为1.8。
7.根据权利要求3或4所述的应用，其特征在于，接种106cfu/ml培养72h，P.luridaFGD5-2、P.koreensis HCH2-3、P.rhodesiae MTD4-1分别可以产生4.9μg/mL、20.1μg/mL和8.4μg/mL生长素。
8.青枯病生防菌剂，其特征在于，以权利要求1所述的青枯病生防菌剂中的P.luridaFGD5-2、P.koreensis HCH2-3或P.rhodesiae MTD4-1为主要有效成分。
9.根据权利要求1所述的青枯病生防菌剂的基于微生物组学技术的开发方法，其特征在于，包括以下步骤：
选择常年种植烟草不发病田块和易感病田块，分别采集烟草根系样品及其根际土壤，提取所有样品中的DNA，利用引物进行扩增子测序；
将所得所有序列在97％相似度水平上划分操作分类单元，利用属水平相对丰度生成物种相关性矩阵，进而利用所得矩阵输出边和节点文件，构建微生物网络；
基于微生物在微生物网络中所占的地位，判断得到关键微生物种群；
从根系和根际土中分离培养微生物，将分离得到的微生物与网络构建得到的关键微生物种群基于16S rRNA基因序列构建系统进化树，最终筛选得到与关键微生物种群聚集在一起的高相似微生物作为青枯病生防菌剂。
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